Previsão de Epítopos para Identificação de Alvos Vacinais Contra Trichonoma Vaginalis, Usando Bioinformática

Universidade Federal de Goiás
Pró Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação

Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
Previsão de epítopos para identificação de alvos vacinais contra Trichonoma

vaginalis, usando bioinformática
Trabalho para obtenção

parcial de nota da disciplina
de Princípios e aplicações da
genômica e bioinformática
para o estudo de doenças
infecciosas e parasitárias II
sob orientação do professor
Dr. Pedro Vitor Lemos
Cravo
Discente:
Juliana Rodrigues
Goiânia
2016
INTRODUÇÃO
O Parasito
A tricomoníase é uma infecção ocasionada pelo protozoário Trichonoma

vaginalis (T. vaginalis), é a segunda infeção transmitida sexualmente, mais comum nos
seres humanos ( Poole and McCelleand 2013).
O T. vaginalis é um flagelado, unicelular, anaeróbico, que infecta o trato

urogenital dos seres humanos (Kusdian and Gould, 2014; Schwebke and Burgess,
2004). A infecção nas mulheres pode ocasionar uretrites, vaginites e infertilidade, para
os homens, a tricomoníase em sua maioria é assintomática. Tem sido sugerido que a
tricomoníase pode aumentar o risco de infecção do vírus da imudeficiência adquirida
(HIV) e papiloma vírus. Kissinger and Adamski, 2013). Existem ainda indicações da
associação desta infecção aumentar o risco de câncer de próstata em homens (Stark et
al., 2009; Sutcliffe et al., 2006; Twu et al., 2014).
Mecanismos de patogênese
O estabelecimento de T. vaginalis na vagina inicia quando há um aumento do

pH vaginal, pois o microorganismo cresce em pH maior que 5,0. A elevação do pH
vaginal é concomitante a uma redução de Lactobacillus acidophilus e um aumento na
proporção de bactérias anaeróbias.
Quando o T. vaginalis entra em contato com os leucócitos, o parasito forma

pseudópodes, internaliza e degrada as células imunes do hospedeiro. A aderência e a
citotoxicidade exercidas pelo parasito sobre as células do hospedeiro são controladas
por fatores de virulência, como adesinas (AP120, AP65, AP51, AP33 e AP23), cisteino-
proteinases, integrinas, cell-detaching factor (CDF) e glicosidases (Lopez et al 2000).
A aderência do parasito as células epiteliais modulam a expressão gênica de

proteínas funcionais das células do hospedeiro, como aquelas associadas a manutenção
da estrutura da matriz extracelular, moléculas pro-apoptóticas e pro-inflamatória.
Produtos secretados pelo T. vaginalis, como glicosidases e CDF são tóxicas as células
do hospedeiro, mostrando que não só o mecanismo contato-dependente é importante
para a patogenia. As cisteíno-proteinases são citotóxicas e hemolíticas, além de
degradar IgG, IgM e IgA presentes na vagina (Lopez et al 2000).
O ferro liberado na menstruação ajuda na resistência do parasito ao sistema

complemento por regular a expressão de cisteino-proteinases, que degradam a porção
C3 do complemento. T. vaginalis pode se auto-revestir de proteínas presentes no plasma
do hospedeiro, impedindo, assim a identificação deste pelo sistema imune.
Tratamento
O tratamento para tricomoníase se dá através de fármacos, sendo que os mais

usados são nitroimidazóis, entretanto a resistência aos fármacos está a emergir, uma vez
que até 5% dos casos nos EUA, já não respondem ao protocolo de tratamento padrão
(Kirkcaldy et al., 2012). Em 2009, 17% de casos isolados em Papaua em Nova Guiné,
demonstraram alto índice de resistência ao metronidazol (Upcroft et al., 2009)
A vacinoterapia é uma nova tentativa de tratamento da tricomoníase sepas

selecionadas de Lactobacillus acidophillus são comercializadas como vacinas com o
nome de Solco-Trichovac e Gynatrem a média de cura depois de quatro doses da vacina
se aproxima á dos nitronidazóis.
Desta forma desenvolver um vacina contra o T. vaginalis se torna relevante,

considerando a evolução de resistência do parasito e a ausência de uma vacina eficaz .
CONTEXTUALIZAÇÃO DO TEMA DA PESQUISA
Procuramos selecionar epítopos presentes na família da proteínas cisteíno -

proteínases, para identificação de alvos vacinais contra T. vaginalis usando estratégias
de bioinformática.
O modelo de estudo é o parasita Trichomona vaginalis
Projeto
 Objetivo 1 - Construir uma biblioteca das proteínas com peptídeo sinal e que
pertençam a família das cisteínas - proteinases
 Objetivo 2- Realizar predição de epítopos para MHCs classe I usando a
plataforma imune epitope database and analysis resource (iedb:
http://www.iedb.org/)
 Objetivo 3- Realizar a predição de epítopos para MHCs classeII , usando a
plataforma iedb
 Objetivo 4 – Realizar a predição de epítopos a serem reconhecidos pelo
linfócitos B, usando a plataforma iedb
Execução do Projeto
 Objetivo 1- Construir uma biblioteca das proteínas com peptídeo sinal e

que pertençam a família das cisteínas - proteinases
Usando o banco de dados TrichDB (http://trichdb.org/), foi realizada uma

procura usando os seguintes filtros:
o Seleção de proteínas baseadas no filtro pepetideos sinal
o Adicionar o filtro usando o termo Text para selecionar proteínas
que estejam inseridas na família das cisteinas proeteinases,
o Inserir o termo “cysteine proteins”
o Fazer a intersecção dos filtros selecionados
Após seleção dos filtros foram encontradas 33 proteinas, confome a

tabela 01
Tabela 01- Biblioteca de proteínas com peptídeo sinal, que pertençam a família
das cisteinas proteinases
Nome do Gene Produto
TVAG_185220 conserved hypothetical protein
TVAG_185540 Clan CD, family C13, legumain-like cysteine peptidase
TVAG_034880 Clan IH, family I25, phytocystatin-like peptidase inhibitor
TVAG_013660 hypothetical protein
TVAG_253780 Rho-gap 92B, putative
TVAG_159730 Rab78, putative
Clan CA, family C40, NlpC/P60 superfamily cysteine
TVAG_393610
peptidase
TVAG_488380 Clan CA, family C1, cathepsin B-like cysteine peptidase
TVAG_126090 Clan CA, family C1, cathepsin L or H-like cysteine peptidase

TVAG_485880 Clan CA, family C1, cathepsin L-like cysteine peptidase
TVAG_302460 cysteine desulfurylase, putative
TVAG_312450 signal recognition particle 54 kD protein, putative
TVAG_034140 Clan CA, family C1, papain-like cysteine peptidase
TVAG_299900 Clan CA, family C2, calpain-like cysteine peptidase
TVAG_052570 Clan CA, family C1, papain-like cysteine peptidase
TVAG_439150 Rab7, putative
TVAG_375500 calpain, putative
 Objetivo 2 – Realizar predição de epítopos para MHCs classe I usando a

plataforma imune epitope database and analysis resource
A predição dos epítopos foi realizada utilizando o banco de dados iedb
(http://www.iedb.org/). A predição foi realizada a partir das proteínas
identificadas na biblioteca gerada (Tabela 01). A sequência primaria das
proteínas hipotéticas não foram preditas, uma vez que as mesmas não
apresentam função conhecida.
A predição foi realizada utilizando os seguintes filtros:
o Foi inserida a sequência linear da proteína
o A espécie selecionada foi camundongo
o Foram selecionados os alelos (H-2Db, H-2Dd, H-2Kb, H-2Kd, H-2Ld)
o O tamanho do alelo utilizado foi 9
Após a seleção dos filtros, a predição foi submetida, para a escolha dos melhores
epitopos. Foram selecionados os epítopos que estiveram melhores ranqueados,
conforme a tabela 02
Tabela 02- Epítopos preditos para proteína TVAG_034880 Clan IH, family I25,
phytocystatin-like peptidase inhibitor, para MHCs classe I
Inic Tama Ran
Alelo Fim Peptideo Metodo
io nho k
H-2-Ld 25 33 9 QPSNLKY Consensus (ann/smm) 0.2
FF
H-2-Dd 24 32 9 FQPSNLK Consensus 0.2
YF (ann/comblib_sidney2008/sm
m)
H-2-Dd 27 35 9 TGTYRMS Consensus 0.2
SF (ann/comblib_sidney2008/sm
m)
H-2-Dd 26 34 9 GSPSLIRV Consensus 0.2
F (ann/comblib_sidney2008/sm
m)
H-2-Kb 3 11 9 FSYTFLQP Consensus (ann/smm) 0.2
F
Após consultar todas as sequências lineares das proteínas, foram preditos

33 Epítopos para MHCs classe I, conforme tabela 03.
Tabela 03: Numero de epítopos previstos por proteínas, para MHC Classe I,
MHC Classe II e linfócitos B, respectivamente
MHC MHC LINF
PROTEÍNA
I II B TOTAL
conserved hypothetical protein
0 0 0 0
Clan CD, family C13, legumain-like
cysteine peptidase 1 1 0 2
Clan IH, family I25, phytocystatin-like
peptidase inhibitor 1 1 0 2
hypothetical protein
0 0 0 0
0 0 0 0
Rho-gap 92B, putative
1 1 0 2
0 0 0 0
Rab78, putative
1 1 5 7
Clan CA, family C40, NlpC/P60
superfamily cysteine peptidase 1 1 0 2
0 0 0 0
Clan CA, family C1, cathepsin B-like
Clan CA, family C1, cathepsin L or H-
like cysteine peptidase 1 1 0 2
Clan CA, family C1, cathepsin L-like
cysteine desulfurylase, putative
1 1 0 2
signal recognition particle 54 kD
protein, putative 1 1 4 6
Clan CA, family C1, papain-like
Clan CA, family C2, calpain-like
Clan CA, family C1, papain-like
0 0 0 0
0 0 0 0
Rab7, putative
1 1 7 9
0 0 0 0
calpain, putative
1 1 0 2
TOTAL
33 25 29
 Objetivo 3- Realizar a predição de epítopos para MHCs classeII , usando a

plataforma iedb

(http://www.iedb.org/ ) . A predição foi realizada a partir das proteínas
identificadas na biblioteca gerada (Tabela 01). Exceto as proteínas hipotéticas,
uma vez que as mesmas não apresentam uma função definida.
o Foi inserida a sequência linear da proteína
o A espécie selecionada foi camundongo
o Foram selecionados os alelos (H-2 IAb, H-2 IAd, H-2 IEd)
Após a seleção dos filtros, a predição foi submetida, para a escolha dos
melhores epítopos. Foram selecionados os epítopos que estiveram melhores
ranqueados, conforme a tabela 04. No total 25 epítopos foram preditos (tabela
03).
Tabela 04: Epítopos preditos para proteína TVAG_253780 Rho-gap 92B,

putative, para MHCs classe II
Alelo Inicio Fim Peptideo Method Rank

H2-IAd 228 242 KQARMIRNVRIEISS Consensus 2.41
(smm/nn)
 Objetivo 4 – Realizar a predição de epítopos a serem reconhecidos pelo
linfócitos B, usando a plataforma imune epitope database and analysis
resource
(http://www.iedb.org/). A predição foi realizada a partir das proteínas
identificadas na biblioteca gerada (Tabela 01). As sequências primárias das
proteínas hipotéticas não foram preditas, uma vez que as mesmas não
apresentam função bem defina.
Foram escolhidas apenas proteínas que eram encontradas nas membranas
celulares e, proteínas do tipo transmembrana. Proteínas de núcleo, lisossomos e
vacúolos não foram submetidas a predição por linfócitos B.
 Foi inserida a sequência linear da proteína
 O método escolhido foi “Bepipred Linear Epitope Prediction”
 Após a escolha do método a sequência da proteína foi encaminhada para
predição.
Os melhores epítopos foram selecionados, considerando o tamanho do
mesmo, todos os que tinham menos de 9 nucleotídeos foram
desconsiderados, conforme é demonstrado na tabela 5.
Tabela 05- Epítopos preditos para proteína TVAG_159730 Rab78, putative,
para linfócitos B
Númer
Inicio Final Peptideo Tamanho
o
11 155 163 SAKTAEGVQ 9
10 127 141 SDLPDKAVQPSAARE 15
7 91 97 TKPASFE 7
5 64 72 TAGQERFQS 9
4 38 52 KATIGSDFSSKQLDV 15
Após a submissão da sequência linear das proteínas, foram preditos 29

epítopos.
CONCLUSÃO
Ao final deste estudo, foi possível gerar uma biblioteca com 25 proteinas
com peptídeo sinal e que pertenciam a família das cisteínas- proteinases,
importantes no mecanismo de patogenicidade do T. vaginalis. A partir destas
proteínas foi possível fazer a predição de 87 epítopos.
Desta forma sugere-se que os epítopos preditos a partir das proteínas:

Rab78, putative, signal recognition particle 54 kD protein, putative, Clan CA,
family C2, calpain-like cysteine peptidase e Rab 7, putative, sejam utilizados
como candidatos vacinais, uma vez que, que foram reconhecidos pelos
linfócitos B, MHCs classe I e MHCs classe II, respectivamente.
Outros estudos sobre a modelagem destas proteínas e revisão de literatura

deverão ser realizados, para que uma vacina de subunidade seja desenhada.
Ainda vale ressaltar que outras plataformas para predição de epítopos podem ser
utilizadas no intuito de validar o método, usada neste trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://trichdb.org/trichdb/ data de acesso11/07/2016
http://www.iedb.org/data de acesso11/07/2016
DE CARLI, G. A. 2000. Trichomonas 2000 in Neves, D,P. Parasitologia humana.

Atheneu
Kusdian, G., Gould, S.B., 2014. The biology of Trichomonas vaginalis in the light of
urogenital tract infection. Mol. Biochem. Parasitol. 198, 92e 99
Lopez et al 2010 Strategies by which some Pathogenic Trichomonads integrate Diverse

Signals in the Decision-making Proces. An. Acad. Bras. Ciênc. vol.72 n.2 Rio de
Janeiro June 2000
NEVES, D. P. Parasitologia Dinâmica. 2 ed. São Paulo: Atheneu, 2005
Poole, D.N., McClelland, R.S., 2013. Global epidemiology of Trichomonas vaginalis.

Sex. Transm. Infect. 89, 418e422
REY, L. Parasitologia. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008
Stark, J.R., Judson, G., Alderete, J.F., Mundodi, V., Kucknoor, A.S.,
Giovannucci, E.L.,
Platz, E.A., Sutcliffe, S., Fall, K., Kurth, T., Ma, J., Stampfer, M.J., Mucci,
L.A., 2009.
Prospective study of Trichomonas vaginalis infection and prostate
cancer incidence and mortality: physicians' health study. J. Natl.
Cancer Inst. 101,
1406e1411
Sutcliffe, S., Giovannucci, E., Alderete, J.F., Chang, T.H., Gaydos, C.A.,
Zenilman, J.M.,
De Marzo, A.M., Willett, W.C., Platz, E.A., 2006. Plasma antibodies
against Trichomonas vaginalis and subsequent risk of prostate
cancer. Cancer Epidemiol.
Biomarkers Prev. 15, 939e 945
Twu, O., Dessi, D., Vu, A., Mercer, F., Stevens, G.C., de Miguel, N.,
Rappelli, P.,
Cocco, A.R., Clubb, R.T., Fiori, P.L., Johnson, P.J., 2014. Trichomonas
vaginalis homolog of macrophage migration inhibitory factor induces
prostate cell growth,
invasiveness, and inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A. 111,
8179 e 8184

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Previsão de epítopos para identificação de alvos vacinais contra Trichonoma

Trabalho para obtenção

A tricomoníase é uma infecção ocasionada pelo protozoário Trichonoma

O T. vaginalis é um flagelado, unicelular, anaeróbico, que infecta o trato

O estabelecimento de T. vaginalis na vagina inicia quando há um aumento do

Quando o T. vaginalis entra em contato com os leucócitos, o parasito forma

A aderência do parasito as células epiteliais modulam a expressão gênica de

O ferro liberado na menstruação ajuda na resistência do parasito ao sistema

O tratamento para tricomoníase se dá através de fármacos, sendo que os mais

A vacinoterapia é uma nova tentativa de tratamento da tricomoníase sepas

Desta forma desenvolver um vacina contra o T. vaginalis se torna relevante,

CONTEXTUALIZAÇÃO DO TEMA DA PESQUISA

Procuramos selecionar epítopos presentes na família da proteínas cisteíno -

O modelo de estudo é o parasita Trichomona vaginalis

 Objetivo 1- Construir uma biblioteca das proteínas com peptídeo sinal e

Usando o banco de dados TrichDB (http://trichdb.org/), foi realizada uma

Após seleção dos filtros foram encontradas 33 proteinas, confome a

TVAG_126090 Clan CA, family C1, cathepsin L or H-like cysteine peptidase

 Objetivo 2 – Realizar predição de epítopos para MHCs classe I usando a

Após consultar todas as sequências lineares das proteínas, foram preditos

 Objetivo 3- Realizar a predição de epítopos para MHCs classeII , usando a

A predição dos epítopos foi realizada utilizando o banco de dados iedb

Tabela 04: Epítopos preditos para proteína TVAG_253780 Rho-gap 92B,

Alelo Inicio Fim Peptideo Method Rank

10 127 141 SDLPDKAVQPSAARE 15

Após a submissão da sequência linear das proteínas, foram preditos 29

Desta forma sugere-se que os epítopos preditos a partir das proteínas:

Outros estudos sobre a modelagem destas proteínas e revisão de literatura

http://trichdb.org/trichdb/ data de acesso11/07/2016

DE CARLI, G. A. 2000. Trichomonas 2000 in Neves, D,P. Parasitologia humana.

Lopez et al 2010 Strategies by which some Pathogenic Trichomonads integrate Diverse

NEVES, D. P. Parasitologia Dinâmica. 2 ed. São Paulo: Atheneu, 2005

Poole, D.N., McClelland, R.S., 2013. Global epidemiology of Trichomonas vaginalis.

REY, L. Parasitologia. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008

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