BASES DA MEDICINA CELULAR E MOLECULAR II

ROTEIROS AULAS PRÁTICAS BACTERIOLOGIA 2009

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Docentes:
Beatriz E. Cabilio Guth: bec.guth@unifesp.br Rosa Maria Silva: rmsilva01@unifesp
.br Sylvia C. Leão: sylvia.leao@unifesp.br Tânia A. Tardelli Gomes tatg.amaral@unife
sp.br Coordenadora do Amaral:
REGRAS DE CONDUTA MICROBIOLOGIA
NO
LABORATÓRIO
DE
As aulas práticas de bacteriologia foram planejadas para mostrar a você, estudante d
e Medicina, os princípios e os métodos clássicos utilizados em laboratórios de diagnóstico
microbiológico. Nessas aulas, você trabalhará com uma variedade de bactérias, algumas p
atogênicas para o homem. É, portanto, essencial que você siga as regras de segurança est
abelecidas para um laboratório de microbiologia, a fim de evitar contaminações do grup
o ou de funcionários. 1. Desinfete sua bancada no início e ao término de cada aula práti
ca. Com isso, estará destruindo os microrganismos que poderão contaminar suas cultur
as e os que tenham contaminado a área de trabalho. 2. Não coma nem fume no laboratório
. Se a bancada ou o equipamento tiver sido contaminado acidentalmente com qualqu
er microrganismo, comer ou fumar é um meio eficiente para uma autocontaminação. 3. Use
sempre o avental. Se ele acidentalmente ficar contaminado, não deve ser utilizado
fora do laboratório.
4. Lave as mãos ao sair do laboratório.
5. Avise o professor em caso de contaminação acidental. 6. Não coloque materiais conta
minados (pipetas, lâminas, etc…) sobre o balcão. Sempre haverá um recipiente próprio para
colocá-los.
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1ª. Aula Prática – 11/02/2009 NUTRIÇÃO, CRESCIMENTO E METABOLISMO BACTERIANO
O METABOLISMO bacteriano compreende reações de DEGRADAÇÃO de compostos (CATABOLISMO) par
a obtenção de ENERGIA que será utilizada em reações de SÍNTESE (ANABOLISMO). As REAÇÕES MET
S necessitam de ALTA ENERGIA, o que causaria um superaquecimento da célula. Este p
roblema é resolvido com o auxílio de ENZIMAS que DIMINUEM A ENERGIA necessária para qu
e as reações metabólicas ocorram. As bactérias podem utilizar diferentes fontes de Carbo
no e de Energia.
FONTES DE CARBONO
FONTES DE ENERGIA
CO2
Compostos Orgânicos
Compostos Orgânicos e Inorgânicos
Bactérias Autotróficas
Bactérias Heterotróficas
Bactérias Quimiotróficas
Bactérias Fototróficas
A MAIORIA DAS BACTÉRIAS, bem como todos os fungos, protozoários e animais são QUIMIO-H
ETEROTRÓFICAS, pois sua fonte de energia pode ser de compostos tanto orgânicos como
inorgânicos e sua fonte de carbono são os compostos orgânicos.
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A OBTENÇÃO DE ENERGIA se faz através de REAÇÕES DE ÓXIDOREDUÇÃO e esta energia é armazenada
ulas como ATP, NADH, FADH.
As bactérias têm 3 formas de acumular energia: RESPIRAÇÃO AERÓBICA,
RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA E FERMENTAÇÃO. RESPIRAÇÃO AERÓBICA = O OXIGÊNIO É O ACEPTOR FINAL DE
GLICÓLISE (AC. PIRÚVICO) CICLO DE KREBS e
-
CADEIA DE
TRANSPORTE DE
38 ATP + CO2 + H2O SOMENTE OCORRE NA PRESENÇA DE OXIGÊNIO
RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA = OUTRO COMPOSTO INORGÂNICO É O ACEPTORFINAL DE e-
(NO3-, SO4= , CO3= , etc.)
GLICOSE GLICÓLISE (AC. PIRÚVICO) CICLO DE KREBS TRANSPORTE DE eCADEIA DE
> 2 ATP + (NO2 ou N2 ou H2S ou CH4 , etc.) SOMENTE OCORRE NA AUSÊNCIA DE OXIGÊNIO
FERMENTAÇÃO = COMPOSTOS ORGÂNICOS SÃO OS ACEPTORES FINAIS DE e(AC. LÁTICO, ETANOL, etc.) G
LICOSE GLICÓLISE (AC. PIRÚVICO) COMPOSTOS ORGÂNICOS + 2 ATP
NÃO UTILIZA OXIGÊNIO, MAS OCORRE TANTO NA PRESENÇA COMO NA AUSÊNCIA DE OXIGÊNIO
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O CRESCIMENTO BACTERIANO significa AUMENTO DO NÚMERO de indivíduos na população e, porta
nto, requer DIVISÃO CELULAR. 1 2 4 ........... 2
n
A DIVISÃO CELULAR necessita que as células bacterianas estejam METABOLICAMENTE ATIVA
S. Existem CONDIÇÕES FÍSICAS E QUÍMICAS ÓTIMAS para que as reações metabólicas ocorram e qu
bactérias se dividam aumentando a população.
• REQUERIMENTOS FÍSICOS PARA O CRESCIMENTO BACTERIANO
TEMPERATURA há bactérias adaptadas para crescer a 0oC, outras preferem 90oC. Entreta
nto, a maioria das espécies de importância médica cresce entre 20 e 40oC. a maioria te
m pH ótimo de crescimento em torno de 7,0. o citoplasma bacteriano contém cerca de 8
0% de H2O necessária para que as reações metabólicas ocorram. A perda de água intracelular
leva à parada do metabolismo e, portanto, do crescimento bacteriano.
pH
UMIDADE
QUESTÕES • POR QUE SE USA A GELADEIRA OU O CONGELADOR PARA CONSERVAR OS
ALIMENTOS POR MAIS TEMPO?
• POR QUE A CARNE SALGADA SE CONSERVA POR LONGO TEMPO, MESMO À TEMPERATURA AMBIENTE?
• POR QUE O LEITE CONDENSADO NÃO SE ESTRAGA COM A RAPIDEZ DO LEITE
COMUM?
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• REQUERIMENTOS QUÍMICOS PARA O CRESCIMENTO BACTERIANO
√ CARBONO √ NITROGÊNIO √ ENXÔFRE √ FÓSFORO constitui 50% do peso seco celular constitui 15%
peso seco celular constituem 3 % do peso seco celular
√ cátions K++, Mg++, Ca++ √ metais Fe, Cu, Zn √ outros elementos - traços
OXIGÊNIO com relação à classificadas em: AERÓBIAS ESTRITA necessidade de oxigênio, as bacté
s são
NÃO VIVEM SEM O2 ELIMINAM RADICAIS O2- E H2O2 pela ação das enzimas SUPERÓXIDO-DISMUTASE
(SOD), CATALASE E PEROXIDASE.
SOD
2 [O2-] + 2 [H+]
H2O2 + O2
catalase peroxidase
O2 + H2O H2O
OBS.: algumas reações não estão balanceadas
ANAERÓBIAS FACULTATIVAS ANAERÓBIAS ESTRITAS
A PRESENÇA DE O2 É INDIFERENTE USAM O O2 DA ÁGUA PARA FORMAR ALGUNS COMPOSTOS, MAS NÃO O
USAM PARA OBTER ENERGIA TÊM SUPERÓXIDO-DISMUTASE, MAS NÃO TÊM CATALASE PRECISAM DE O2 E
M BAIXAS CONCENTRAÇÕES
ANAERÓBIAS AEROTOLERANTES MICROAERÓFILOS
A EXPOSIÇÃO AO O2 GERA PRODUTOS TÓXICOS, DURANTE AS REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO. ESTES PRODUTO
UITO REATIVOS E DANIFICAM PROTEÍNAS, DNA E LIPÍDEOS. PARA INATIVÁ-LOS SÃO NECESSÁRIAS ENZI
MAS COMO A SUPERÓXIDODISMUTASE, CATALASE E PEROXIDASE.
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EXERCÍCIO SOBRE NECESSIDADE DE OXIGÊNIO Você recebeu 4 tubos contendo cada um, um tipo
de cultura bacteriana. O meio de cultura, no caso, possui um redutor de oxigênio
e um indicador de oxigênio, que fica róseo na presença de O2. Identifique as regiões do
tubo aonde há presença e ausência de O2. Com relação à exigência de O2 para seu metabolismo
ual é o tipo de bactéria no tubo 1? Por quê? • qual o tipo de bactéria no tubo 2? Por quê?
ual o tipo de bactéria no tubo 3? Por quê? • Qual o tipo de bactéria no tubo 4? Por quê?
• CULTIVO BACTERIANO
Para estudar as bactérias, ou para utilizá-las na indústria, por exemplo, há necessidade
de cultivá-las. Para isto, desenvolveram-se meios de cultivo utilizados em labora
tório. De um modo geral, as bactérias de importância médica podem ser cultivadas em meio
s líquidos ou meios sólidos. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO: A inoculação dos meios de cultura pode
r feita com fio ou alça de platina, pipeta, palitos ou suabes esterilizados, assim
como materiais de plástico estéreis descartáveis. As seguintes normas devem ser segui
das nas inoculações dos meios de cultura: a) O fio e alça de platina devem sempre ser
flambados antes e depois de qualquer inoculação, ou seja, devem ser aquecidos ao rub
ro, na chama do bico de Bunsen. É importante deixá-los esfriar (sem assoprar) por al
guns segundos antes de entrarem em contato com a cultura bacteriana a ser inocul
ada. Este procedimento não deverá ser utilizado no caso de fios e alças de material plás
tico descartável, os quais deverão ser usados diretamente e descartados em recipient
e apropriado. b) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com mei
o de cultura devem sempre ser abertos próximo à chama do bico de Bunsen. c) A boca d
os tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada e antes da colocação da tampa. A
tampa nunca deve ser colocada sobre o balcão, sendo retirada e mantida presa pelo
dedo mínimo da mão direita durante a inoculação.
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No entanto, para o CULTIVO DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS é imprescindível que se retire todo o
Oxigênio do meio de cultivo e que a cultura seja incubada na ausência desse gás. Para
isso, existem técnicas apropriadas.
Jarra de Anaerobiose contém um catalisador para a seguinte reação: O2 + 2H2 paládio 2H2O
Câmara de Anaerobiose
Entretanto, NÃO ESQUEÇA, AINDA HOJE existem bactérias NÃO CULTIVÁVEIS em meios de laboratór
o, sendo as de maior importância médica: Mycobacterium leprae Treponema pallidum Chl
amydia, rickétsias
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• ASPECTOS DO METABOLISMO BACTERIANO
Diferentes bactérias podem utilizar uma variedade enorme de substratos para obter
energia e elementos básicos para as suas reações de síntese metabólica. Cada gênero ou espé
bacteriana tem um conjunto de enzimas que lhe permitirá a utilização de determinados
substratos, algumas podendo ser utilizadas para diferenciar uma espécie de outra.
Você recebeu uma placa com um meio de cultura contendo, entre outros nutrientes, 0
,2% de amido. Essa placa foi semeada com duas culturas bacterianas: a Escherichi
a coli e o Bacillus circulans. Uma delas produz a enzima amilase que hidrolisa o
amido (polímero de α-D-glicose) presente no meio de cultur , p r poder utilizá-lo co
mo um fonte de energi . S bendo que o mido em cont to com iodo torn -se escuro
, dicione iodo sobre superfície d pl c e respond : - Qu l b ctéri produtor
de mil se? - Como você chegou est conclusão?
• CONCEITO DE CULTURA PURA
Em muit s situ ções é fund ment l que se tr b lhe com cultur s b cteri n s pur s, isto
é, cultur s onde h j somente um único tipo de microorg nismo. P r isto é necessário
o conhecimento de métodos que permit m v li r purez de um cultur . Há vários método
s de cultivo de b ctéri s e diferentes formul ções de meios de cultur que serão vistos
o longo d s ul s prátic s. Sig s orient ções do professor p r f zer o que se pede
seguir:
Você recebeu três tubos de ens io contendo s cultur s A, B e C em estoque. - com o
uxílio de lç desc rtável estéril, semeie s três cultur s sep r d mente em meio líquido.
- os tubos seme dos serão incub dos 37oC e utiliz dos n ul seguinte.
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• CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO
O ciclo de vid de um cultur b cteri n é conhecido como CURVA DE CRESCIMENTO. O
tempo de ger ção é o tempo necessário p r que popul ção dobre em número. A m iori d s
téri s tem um tempo de ger ção entre 1 e 3 hor s. M s, existem b ctéri s de gr nde impor
tânci médic que têm um tempo de ger ção que pode cheg r ser de 12 hor s (Ex. Mycob cte
rium tuberculosis, Leptospir interrog ns). Se você seme r um b ctéri em um tubo c
ontendo meio líquido e n lis r cultur em termos de b ctéri s viáveis, você observ rá,
o longo do tempo, um típic curv de crescimento b cteri no, represent d no gráfi
co b ixo:
Número de b ctéri s viáveis
3
2 1
4
Δt (hor s) F se 1 = F se l g = cultur está se d pt ndo o meio, tem b ix t x d
e divisão celul r. F se 2 = F se log rítmic = cultur present divisão em t x con
st nte. F se 3 = F se est cionári = no. de b ctéri s viáveis igu l o no. de b ctéri s
mort s. F se 4 = F se de declínio ou morte = no. de b ctéri s mort s > no. de viáveis.
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2ª Aul : CULTIVO. MEIOS SELETIVOS E DIFERENCIAIS. COLORAÇÃO DE GRAM Est coleção de experi
mentos práticos será desenvolvid em três di s, tendo como objetivo introduzir o luno
às técnic s de cultivo, isol mento e identific ção presuntiv de diferentes espécies b ct
eri n s. Noss propost é que s espécies b cteri n s contid s em um mesm cultur
sej m isol d s e identific d s por meio de prov s bioquímic s, exemplo do que oc
orre n identific ção de p tógenos b cteri nos presentes em m teri l clínico proveniente
de sítios contendo um microbiot norm l.
1º. di : 12/02/2009
• CULTIVO BACTERIANO BACTERIANO Como mencion do n ul nterior s b ctéri s podem
ser cultiv d s em meios líquidos ou meios sólidos. Os meios de cultur podem ser sel
etivos qu ndo contêm um substânci que inibe o crescimento de um determin do grupo
de b ctéri s, m s permite o crescimento de outr s. Alguns meios sólidos são ch m dos d
iferenci is qu ndo permitem diferenci r colôni s que present m propried des disti
nt s.
Exercício 1: Comp re s cultur s A, B e C, seme d s nteriormente em meio líquido, e
ntre si e com o conteúdo de um tubo contendo o mesmo meio de cultur não inocul do.
Você consegue identific r em qu l del s houve crescimento b cteri no? Por quê?
Comp re gor s cultur s A, B, C com cultur D entregue pelo professor. É possíve
l identific r se est s cultur s b cteri n s são cultur s pur s?
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Exercício 2: . Homogeneíze s 3 cultur s b cteri n s (cultur s A, B e C) crescid s
em meio líquido e semeie c d um dess s cultur s em pl c s de Petri contendo Ág r n
utriente, Ág r s ngue e Ág r M cConkey, p r obtenção de colôni s isol d s, de cordo co
m s instruções do professor e descrição b ixo. b. Homogeneíze t mbém cultur D e seme
e em um outr pl c de Ág r M cConkey p r obtenção de colôni s isol d s. c. Identifi
que s pl c s com os números do l bor tório e d turm e entregue- s o monitor p r
que sej m incub d s té o di seguinte, em estuf 37ºC.
A
B
C
2o di : 13/02/2009
Observe c d um d s cultur s A, B, C e D seme d s em um pl c contendo meio sóli
do. É possível gor verific r se lgum del s é um cultur b cteri n pur ? Por quê?
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Exercício 3: Observe nov mente s pl c s seme d s e respond : 1. Ág r nutriente: .
Houve crescimento de colôni s? b. Que color ção present s colôni s crescid s? 2. Ag r
s ngue: . Houve crescimento de colôni s? b. Que lter ções você observ no meio? 3. Ag
r M cConkey: . Houve crescimento de colôni s? b. Que color ção present s colôni s c
rescid s? c. Houve ferment ção d l ctose? Em qu is colôni s?
Exercício 4: . Re lize um esfreg ço de um colôni crescid em M cConkey e de um colôn
i hemolític crescid em Ág r s ngue, de cordo com s instruções do professor e s ori
ent ções b ixo. b. Repit o procedimento p r f zer um esfreg ço de m teri l colhido
de mucos or l, com cotonete. c. Re lize color ção de Gr m, conforme s instruções.
•
COLORAÇÃO DE GRAM
http://www.medde n.luc.edu/lumen/DeptWebs/microbio/med/gr m/gr m-stn.htm
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A color ção de Gr m (H ns Christi n Gr m, 1884) diferenci b ctéri s em Gr m-positiv s
e Gr m-neg tiv s. Org nismos Gr m-positivos e Gr m-neg tivos se diferenci m dr
stic mente n org niz ção d s estrutur s extern s à membr n pl smátic .
PREPARO DO ESFREGAÇO
1. Coloque um got de solução s lin sobre um lâmin de microscopi . 2. Com p lito e
steriliz do, toque um colôni isol d e suspend n s lin .
3. Homogeneíze suspensão e esp lhe- sobre lâmin , de form obter um c m d hom
ogêne e pouco dens (esfreg ço). 4. Seque o m teri l o r e fixe levemente p ss nd
o r pid mente sobre ch m do bico de Bunsen.
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COLORAÇÃO
1. Cobrir tod lâmin com solução de crist l violet . 2. Agu rd r 1 minuto e desprez
r o cor nte n pi . 3. Cobrir lâmin com lugol (KI + I2). 4. Agu rd r 1 minuto
e desprez r o cor nte n pi . 5. Inclin r lâmin e gotej r álcool etílico 95% té qu
e não h j desprendimento de cor nte. 6. L v r lâmin r pid mente em águ corrente.
7. Cobrir com fucsin de Gr m. 8. Agu rd r 30 segundos. 9. L v r lâmin e sec r
com p pel (sem esfreg r).
3º. Di : 18/02/2009 Exercício 5: Ex me o Microscópio Inici lmente, foc lize com s ob
jetiv s de menor umento e depois coloque um got de óleo de cedro sobre o esfreg
ço e foc lize em imersão (o objeto é ument do 1000x). Observe o tipo de color ção (Gr m
+ ou Gr m -), form e o tipo de rr njo d s b ctéri s fornecid s. Ao término d ob
serv ção, limpe objetiv de imersão com p pel bsorvente.
RESPONDA
- Como se explic diferenç de color ção d s b ctéri s Gr m-positiv s e Gr mneg tiv s?
- O que conteceri com um b ctéri Gr m-positiv tr t d com lisozim (hidrolis
s lig ções entre çúc res d c m d de peptideoglic no, desest biliz ndo- )?
- Qu l utilid de prátic d color ção de Gr m p r o médico?
- Que outros elementos você pôde observ r no esfreg ço de mucos or l? 19
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EXPERIMENTOS DE GENÉTICA BACTERIANA 1º di : 04/03/09 Os experimentos deline dos se
guir demonstr m ocorrênci de lter ção genétic em um d s b ctéri s utiliz d s. O obje
tivo é determin r qu l b ctéri foi modific d e qu l(is) evento(s) genético(s) poderi
(m) explic r o result do obtido.
Amostr s b cteri n s utiliz d s e su s c r cterístic s relev ntes M rc s de Resistên
ci * Amostr A [E.coli J53 (pR1)] B [E. coli MA 3456] Ferment ção de l ctose l c + l
c
_
cromossômic s N l
pl smidi is Et, Clo, Ap -
* Et = estreptomicin , Clo = clor nfenicol, Ap = mpicilin , N I = ácido n lidíxico
As du s cultur s b cteri n s serão coloc d s em cont to, de cordo com s condições b
ixo: IEm um tubo de ens io dicione: - 1 ml de cultur em c ldo TSB d mostr
A - 1 ml de cultur em c ldo TSB d mostr B - 1 ml de c ldo TSB II Incube ess
mistur (M) bem como s cultur s p rent is (A e B) 37oC, dur nte 1 hor pelo
menos.
Experimento 1: Utiliz ndo p litos estéreis, semeie s mostr s A, B e mistur M
em pl c s contendo meio seletivo M cConkey (N l 50 μg/mL + Ap 50 μg/mL), de cordo c
om o esquem b ixo. P r controle de vi bilid de, semeie s mesm s cultur s no
meio de M cConkey sem drog s. Incube s pl c s 37 oC por 16-18 h. M B A
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2º DIA: 05/03/09 Leitur do experimento 1 I - Registre os result dos obtidos B ctéri
A B M II - Comp re s c r cterístic s d s colôni s crescid s e respond : - Quem é
b ctéri crescid n pl c com drog ? crescimento em meio sem drog crescimento em
meio com drog
- Neste momento, qu is s hipóteses possíveis p r explic r o ocorrido?
Experimento 2: Determine resistênci d s mostr s A, B e M (result nte d mistur
seme d em meio seletivo) p r s drog s Ácido N lidíxico (N l), Estreptomicin (E
t), Clor nfenicol (Co) e Ampicilin (Ap), utiliz ndo o seguinte protocolo: • com p
lito estéril, pegue lgum s colôni s crescid s n pl c com drog (M) e semeie em p
l c s de M cConkey contendo c d drog isol d mente, n s concentr ções de: N l = 50 µg
/ml, Ap = 50 µg/ml, Co = 30 µg/ml, Et = 20 µg/ml. • f ç o mesmo com s mostr s A e B. • I
cube s pl c s 37oC por 16-18h.
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3º DIA: 06/03/09 L2: I - F ç leitur do teste de resistênci , observ ndo presenç ou
usênci de crescimento b cteri no n s pl c s com drog . Observe t mbém c p cid de
de ferment ção d l ctose. Preench t bel b ixo: Crescimento n presenç de B ctéri
A B M - Em vist dos result dos obtidos, qu l d s hipóteses que você considerou n
teriormente seri m is viável p r explic r o ocorrido? Por quê? N l Et Clo Ap P d
rão de Resistênci Ferment ção de l ctose
- Como você poderi comprov r su hipótese utiliz ndo métodos molecul res?
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AGENTES ANTISSÉPTICOS Como exemplos de processos de ntissepsi serão utiliz dos nt
issépticos comerci is de uso corrente.
1º di : 04/03/09 EXPERIMENTO 1 A. ANTISSÉPTICO PARA ENXAGUE BUCAL Dividir um pl c
de ág r s ngue em três p rtes, m rc ndo t0, t1 e t2.
t0 t2
t1
Friccion r um cotonete estéril n mucos d bochech e seme r em t0, em ziguez gue
. Bochech r com p rte d solução fornecid por 1 min. Agu rd r 3 min e repetir col
et de m teri l, seme ndo em t1. Bochech r nov mente por 1 min, gu rd r 3 min e
seme r em t2. As pl c s serão incub d s 37o.C.
EXPERIMENTO 2 B. ANTISSÉPTICOS PARA USO NA PELE Umedecer um cotonete estéril em s li
n , esfreg r em um região do br ço, por ex., e seme r em um met de de pl c de ág r
nutriente.

b
Umedecer um segundo cotonete no nti-séptico distribuído, p ss r no outro br ço e gu
rd r 5 min. A seguir, umedecer um terceiro cotonete em s lin , p ss r n zon de
sinfet d e n outr met de d pl c . As pl c s serão incub d s 37oC.
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2º di : 05/03/09 LEITURA DOS EXPERIMENTOS SOBRE A AÇÃO DE ANTISSÉPTICOS F zer leitur
d s pl c s, not ndo o crescimento em cruzes (+ ++++).
Crescimento Antisséptico P r enx gue buc l Antisséptico Antisséptico 1 Antisséptico 2 A
ntisséptico 3 Antisséptico 4 Antisséptico 5 b t0 t1 t2
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ANTIBIOGRAMA
O ntibiogr m é o método utiliz do em l bor tório de nálises clínic s p r v li r o per
fil de susceptibilid de ntimicrobi nos de b ctéri s isol d s de processos infec
ciosos. Após process mento microbiológico do m teri l clínico colhido do p ciente (p/e
x. urin , secreções divers s - de orof ringe, v gin l, uretr l, etc., spir do brônqui
co, entre outros), (s) b ctéri (s) suspeit (s) isol d (s) freqüentemente deve(m) se
r submetid (s) à nálise de seu perfil de susceptibilid de p r que o médico poss ter
um orient ção sobre o tr t mento ntimicrobi no m is dequ do. A metodologi p r
re liz ção do ntibiogr m é p droniz d e deve ser execut d com rigor. No teste de d
ifusão Kirby-B uer, discos de p pel filtro impregn dos com ntimicrobi nos são depos
it dos sobre superfície do meio onde se inoculou um suspensão p droniz d do org
nismo ser test do. O ntimicrobi no se difunde no meio e, c so b ctéri prese
nte lgum susceptibilid de este ntimicrobi no, seu crescimento será inibido o
redor do disco. A medid do diâmetro d zon de inibição do crescimento é us d p r de
termin r susceptibilid de ou resistênci determin do ntimicrobi no, por comp
r ção com t bel s p droniz d s. O meio sólido Muller-Hinton é recomend do p r re liz ção d
ntibiogr m d m iori d s b ctéri s isol d s de espécimes clínicos. O experimento q
ue será re liz do em cl sse tem como objetivo re liz r e discutir técnic ; t nto o
s ntimicrobi nos como s b ctéri s que serão test d s for m escolhidos de modo il
ustr r os diferentes result dos que podem ser obtidos com est técnic . É import nte
s lient r que, n rotin de um l bor tório clínico, existem p râmetros p r escolh
dos discos de ntimicrobi nos, dependendo d espécie de b ctéri que foi isol d , d
o perfil de resistênci present do por est espécie n região e do tipo de infecção, espe
ci lmente no c so de infecções dquirid s no hospit l. Muit s v riáveis podem influir
n qu lid de e confi bilid de do teste e serão discutid s em cl sse.
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1º. Di 10/03/09 - Com uxílio de um pipet , retir r UMA GOTA d cultur b cteri n
fornecid e inocul r em solução s lin . ATENÇÂO: observ r turv ção d suspensão que deve
r semelh nte o p drão fornecido (∼108 b ctéri s/mL) - Mergulh r um su be estéril n sus
pensão prep r d , retir r o excesso de líquido comprimindo-o contr p rede intern
do tubo e seme r em tod superfície d pl c de Muller-Hinton, de form homogêne
em três direções. - Deix r pl c sec r e, com uxílio de um pinç , plic r os discos d
e ntibióticos sobre superfície seme d , de form equidist nte e m ntendo um distân
ci de
2 cm d s bord s. É conveniente m rc r com c net , n b se d pl c de P
etri, os loc is onde os discos serão coloc dos. Pressioná-los levemente, com pinç ,
pós plic ção. - Incub r s pl c s por 16-18 h.
2º. Di – 11/03/09
LEITURA DO ANTIBIOGRAMA
Re liz r leitur do ntibiogr m , medindo os diâmetros dos h los de inibição de cres
cimento em mm e determin ndo o perfil de resistênci com o uxílio d T bel p drão b
ixo.
h lo disco
mm
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T bel : Diâmetro de h los com diferentes gentes ntimicrobi nos Diâmetro m is próximo
(mm) Agente qu ntid de observ ções ntimicrobi no no disco Resistente Intermediário S
uscetível AMINOGLICOSÍDEOS Amic cin Gent micin Exceto p r enterococos lt mente r
esistentes 30 µg 10 µg <14 <12 15-16 13-14 >17 >15
C n micin Netilmicin Estreptomicin Tobr micin QUINOLONAS Ciproflox cin Enox
cin Lomeflox cin Ácido N lidíxico Norflox cin Oflox cin OUTROS Clor nfenicol Cl
ind micin Nitrofur ntoin Rif mpim Sulfon mid s Trimetoprim Trimetoprim/ sulf m
etox zol
30 µg 30 µg 10 µg 10 µg 5 µg 10 µg 10 µg 30 µg 10 µg 5 µg 30 µg 2 µg 300 µg 5 µg 300 µg 5 µ
<13 <12 <11 <12 <15 <14 <18 <13 <12 <12 <12 <14 <14 <16 <12 <10 <10
14-17 13-14 12-14 13-14 16-20 15-17 19-21 14-18 13-15 13-15 13-17 15-20 15-16 17
-19 13-16 11-15 11-15
>18 >15 >15 >15 >21 >18 >22 >19 >16 >16 >18 >21 >17 >20 >17 >16 >16
Preencher o qu dro b ixo com os result dos obtidos: B ctéri P drão de Resistênci
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18/05/2009
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
Nest ul , serão discutidos lguns métodos empreg dos n identific ção de b ctéri s p togê
ic s p r o hospedeiro hum no.
EXPERIMENTO 1. Você recebeu du s pl c s de Ag r M cConkey e du s pl c s de Ag r s
ngue, c d um del s contendo um mistur de b ctéri s distint s (mistur s A e B).
P r identific r s b ctéri s contid s ness s mistur s: 1. Observe s pl c s seme
d s com mistur A e respond : - Houve crescimento n pl c de M cConkey? Qu l
o signific do desse ch do?
- Houve crescimento n pl c de Ag r S ngue? Qu is s c r cterístic s d s colôni s c
rescid s ness pl c ?
2. Observe s pl c s seme d s com mistur B e respond : - Houve crescimento n
pl c de M cConkey? Que lter ções você observ n s colôni s crescid s neste meio? Qu l
o signific do desse ch do? Anote os result dos n t bel d Págin 4.
- Houve crescimento n pl c de Ag r S ngue? Que lter ções você observ n s colôni s cr
escid s neste meio?
EXPERIMENTO 2.
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Selecione um colôni de c d tipo d pl c de Ag r S ngue d mistur A e f ç o ens
io de c t l se conforme descrito seguir.
PROVA DA CATALASE 1. Com o uxílio de p lito esteriliz do, toque um colôni e mistu
re- um got de H2O2 10 V n superfície de um lâmin de microscópio. 2. Obs.: Qu n
do colôni é obtid de um pl c de Ag r S ngue, é essenci l que o meio de cultur não
sej removido d superfície, pois hemáci s contêm c t l se. 3. A produção de bolh s de gás
indic tiv de teste positivo. A c t l se c t lis seguinte re ção: 2 H2 O2 → 2 H2O +
O2
Anote os result dos n t bel d Págin 3. EXPERIMENTO 3. P r s colôni s que pres
ent rem result do positivo p r prov de c t l se, re liz r prov d co gul
se. PROVA DA COAGULASE Selecione du s colôni s d pl c de Ag r S ngue, que tenh m
d do result do positivo n prov d c t l se. Com uxílio de p litos esteriliz do
s, homogeneíze s du s colôni s em um mesmo tubo contendo 0,5 ml de pl sm de coelho
. O outro tubo servirá como um controle neg tivo d prov de co gul se. Incline su
vemente os tubos, gir ndo-o sem git r. Identifique-os e os entregue o profess
or, que irá incubá-los 37°C té o di seguinte (ou, no mínimo, por 4 hor s). EXPERIMENTO
4. Com o uxílio do fio esteriliz do, selecione um colôni de c d tipo d pl c d
e M cConkey seme d com mistur B e inocule c d um del s nos meios EPM e MiL
i, conforme explic ção do professor, p r re liz ção de prov s bioquímic s. Os tubos s
erão incub dos 37ºC por 24 hor s. 19/05/2009
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Leitur do EXPERIMENTO 3 (PROVA DA COAGULASE) Proced à leitur inclin ndo o tubo
p r os l dos, procur ndo detect r form ção de um coágulo. Anote os result dos obser
v dos n t bel b ixo e consulte o esquem de identific ção (Págin 5) p r determin
r o gênero e espécie b cteri nos. IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS A PARTIR DE Á
AR SANGUE SEMEADAS COM A MISTURA A Colôni 1 2 Tipo de Hemólise C t l se Co gul se I
dentific ção
Leitur do EXPERIMENTO 4 (PROVAS BIOQUÍMICAS) P r identific r s mostr s b cteri
n s Gr m-neg tiv s contid s n pl c de M cConkey, proced à leitur dos ens ios
bioquímicos re liz dos, de cordo com t bel nex (Págin 5). Registre os result
dos n t bel b ixo. Conclu su identific ção e comp re com os result dos de outr
s b ctéri s fornecid s e com os meios de EPM e MiLi não inocul dos.
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS A PARTIR DE ÁGAR M cCONKEY SEMEADA COM MISTURA
B Colôni 1 2 M c Conkey EPM Ferm. L c Gás H2S Ure se LTD MiLi Mot. Indol Lisin Id
entific ção
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Esquem p r identific ção de lgum s b ctéri s p togênic s e não-p togênic s
B cilos Gr m -
Prov s Bioquímic s
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