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artigo técnico

Controle de Carga Microbiana


em Salas Limpas - Avaliação do uso de
PetrifilmTM – 3M para controle de superfícies e operadores

Siomara Christina Veronezi Curtale*

O controle da carga microbiana é feito por uma ou


Introdução mais técnicas abaixo:
Amostrando-se ar ambiental por meio de amostra-
A preparação asséptica de produtos farmacêuticos, dores de ar (técnica de impactação),
especialmente destinados à nutrição parenteral e pro- Exposição de placas de petri com ágar padrão (téc-
dutos estéreis em geral (colírios, soros e imunoterapia) nica de sedimentação)
pressupõe a manipulação dos princípios ativos em áreas Amostragem da superfície de pontos críticos através
controladas, comumente denominadas “Salas Limpas”. de aplicação direta de placas especiais com ágar padrão
Além destes ambientes especiais, o uso de material e posicionadas em locais estratégicos (técnica de contato
instrumentos esterilizados, matérias primas qualificadas ou RODAC)
e pré-esterilizadas, manipuladores treinados e paramen- Inoculando-se em placas ou caldos padrão material
tados adequadamente, o extremo rigor na garantia das coletado do ambiente com swabs.
condições ambientais durante a preparação e envase A somatória dos resultados obtidos destas diferentes
destes produtos é prática obrigatória. estratégias de monitoramento deve assegurar que a
Esta condição especial de fabricação está presente não carga microbiana total esteja dentro das especificações
somente nas indústrias farmacêuticas, mas também em preconizadas para cada ambiente classificado, especifi-
farmácias de manipulação que se enquadram no grupo cações bem definidas em compêndios farmacopéicos.
IV – manipulação de estéreis, segundo a nova RDC 214 Considerando-se a crescente busca por otimização de
(ANVISA, 12/12/06). rotinas, minimizando ao máximo as rotinas preparató-
Nas farmácias de manipulação de estéreis, as Salas rias para as análises microbiológicas em geral, métodos
Limpas classe 100 instaladas dentro de ambientes classe que garantam a eficácia do monitoramento micro-
1000, garantem a manipulação segura do medicamento biológico de forma prática e eficiente, envolvendo o
graças ao sistema de constante renovação e filtragem do mínimo possível de preparação e manuseio são sempre
ar, diferencial de pressão nas portas, manipulação sob flu- desejáveis.
xos laminares, uso de paramentos adequados completos Este panorama aponta para a utilização de meios de
e estéreis (calças, bata, capuz, luvas, botas e máscaras) e cultura industrializados e prontos para uso, já plaquea-
rigoroso monitoramento periódico da carga microbiana dos, com longa validade e qualidade garantida.
do ambiente através de amostragem do ar interior, de PetrifilmTM é uma moderna alternativa para análises
superfícies em contato direto com o produto e de mani- microbiológicas desenvolvida pela 3M e mundialmen-
puladores (mãos e uniformes). te utilizada para a enumeração geral ou específica de
Este controle rigoroso assegura as Boas Práticas de microorganismos. Graças ao seu design, é considerado
Manipulação e confere segurança ao processo de manipu- um sistema pronto para uso.
lação e por conseqüência ao medicamento preparado. Entre as características mais marcantes do PetrifilmTM
destaca-se o uso de meios de cultura farmacopéicos
* Bióloga pelo Mackenzie, especialização padrões solúveis a frio, distribuídos e liofilizados em fil-
em microbiologia pelo Instituto Adolfo Lutz mes plásticos, o que confere longo período de validade
ao produto e permite a substituição de tubos e placas de
contato: sbcc@sbcc.com.br petri e suas etapas convencionais de preparação, esterili-
zação e plaqueamento do meio de cultura previamente
ao uso. A incorporação de corantes indicadores e revela- em uma área delimitada de 30 cm² onde a geleificação
dores específicos para atividade microbiana ao meio de do meio ocorrerá.
cultura facilita a leitura e interpretação dos resultados Este procedimento deve ser realizado pelo menos 1 hora
do PetrifilmTM, permitindo inclusive documentar foto- antes da utilização, podendo os PetrifilmTM ser armazena-
graficamente para arquivos futuros. dos sob refrigeração por períodos de até 1 semana.
A proposta do PetrifilmTM é permitir recuperar e No momento da amostragem de superfícies e opera-
replicar microrganismos recuperados de ambientes, ar, dores a controlar, o filme superior deve ser levantado
soluções e suspensões em geral, fornecendo-se nutrien- suavemente, aplicando-se o gel formado diretamente
tes e condições ideais para a formação e visualização das sobre a superfície ou luvas, uniformes dos operado-
colônias, da mesma maneira que o método tradicional res com uma leve pressão para favorecer o contato.
utilizando placas de petri. Aguardar alguns segundos e retirar suavemente o filme,
PetrifilmTM se aplica às diversas rotinas de análise selando-o novamente e procedendo à incubação na
microbiológica, incluindo amostragem de superfícies, temperatura ideal definida.
controle de higiene e limpeza, amostragem de ar por No presente estudo foram utilizados dois tipos de
sedimentação ou associado à técnicas de coleta por PetrifilmTM,, o modelo AC para contagem de aeróbios
swabs. Estas características sugeriram sua avaliação para totais preparado com ágar padrão PCA (PetrifilmTM-
controle de carga microbiana em Salas Limpas e ambien- AC), e o modelo YM para contagem de bolores e levedu-
tes controlados. ras preparado com ágar Sabouraud suplementado com
antibióticos (PetrifilmTM-YM). Para os dois modelos de
PetrifilmTM- adotou-se uma área de amostragem de 30
Objetivos cm² e incubação a 35°C durante 48 hs.
Verificar a viabilidade do uso de placas PetrifilmTM
parâmetros Aeróbios Totais (PetrifilmTM – AC) e Bolores
e Leveduras (PetrifilmTM YM) para monitoramento
Placas para contato (RODAC) com meio TSA
ambiental de superfícies e controle de higiene de ope- As placas para amostragem por contato foram adqui-
radores, comprovando que esta metodologia apresenta ridas no mercado local, já prontas para uso no modelo
resultados tão confiáveis e eficazes quanto os apresenta- RODAC (Replicated Organisms Detection and Counting)
dos pelo método tradicional de amostragem com placas contendo meio de cultura TSA. A área de amostragem
de contato (RODAC). destas placas corresponde a 20 cm².

Material e Métodos Microrganismos testes


Para o estudo foram utilizadas cepas de dois micror-
PetrifilmTM ganismos desafio: C.albicans e P. aeruginosa.
As placas de PetrifilmTM são compostas por dois filmes: Estes microrganismos foram cultivados no laboratório
a) Um filme superior em polipropileno, recoberto de controle de qualidade da Farmoterápica, e a par-
internamente com um adesivo que contém indicador tir de cultivos recentes foram preparadas suspensões
e géis hidrossolúveis a frio. Este filme é permeável ao ar, microbianas contendo aproximadamente 100 células
fornecendo oxigenação suficiente durante a incubação. para desafiar os produtos e avaliar sua capacidade de
b) Um filme inferior em papel quadriculado revestido recuperação tanto por inoculação direta (detecção
por polietileno, recoberto por nutrientes e géis hidros- de baixas concentrações de microrganismos) e indire-
solúveis. ta (% de recuperação de microrganismos inoculados
Previamente à amostragem de controle microbioló- em superfícies) através do contato com as placas
gico ambiental, os PetrifilmTM necessários devem ser e PetrifilmTM.
hidratados com 1 mL de diluente apropriado, neste
estudo adotando-se o uso de Caldo Letheen para inati-
vação de conservantes e agentes de sanitização utiliza-
Parâmetros avaliados
dos na rotina de limpeza. Teste Qualitativo – Sensibilidade de detecção de bai-
Aplica-se 1 mL do diluente no centro do filme inferior xas cargas de microrganismos:
quadriculado, abaixa-se suavemente o filme superior Foram avaliados um total de 30 placas de RODAC-
evitando-se a retenção de bolhas de ar e aplica-se o TSA, 30 placas de PetrifilmTM-AC e 30 de PetrifilmTM-
difusor sobre o filme com uma leve pressão durante YM, divididas em grupos de 10 placas avaliadas simulta-
alguns segundos permitindo assim a difusão do líquido neamente em 3 dias diferentes. O controle das diluições
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desafio foi realizado semeando-se em profundidade as 24/48hs. Após período de incubação foi realizada a con-
diluições de microrganismos em meio TSA para estabe- tagem do número de microrganismos recuperados.
lecimento da concentração de células aplicada às placas Os resultados estão registrados na tabela abaixo.
nos diferentes dias de testes. Para o Cálculo da porcentagem de recuperação foi
Com auxilio de uma micropipeta ou alça estéril foram utilizada a fórmula:
inoculadas 10 placas de RODAC, 10 placas de PetrifilmTM- (C X D)
Rec% = petr/RODAC x100
AC e 10 de PetrifilmTM-YM a partir de diluições realiza- (CL X D)
das de suspensões microbianas preparadas no dia do Onde:
teste e ajustadas para conterem aproximadamente 100 Rec % – Recuperação de microrganismos em porcen-
UFC/10 µL. P. aeruginosa foi aplicada ao RODAC-TSA e tagem
ao PetrifilmTM AC, enquanto que C. albicans foi aplica- CI – Crescimento dos inóculos dos microrganismos no
da ao RODAC-TSA e PetrifilmTM YM. As placas foram meio TSA controle
incubadas a 35°C por 24/48hs. Após este período de CPET/RODAC – Crescimento dos microrganismos no
incubação, foram anotados os resultados das leituras PetrifilmTM ou RODAC
obtidas em todas as placas verificando se todas as placas D – Fator de Diluição
foram capazes de detectar os inóculos aplicados (avalia-
ção qualitativa). Após realização das contagens das placas para cada
uma das diluições, os resultados foram analisados quan-
Teste Quantitativo - Capacidade de recuperação de to à especificação de recuperação maior que 70% e
microrganismos inoculados em superfícies-teste: reprodutibilidade nas duplicatas.
Foram preparadas 10 placas de RODAC-TSA, 10 placas
de Petrifilm AC e 10 de Petrifilm YM, amostrando-se
diretamente superfícies-teste previamente inoculadas
Resultados
com microrganismos desafio C. albicans e P. aeruginosa.
Com auxílio de uma micropipeta ou alça estéril, foi
Testes qualitativos
retirado 10µL da diluição de microrganismos contendo Tanto as placas RODAC quanto o PetrifilmTM AC e YM
cerca de 100 células e inoculado em áreas delimitadas de foram capazes de detectarem inóculos da ordem de 100
superfícies de inox previamente esterilizadas e na palma células em todas as replicatas de placas e filmes adesivos
de luvas cirúrgicas de látex natural estéreis. O volume nos três dias diferentes de teste, garantindo assim a capa-
de inóculo foi espalhado suavemente por uma área de cidade promotora de crescimento nos dois métodos.
aproximadamente 20 a 30 cm² destas superfícies aguar-
dando-se completa secagem do campo. O teste foi reali-
Testes quantitativos
zado em duplicata para cada metodologia, e controlada As tabelas abaixo apresentam os resultados obti-
a concentração do inoculo aplicado. dos com microrganismos inoculados em superfície
As placas de RODAC-TSA e PetrifilmTM AC ou YM de inox e palmas de luvas e suas respectivas recupe-
foram aplicadas às áreas durante 10 segundos, e após rações com amostragem por RODAC e PetrifilmTM
amostragem as mesmas foram incubadas a 35°C por AC e YM.

Tabela 1: Resultados obtidos nos testes de inoculação e recruperação de microrganismos em superfície de Inox
Teste Quantitativo – Inox
Microrganismos Inóculo Contagens Rodac Contagens PetrifilmTM AC Contagens PetrifilmTM YM % Rec. Rodac % Rec. Petri Film
P. aeroginosa 130 UFC/10ul 53 UFC/20 cm2 110 ufc/30cm2 – 41 % 84 %
P. aeroginosa 130 UFC/10ul 35 UFC/20 cm2 96 ufc/30cm2 – 27 % 74 %
Média 130 UFC/10ul 44 UFC/20 cm2 103 ufc/30cm2 – 34% 79 %
C. albicans 81 UFC/10ul 52 UFC/20 cm2 – 74 ufc/30cm2 64 % 91 %
C. albicans 81 UFC/10ul 44 UFC/20 cm2 – 60 ufc/30cm2 54 % 74 %
Média 81 UFC/10ul 48 UFC/20 cm2 – 67 ufc/30cm2 59 % 82,50 %

Tabela 2: Resultados obtidos nos testes de inoculação e recruperação de microrganismos em palmas de luvas de latex
Teste Quantitativo – Luva
Microrganismos Inóculo Contagens Rodac Contagens PetrifilmTM AC Contagens PetrifilmTM YM % Rec. Rodac % Rec. Petri Film
P. aeroginosa 130 UFC/10ul 35 UFC/20 cm2 106 ufc/30 cm2 – 27 % 82 %
P. aeroginosa 130 UFC/10ul 30 UFC/20 cm2 92 ufc/30 cm2 – 23% 71 %
Média 130 UFC/10ul 33 UFC/20 cm2 99 ufc/30 cm2 – 25% 76 %
C. albicans 81 UFC/10ul 42 UFC/20 cm2 – 60 ufc/30cm2 51 % 74 %
C. albicans 81 UFC/10ul 22 UFC/20 cm2 – 56 ufc/30cm2 27 % 69 %
Média 81 UFC/10ul 32 UFC/20 cm2 – 58 ufc/30cm2 39 % 72 %
Resultados de % de Recuperação Média do Rodac X Petrifilm
em superfície de Inox e Luvas inoculadas com P.aeruginosa e C. albicans

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%
% Recuperação Média Petrifilminox
20%
% Recuperação Média RODACinox

10% % Recuperação Média Petrifilm Luvas

0% % Recuperação Média RODAC Luvas

Gráfico de recuperação nos testes muito abaixo da especificação necessária para que o
quantitativos método possa ser considerado validado.
Embora a área de amostragem do PetrifilmTM seja de
O gráfico acima representa a % média de recuperação 30 cm², contra os 20 cm² do RODAC, a diferença obser-
dos microrganismos inoculados em diferentes tipos vada foi marcante, não sendo passível de justificativa
de superfícies (inox e palmas de luvas de látex), comu- por esta diferença.
mente objetos de amostragem para controle de carga As duplicatas de cada método mostraram-se satisfa-
microbiana em ambientes classificados. tórias, sendo os dois métodos considerados precisos.
Conclui-se com estes resultados dos testes qualitati-
vos (Grow Promotion) e quantitativos, que o método
Discussão e Conclusão de amostragem em superfícies com PetrifilmTM AC e
Foram realizados testes qualitativos e quantitativos YM foi tão eficaz quanto em placas RODAC-TSA, sendo
do PetrifilmTM AC e YM em comparação com o método a recuperação de microrganismos mais segura, mais
referência utilizando placas RODAC-TSA. prática e mais confiável.
Os testes qualitativos demonstraram que houve cres- O uso de meios de cultura diferenciados à base de
cimento em todas as placas PetrifilmTM AC e YM em ágar padrão e Agar Sabouraud melhoram a discrimi-
todos os dias de testes realizados, assim como em todas nação de possíveis agentes de contaminação ambien-
as Placas de RODAC-TSA analisadas. Estes resultados tal pesquisando-se bactérias e leveduras, permitindo
representaram que as duas metodologias possuem decisão mais fácil quanto à escolha de sanitizantes
sensibilidade para detectar baixas concentrações de adequados e ações de limpeza mais efetivas em função
microrganismos, e a fertilidade dos meios é satisfatória. dos resultados.
No teste quantitativo representado no gráfico verifi- Aliando-se a alta performance do método às vanta-
cou-se que a porcentagem de recuperação de micror- gens já apresentadas quanto à praticidade no uso, longo
ganismos das Placas PetrifilmTM AC e YM está acima de período de validade, mínimo espaço para estocagem
70% tanto para superfícies de inox, quanto para as luvas geração de resíduos no descarte, PetrifilmTM pode ser
de látex, e para os dois microrganismos teste utilizados. uma alternativa de otimização das rotinas de amostra-
Já a recuperação de microrganismos com as placas gem para controle de carga microbiana em ambientes
RODAC-TSA foram sistematicamente inferiores a 70%, controlados u