A fixação biológica de nitrogênio como suporte

para a produção de energia renovável

 

Diego Mureb QuesadaI; Cátia FradeI; Alexander ResendeI; José

Carlos PolidoroI; Verônica Massena ReisI; Robert BoddeyI; Bruno
José Rodrigues AlvesI; Segundo UrquiagaI; Deise XavierII

I
EMBRAPA Agrobiologia, Cx. Postal 74.505, Seropédica 23851-970, RJ,
Brasil
II
Embrapa Gado de Leite Juiz de Fora 36038.330, MG, Brasil

RESUMO

A fixação biológica de nitrogênio é um grande suporte para se conseguir

altas produções no campo, aliada a um equilíbrio com o meio ambiente e
a racionalização dos custos . A importância da FBN se faz ainda maior
nos casos de culturas produtoras de biomassa como fontes alternativas
de energia, onde se torna necessário que o balanço energético (maior
energia produzida que a consumida na produção de biomassa) seja
altamente positivo. As pesquisas tem demonstrado que a chave para o
sucesso do processo de FBN está numa seleção de genótipos e de
bactérias diazotróficas que se associem mais eficientemente. É
necessário portanto o estudo mais detalhado sobre a população de
bactérias diazotróficas durante o ciclo de crescimento da planta em
estudo.
Com este intuito, um estudo está sendo feito no campo para se
selecionar genótipos de Pennisetum purpureum que sejam eficientes em
produção de biomassa em solos pobres em N. No primeiro estágio,
selecionou-se quatro genótipos (Gramafante, Cameroon, BAG 02 e
Roxo) que se destacaram em produção ao longo de cinco anos, sem a
aplicação de N-fertilizante. Estes foram para o campo para
experimentação complementar, em solo também deficiente em
nitrogênio para avaliação de biomassa e FBN. Resultados promissores
estão sendo alcançados, com os materiais produzindo muito bem sem
aplicação de N-fertilizante (estatisticamente igual ao equivalente a
100kg N/ha) e com um percentual de FBN bem satisfatório para uma
gramínea forrageira, da ordem de 30%

Palavras-chave: Biomassa, Bactéria Diazotrófica, Energia, Fixação

Biológica de Nitrogênio e Pennisetum purpureum,
ABSTRACT

Recently, rapid-growing grasses which possess the C4 photosynthetic

pathway such as Miscanthus and Pennisetum spp. have been considered
as prime candidates for the production of bio-fuels. In the case of
Pennisetum purpureum (Elephant grass) and related hybrids, the
genotypes studied until now have generally been selected for high
production of forage for cattle under high N fertiliser additions. For
forage production it is desirable that the tissues have high protein
content. However, for biomass production the priority should be for
carbon accumulation and the highest possible biomass production per
unit of applied fertiliser. The manufacture of N fertiliser involves a very
high cost in terms of fossil energy, and if large additions are made the
grass biomass produced may have only a little more (or even less)
calorific value than that utilised in the manufacture of the fertiliser. This
completely negates the prime objective of biofuel production which the
replacement of energy derived from non-renewable fossil sources with
that derived from solar radiation.
Recently the team headed by Dr Johanna Döbereiner at Embrapa
Agrobiologia have shown that several tropical grasses (including sugar
cane and elephant grass) are able to obtain significant quantities of N
through the action of associated endophytic N2-fixing bacteria. Derived
from this line of reasoning a study is being conducted in the field to
select appropriate genotypes of Pennisetum purpureum which are
efficient is biomass production in soil of very low N fertility. In the first
stage four genotypes have been selected : Gramafante, Cameroon, BAG
02 and Roxo, which have been the most productive over a 5 year period
without N fertiliser addition. A complementary study is underway to
evaluate biomass production and quantify the N2 fixation input.
Preliminary results are promising and show that these materials produce
well without N fertiliser application a with a contribution of
approximately 30 % of plant N derived from N2-fixing, which can be
regarded as very satisfactory for a graminaceous specie.

INTRODUÇÃO

A produção de material energético alternativo através de biomassa

representa hoje um dos grandes desafios para a ciência, já que a
continuação da queima desenfreada de petróleo, que além de ser finita ,
contribui para o efeito estufa que ameaça o equilíbrio do clima da terra.
Como a queima de biomassa somente recicla CO2 que foi retirado da
atmosfera pela fotossíntese, tudo indica que a longo prazo esta será a
alternativa energética mais segura.
Qualquer bio-combustível para ter a sua produção viável, não somente
precisa ser economicamente compatível mas necessita principalmente de
tecnologias que garantam a sua produção com balanços energéticos
altamente positivos, isto é, produzir pelo menos três vezes mais energia
que a gasta para a produção e processamento dos materiais vegetais a
serem utilizados. Na Europa e EUA, a elevada mecanização da
agricultura e o consumo de níveis elevados de fertilizantes,
principalmente nitrogenados, não permitem que este balanço seja
alcançado. Contrário a isto, no Brasil há ainda muito mais uso de mão de
obra manual e devido a falta de subsídios de fertilizantes, os adubos
nitrogenados são usados normalmente em doses menores que um
quinto do aplicado nos países desenvolvidos. Além disso vários genótipos
de culturas em nosso país, como cana de açúcar, adquiriram mais
facilidades de se associarem com bactérias fixadoras de nitrogênio e
assim obtém grande parte do N necessário através da fixação biológica
de nitrogênio, o qual pode estar associado com a alta capacidade
fotossintética, taxa de crescimento, eficiência do uso de água e
intercepção da luz das espécies tropicais. O capim elefante (Pennisetum
purpureum Schum.), está entre as espécies de alta eficiência
fotossintética, resultando numa grande capacidade de acumulação de
matéria seca, tendo sido a forrageira mais utilizada em sistemas semi-
intensivos de produção de leite. Nas últimas décadas, tem havido
crescente interesse no uso desta forrageira sob pastejo, principalmente
para vacas de lactação. Entretanto, devemos considerar que por se
tratar de uma forrageira de alta produção, suas necessidades de
nutrientes relacionam-se com seu potencial produtivo. Levando-se em
conta que dentre os fertilizantes utilizados na agricultura, são os
nitrogenados aqueles que mais oneram os custos com adubação, tem-se
enfatizado a necessidade de uma maior exploração do potencial da
fixação biológica de nitrogênio em gramíneas tropicais.

Devido a estes fatos, o Brasil assumiu a liderança na pesquisa sobre

produção de gramíneas com níveis de adubação nitrogenada muito
abaixo das necessidades das plantas sendo com isto energeticamente e
ecologicamente mais indicados para alternativas bioenergéticas. A
pesquisa tem demonstrado que a chave para o sucesso do processo de
fixação biológica de N2 (FBN) na agricultura, está numa seleção de
genótipos e de bactérias que se associem mais eficientemente. Várias
espécies de bactérias fixadoras de N2 como Beijerinckia, Bacillus,
Azotobacter, Derxia, Enterobacter e Azospirillum foram isoladas do solo
e da rizosfera de cana-de-açúcar e outras gramíneas [1], [2], [3], [4],
[5], [6], [7], [8]. Três espécies já identificadas foram chamadas de
endófitas (habitam o interior de plantas), são elas: Acetobacter
diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae e H. rubrisubalbicans [9],
[10], [11]. A. diazotrophicus também foi isolado de plantios de cana-de-
açúcar em outros países como Cuba, México[12] e Austrália [13], [14].
Já para Herbaspirillum spp., os trabalhos de isolamento se referem
apenas aos plantios no Brasil. O grupo do CNPAB estuda a associação
destas bactérias com a cana-de-açúcar e os resultados mostraram que
A. diazotrophicus possuí um modo de infecção passivo, isto é, utiliza
aberturas naturais ou provocadas pelo crescimento ou injúrias para
colonizar a planta. O modo de transmissão mais eficiente é via toletes
usados para propagação e portanto somente foi isolado de plantas
propagadas vegetativamente [15]. Já Herbaspirillum seropedicae foi
isolado de diversas gramíneas e possivelmente usa a semente para sua
transmissão [16]. Essas associações permitem que a cana-de-açúcar
apresente produções acima de l50t por ha plantada em solos pobres e
sem nenhuma adubação nitrogenada, acumulando mais que 200kg N ha-
1
através da associação com estas bactérias [17]. Espera-se que no
capim elefante sejam encontrados resultados semelhantes

Pouca informação se tem a cerca de bactérias colonizando gramíneas de

alta produção de biomassa como Pennisetum, e ha uma grande
necessidade de entender se os organismos presentes neste vegetal se
comportam de forma semelhante aos resultados encontrados na cana-
de-açúcar e usar esta oportunidade para a seleção de fontes energéticas
mais eficientes.

Pesquisas com vários capins forrageiros mostraram também

possibilidades semelhantes cobrindo até 40% da suas necessidades de N
através da associação com bactérias fixadoras de N2 [18], [19]. Como
até então, o melhoramento de capins sempre visou finalidades
forrageiras que necessitam teores elevados de proteína e baixos níveis
de fibra para ter boa qualidade como alimento animal, a mudança no
rumo da seleção ou melhoramento de genótipos para fontes
bioenergéticas se faz necessária. Neste caso, há a necessidade de um
elevado teor de celulose sem necessariamente conter altos teores de
proteína. Neste sentido a redução ou eliminação completa do adubo
nitrogenado na produção de biomassa além de aumentar o balanço
energético, ainda reduz os custos de produção apresentando ainda
melhores possibilidades. Tudo isto, vislumbra a possibilidade do uso de
capim elefante como fonte de energia renovável

Os objetivos do presente trabalho são o de selecionar genótipos de

Pennisetum purpureum Schum., que apresentem elevadas produções
quando adubados com adequados níveis de nutrientes (PK e
micronutrientes) mas sem a aplicação de N e selecionar genótipos de
Pennisetum purpureum Schum. para alta fixação biológica de nitrogênio.

MATERIAL E MÉTODOS

Os estudos estão sendo realizados através de três experimentos.

Experimento 1

Este experimento teve início em 1995, onde foram utilizados 14

genótipos de Pennisetum purpureum e 1 variedade de cana de açúcar
selvagem (Krakataú, com alta eficiência para FBN) para se avaliar a
contribuição da Fixação Biológica de Nitrogênio nos mesmos, através da
técnica de diluição isotópica de 15N. Os genótipos são cultivados em
cilindros de concreto (50 cm de prof. e 60 cm de profundidade),
preenchidos com solo PVA série Itaguaí e marcados com 15N, em
espaçamento 100 x 50cm O experimento vem sendo realizado na
EMBRAPA-AGROBIOLOGIA, sendo utilizado o delineamento de blocos ao
acaso, com sete repetições, e cortes periódicos estão sendo feitos para
se avaliar matéria seca, N-total e enriquecimento em 15N.

Experimento 2

Este experimento tem por objetivo identificar bactérias fixadoras de N2

que colonizam raízes, folhas e colmos de capim elefante do experimento
1, pelo método do número mais provável (NMP).

Experimento 3

Neste experimento que está em desenvolvimento no campo, está se

avaliando a produção de matéria seca e a FBN em quatro genótipos de
Pennisetum purpureum, através da técnica de abundância natural de
15N , selecionados no experimento 1 e cultivados em solo muito pobre
em N ( planossolo ) na área experimental da EMBRAPA-AGROBIOLOGIA.
Os tratamentos são testemunha (sem aplicação de N) e aplicando-se
100 Kg de N/ha na forma de Uréia. Os quatro genótipos são
Gramafante, Cameroon, BAG 02 e Roxo, sendo sua instalação em
outubro de 1999 e a primeira colheita realizada em maio de 2000. As
parcelas são constituídas de 5 linhas de 5 x 0,5m e o delineamento é o
de blocos ao acaso com quatro repetições.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com relação a produção de matéria seca no experimento com cilindros

( experimento 1 ), a medida que os anos passam alguns genótipos se
destacam em relação aos demais. Como este experimento não recebe
adubação nitrogenada, isto vem comprovar que alguns genótipos são
mais eficientes no uso do N do solo ou que os mesmos genótipos podem
estar recebendo outra fonte de N diferente do solo, e neste caso só
poderia ser via fixação biológica de nitrogênio. Assim, com o conteúdo
de nitrogênio do solo caindo ao longo dos anos, os genótipos que
utilizam somente nitrogênio do mesmo caem de rendimento e os que
são mais eficientes no uso do N, e/ou possuem outra via de nutrição
nitrogenada mantém ou até mesmo melhoram seus rendimentos. Estes
resultados se encontram na tabela 1. Observa-se que os rendimentos
variaram muito com o ano agrícola, mas o interessante é que no ano de
1999, cinco anos após o estabelecimento da cultura e sem aplicação de
N-fertilizante, alguns genótipos como Gramafante e Cameroon se
destacaram, produzindo de 50 até 80 t/ha de matéria seca, indicando
um alto potencial destes materiais para uso na produção de biomassa, e
com um balanço energético muito positivo pois não se tem usado N-
fertilizante

As análises de enriquecimento em 15N nos genótipos de Pennisetum no

ano de 1995, e consequentemente o percentual de contribuição da FBN
nos genótipos estudados, levam a comprovação do que foi dito
anteriormente. Os genótipos que mais se destacaram em relação a
massa seca, também tiveram destaque quando se trata da contribuição
da FBN, não diferindo estatisticamente dos genótipos que tiveram
contribuições pouco maiores. Os resultados podem ser vistos na tabela
2.

Para se ter uma maior precisão nos resultados, se faz necessário que
análises de enriquecimento em 15N sejam feitas nas colheitas seguintes,
uma vez que a medida que os anos passam os genótipos mais
promissores começam a se destacar. Estas análises estão sendo feitas
na EMBRAPA-AGROBIOLOGIA, por espectrometria de massas. Com base
nestes resultados, foram selecionados os genótipos para a implantação
do experimento 3

No experimento três, quatro genótipos de capim elefante estão sendo

estudados em solo deficiente em nitrogênio e submetidos a dois
tratamentos de N. Um onde se aduba o equivalenta a 100 kg de
nitrogênio por hectare, na forma de uréia, e outro onde as parcelas não
recebem N-fertilizante (testemunha), para se saber se ocorre diferenças
em relação a produção de biomassa e nitrogênio acumulado na parte
aérea. Através da técnica de abundância natural de 15N, também se
obtém o valor do delta para os quatro genótipos e o percentual de
nitrogênio da planta oriundo da fixação biológica de nitrogênio nestes
genótipos. Para se calcular a FBN por esta técnica, é necessário que se
tenha uma testemunha não fixadora, que neste caso foi o genótipo
Roxo, pois obteve um valor de Delta equivalente ao do solo

Apesar de não ter havido diferença significativa para nenhum dos

parâmetros analizados,é de se ressaltar que os genótipos foram capazes
de produzir até 100t/ha de biomassa, acumulando somente 40 kg N/ha,
o que é mais um indicativo da capacidade de produção destes materiais,
associada a sua elevada capacidade fotossintética, taxa de crescimento e
eficiência no uso da luz. O genótipo Roxo teve um rendimento abaixo
dos demais, o que já era esperado, pois os demais foram selecionados
pela alta capacidade de produção de biomassa observada no
experimento 1. Também não houve diferença estatística quando se
compara o tratamento que recebeu N-fertilizante com a testemunha,
para nenhum dos quatro genótipos, sendo um bom indicativo de
contribuição da FBN. Para se ter uma conclusão mais concisa, é
necessário que mais colheitas sejam feitas ao longo do tempo para se
saber quais genótipos se destacarão. Em se tratando de uma gramínea
forrageira, os resultados encontrados para a fixação biológica de
nitrogênio são bem satisfatórios e promissores

 
 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem. ao IPT, e especialmente a FINEP pelo apoio

financeiro

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1]DÖBEREINER, J. Nitrogen fixing bacteria of the genus Beijerinckia

Derx in the rhizosphere of sugar cane. Plant and Soil 15: 211-216, 1961.

[2]ARIAS, O.E.; GATTI, I.M.; SILVA, D.M.; RUSCHEL, A.P. & VOSE, P.B.
Primeiras observações al microscópio eletrónico de bactérias fijadoras de
N2 en la raíz de la canã de azícar (Saccharum officinarum L.) Turrialba
28: 203-207, 1978.

[3]HEGAZI, N.A.; EID, M.; FARAG, R.S. & MONIB, M. Asymbiotic N2-
fixation in the rhizosphere of sugar cane planted under semi-arid
conditions of Egypt. Rev. Ecol. Biol. Soil 16: 23-37, 1979.

[4]PURCHASE, B.S. Nitrogen fixation associated with sugarcane. Proc.

South Africa Sugar Technology Association. June, 173-176, 1980.

[5]GRACIOLI, L.A. & RUSCHEL, A.P. Microorganisms in the phyllosphere

and rhizosphere of sugar cane. In: Associative N2-fixation. Vose, P.B. &
Ruschel, A.P. eds. CRC Press. Boca Ratoon vol II 91-101, 1981.

[6]GRACIOLLI, L.A.; FREITAS, J.R. & RUSCHEL, A.P. Bactérias fixadoras

de nitrogênio nas raízes, colmos e folhas de cana-de-açúcar (Saccharum
sp.). Revista de Microbiologia, . São Paulo, v. 14, p. 191-196, 1983.

[7]RENNIE, R.J.; FREITAS, J.R.; RUSCHEL, A.P. & VOSE, P.B. Isolation
and identification of N2-fixing bacteria associated with sugar cane
(Saccharum sp.). Canadian Journal of Microbiology, Otawa. v.28, p. 462-
467, 1982.
[8]SELDIN, L.; ELSAS, J.D. & PENIDO, E.G.C. Bacillus azotofixans sp.
nov. a nitrogen-fixing species from Brazilian soils and grass roots. Int. J.
Syst. Bacteriol. 34: 451-456, 1984.

[9]BALDANI, J.I.; BALDANI, V.L.D.; SELDIN, L. & DÖBEREINER, J.

Characterization of Herbaspirillum seropedicae gen. nov.; sp. nov., a
root-associated nitrogen-fixing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 86-
93, 1986.

[10]CAVALCANTE, V.A. & DöBEREINER, J. A new acid tolerant nitrogen-

fixing bacterium associated with sugarcane. Plant and Soil, Dordrecht. v.
108, p. 23-31, 1988

[11]GILLIS, M.: DÖBEREINER, J.; POT, B.; GOR, M.; FALSEN E.; HOSTE,
B.; REINHOLD, B. & KERSTERS, K. Taxonomic relationship between
(Pseudomonas) rubrisubalbicans, some clinical isolates (EF group 1),
Herbaspirillum seropedicae and ( Aquaspirillum) autotrophicum. In:
Polinelli, M. Materassi, R. and Vicenzini, M. eds. Nitrogen Fixation.
Kluwer Academic Publish. p. 292-294, 1991.

[12]FUENTES-RAMIREZ, L.E.; JIMENEZ-SALGADO, T.; ABASCA-OCAMPO,

I.R. & CABALLERO-MELLADO, J. Acetobacter diazotrophicus, a
indoleacetic acid producing bacterium isolated from sugarcane cultivars
of México. Plant and Soil, Dordrecht, v. 154, p. 145-150, 1993.

[13]LI, R. & MACRAE, I.C. Specific association of diazotrophic

Acetobacters with sugarcane. Soil Biology and Biochemistry, Oxford.
v.23, p. 999-1002, 1991.

[14]LI,R. & MACRAE, I.C. Specific identification and enumeration of

Acetobacter diazotrophicus in sugarcane. Soil Biology and Biochemistry.,
Oxford. v. 24, p. 413-419, 1992.

[15]REIS, V.M. Estudos de infecção e métodos de detecção da bactéria

endófita Acetobacter diazotrophicus em associação com a cana-de-
açúcar. Rio de Janeiro, UFRRJ, Tese de Doutorado, 213 p., 1994.

[16]OLIVARES et al., Occurrence of the endophitic diazotrophs

Herbaspirillum spp. in roots, stems and leaves predominantily of
Gramineae. Biol. Fert. of Soils. , 1995.

[17]URQUIAGA, S.; CRUZ, K.H.S.; BODDEY, R.M. Contribution of

nitrogen fixation to sugar cane: Nitrogen-15 and Nitrogen-balance
estimates. Soil Science Society of America Journal, Madison, v. 56, p.
105-114, 1992.

[18]BODDEY, R.M.; VITORIA, R.L. Estimation of biological nitrogen

fixation associated with Brachiaria and Paspalum grasses using 15N
labeled organic matter and fertilizer. Plant and Soil, Dordrecht, v. 90, p.
265-292, 1986.
[19]MIRANDA, C.H.B.; URQUIAGA, S. & BODDEY, R.M. Selection of
ecotypes of Panicum maximum for associated biological nitrogen fixation
using the 15N isotope dilution technique. Soil Biol. Biochem. 22: 657-663,
1990.