UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA PRÓ-REITORIA

DE PESQUISA
COORDENAÇÃO GERAL DE PROGRAMAS ACADÊMICOS E DE
INICIAÇÃO CIENTÍFICA

PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

PIBIC/PIBITI/PIBIC-AF/PIVIC/PIVITI

Título do projeto:

CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS DO INDOL-3-CARBINOL E DO

SEU METABÓLITO 3,3’-DIINDOLILMETANO NA FUNÇÃO
ERÉTIL E NO CORPO CAVERNOSO ISOLADO DE RATO

Título do plano:

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO 3,3’-DIINDOLILMETANO NO

CORPO CAVERNOSO ISOLADO DE RATO

Prof. Dra. Islania Giselia Albuquerque Gonçalves

Departamento de Ciências Farmacêuticas/Centro de Ciências da Saúde

Rafaelly Lins de Lima Santos

Farmácia/Centro de Ciências da Saúde

João Pessoa, 24 de julho de 2020

TÍTULO DO PLANO DE TRABALHO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO 3,3’-DIINDOLILMETANO NO CORPO CAVERNOSO
ISOLADO DE RATO

1. RESUMO

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito relaxante do metabólito secundário
3,3’- diindolilmetano (DIM) na função erétil de ratos, através de metodologias in vitro. Foram
utilizados segmentos de corpos cavernosos previamente retirados de ratos Wistar e que foram
montados verticalmente através de hastes metálicas e colocados em cubas para órgãos isolados
mantidos em solução de Krebs-Ringer, 37ºC, com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) e
uma tensão de repouso de 0,50 g. Foi observado nos experimentos, que após contração induzida
por fenilefrina (FEN) (10 µM), o DIM (1 pM – 1 mM) induziu relaxamento dependente de
concentração em corpos cavernosos isolados de rato (Emax = 78,8 ± 6,8%), sugerindo que o DIM
pode promover benefícios na função erétil. Além disso, foi investigada a participação da enzima
óxido nítrico sintase (NOS), onde foi utilizado o L-NAME, um inibidor não específico da
enzima. O tratamento prévio do corpo cavernoso com L-NAME (300 µM) atenuou a resposta
relaxante do DIM (1 pM – 1 mM), com redução do seu efeito máximo (Emax = 35,40 ± 4,11%,).
Esse resultado sugere que o DIM produz o seu efeito relaxante, em parte, por ativação da NOS.
A ativação desta enzima leva a produção de óxido nítrico (NO) que atua ativando a ciclase de
guanilil sóluvel (CGs) e leva a ativação de eventos intracelulares no músculo liso das artérias
dos corpos cavernosos, promovendo o seu relaxamento. Também foi investigado o papel da
CGs no efeito relaxante induzido pelo DIM, onde foi usado um inibidor irreversível da enzima,
o ODQ. Foi observado que na presença de ODQ, a resposta relaxante induzida pelo DIM foi
significativamente atenuada com redução do efeito máximo (42,93 ± 4,04 %), sugerindo a
participação da CGs no efeito relaxante induzido pelo DIM. Desta forma, os resultados
demonstram, pelo menos em parte, que o DIM induz efeito relaxante em corpo cavernoso,
podendo apresentar benefícios sobre a disfunção erétil.

2. Palavras-chave: Disfunção erétil. Óxido nítrico. Crucíferos

3. Title:
EVALUATION OF THE EFFECTS OF 3,3'-DIINDOLYLMETHANE IN CORPUS
CAVERNOSUM ISOLATED OF RATS

4. Abstract:
This study aimed to evaluate the relaxing effect of the secondary metabolite 3,3'-
diindolylmethane (DIM) on the erectile function of rats, through in vitro methodologies.
Cavernous corpus segments previously removed from Wistar rats were used, which were
assembled vertically through metal rods and placed in vats for isolated organs kept in Krebs-
Ringer's solution, 37ºC, with a carbogenic mixture (95% O2 and 5% CO2) and a resting tension
of 0.50 g. It was observed in the experiments, that after phenylephrine-induced contraction
(FEN) (10 µM), the DIM (1 pM - 1 mM) induced concentration-dependent relaxation in isolated
rat cavernous corpus (Emax = 78.8 ± 6.8%), suggesting that DIM may promote benefits in
erectile function. In addition, the participation of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) was
investigated, where L-NAME was used, a non-specific inhibitor of the enzym. The previous
treatment of the corpora cavernosa with L-NAME (300 µM) attenuated the relaxing response of
the DIM (1 pM - 1 mM), with a reduction in its maximum effect (Emax = 35.40 ± 4.11%,). This
result suggests that DIM produces its relaxing effect, in part, by activating NOS. The activation
of this enzyme leads to the production of nitric oxide (NO) that acts by activating the soluble
guanylil cyclase (GCs), and leads to the activation of intracellular events in the smooth muscle
of the arteries of the corpora cavernosa, promoting its relaxation. The role of CGs in the
relaxing effect induced by DIM was also investigated, using an irreversible enzyme inhibitor,
ODQ. It was observed that in the presence of ODQ, the relaxing response induced by DIM was
significantly attenuated with a reduction in the maximum effect (42.93 ± 4.04%), suggesting the
participation of CGs in the relaxing effect induced by DIM. In this way, the results demonstrate,
at least in part, that DIM induces a relaxing effect in the corpora cavernosa and may have
benefits on erectile dysfunction.

5. Keywords: Erectile dysfunction. Nitric Oxide. Cruciferous.

6. Introdução

O pênis é formado pelos corpos cavernosos e pelo corpo esponjoso, sendo circundados
pela túnica albugínea que é formada por uma bainha fibrosa (KIRKHAM, 2012). O orgão tem
inervação autonômica e somática partindo dos neurônios da medula espinhal e dos gânglios
periféricos, os nervos simpático e parassimpático se juntam para formar os nervos cavernosos,
que entram nos corpos cavernosos e no corpo esponjoso, ocasionando os eventos
neurovasculares durante a etumescência (ereção) e a detumescência (flacidez) (DEAN & LUE,
2005).
A ereção peniana é descrita como a capacidade do homem de manter o pênis
rígido de forma suficiente com o objetivo de alcançar uma relação sexual satisfatória (JUNG et
al., 2014). Esse processo é iniciado através do sistema nervoso parassimpático, onde sua
ativação leva a diminuição de noradrenalina dos nervos adrenérgicos do pênis. Dessa forma, a
excitação está associada à redução desse neurotransmissor, além da liberação de óxido nítrico
(NO) e a redução do tônus muscular (ANDERSSON & STIEF, 2000).
Mecanismos neurogênicos, psicogênicos e hormonais estão envolvidos na
ereção peniana, onde NO é considerado o fator mais importante para o relaxamento do músculo
liso nos corpos cavernosos. Esse gás é liberado pelo endotélio e neurônios no tecido peniano
onde se liga ao grupo heme da GCs aumentando a produção de monofosfato de guanosina
cíclico (cGMP), que por sua vez ativa a proteína cinase G. O cGMP junto com a proteína G
regula a sinalização intracelular, levando o relaxamento do músculo liso nos corpos cavernosos
e a ereção peniana (MUSICKI et al., 2016).
Na função erétil normal os fatores contratantes e relaxantes estão em equilíbrio,
porém, na disfunção erétil (DE) pode haver mudanças na neurotransmissão, na propagação de
impulsos nervosos e transdução intracelular, etapas importantes para a ocorrência da ereção
peninana (ANDERSSON, 2011). A DE é definida como a incapacidade de alcançar uma ereção
para uma relação sexual satisfatória (NIH, 1993). Além disso, o estresse oxidativo é um fator
contribuinte para o desenvolvimento da DE, observando-se a formação de espécies reativas de
oxigênio, reduzindo a disponibilidade de NO para os processos de relaxamento e contribuindo
para o dano oxidativo em biomoléculas (TREBATICKÝ et al., 2019). A DE é uma desordem
clínica multifatorial que tem maior prevalência em homens com mais de 40 anos. Além das
principais causas da disfunção erétil, como a diabetes mellitus e a hipertensão, vários outros
fatores comuns do estilo de vida como obesidade e a carência de exercício físico e problemas no
trato urinário inferior, podem levar ao desenvolvimento da DE (SHAMLOUL & GHANEM,
2013).
O tratamento para DE é baseado em terapias medicamentosas e não medicamentosas.
No tratamento medicamentoso, destacam-se os inibidores da fosfodiosterase tipo 5 (iPDE),
considerados tratamento de primeira linha, como a sildenafila, tadalafila e vardenalifa. Eles
atuam aumentando o fluxo sanguíneo para a região dos corpos cavernosos e, dessa forma,
melhorando a etumescência (MOBLEY et al; 2016). Porém, essa classe medicamentosa
desencadeia efeitos adversos graves como dor de cabeça, rubor e disepsia (REW &
HEIDELBAUGH, 2016).
Muitos produtos naturais têm mostrado benefícios para o tratamento de doenças
(XIE, 2015). Tal como os vegetais, que são uma fonte valiosa de diversos metabolitos
secundários, e dentro da diversidade de vegetais, destacam-se os do gênero crucíferos
(ABELLAN et al, 2019). O DIM é um metabolito obtido a partir do indol-3-carbinol (I3C),
encontrado em vegetais crucíferos (LEE et al., 2017). O DIM demonstra atividades
antioxidantes e antineoplásicas (WU et al., 2011; LUO et al., 2018). Desta maneira, devido a
sua atividade antioxidante, o estudo teve como objetivo pesquisar o potencial terapêutico do
DIM para tratamento da DE, avaliando o efeito relaxante do mesmo em corpo cavernoso isolado
de rato e o mecanismo envolvido.

7. Procedimentos metodológicos

7.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos (Rattus novergicus) com 12 semanas de

nascidos, pesando entre 250 e 300 g, provenientes da Unidade de Produção Animal (UPA) do
Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM) da UFPB. Estes animais foram
mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 1°C), em um ciclo claro-escuro de 12
horas (6 – 18 horas) com livre acesso à água e alimentação (Nuvilab). O projeto foi submetido e
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal da Paraíba
(CEUA-UFPB) com número de protocolo: 3237100418.

7.2 Obtenção e preparação do DIM

O DIM foi adquirido da empresa Sigma-Aldrich (Cat#D9568). A substância foi

solubilizada em cremophor®. Em seguida, foi diluído antes dos experimentos em água destilada
para obtenção das concentrações desejadas. As concentrações de cremophor® em solução não
excederam 0,03%, nesta concentração o solubilizante apresenta ausência de efeito biológico
(dados não demonstrados).

7.3 Substâncias utilizadas

Para a execução dos protocolos experimentais, foram utilizadas as seguintes

substâncias: Cloridrato de xilazina e cloridrato de cetamina, obtidos da Syntec do Brasil Ltda
(Santana de Parnaíba-SP, Brazil). Cloridrato de L(-) fenilefrina (FEN), L-Nω-nitro-arginina-
metil-éster (L-NAME), 1H-[1,2,4] oxadiazole [4,3,a] quinoxalin-1-ona (ODQ), todos obtidos da
Sigma-Aldrich Brasil Ltda (São Paulo-SP, Brasil). Todas as substâncias foram diluídas em água
destilada, exceto ODQ que foi diluído em DMSO.

7.4 Soluções fisiológicas

Para os experimentos com corpo cavernoso foi utilizada a solução de Krebs-Ringer,

que foi preparada a partir das seguintes substâncias: cloreto de sódio (NaCl 118,0 mM), cloreto
de potássio (KCl 4,7 mM), cloreto de cálcio (CaCl2 2,5 mM), sulfato de magnésio (MgSO4 1,17
mM), bicarbonato de sódio (NaHCO3 25,0 mM), fosfato de potássio monobásico (KH2PO4 1,2
mM) e glicose (C6H12O6 5,6 mM) (CLAUDINO et al., 2010), todos provenientes da VETEC
(Rio de Janeiro,RJ, Brasil).

7.5 Preparação do corpo cavernoso isolado de rato

Os animais foram eutanasiados e o pênis foi retirado, e imediatamente colocado em solução de

Krebs-Ringer para remoção do tecido conjuntivo. Posteriormente, o corpo cavernoso foi
separado em dois segmentos. Em seguida, foram montados verticalmente através de hastes
metálicas e colocados em cubas para órgãos isolados, preenchidos com solução nutritiva (10
mL) e gaseificado com mistura carbogênica. As tiras foram esticadas e suspensas em um
transdutor de força, com tensão de repouso de 0,50 grama-força, deixando em equilíbrio por 60
minutos antes de iniciar o experimento (LEITE et al; 2017). Além disso, a solução foi trocada a
cada 15 minutos para evitar a intervenção de metabólitos indesejáveis (ITALIANO; CALABRO;
PAGANO, 1994). As alterações de tensão foram medidas usando transdutores isométricos
(MLT020, ADInstruments,Sydney, Nova Gales do Sul, Austrália) e registradas em sistema
PowerLab™ de aquisição de dados (ML870/P, LabChart versão 7.0, ADInstruments, Sydney,
Novas Gales do Sul, Austrália).

7.6 Protocolos experimentais de corpo cavernoso isolado de rato

Logo após o período de estabilização, os corpos cavernosos foram pré-contraídos com

FEN (10 μM), um agonista α1-adrenérgico, tendo como objetivo avaliar a viabilidade e
integridade dos corpos cavernosos (CHRIST et al., 1992). Os tecidos que apresentaram
contração igual ou superior a 0,30 g foram considerados apropriados e utilizados no estudo, já
os tecidos com contrações inferiores a 0,30 g foram desprezados.

7.7 Avaliação do efeito relaxante do DIM em corpo cavernoso isolado de rato pré-
contraído com FEN

Os corpos cavernosos foram preparados como descrito anteriormente no item 2.5. Após
passado o período de estabilização do tecido, foi realizada a contração do tecido utilizando FEN
(10 μM). Foram adicionadas ao banho de órgãos concentrações do DIM (10-12 - 10-3) de maneira
crescente e cumulativa, e observado o seu possível efeito relaxante.

7.8 Avaliação da participação da via NOS no efeito relaxante do DIM em corpo cavernoso
isolado de rato pré-contraído com FEN

Como as principais vias de relaxamento do corpo cavernoso depende da ação do NO, foi
investigada a participação da via NOS-CGS. Após o período de estabilização, as preparações
foram expostas a L-NAME (300 µM), um inibidor não seletivo da enzima NOS (Óxido Nítrico
Sintade) (WOODE et al., 2013) ou ODQ (10 µM), um inibidor da GCs (FRIEBE et al., 2003;
GARTHWAITE, et al., 1995). Os inibidores foram adicionados 30 minutos antes da aplicação
de FEN (10 μM). No platô de contração, curvas concentração-resposta foram realizadas
adicionando de maneira cumulativa o DIM (1 pM – 1 mM) aos orgãos até que fosse observada
uma resposta máxima do platô.

7.9 Análise estatística

Os dados foram representados como média ± erro padrão da média (e.p.m.). As curvas
de concentração-resposta foram consideradas em valores de pD2, calculados a partir da
regressão não linear das respostas adquiridas. As diferenças estatisticas foram determinadas pelo
teste t de student. Os resultados foram avaliados utilizando o programa Graph Pad Prism®
versão 7.00. Para todos os experimentos, valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente
significativo.

8. Resultados e discussões

A DE causa um impacto significativo na qualidade de vida dos homens, onde estima-se

que 322 milhões de homens em todo mundo serão afetados pela doença (KESSLER et al, 2019).
Desta forma, o estudo teve como objetivo investigar os efeitos do DIM em corpo cavernoso
isolado de rato, bem como a participação da NOS/CGs no efeito relaxante do composto a fim de
verificar prováveis benefícios sobre a DE. O principal achado deste estudo foi que o DIM
induziu relaxamento ativando, pelo menos em parte, a via do NO. O DIM é um importante
metabolito do I3C, obtido a partir de vegetais da família Brassicaceae, como brócolis, couve e
couve de Bruxelas (ROGAN, 2006). Esse metabolito possui atividades como, reparos de danos
no DNA, antiagiogênicos, antitumorais, antivirais, apoptóticas e controle do metabolismo
hormonal (AKSU et al, 2016). Além disso, o DIM também exerce atividade antioxidante
(FUENTES; PAREDES-GONZALEZ; KONG, 2015).
Nas preparações de corpo cavernoso, pré contraídas com FEN (10 μM) e adicionadas
concentrações crescentes e cumulativas do DIM (1 pM – 1 mM) observou relaxamento
dependente de concentração (Emax = 78,8 ± 6,8%). O tempo necessário para obter as respostas
máximas nas respectivas concentrações variou de 5 a 10 minutos. Dessa forma, o DIM
apresentou efeito relaxante no corpo cavernoso isolado de rato promovendo uma possível ação
benéfica sobre a DE.
O NO é um mediador fisiológico essencial para que ocorra a ereção peniana. Sendo
formado a partir do aminoácido L-arginina devido ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS)
(ALDERTON, 2011; BARASSI et al, 2017). Dessa forma, foi investigado a participação da
enzima NOS no efeito relaxante induzido pelo DIM, onde foi utilizado o L-NAME, inibidor da
NOS (SIMKO et al, 2018). Foi realizada uma curva concentração resposta na presença do L-
NAME (300 μM) e observado que a resposta relaxante do DIM (1pM – 1mM) foi atenuada com
redução do efeito máximo (Emax = 35,40 ± 4,11%), sugerindo que DIM produz o seu efeito
relaxante em preparações de corpos cavernosos, em parte, através da ativação da NOS,
produzindo o NO que agiria ativando a guanilil ciclase soluvél desencadeando eventos
intracelulares no músculo liso das trabéculas e artérias dos corpos cavernosos, promovendo
relaxamento (GHALAYINI; 2004).
Além disso, para investigar o papel da GCs, no efeito relaxante induzido pelo DIM, foi
realizado o tratamento das preparações de corpo cavernoso com ODQ (10 µM), um inibidor
irreversível da guanilil ciclase solúvel (SCHRAMMEL et al., 1996). Foi observado que na
presença de ODQ, a resposta relaxante induzida pelo DIM foi significativamente atenuada com
redução do efeito máximo (42,93 ± 4,04 %), sugerindo a participação da guanilil ciclase solúvel
no efeito relaxante induzido pelo DIM.

9. Conclusões

Foi demonstrado pelo presente estudo que o DIM induziu relaxamento em corpo
cavernoso isolado de rato, evidenciando o seu efeito pró erétil in vitro. Contudo, na presença
dos inibidores L-NAME e ODQ o efeito relaxante do DIM foi inibido, mostrando-se que,
possivelmente, o mecanismo de ação do composto envolve, pelo menos em parte, a ativação da
via NOS/GCs. Desta forma, o estudo demonstra que o DIM induz efeito relaxante podendo
apresentar benefícios sobre a disfunção erétil. Este estudo demonstra pela primeira vez na
literatura o efeito do DIM sobre corpo cavernoso isolado de rato.

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