Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 1

Nova tecnologia
no combate ao
Entrevista
“mal da vaca louca”
Metodologia detecta proteínas na ração e evita a contaminação de animais
Entrevista concedida a
Maria Fernanda Diniz

mal da vaca louca, conhecido cientificamente como

BSE (sigla em inglês para encefalopatia
espongiforme bovina), afeta o cérebro do animal,
provocando descontrole motor. As células morrem
e o cérebro fica com a aparência de uma esponja.
A vaca passa a agir como se estivesse enlouquecida, o que explica
o fato de ser conhecida popularmente como mal da vaca louca.
Não há tratamento conhecido para essa doença, que já foi
detectada em cerca de 20 países da Europa, atingindo mais de 180
mil cabeças de gado. Ao contrário da maior parte das enfermida-
des, o mal da vaca louca não é transmitido por fungos, vírus ou
bactérias, e sim por proteínas específicas denominadas prions.
Essa doença nunca foi detectada no Brasil e a sua entrada, certamente,
resultaria em um desastre para o país, que tem na pecuária um de seus
principais alicerces econômicos, representando ganhos de mais de R$ 55
bilhões por ano. Sem falar que o rebanho brasileiro é hoje maior do que a
soma dos rebanhos da Argentina, Paraguai e Uruguai. Diante da necessidade
urgente de conter a sua disseminação, a Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (Embrapa), por meio de uma de suas 40 unidades de pesquisa,
a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, localizada em Brasília, DF,
desenvolveu um método para detecção de proteínas de origem animal em
rações destinadas a mamíferos, especialmente ruminantes, que tem como
objetivo monitorar a qualidade do alimento e evitar a transmissão de doenças
causadas por substâncias infecciosas, tais como prions transmissores de
encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE), principalmente o mal da
vaca louca.
O método, desenvolvido pela equipe do pesquisador Carlos Bloch Jr há
cerca de três anos, cuja patente foi depositada pela Embrapa em 2002, utiliza
aparelhos de última geração denominados espectrômetros de massa, para a
detecção das proteínas. Para se ter uma idéia do grau de modernidade e de
eficiência desses aparelhos, eles possuem tecnologia comparável à que está
sendo usada pelos robôs Spirit e Opportunity nas pesquisas que estão sendo
feitas pela NASA no Planeta Marte, para a detecção de outros tipos de
moléculas. De acordo com o pesquisador, esses aparelhos são hipersensíveis,
com um limite de detecção altíssimo, de uma parte por milhão, ou seja, se
fizermos uma comparação com uma balança na qual fossem colocadas um
milhão de pessoas, o espectrômetro de massa seria capaz de detectar a ausência
de apenas uma delas.

2 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

 Para falar sobre essa metodolo-
gia e a sua importância para a pesqui-
sa agropecuária brasileira, a revista
Biotecnologia, Ciência & Desen-
volvimento entrevistou o pesquisa-
dor da Embrapa Recursos Genéticos
e Biotecnologia, Carlos Bloch Jr. Du-
rante a entrevista, ele falou sobre o
método desenvolvido por sua equi-
pe e das vantagens que representa
sobre os outros métodos utilizados
até o momento, além dos rumos
dessas pesquisas para o futuro.
BC&D – Em que consiste o
método utilizado pela Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnolo-
gia e há quanto tempo foi desen-
volvido?
Bloch – O método começou a
ser desenvolvido pela nossa equipe
há cerca de três anos, foi aperfeiçoa-
do ao longo de 2001 e em 2002 foi
depositada a patente. O objetivo
desse método é avaliar a qualidade
das rações destinadas a ruminantes
e, assim, evitar a transmissão de
TSE’s (encefalopatias espongiformes
transmissíveis), especialmente a
encefalopatia espongiforme bovina
(BSE), pela detecção de proteínas de
origem animal, em particular daque-
las provenientes de restos de carca-
ças de animais abatidos que pudes-
sem ser misturados à ração. O
desenvolvimento dessa metodologia
compreende três etapas: a primeira e
mais trabalhosa é a extração do ma-
terial protéico para separá-lo, princi-
palmente de lipídeos e dos carboi-
dratos. Em seguida, cada amostra
pode ser analisada em dois tipos de
espectrômetros de massa simultane-
amente, o primeiro analisa em pou-
cos minutos a presença de moléculas
de proteína animal, como a mioglo-
bina, cadeias alfa e beta da hemoglo-
bina e proteínas plasmáticas, para
dizer se existe ou não algum indício
de contaminação. O segundo analisa
e quantifica os seus fragmentos
(peptídeos) derivados de moléculas
inteiras de contaminantes, que po-
dem se formar a partir do ataque de
microrganismos e/ou da ação mecâ-
nica durante o processo de fabrica-
ção. A terceira etapa é a interpreta-
ção dos dados para determinar os
níveis de contaminação e a sua ori-
gem, ou seja, se as moléculas conta-
minantes encontradas eram proveni-
entes de bovinos, suínos, eqüinos,
ovinos, aves, peixes, etc.
“O grande avanço propiciado
por essa metodologia é o fato
de poder detectar as proteínas
inteiras ou fragmentos delas
com uma precisão de uma
parte por milhão (PPM).”
BC&D – Qual é a vantagem da
espectrometria de massa sobre
os outros métodos utilizados para
o controle dessas doenças?
Bloch – A espectrometria de
massa é um método muito mais sen-
sível, rápido e seguro para se diag-
nosticar a presença desse tipo de
molécula. Não é à toa que você
encontra espectrômetros de massa
espalhados por locais e em ativida-
des que até bem pouco tempo atrás
não se poderia imaginar. Só para
citar alguns exemplos, encontram-se
hoje espectrômetros de massa nos
aeroportos, nos correios, nos espor-
tes, nos tanques e aviões de guerra,
sem falar nas missões espaciais. São
esses equipamentos que produzem,
com mais rapidez e eficiência, res-
postas sobre a presença ou não de
explosivos, material de guerra quí-
mica ou biológica. Atualmente, são
utilizados três métodos para monitorar
a qualidade dos alimentos dos rumi-
nantes: o primeiro é o de microscopia
ótica, que se baseia na procura de
fragmentos de pele, ossos etc. na
ração; o segundo é o método ELISA,
que utiliza anticorpos para detectar
as proteínas alvo; e o terceiro e mais
novo é o método PCR, que detecta o
DNA das proteínas por meio de um
primer (um tipo de gene marcador).
Todos esses métodos apresentam li-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
mitações da mesma natureza, ou seja,
não detectam diretamente a presen-
ça de proteína. O primeiro, e mais
utilizado ainda hoje na União Euro-
péia é também o mais falho de todos,
já que a microscopia ótica não permi-
te a detecção de proteínas. O méto-
do ELISA tem como fator limitante o
fato de utilizar anticorpos específicos
para determinadas classes de proteí-
nas, o que impede a identificação de
outros grupos; e o terceiro, o de PCR,
esbarra no problema do DNA ser
fragmentado depois do processo de
industrialização, tornando difícil a
sua amplificação para a análise. Logo,
a espectrometria de massa aparece
como o método mais preciso para a
detecção direta e não indireta de
proteínas. O grande avanço propici-
ado por essa metodologia é o fato de
poder detectar as proteínas inteiras
ou fragmentos delas com uma preci-
são de uma parte por milhão (PPM).
O que isso significa? Se fizermos uma
analogia com uma balança na qual
são colocadas um milhão de pessoas,
o espectrômetro é capaz de detectar
a ausência de apenas uma delas. E os
níveis de detecção estão sendo me-
lhorados cada vez mais. Os últimos
espectrômetros lançados já têm po-
der de menos de uma parte por
milhão, ou seja, menos de uma pes-
soa, se continuarmos a seguir aquela
analogia, e tudo isso com muita rapi-
dez e eficiência automatizáveis. A
parte mais demorada desse processo
é a primeira etapa, na qual é feita a
extração do material a ser analisado.
Essa etapa pode demorar de 36 a 72
horas, mas é comum a todos os
outros métodos. Em suma, ao que
tudo indica, essa metodologia é o
que existe hoje de mais moderno e
seguro para monitorar a qualidade
dos alimentos oferecidos aos rumi-
nantes e, logo, controlar a dissemina-
ção das encefalopatias espongifor-
mes transmissíveis, ou TSE’s, como
são conhecidas.
BC&D – As TSE’ s , entre as
quais a mais nociva é a BSE
(encefalopatia espongiforme bo-
vina), ou mal da vaca louca, re-
3
 presentam uma ameaça não ape-
nas para os animais como tam-
bém para os seres humanos.
Como se dá a contaminação e
qual o tratamento existente hoje
para essas doenças?
Bloch – As encefalopatias es-
pongiformes transmissíveis, ou TSE’s,
são doenças progressivas e letais que
afetam o sistema nervoso central e se
caracterizam por alterações anatômicas
localizadas no cérebro. Essas altera-
ções são um tipo de lesão histológica,
constituídas de vacúolos e depósitos
protéicos. As TSE’s podem resultar de
infecções espontâneas, transmissão
hereditária ou exposição a materiais
contaminados. As TSE’s incluem: a
BSE, conhecida popularmente como
“mal da vaca louca”; a scrapie, ou
paraplexia enzoótica dos ovinos, que
afeta ovinos e caprinos em muitos
países há mais de 200 anos; e a
doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD)
que afeta seres humanos, principal-
mente com mais de 50 anos de idade.
Essa doença tem distribuição mundi-
al, com incidência anual de aproxima-
damente um caso por milhão e ocorre
de três formas: esporádica (responsá-
vel por 85 a 90% dos casos). familiar
(associada a mutações genéticas, re-
presenta 5 a 10% dos casos) e
iatrogênica, ou seja, por contamina-
ção, (responsável por menos de 5%
dos casos). Logo, em humanos, a
chance de desenvolver a doença por
contaminação é de menos de 5%. Nos
outros 95% dos casos, a doença se
desenvolve naturalmente. Em ovinos
e bovinos, os principais sintomas são
agressividade e falta de coordenação
motora. Em humanos, os principais
sintomas são: mioclonia – contração
muscular brusca e breve – e demên-
cia. Não existe tratamento conhecido
para a BSE, portanto, a única forma de
combatê-la é evitando a contamina-
ção. Cerca de 125 casos foram
registrados no mundo em humanos,
segundo os Centros de Controle e
Prevenção de Doenças dos Estados
Unidos, e na Europa, aproximada-
mente 100 pessoas morreram em fun-
ção dessa doença. Mas, para os ani-
4 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
mais, a situação é bem mais séria,
visto que já foi detectada em mais de
20 países da Europa, atingindo mais
de 180 mil cabeças de gado.
BC&D – Então a BSE tem se
disseminado de forma rápida, es-
pecialmente na Europa. Como se
dá a contaminação?
Bloch – A natureza do agente
infeccioso da BSE, assim como das
outras TSE’s, é ainda motivo de
controvérsia. Acredita-se que as
partículas infecciosas responsáveis
pela BSE são predominantemente
proteínas específicas denominadas
prions, que são compostas, em qua-
se a sua totalidade, de uma
glicoproteína de conformação anor-
mal, que se prende à superfície
externa das células. Em outras
palavras, a teoria mais aceita hoje
afirma que o agente infeccioso,
prion, é derivado de uma proteína
da membrana celular, que sofre
uma mutação e forma um tipo inso-
lúvel e patogênico de prion. Ainda
hoje não está totalmente esclareci-
do o mecanismo pelo qual essa
proteína anormal produz as altera-
ções patológicas no cérebro dos
animais ou indivíduos afetados.
BC&D – Desde que foi diag-
nosticada pela primeira vez no
mundo, como se deu a evolução
da BSE ao longo dos anos?
Bloch – Os primeiros casos de
BSE foram diagnosticados no Reino
Unido, em 1986. No final de 1987,
o Departamento de Epidemiologia
do Laboratório Veterinário Central
daquele país concluiu que a disse-
minação da doença entre os bovi-
nos ocorria mediante o consumo de
farinha de carne e ossos, obtida a
partir de carcaças de animais conta-
minados e incorporada à ração ofe-
recida aos bovinos. Essa teoria foi
plenamente confirmada, já que a
proibição do uso daquele produto
na alimentação de ruminantes teve
efeito claro, resultando em redução
significativa no aparecimento de
novos casos de BSE. Foram levan-
tadas outras possibilidades de con-
taminação, como por exemplo, a
transmissão vertical da vaca para o
bezerro. Mas, o que se sabe de fato
é que a epidemia do “mal da vaca
louca” não teria acontecido se não
houvesse disseminação por meio
da farinha de carne e ossos. Diante
disso, pode-se dizer que se um
bovino contaminado for introduzi-
do num país ou região onde não
existe BSE, como é o caso do Brasil,
só poderá ocorrer uma epidemia se
a carcaça desse animal for utilizada
para produzir farinha destinada à
alimentação de ruminantes porque
isso gera um sistema de dissemina-
ção e amplificação do agente infec-
cioso na população animal. Após
o início da epidemia no Reino Uni-
do, surgiu a teoria de que os primei-
ros casos de BSE teriam resultado
da utilização de carcaças de ovinos
contaminados com scrapie na ali-
mentação de bovinos e que uma
mudança no processo industrial de
produção de farinha de carne e
ossos teria diminuído a probabili-
dade de inativação do agente infec-
cioso. Entretanto, foram surgindo
evidências de que a BSE e a scrapie
são doenças diferentes, embora per-
tencentes ao mesmo grupo. Uma
das evidências foi obtida a partir da
inoculação experimental de scrapie
em bovinos, que resultou em uma
doença diferente da BSE. Além
disso, a BSE mantém as suas carac-
terísticas durante toda a epidemia,
mesmo quando é transmitida a ou-
tra espécie animal, ao contrário da
scrapie. Sem falar que essa doença
não pode contaminar seres huma-
nos, como é o caso da BSE. Na
verdade, o ponto em comum entre
as TSE’s é a elevada resistência a
tratamentos físico-químicos de es-
terilização.
BC&D – Mas há indícios de
que a doença possa ter surgido
antes de 1986, não é verdade?
Bloch – Alguns relatórios téc-
nicos mais recentes indicam que os
casos de BSE diagnosticados a par-
tir de 1986 não teriam sido os pri-
meiros casos da doença que, prova-
velmente, já existia no Reino Unido
anteriormente. Alguns veterinários
britânicos alegam ter visto casos
semelhantes antes de 1986 que, na
época, foram diagnosticados como
doenças metabólicas comuns em
vacas de alta produção. Mas não há
comprovação científica sobre essas
evidências.
BC&D – Então a causa mais
provável para a transmissão da
BSE em bovinos está mesmo na
mudança no processo de fabrica-
ção de farinha de carne e ossos,
que tornou possível a reciclagem
do agente infeccioso?
Bloch – Essa, sem dúvida, é a
causa mais provável para a transmis-
são dessa doença, o que tem repre-
sentado um prejuízo para os produ-
tores em escala mundial, já que as
rações à base de farinha de osso,
sangue e carne vinham sendo larga-
mente recomendadas e usadas na
alimentação de animais, como uma
fonte de proteína, devido à presença
de aminoácidos essenciais, minerais
e vitamina B12. Além disso, essa
forma de aproveitamento é uma ma-
neira eficaz de reciclar os subprodutos
proveniente do abate, evitando cus-
tos econômicos e ambientais adicio-
nais. No entanto, como os materiais
à base de osso e carnes de animais
mamíferos presentes em dietas para
ruminantes foram considerados a pro-
vável causa da BSE em bovinos, o seu
uso foi proibido na Comunidade Eu-
ropéia, nos EUA e também no Brasil.
Diante das vantagens desse tipo de
alimentação para os bovinos, várias
têm sido as tentativas de cessar a
transmissão das TSE’s, em particular
da BSE. Alguns trabalhos têm sido
direcionados para a inativação das
partículas infecciosas, favorecendo,
assim, o aproveitamento dos resídu-
os do abate. Outros têm visado elimi-
nar a possibilidade da transmissão
pela detecção de proteínas animais
nas rações e a sua rejeição no caso de
teste positivo. Ambas as formas fa-
zem uso de procedimentos analíticos
para garantir a ausência de agentes
causadores das TSE’s na alimentação
animal. Dentre esses procedimentos,
estão os que eu já descrevi na ques-
tão anterior, ou seja, a microscopia
ótica, o método ELISA e as análises
de DNA por PCR. A complexidade e
especificidade das biomoléculas têm
dificultado em muito a aplicação das
técnicas freqüentemente utilizadas
para a identificação e caracterização
de compostos inorgânicos e orgâni-
cos nas rações. Esse fato vem moti-
vando o desenvolvimento de técni-
cas analíticas cada vez mais sofistica-
das e eficientes, com ênfase na pre-
cisão requerida pela moderna biotec-
nologia. Dessa forma, chegamos hoje
aos espectrômetros de massa que,
como eu também já mencionei antes,
são o que há de mais moderno e
preciso para a detecção de proteínas
nas rações de ruminantes.
BC&D – E quais são os passos
daqui pra frente, já existe alguma
parceria para repasse dessa
tecnologia à iniciativa privada?
Existe alguma demanda do gover-
no brasileiro para que essa
tecnologia se torne obrigatória,
de modo a evitar a entrada do
“mal da vaca louca” no Brasil?
Bloch – Creio firmemente que
antes de nos preocuparmos com
qualquer tipo de avanço tecnológi-
co e sua comercialização, como é o
caso desse método, devemos vê-lo
como uma ferramenta de trabalho.
Ela só poderá servir ao seu propó-
sito e alcançar sua plenitude de uso
se houver a visão clara do objetivo
final que queremos atingir. Ou seja,
se o nosso objetivo final for o lucro
imediato, puro e simples para satis-
fazer acionistas, balanças de paga-
mentos e manutenção dos mesmos
paradigmas de produção vigentes
há décadas, essa tecnologia terá um
impacto modesto e servirá somente
nos momentos de crise, como o que
estamos vivendo hoje, caso contrá-
rio cairá no esquecimento, como de
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
fato ela se encontrava, até o
surgimento da BSE nos Estados Uni-
dos. Contudo, se tomarmos a deci-
são de priorizar a vida, a qualidade
e a sanidade dos alimentos que
chegam às mesas dessa geração e
das próximas, essa tecnologia com
certeza será de grande utilidade,
não somente no processo de iden-
tificação de contaminantes intenci-
onais ou acidentais, mas poderá
didaticamente demonstrar interna-
mente e para o exterior que esse
país possui tecnologia de alto nível
para responder a problemas mun-
diais imediatos, bem como para
oferecer alternativas mais inteligen-
tes e com visão de perspectiva para
um setor tão importante como o do
agronegócio. No que diz respeito
aos aspectos legais dessa tecnologia,
ela já está patenteada e pronta para
ser licenciada à iniciativa privada.
Estamos aguardando propostas de
empresas interessadas em utilizá-
la. Quanto ao governo brasileiro, a
Embrapa e o Ministério da Agricul-
tura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA) estão em entendimento
para discutir a melhor forma de
implementá-la e, assim, dar um gran-
de passo para reduzir ainda mais a
possibilidade da presença de prote-
ínas animais nas rações. Provavel-
mente, será por meio de uma porta-
ria que obrigue as empresas a testa-
rem seus produtos. A nossa equipe
da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia tem plenas condições
de atender a essas demandas. Se-
rão necessárias apenas algumas
adaptações nos laboratórios de es-
pectrometria de massa, de forma a
torná-los mais aptos a prestar servi-
ços – visto que hoje são laboratóri-
os de pesquisa – além da contratação
de pessoal especializado. Nós já
atendemos a uma demanda do
MAPA para análise de 800 amostras
e, dessas, grande parte continha
proteínas animais. No final do mês
de fevereiro, teremos uma nova
reunião com a equipe do Ministério
para fechar essa questão.
___________________________________
O e-mail do Professor Carlos Bloch Júnior é:
cbloch@cenargen.embrapa.br
5
 Carta ao Leitor

Prezados Leitores,

Já está bem divulgado o problema do “mal da vaca

BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento
KL3 Publicações
Fundador
Dr. Henrique da Silva Castro
louca” no mundo todo, principalmente sobre os surtos
que aconteceram na Europa e dizimaram milhares de
cabeças de gado, causando imenso prejuízo.
Aqui no Brasil, felizmente até agora, fomos poupados,
mas sabemos também que pode ser apenas uma
questão de tempo. Por isso mesmo o apoio à pesquisa
dessa importante doença é primordial para a pecuária
no país.
Para falar sobre o assunto convidamos o Dr. Carlos
Bloch Jr., que desenvolve, na Embrapa-Cenargen, um
método de combate à doença. Confira a entrevista.

Direção Geral e Edição Dr. Henrique da Silva Castro

Ana Lúcia de Almeida
E-mail
biotecnologia@biotecnologia.com.br
Nota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência &
Home-Page Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS
(International Information System for the Agricultural Sciences
www.biotecnologia.com.br and Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados
da Agricultura Brasileira).
Projeto Gráfico
KL3 Publicações LTDA

SHIN CA 05 Conjunto “J”

Bloco “B” Sala 105
Lago Norte - Brasília - DF
Tel.: (061) 468-6099
Fax: (061) 468-3214

Os artigos assinados são de

inteira responsabilidade
de seus autores.

ISSN 1414-4522
Conselho Científico
Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal
Colaboraram nesta edição:
Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde;
Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; Adriano Luiz Tonetti, Alessandra Pereira Fávero, Alexandre
Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Patto Kanegae, Ana Paula Pacheco Clemente, Anderson
Dr. Naftale Katz - Saúde; Kurunczi Domingos, Antonio Costa de Oliveira, Bruno
Dr. Pedro Jurberg - Ciências; Coraucci Filho, Carla M. Y. Lemos, Celso Omoto, David
Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; John Bertioli, Eleni Gomes, Eliane Cristina Gruszka
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; Vendruscolo, Elza Fernandes de Araújo, Enio Luiz Pedrotti,
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Erica Fuchs, Everaldo Gonçalves de Barros, Fábio Rueda
Faucz, Fernando Irajá Félix de Carvalho, Francismar Corrêa
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Marcelino, Gabrielle Mouco, Gaspar Malone, Gláucia Maria
Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Pastore, Helena Maria Wilhelm, Jorge Fernando Pereira,
José Fernandes Barbosa Neto, Juliana Oliveira Lima, Karina
Fundação Dalmo Catauli Giacometti Proite, Karla Thomas Kucek, Luiz Pereira Ramos, Maira
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; Jardim Bernardino, Marcio Antônio Silva Pimenta, Márcio
Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; de Carvalho Moretzsohn, Márcio Nitschke, Marcos Barros
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos de Medeiros, Maria Fernanda Diniz, Maria José Araújo
Wanderley, Marisa Vieira de Queiroz, Marta Fonseca
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN Martins, Maurílio Alves Moreira, Melânia Lopes Cornélio,
Dr. José Roberto Rogero Monita Fiori de Abreu, Patrícia Messenberg Guimarães,
Paulo Alves Wanderley, Paulo Dejalma Zimmer, Paulo
Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Henrique Machniewicz, Pilar Ximena Lizarazo Medina,
Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA Ricardo Antonio Polanczyk, Roberto da Silva, Rodrigo
Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS Barros Rocha, Ronaldo Stefanutti, Rubens Onofre Nodari,
Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE Samuel Martinelli, Sérgio Batista Alves, Soraya Cristina
Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ Leal-Bertioli, Valdir Marcos Stefenon.

Entrevista
Nova tecnologia no combate ao “mal da vaca louca” 2

Pesquisa
Silenciamento Gênico e Transgênicos 8
Detecção de resíduos de transgênicos em grãos e produtos derivados 14
Bacillus thuringiensis no Manejo Integrado de Pragas 18
Biodiesel 28
Biofertilizantes Líquidos 38
Iniciativas Genômicas 45
Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 53
Biosurfatantes a partir de resíduos agroindustriais 63
Controle de qualidade de ervas medicinais 68
Nitrato Redutase em Fungos Filamentosos 74
Glucoamilase:Estrutura e termoestabilização 86
Marcadores Moleculares no Melhoramento Genético de Araucária 95
Micropropagação de Macieira 100
Método Alternativo de Tratamento de Esgotos 109
Amendoim Selvagem 116
Bioética 120
 Silenciamento Gênico
Pesquisa
e Transgênicos
Eliane Cristina Gruszka Vendruscolo
MSc, Melhoramento Genético Vegetal.
Professora de Genética/UFPR - Campus Palotina
vendruscolo.1@osu.edu;
egvendru@vn.com.br
8 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Importância, mecanismos e modelos do silenciamento gênico
Introdução
A estrutura genômica de plan-
tas pode ser alterada por transfor-
mação genética durante o processo
de transferência gênica utilizando-
se Agrobacterium tumefaciens, bio-
balística e outras técnicas que inte-
gram parte de um genoma (gene
exógeno) em um outro genoma (no
caso, vegetal). A transgenia tem sido
usada com o propósito de integrar
seqüências gênicas de interesse com
conseqüente alteração da expressão
gênica. A expressão desse transgene
nem sempre pode ser predita. Desse
modo, o estudo das conseqüências
dessas transformações tem-se torna-
do relevante nos últimos anos
(VOINNET & BAULCOMBE, 1997;
WATERHOUSE et al., 1998;
VAUCHERET et al., 2001).
Vários termos podem ser en-
contrados na literatura para descre-
ver o silenciamento gênico. Esses
incluem cossupressão, RNAi (RNA
de interferência) e quelling (inter-
rupção da seqüência gênica) em
leveduras. A cossupressão seria o
termo aplicado ao silenciamento
gênico do gene endógeno pela ação
do RNA do transgene. Aqui ambos
os genes, exógeno e endógeno, são
coordenadamente suprimidos.
Quelling é um termo de cossupres-
são usado em Neurospora crassa, e
o RNAi é aplicado ao silenciamento
gênico em animais, quando esse
acontece pela ação de uma fita du-
pla de RNA, causando a não transcri-
ção nem a tradução de determinado
gene(BAULCOMBE, 2002).
Em vários experimentos, fo-
ram obtidas evidências do silencia-
mento gênico em plantas, que leva-
ram à conclusão que, ao aumentar
o número de cópias de um gene de
interesse em particular, poderia re-
duzir a sua expressão (MAZTKE &
MAZTKE, 1995; DEPICKER & VAN
MONTAGU, 1997). WEI et al. (2001)
comentam sobre uma correlação
positiva entre o número de insertos
com pobre expressão gênica. Vári-
os transgenes inseridos podem ser
silenciados após uma (relativamen-
te) longa fase de expressão e po-
dem, às vezes, silenciar a expres-
são (parcialmente) de genes homó-
logos localizados em posições
ectópicas no genoma (FAGARD &
VAUCHERET, 2000). Em alguns ca-
sos, o silenciamento gênico de
transgenes pode desencadear a re-
sistência a vírus e, em outros casos,
a infecção viral pode silenciar a
expressão de genes endógenos nas
plantas (BAULCOMBE, 1996).
Mecanismos de
silenciamento gênico
O silenciamento gênico, como
processo, corresponde a uma intera-
ção entre seqüências homólogas de
DNA ou RNA. Até hoje, sabe-se que
o RNA está envolvido em 2 tipos de
silenciamento gênico dependente de
homologia (SGDH): 1) SGPTS (si-
lenciamento gênico pós-transcricio-
nal), onde a degradação de RNAs
homólogos no citoplasma levaria a
não tradução e 2) SGT (silenciamen-
to gênico transcricional), que está
relacionado com o bloqueio na trans-
crição induzido por um RNA anti-
senso derivado do próprio DNA,
que promoveria uma metilação na
região promotora, a nível nuclear, e
a homologia para a metilação dirigida
ocorreria nas regiões transcritas
(WASSENEGGER, 2000; FAGARD &
VAUCHERET, 2000; VAUCHERET et
al., 2001).
Embora os genes que interagem
podem estar muito próximos no
mesmo cromossomo e iniciar a
inativação em cis, muitos sistemas
estudados envolvem a interação de
seqüências localizadas em diferen-
tes cromossomos ou a trans-
inativação. Ambos os tipos de SGDH
estão freqüentemente associados
com metilações de novo em se-
qüências-específicas do DNA nu-
clear (KOOTER et al., 1999;
WASSENEGGER, 2000).
O mecanismo de silenciamento
gênico transcricional (SGT) estaria as-
sociado a metilações de novo na região
do promotor do transgene, que pode-
riam ser meioticamente herdáveis
(KOOTER et al., 1999). Essa metilação
seria induzida por pareamento de regi-
ões homólogas de DNA ou ainda DNA-
RNA. Esse pareamento constitui o pas-
so inicial para a iniciação do SGPT
(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).
O pareamento induziria a uma
metilação dentro da região codificante
do transgene, que levaria a uma pre-
matura interrupção de sua transcrição.
Como resultado dessa síntese irregular
de mRNA, um RNA aberrante (abRNA)
seria formado (WASSENEGGER &
PÉLISSIER, 1998; HAMILTON &
BAULCOMBE, 1999; MATZKE et al.,
2001).
Estudos recentes têm encontra-
do presença de um RNA de, aproxi-
madamente, 25 nt em sense e
antisense, com homologia ao RNA
alvo, em plantas que apresentam
cossupressão e resistência a vírus,
mas que não são encontradas em
plantas usadas como controle. Tal
fato contribui para evidenciar que
existem diferentes formas de silenci-
amento, porém todas agindo num
mesmo mecanismo (HAMILTON &
BAULCOMBE, 1999).
A resistência a vírus seria
explicada pelo fato de estes abRNA
serem o molde para que as RNA
polimerases dependentes de RNA
(RPdR) do hospedeiro (vegetal) pos-
sam sintetizar pequenas moléculas
de RNA anti-sense (METTE et al.,
1999; MATZKE et al., 2001;
MLOTSHWA et al., 2002). Esses pe-
quenos RNA antisense agiriam em
trans, em seqüências de RNA com-
plementares (RNA viral), levando à
formação de RNA fita dupla (dfRNA).
Um complexo de RNAses específi-
cas para esses dfRNAs (conhecidas
como Complexo DICER ou RNAses
tipo III, específicas para as dfRNAs),
levariam a degradação dessas molé-
culas híbridas e, em conseqüência,
tornariam a planta resistente ao ví-
rus (METZLAFF et al., 1997;
CERUTTI, 2003).
No caso das integrações múlti-
plas, como as cópias do transgene, o
silenciamento se iniciaria por um
pareamento não recíproco entre o
transgene e o gene endógeno, ou
entre os transgenes e, como conse-
qüência desse pareamento, o locus
receptor seria metilado, levando a
uma terminação prematura da trans-
crição (ENGLISH & BAULCOMBE,
1996; WASSENEGGER, 2000).
A posição de integração do
transgene também parece ser impor-
tante para o silenciamento pelo fato
de o loci silenciador usualmente con-
sistir de múltiplas cópias do transgene
ligadas. Outro modelo que explica o
silenciamento de transgenes em có-
pias múltiplas e invertidas é a forma-
ção de um RNA em alça (alRNA),
que, posteriormente, se transforma-
ria em dfRNA pela ação de RNA
nucleases causando o efeito do silen-
ciamento conforme foi descrito aci-
ma (WATERHOUSE et al., 2001). De
modo similar, o dfRNA poderia tam-
bém ser usado como molde para
algumas RNA polimerases que trans-
creveriam moléculas de RNA anti-
senso, homólogos aos mRNAs, for-
mando os dfRNAs e continuando o
ciclo de silenciamento por indução
do SGT e SGPT (KOOTER et al.,
1999; FAGARD & VAUCHERET,
2000).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Modelos para explicar o
silenciamento gênico
Vários autores têm sugerido
modelos para os mecanismos mole-
culares envolvidos no silenciamen-
to gênico, que não são eventos mu-
tuamente exclusivos, mas que po-
dem ser usados individualmente ou
em conjunto para explicar o silenci-
amento gênico.
1. Silenciamento mediado
pelo pareamento DNA-DNA
Esse modelo tem sido proposto
para explicar certos tipos de cossu-
presssão (JORGENSEN, 1990; MEYER
& SAEDLER, 1996); a trans-inativação
(MATZKE & MATZKE; 1990;
CHANDLER & VAUCHERET, 2001) e
a paramutação (MEYER et al., 1993;
CHANDLER & VAUCHERET, 2001).
O pareamento de regiões homó-
logas do DNA, devido à interação
entre duas seqüências homólogas
numa interfase da meiose, levaria à
formação de estruturas em alças, que
seria o precursor da difusão de
metilações no DNA, induzindo o SGT
(ENGLISH & BAULCOMBE, 1996).
Os transgenes diferem muito em
sua capacidade de trans-inativar cópi-
as homólogas, o que parece estar asso-
ciado à capacidade de procurar outras
posições cromossomais com homolo-
gia. A presença de genes silenciadores
muito próximos ao telômero sugere
que regiões teloméricas são sítios favo-
ráveis para a interação com seqüências
homólogas (MEYER & SAEDLER, 2001).
2. Degradação de RNA em
excesso
Em transgênicos, é comum o
uso de promotores fortes para se
conseguir a alta expressão do
transgene. Como conseqüência, para
a detecção de planta com o inserto,
são esperados níveis altos do mRNA
do transgene. Nesse modelo, os
abRNA seriam produzidos devido a
uma alta taxa de transcrição do DNA,
com isso, os altos níveis de mRNA. Se
essa taxa de mRNA exceder a taxa de
tradução, pode ocorrer, além da de-
9
 gradação parcial desses mRNA, a
terminação abrupta da transcrição, o
processamento irregular, originando
abRNAs e induzindo ao SGPT
(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).
Outrossim, o excesso de produ-
ção de uma determinada proteína pode
transmitir um sinal para a maquinaria
de tradução a fim de induzir a termi-
nação de sua própria transcrição. As
proteínas em excesso seriam marcadas
por ubiquitinas, por fosforilação ou
por outras modificações pós-transcri-
cionais (HOCHSTRASSER, 1996;
WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).
3. Híbridos DNA-RNA
A observação de que o parea-
mento DNA-RNA pode induzir pa-
drões de metilação sugere mudanças
no estado epigenético caracterizado
por um estado específico de metilação
do DNA ou da estrutura da cromatina,
durante o período pré-meiótico ou
de hibridização somática (MEYER &
SAEDLER, 2001). Estudos indicaram
que fragmentos de RNA poderiam
induzir uma hipermetilação em se-
qüências homólogas (pareamento
DNA -RNA), causando as mudanças
epigenéticas. Tal fenômeno foi com-
provado em estudos com plantas
transgênicas que continham o cDNA
dos virióides do PSTV da batata. A
metilação no genoma do viróide foi
observada mesmo sem que a
replicação do seu RNA tivesse ocor-
rido (WASSENEGGER et al., 1994;
WASSENEGGER, 2000).
Os transcritos poderiam induzir
a metilação em regiões homólogas
de DNA, que seria comum em trans-
formantes, os quais acumulariam
grandes concentrações dos transcri-
tos no núcleo, devido às altas taxas
de tradução e do processamento irre-
gular desses RNAs. Como conseqü-
ência dessa marcação, a proteína e
seus produtos, após degradação, po-
deriam reconhecer seqüências ho-
mólogas surgindo nos ribossomos, e
levando ao término prematuro da
transcrição, além de uma deadenila-
ção na posição 3’ e, com isso, ao
surgimento dos abRNAs e a indução
do SGPT (JONES et al., 1999).
10 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
4. Modelo mediado por
RNA antisenso
O RNA antisenso parece ser
fundamental nos mecanismos de
cossupressão. As fitas duplas de RNA
seriam alvos gerados pelos promo-
tores presentes no DNA do transgene
e pela ação de RNA polimerases
dependente de RNA ( RPdR)
(LINDBO et al., 1993).
WASSENEGGER & PÉLISSIER
(1998) ainda propõem que esse RNA
poderia surgir devido à posição da
seqüência de DNA produtora do
RNA antisenso, próximo a um pro-
motor localizado adjacente a uma
cópia de T-DNA integrado e em
anti-senso .
A produção de RNA antisenso
pelas RPdR dependeria de níveis
específicos do RNA senso e do
acúmulo de intermediários de RNA
(durante o processamento ou trans-
porte). Essa hipótese se baseia no
fato de que as RPdR reconheceriam
os transcritos aberrantes, que seri-
am derivados de transcrição, trans-
porte ou tradução incorreta do
transgene. A produção de abRNA
poderia induzir as mudanças
epigenéticas do gene que influenci-
aria o seu processamento (MEYER &
SAEDLER, 1996; WASSENEGGER,
2000).
Certos transgenes somente po-
dem silenciar ou cossuprimir seqüên-
cias caso contenham um final 3’
homólogo, enquanto certos transgenes
com regiões 5’ homólogas não são
afetadas (ENGLISH et al., 1996). Essas
observações sugerem que os transcri-
tos antisenso são feitos preferencial-
mente nas regiões 3’ do transgene
(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).
O papel da metilação e da
estrutura da cromatina no
silenciamento gênico
Em recentes estudos sobre si-
lenciamento em plantas, a ocorrên-
cia de pareamento entre seqüências
homólogas parece ser condição im-
portante para o silenciamento
(BAULCOMBE & ENGLISH, 1996;
VOINNET et al., 1998). O silencia-
mento em trans seria quando uma
região metilada teria homologia com
a região promotora de um determi-
nado gene, dirigindo uma metilação
de novo nessa região, para induzir o
SGT. Tal fenômeno é conhecido
como metilação do DNA dirigida
por DNA (MDdD)(JONES et al., 1999;
METTE et al., 1999; WASSENEGGER,
2000).
Muitos genes eucarióticos e ele-
mentos transponíveis exibem uma
forte correlação inversa entre den-
sidade de metilação do DNA e ati-
vidade transcricional ou transposi-
cional. Ao certo, não se sabe se a
ação da metilação da citosina alte-
raria a estrutura da cromatina, mas
estudos em plantas demonstram
uma correlação positiva entre o
número de cópias do transgene, o
aumento da metilação e a diminui-
ção da atividade transcricional
(KUMPATLA et al.,1997).
Em eucariontes, os resíduos de
citosina do DNA genômico podem
ser metilados na posição 5’da citidina.
As enzimas das DNA metiltransferases
que realizam essa reação têm prefe-
rências por grupos CpG ou CpNpG.
Em ambos os casos, o DNA recente-
mente replicado, que contém grupos
CpG ou CpNpG hemimetilados, são
fortes substratos para a ação das
DNA metiltransferases. Tal padrão
asseguraria as metilações de manu-
tenção e de padrões de metilação
pré-existentes nos cromossomos fi-
lhos (ATHERLY et al.,1999).
Em transgenes, esse padrão de
metilação não é igual. As metilações
localizadas em resíduos de citosina
não estão localizadas em seqüênci-
as CpG ou CpNpGp. Os fatores que
especificam esse padrão de metilação
não simétrico são ainda uma incóg-
nita, mas parece que a metilação do
DNA é dirigida por um RNA. Não se
sabe se esse RNA seria o sinal em
todos os casos da metilação não
simétrica das citosinas em plantas
(FINNEGAN et al., 1998). Alguns
autores denominam esse fenômeno
de metilação do DNA dirigida por
RNA (MDdR)(WASSENEGGER, 2000;
BAULCOMBE, 2002). Esse padrão
também não parece ser conservado
durante a meiose, em contraste com
o padrão de metilação simétrica
(PARK et al., 1996; LUFF et al.,
1999).
Estudos têm demonstrado que
a metilação do DNA e a estrutura da
cromatina têm um importante papel
no SGT e SGPT. Nessa forma de
silenciamento, a região promotora
e, às vezes, a região codificante dos
transgenes silenciados apresentam-
se densamente metilados (KOOTER
et al., 1999). Plantas mutantes para
o gene da proteína DDM1, que re-
modela a cromatina, não apresenta-
ram o silenciamento gênico. Isso
indica um possível papel da
metilação do DNA e da estrutura da
cromatina no estabelecimento e na
manutenção de SGPT. Supõe-se que
o aumento da metilação leve à
heterocromatização do DNA e, com
isso, ao difícil acesso às RNA
polimerases, diminuindo a ação
transcricional (YE et al., 1996;
WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998;
WASSENEGGER et al., 2000).
Embora os modelos atuais pro-
ponham que a produção de um
RNA aberrante, fruto de uma
metilação, seja o causador de uma
finalização prematura da transcri-
ção do mRNA, existem estudos com
linhagens defeituosas de N. crassa
para o gene da metilase da citosina
(dim2) que exibiram a mesma capa-
cidade de silenciamento que a li-
nhagem controle (dim +) (COGONI
& MACINO, 1999). Fato semelhante
foi observado em estudos realiza-
dos com plantas transgênicas de
fumo, onde o gene nptII (neomicina
fosfotransferase) metilado teve a
transcrição e o SGPT normais quan-
do comparado com uma cópia do
gene nptII não metilado e não si-
lenciado (VAN HOUDT et al., 1997).
Tais fatos indicam que a metilação
não parece ser condição sine qua
non para a indução e a manutenção
do SGPT (PARK et al., 1996).
Razões para a ocorrência do
silenciamento gênico
Diversos autores têm levantado
o papel do silenciamento gênico . O
silenciamento gênico parece estar
envolvido com a defesa a ácidos
nucléicos estranhos (COVEY, 2000;
JORGENSEN, 1995; MOURAIN et al.,
2000), com a proteção do genoma
contra a inserção de elementos
transponíveis (KETTING et al., 1999;
BAULCOMBE, 2002) e com a
regulação da expressão gênica de
famílias de multigenes ou ainda
genes duplicados em plantas
(TANZER et al., 1997; CHANDLER &
VAUCHERET, 2001).
Uma outra questão poderia ser
levantada, se seqüências homólogas
de DNA podem parear e se tornar
silenciadas, como então explicar que
membros de famílias de genes pode-
riam escapar da inativação? MATZKE
& MATZKE (1995) propõem a exis-
tência de duas maneiras de prevenir
esse pareamento: ou pela divergên-
cia de seqüências encontradas em
alelos (heterozigosidade) ou devido
à redução do comprimento de se-
qüências homólogas, o que sugere
um papel muito importante para os
íntrons, que dividiriam a região
codificante da proteína em segmen-
tos pequenos demais para realizar
um pareamento efetivo.
Parece bastante unânime en-
tre vários autores que o silencia-
mento gênico tem como função
principal prevenir a superexpres-
são gênica, controlando o número
de cópias de determinado gene ou
ainda ser um mecanismo de defesa
contra a superexpressão de
transgenes (WASSENEGGER &
PÉLISSIER, 1998; KOOTER et al.,
1999; WASSENEGGER, 2000).
Difusão e amplificação do
silenciamento gênico
Um dos mais importantes aspec-
tos do silenciamento gênico é que
este é um mecanismo autômato, isto
é, pode ser induzido localmente e
pode se espalhar para distantes locais
no organismo (VOINNET et al., 1998;
COVEY, 2000). Esse transporte
sistêmico do sinal de silenciamento
parece relacionar-se com um sinal
móvel, não metabólico, ainda não
completamente identificado. Esse si-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
nal, sendo parte integral do processo
de silenciamento, parece interagir com
proteínas de membranas, movendo-
se de célula em célula através do
floema (plasmodesmata), assemelhan-
do-se com o padrão de infecção de
vírus nas plantas (PALAUQUI et al.,
1997; VOINNET & BAULCOMBE, 1997;
VOINNET et al., 1998; MLOTSHWA
et al., 2002).
O SGPT teria três fases: início,
manutenção e difusão propriamen-
te dita. Os transgenes, os vírus e até
mesmo o DNA exógeno (proveni-
ente da transformação) poderiam
iniciar o SGPT. Alguns autores su-
gerem que esse sinal seja na forma
de RNA, mas não é conhecido ainda
qual o tipo de RNA que estaria
envolvido: se abRNA, dfRNA ou
ainda o asRNA (METTE et al., 1999;
KOOTER et al., 1999; MATZKE et
al., 2001; MLOSTHWA et al., 2001).
Esse conceito de difusão célula-
célula e de transporte a longas dis-
tâncias não pode ser descartado,
visto que o vírus tem seu genoma
composto por RNA e esse RNA di-
funde-se para dentro da planta, po-
dendo se mover de célula-célula
através de proteínas codificadas pelo
seu próprio genoma (WATERHOUSE
et al., 2001).
Ainda não está completamente
elucidado como o sinal para o silen-
ciamento pode se espalhar sistemi-
camente pela planta e ainda ter seus
efeitos amplificados. O silenciamen-
to parece ser um mecanismo de pre-
venção, como a vacina é para os
humanos. Parece sensato estabele-
cer que o silenciamento nada mais é
que uma mensagem enviada pelas
células já infectadas pelo vírus para
aquelas que ainda não o foram, mas
que estejam na iminência de o ser,
para que essas preparem suas defe-
sas contra o agente invasor. Se esse
sinal contiver fragmentos da seqüên-
cia viral, as células receptoras pode-
riam estar preparadas para degradar
qualquer RNA que contivesse essas
seqüências, mesmo antes de o vírus
chegar (RATCLIFF et al., 1997;
WATERHOUSE et al., 2001).
Esse modelo poderia explicar al-
gumas observações:1) de que plantas
11
 transgênicas com transgenes deriva-
dos de vírus podem apresentar uma
recuperação, isto é, apresentar os sin-
tomas da infecção inicial do vírus,
seguida de crescimento sem os sinto-
mas e de resistência ao vírus. 2) plan-
tas transgênicas apresentando cossu-
pressão tendem, inicialmente, a apre-
sentar atividade do transgene, mas
um silenciamento progressivo em te-
cidos em crescimento (WATERHOUSE
et al., 2001).
Considerações finais
Na última década, o estudo do
silenciamento gênico cresceu consi-
deravelmente. Já existem evidênci-
as de que características específicas
do DNA, como a metilação e a estru-
tura da cromatina, são importantes
para o fenômeno do silenciamento.
Todavia, o seu mecanismo molecu-
lar ainda não foi totalmente
elucidado, mas, em razão de obser-
vações funcionais dos RNA anti-sen-
so, abRNA, dfRNA, RNA polimerases
e RNA nucleases, os estudiosos des-
se assunto puderam elaborar mode-
los para os mecanismos de SGDH ,
o SGT e SGPT.
É notória a existência de algu-
mas dificuldades para o estudo do
silenciamento gênico em plantas
transgênicas. Variações entre as li-
nhas de plantas transgênicas consti-
tuem uma grande barreira para o
completo estudo desses mecanismos.
Duas linhas transgênicas não são
similares pelo fato de o transgene em
cada planta se situar em diferente
domínio no cromossomo, em dife-
rente arranjo e também devido à
associação com diferentes quantida-
des de DNA do vetor de transforma-
ção (IGLESIAS et al., 1997; STAM et
al., 1997).
Apesar das dificuldades, vislum-
bram-se para essa área da ciência
grandes e importantes descobertas: o
completo entendimento da regulação
gênica, a identificação dos fatores
que podem afetar a expressão gênica
e dos transgenes (talvez se discuta no
futuro algumas propriedades dessa
tecnologia) e, ainda mais, a compre-
ensão dos mecanismos evolutivos.
12 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Agradecimentos
Aos pesquisadores Ivan
Schuster (Coodetec) e Maria Júlia
Corazza Nunes (UEM/PR) pelas
correções e sugestões dadas. Agra-
deço a Deus por tudo.
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13
 Detecção de resíduos de
transgênicos em grãos e
Pesquisa
produtos derivados
A experiência da Universidade Federal de Viçosa

Francismar Corrêa Marcelino
Mestre em Genética Molecular, Laboratório
de Análises Genéticas - AgroGenética
eg34680@vicosa.ufv.br
Marta Fonseca Martins
Doutora em Genética Molecular, Laboratório
de Análises Genéticas - AgroGenética
mmartins@tdnet.com.br
Marcio Antonio Silva Pimenta
Doutor em Genética Molecular,
Universidade Federal de Viçosa
marciopimenta@vicosa.ufv.br
Maurilio Alves Moreira
PhD, Bioquímica & Genética de Plantas,
Universidade Federal de Viçosa
moreira@ufv.br
Everaldo Gonçalves de Barros
PhD, Biologia Molecular de Plantas,
Universidade Federal de Viçosa
ebarros@ufv.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Mais de 58 milhões de hectares são
cultivados atualmente no mundo com
espécies transgênicas, sendo a soja, o
milho, o algodão e a canola, as principais
delas. Os países com as maiores áreas
cultivadas com transgênicos são, nesta
ordem, os Estados Unidos, a Argentina, o
Canadá e a China. Estes países respondem
por cerca de 99% da área total plantada
com cultivos transgênicos. O cultivo de
plantas geneticamente modificadas vem
crescendo rapidamente em vários países,
inclusive no Brasil, onde no mês de
setembro foi aprovado, embora com res-
trições, o plantio de soja transgênica para
o ano agrícola 2003/2004 (Medida Provi-
sória 131, de 25 de setembro de 2003).
A demanda por análises da presen-
ça de resíduos de transgênicos em maté-
rias-primas e em alimentos tem aumenta-
do significativamente no Brasil, nos últi-
mos dois anos, principalmente após a
comprovação do cultivo ilegal da soja
transgênica, resistente ao herbicida
glifosato, destacadamente no estado do
Rio Grande do Sul, com sementes prove-
nientes da Argentina. A maior parte das
análises tem sido demandada por em-
presas exportadoras de grãos de soja e de
produtos derivados. Esses produtos são
exportados, na maioria, para a Europa,
Japão e Coréia. Já antevendo esse cená-
rio, a Universidade Federal de Viçosa
(UFV), por intermédio do Instituto de
Biotecnologia (BIOAGRO), desenvolveu
e otimizou metodologias baseadas na
técnica de PCR (Polymerase Chain
Reaction) para determinar a presença e
quantificar resíduos de transgênicos em
amostras de DNA extraídas de grãos,
bem como de seus produtos derivados.
Recentemente, a AgroGenética, labora-
tório incubado na Incubadora de Empre-
sas de Base Tecnológica da UFV, foi
credenciado junto ao Ministério da Agri-
cultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)
- Portaria Nº 27, de 15 de maio de 2003,
para a “detecção de modificação genéti-
ca em produtos de origem vegetal”.
As modificações genéticas intro-
duzidas que derivam os organismos
geneticamente modificados (OGMs)
podem ser produzidas por pelo me-
nos três metodologias:

Figura 1 - Representação da construção presente na soja RR® (Roundup Ready).

Região promotora 35S do vírus do mosaico da couve flor, peptídeo de trânsito de
Petúnia, gene que codifica a proteína EPSPS, que confere a resistência ao herbicida,
e o terminador do gene da nopalina sintase (NOS).

14 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

 - técnicas do DNA recombinante,
utilizando vetores para transforma-
ção de plantas;
- técnicas envolvendo a introdução
direta do material genético no
organismo;
- fusão celular por métodos não
naturais.

A construção genética utilizada para

produzir OGMs consiste de três elemen-
tos básicos: o promotor, que controla a
expressão do transgene no organismo;
a região codificadora, que codifica a
proteína de interesse; e a região
terminadora, que determina o final do
processo de transcrição do gene. Além
disso, pode ser usado um gene marcador
que serve para selecionar as células que,
de fato, foram transformadas. A soja
resistente ao herbicida glifosato, por
exemplo, tem como região reguladora o
promotor 35S do vírus do mosaico da
couve flor (CaMV); como região
codificadora, o gene para a proteína
EPSPS de Agrobacterium tumefasciens,
que confere a resistência ao herbicida, e
como região terminadora, o terminador
do gene da nopalina sintase (NOS),
também de Agrobacterium (Figura 1).
A identificação de alimentos geneti-
camente modificados pode ser feita facil-
mente com o auxílio de técnicas de
Figura 2 - Análise qualitativa de OGM em amostras de grãos de soja. O DNA das amostras foi
extraído pelo método Wizard e amplificado com primers específicos que anelam ou no gene
biologia molecular. OGMs podem ser
da lectina (controle A e B), ou na região do promotor 35S do CaMV (C e D), ou na região identificados pela detecção direta do DNA
terminadora NOS (E e F), ou na região codificadora do gene EPSPS (G e H). Após a reação de exógeno nele contido, do mRNA corres-
PCR, os produtos amplificados foram separados em géis de agarose. À esquerda (A, C, E e G) pondente produzido, da proteína resul-
está exemplificado um resultado negativo e à direita (B, D, F e H), um resultado positivo. Os
símbolos nas canaletas representam: (–), reação de PCR sem DNA (controle); N, soja normal tante ou, ainda, pela característica intro-
(controle); T, soja transgênica (controle); 1, 2 e 3, referem-se a amostras de grãos de soja. As duzida. Os principais métodos analíticos
setas indicam as bandas de DNA de interesse. de detecção utilizam a técnica da reação
em Cadeia da DNA Polimerase (PCR) para
detectar o DNA exógeno, ou métodos
imunológicos, como o ELISA, para detec-
tar a proteína. O método analítico escolhi-
do deve ser sensível, confiável,
reprodutível, minimizando, assim, falsos
positivos e falsos negativos.
Em nosso laboratório a detecção e
quantificação de resíduos de OGMs em
grãos, ingredientes e produtos derivados
é feita pela técnica de PCR. Para tal, é
necessária a extração de DNA das amos-
tras e amplificação do fragmento de inte-
resse. Para ser amplificado, o DNA purifi-
cado deve apresentar boa qualidade. Além
disso, como controle, um gene normal-
mente presente no organismo, é amplifi-
cado em uma reação paralela. Para pro-
Figura 3 - Curva de amplificação de uma análise quantitativa em PCR de tempo real. A dutos que contenham soja na sua compo-
determinação da porcentagem de resíduos de OGM é baseada na comparação da curva de
amplificação da amostra analisada com as curvas de amplificação de padrões certificados sição é utilizado o gene da lectina. Para
contendo quantidades conhecidas de OGMs. produtos à base de milho, é utilizado o

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 15

 gene da delta zeína. Quando se quer
detectar a presença de OGM em uma
amostra de salsicha, por exemplo, ampli-
fica-se como controle o gene da lectina,
uma vez que a salsicha geralmente con-
tém pelo menos 2% de proteína de soja na
sua composição.
O nosso laboratório procura utili-
zar métodos validados internacional-
mente nas suas análises. Para a extração
de DNA das amostras é utilizada a
Figura 4 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2000. metodologia Wizard, método já valida-
do pela Comunidade Econômica Euro-
péia. O transgene, ou seja, o segmento
de DNA que foi introduzido na planta,
é amplificado com primers específicos.
Para a detecção do gene RR (Roundup
Ready) são utilizados primers que se
ligam ou à região do promotor 35S do
CaMV, ou à região codificadora, ou ao
terminador NOS. Após a reação de PCR
os produtos amplificados são separados
em géis de agarose. Para as análises
quantitativas, o DNA das amostras é
extraído pela metodologia PrepMan-
Ultra e a análise é baseada no método
TaqMan®, que utiliza a técnica de PCR
em Tempo Real, para amplificar a se-
Figura 5 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2001.
qüência de DNA do promotor 35S, o
qual está presente na maioria dos OGMs
comercializados até o momento. O pro-
cedimento é extremamente preciso de-
vido à perfeita complementaridade en-
tre os primers usados na reação de PCR,
a sonda TaqMan® e as seqüências alvo
de DNA que estão sendo amplificadas.
A fluorescência liberada durante a rea-
ção é lida pelo sistema de detecção ABI
PRISM® 7000 e os dados gerados são
analisados eletronicamente. Como a
metodologia é bastante sensível, pode-
se detectar, numa dada amostra, uma
contaminação da ordem de 0,01%. No
entanto, devido ao limite de recupera-
Figura 6 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2002 ção do DNA durante o processo de
extração e também aos erros inerentes
ao processo de amostragem, temos tra-
balhado com um nível de detecção e
quantificação da ordem de 0,1%. Isto é,
uma amostra contendo 0,1% de transgê-
nicos é classificada como positiva na
nossa análise, tendo como referência
um padrão certificado. Amostras com
uma contaminação menor que 0,1% são
classificadas como negativas. A Figura 2
mostra os possíveis resultados obtidos
em uma análise qualitativa, enquanto
que na Figura 3 pode ser visualizada
uma curva de amplificação numa análi-
se quantitativa em tempo real. A
Figura 7 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2003. quantificação de uma determinada amos-

16 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

tra é feita com base na comparação da mente, temos recebido amostras de con- tras desde o ano de 2000. Ao longo dos
sua curva de amplificação com as de dimentos e temperos, óleos, amido de anos que temos realizado análises de
padrões certificados contendo quanti- milho, sopas, fubá, entre outras. A partir OGM em grãos e diferentes tipos de
dades conhecidas de OGMs. de 2001 foram feitas as primeiras análi- alimentos, pudemos observar um au-
Desde o ano de 2000, o laboratório ses de produtos cárneos. A partir de mento gradual no número de amostras
vem realizando a detecção de OGMs em 2002 houve um aumento expressivo no positivas, demonstrando que embora
grãos e em produtos derivados. Inicial- número de análises para esse tipo de seja proibido o plantio e a comercializa-
mente a demanda era concentrada em produto. Naquele ano, 12,3% do total de ção de OGM no país, estes de alguma
amostras de grãos de soja e milho e em amostras analisadas foram de produtos forma estão presentes no mercado, pelo
diferentes tipos de preparações de pro- cárneos. Até setembro de 2003 a porcen- menos, desde o ano de 2000. Naquele
teínas de soja. Com o passar dos anos, tagem foi de 7,3%. ano apenas 5% das amostras analisadas
observamos um aumento na demanda As Figuras 4, 5, 6 e 7 mostram a foram positivas para a presença de
pelas análises bem como uma diversifi- porcentagem de cada classe de produto resíduos de OGM. Em 2001, esse
cação das amostras enviadas. Atual- analisado em relação ao total de amos- percentual subiu para 11,5%. Em 2002,
para 28,5%, e até setembro de 2003,
32,3% das amostras apresentaram resul-
tado positivo. A Figura 8 representa de
forma gráfica estes resultados.
A porcentagem de amostras positi-
vas dentro de cada classe de produtos
também sofreu elevação, principalmente
no caso de grãos de soja, farelo de soja e
ração. A porcentagem de amostras de
grãos de soja positivas para a presença de
OGM em 2000 foi de 3,89 % com relação
ao total de amostras analisadas. Com
relação apenas às amostras de grãos
analisadas, esse percentual foi de 12,96%,
atingindo 35,42%, 31,69% e 64,20%, res-
pectivamente, em 2001, 2002 e 2003. As
amostras de farelo OGM subiram de
1,11% do total de amostras analisadas,
em 2000, para 8,33% em 2003, enquanto
as de ração eram 1,82% em 2001 e 2,3%
Figura 8 - Percentual de amostras positivas para a presença de resíduos de OGMs com em 2003. A porcentagem de amostras de
relação ao número total de amostras analisadas, entre os anos de 2000 e 2003. produtos cárneos contendo resíduos de
OGM foi de 7,93% do total de amostras
Qu ad ro 1 - P o rcen tagem d e amo stras po sitivas d en tro d e cad a classe d e amo stras e co m relação ao to tal analisadas e 63,04% com relação ao total
d e amo stras an alisad as
% de % de % de % de % de % de % de % de
de amostras dessa classe de produtos em
amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras 2002. Em 2003, esses valores foram de
T ipo d e
po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas 5,32% e 73,17%, respectivamente. Com
pelo to tal d en tro pelo to tal d en tro pelo to tal d en tro pelo to tal d en tro
A mo stra
de d a classe de d a classe de d a classe de d a classe
relação às amostras de milho e derivados
amo stras an alisad a amo stras an alisad a amo stras an alisad a amo stras an alisad a apenas em 2003 começamos a detectar
em 2000 em 2000 em 2001 em 2001 em 2002 em 2002 em 2003 em 2003 algumas amostras positivas, o que reflete
So ja grão 3,89 12,96 7,74 35,42 6,16 31,69 9,22 64,20
Diferen tes a presença de outros cultivos transgêni-
tipo s d e
0,00 0,0020 0,00 0,00 0,96 3,91 2,13 7,41 cos, que não a soja RR®, no mercado
pro teín as
d e so ja
mundial. O Quadro 1 mostra a porcenta-
Farelo d e gem de amostras positivas em relação ao
1,11 11,76 1,37 14,64 7,93 54,72 8,33 54,49
so ja número total de amostras analisadas e
P ro d u to s
cárn eo s
0,00 0,00 0,00 0,00 7,93 63,04 5,32 73,17 dentro de cada classe de amostras.
Milh o grão 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,06 13,04 Os nossos dados permitem concluir
R ação 0,00 0,00 1,82 21,62 3,56 49,06 2,30 35,14 que no período de 2000 a 2003 houve um
Hid ro lisad o
d e so ja
0,00 0,00 0,23 4,76 0,00 0,00 0,18 25,00 aumento gradual da presença de resíduos
So pas 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 de transgênicos em grãos, ingredientes e
Fu b á d e
milh o
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,18 14,29 alimentos derivados no país, especialmen-
C o n d imen - te com relação à soja. Os dados apontam
to s e 0,00 0,00 0,00 0,00 0,55 36,36 1,42 61,54 também para a necessidade de definição
tempero s
Lecitin a d e
de normas claras de rotulagem de alimen-
0,00 0,00 0,00 0,00 0,82 75,00 0,00 0,00
so ja tos. Para esse fim, é importante que se
Óleo s e
0,00 0,00 0,00 0,00 0,27 40,00 0,00 0,00 disponham de laboratórios qualificados
go rd u ras
Ou tro s 0,00 0,00 0,23 2,22 0,27 5,88 2,30 37,14 para realizar esse tipo de análise.

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 17

 Bacillus thuringiensis
Pesquisa no Manejo Integrado de Pragas
Ricardo Antonio. Polanczyk
Engenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa de
Pós Graduação em Entomologia (Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP).
rapolanc@esalq.usp.br
Samuel Martinelli
Engenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa de
Pós Graduação em Entomologia (Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP).
smartine@esalq.usp.br
Celso Omoto
Engenheiro Agrônomo, Prof. Dr. Depto
Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola
(ESALQ-USP).
celomoto@esalq.usp.br
Sérgio Batista Alves
Engenheiro Agrônomo, Prof. Dr. Depto
Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola
(ESALQ-USP).
sebalves@esalq.usp.br
Ilustrações cedidas pelos autores
18 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Do uso convencional em Pulverização à Biotecnologia
1. Introdução
A exploração agrícola intensi-
va, necessária para atender à cres-
cente demanda interna por alimen-
tos, aumento do volume de expor-
tações agrícolas e necessidade por
produtos como fibras, tem como
fator limitante o impacto negativo
nos ecossistemas. De acordo com
Tilman et al. (2001), diante da con-
tinuidade dos impactos ambientais
globais provocados pela agricultu-
ra, 109 hectares de ecossistemas na-
turais serão convertidos em siste-
mas agrícolas até o ano de 2050. Do
mesmo modo, os agroquímicos, uti-
lizados para o controle de pragas
agrícolas são muitas vezes respon-
sáveis por contaminações do meio
ambiente e intoxicações de produ-
tores rurais. Portanto, é importante
o desenvolvimento e implementa-
ção de táticas de controle de pragas
menos agressivas, que estejam de
acordo com as premissas do Mane-
jo Integrado de Pragas, e que, ao
mesmo tempo, proporcionem o re-
torno econômico ao agricultor.
Neste sentido, o controle bioló-
gico é uma importante estratégia
que, através da liberação, incremen-
to e conservação de insetos parasi-
tóides, predadores e microrganis-
mos, impede que os insetos-praga
atinjam níveis populacionais capa-
zes de causar dano econômico. Indi-
retamente, diminui o impacto dos
agroquímicos sobre o meio ambien-
te, pois minimiza ou torna desneces-
sário o seu uso. Entre os microrga-
nismos com potencial para serem
empregados no controle biológico
destaca-se o entomopatógeno
Bacillus thuringiensis (Bt). Esta bac-
téria é capaz de produzir inclusões
cristalinas durante a esporulação,
que são responsáveis pela sua ativi-
dade tóxica. As suas toxinas, após a
ingestão, solubilização e ativação
no intestino do inseto, unem-se às
células do epitélio, formando poros
e desestabilizando os gradientes
osmótico e iônico, fazendo com que
este cesse a alimentação, morrendo
por inanição ou septicemia (Priest,
2000; Glare & O´Callagham, 2000).
Para que a patologia de Bt ocorra é
necessário que o intestino do inseto
permita a eficiente solubilização do
cristal e que proteases ativem as
protoxinas resultantes desta solubi-
lização. Estas etapas são essenciais
para que a toxina passe pela mem-
brana peritrófica e se ligue aos re-
ceptores presentes na parede do
intestino médio do inseto. Em fun-
ção da variabilidade genética, entre
os insetos há diferenças específicas
e não específicas com relação à
especificidade dos receptores das
toxinas de Bt. A especificidade do
receptor assume papel vital na defe-
sa do organismo contra esta ação
inseticida, juntamente com a solubi-
lização do cristal e ativação da toxi-
na. A ausência de necessidade de
solubilizar o cristal e ativar as toxi-
nas produzidas pelas plantas trans-
gênicas pode influenciar a suscetibi-
lidade dos organismos-alvos e não-
alvos de controle. A morte do inseto,
no caso de produtos à base de Bt é
uma interação da ação da toxina e
dos esporos; o primeiro fator leva à
formação de poros no tecido epitelial,
causando desiquilíbrio osmótico e
iônico e a segundo causa septicemia
devido à germinação dos esporos,
proporcionada pela redução do pH
intestinal devido à ação das toxinas.
No caso de plantas-Bt, a causa da
morte é somente a toxina.
As primeiras tentativas de utili-
zação de Bt no controle de pragas
foram feitas na Europa durante a
década de 30. Devido aos êxitos
iniciais, a produção deste patógeno
começou na França em 1938. Nos
EUA, o interesse por este patógeno
aumentou após 1950, principalmen-
te para o controle de lepidópteros
(Lambert & Peferoen, 1992; Beegle &
Yamamoto, 1992).
Deve-se salientar que a pressão
da opinião pública quanto à saúde
humana e preservação do meio ambi-
ente incentivou a utilização de produ-
tos microbianos, principalmente em
hortaliças e frutíferas com alto valor
comercial. Em 1970 foi lançado no
mercado o Dipel (Bt kurstaki) que
provou ser 20 a 200 vezes mais poten-
te que outros isolados desta bactéria
(Beegle & Yamamoto, 1992). Este
produto, atualmente, é utilizado para
o controle de mais de 167 lepidópteros-
praga (Glare & O’Callagham, 2000).
Além disso, em 1976 foi caracterizado
um isolado eficaz para o controle de
insetos da ordem Diptera, denomina-
do Bt israelensis e em 1983 outro letal
para coleópteros denominado de Bt
tenebrionis. O sucesso do uso de Bt
no mundo só não é maior até agora,
em função da existência de inseticidas
químicos baratos que podem substi-
tuí-lo no controle de lepidópteros.
Além de ser utilizado como
bioinseticida, a partir da metade da
década de 1980, foram obtidas as
primeiras plantas transgênicas com
a incorporação dos genes codifica-
dores das proteínas tóxicas de Bt
em plantas de fumo e tomate (Dias,
1992). Segundo Ely (1993), mais de
50 espécies de plantas sofreram
transformações deste tipo com re-
sultados satisfatórios. Formas
truncadas dos genes que codificam
proteínas inseticidas de Bt na sua
forma ativa foram introduzidas e
expressas com sucesso em plantas
de fumo (Vaeck et al., 1987) e
algodão (Perlak et al., 1990). Koziel
et al. (1993), através da inserção de
uma versão modificada do gene
truncado cry1Ab, conseguiram a ex-
pressão da proteína Cry1Ab em al-
tos níveis em plantas de milho e,
em testes de campo, foi verificada a
proteção contra o consumo foliar e
perfuração de colmos por Ostrinia
nubillalis, uma importante praga
da cultura do milho nos EUA.
De acordo com Clive (2002),
estima-se que foram ocupados cerca
de 58,7 milhões de hectares com
culturas transgênicas no ano de 2002,
com um aumento de 11,6% em rela-
ção ao ano anterior (Figura 1). A
Índia, o maior produtor mundial de
algodão, comercializou algodão-Bt
pela primeira vez em 2002. Também,
foi verificado um aumento da área
pré-comercial de algodão-Bt na Co-
lômbia e em Honduras. O EUA foi o
país com maior área plantada, cerca
de 39 milhões de hectares (66%),
seguido pela Argentina (23%), Cana-
dá (6%) e China (4%). A China apre-
sentou o maior incremento anual
(40%) entre 2001 e 2002 na área
plantada com algodão-Bt, ocupando
51% da área cultivada com esta espé-
cie. Em termos mundiais, o milho
geneticamente modificado ocupou
12,4 milhões de hectares (com au-
mento de 9% em relação à área de
2001), seguido pelo algodão e canola
com 6,8 e 3 milhões de hectares,
respectivamente (Figura 2).
2. Vantagens e Limitações
O emprego de biopesticidas à
base de Bt é altamente desejável em
programas de controle de insetos devi-
Figura 1. Adoção mundial de plantas geneticamente modificadas (GM)
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
do à sua alta especificidade e rápida
degradação do ambiente. No entanto,
de acordo com Vaeck et al. (1987),
independentemente das vantagens do
uso de inseticidas à base de toxinas
produzidas pela bactéria Bt, o empre-
go destes produtos em escala comerci-
al é limitado em função da instabilida-
de do cristal protéico em campo, devi-
do à ação da luz ultravioleta e do seu
alto custo de produção. Em relação ao
efeito destas toxinas sobre insetos be-
néficos, Glare & O´Callagham (2000)
relatam estudos realizados sobre o
efeito de várias subespécies e produ-
tos à base de Bt sobre 9 ordens de
predadores, distribuídos em 25 famíli-
as. Em relação aos parasitóides, os
mesmos autores enumeram uma série
de trabalhos realizados com Diptera
(Tachinidae) e Hymenoptera
(Aphelinidae, Braconidae, Chalcididae,
Encyrtidae, Eulophidae, Eupelmidae,
Ichneumonidae, Pteromalidae, Scelio-
nidae e Trichogrammatidae). Em am-
bos os casos, embora os estudos te-
nham mostrado alguma variação nos
resultados, os produtos formulados com
Bt e suas subespécies apresentam pou-
co ou nenhum efeito sobre estes inimi-
gos naturais.
Os benefícios potenciais do uso
de plantas geneticamente modifica-
das como, por exemplo, milho-Bt,
não se limitam apenas à redução na
aplicação de inseticidas de largo
espectro. Estudos mostram a dimi-
nuição dos níveis de micotoxinas
nos grãos destas plantas (Munkvold
et al., 1999).
De acordo com Obrycki et al.
(2001), os riscos ou limitações no
uso das plantas geneticamente mo-
19
 dificadas podem ser agrupados em
três categorias: troca de material
genético entre as plantas genetica-
mente modificadas e espécies selva-
gens aparentadas por meio da dis-
persão de grãos de pólen; a seleção
de indivíduos resistentes na popula-
ção do inseto-alvo de controle e o
impacto da tecnologia sobre outros
insetos e organismos não-alvos do
controle. Com relação à troca de
material genético, segundo Ellstrand
et al. (1999), as plantas domestica-
das e utilizadas em sistemas agríco-
las não podem ser consideradas
como indivíduos evolutivamente se-
parados de seus parentes selvagens.
Dentre as 13 mais importantes espé-
cies utilizadas para a produção de
alimentos, 90% destas formam híbri-
dos com seus parentes selvagens
em algum local dentro de sua área
de distribuição agrícola. Deste modo,
os centros de origem das espécies
seriam os locais mais suscetíveis a
tal fenômeno. A taxa de fluxo gênico
neste caso tende a ser extremamen-
te variável e as suas conseqüências
evolutivas dependem de sua magni-
tude. A conseqüência evolutiva mais
clara do fluxo gênico é a sua tendên-
cia em homogeneizar a composição
genética das populações. A taxa de
fluxo gênico pode ser efetivamente
zero entre plantas com incompatibi-
lidade de cruzamento que estejam
isoladas espacialmente ou que não
apresentem sobreposição de suas
épocas de florescimento. Porém, os
autores chamam a atenção em parti-
cular para os agroecossistemas. Em
tais casos, o plantio concentrado de
uma espécie de interesse econômi-
co pode permitir que outras espéci-
es (ex: plantas daninhas) sofram
hibridização e introgressão de genes
vindos do campo de produção agrí-
cola. Assim, o fluxo gênico entre as
plantas domesticadas e seus paren-
tes selvagens apresenta potencial-
mente duas conseqüências danosas:
o aumento da capacidade de inva-
são de ambientes por algumas espé-
cies e o aumento do risco de extinção
destes parentes selvagens. De acor-
do com Wolfenbarger & Phifer
(2000), modificações genéticas atra-
vés do melhoramento genético, con-
vencional ou através de engenharia
20 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 2. Taxa de adoção mundial das principais culturas GM em 2002
genética, de uma espécie cultivada,
ou não, podem produzir mudanças
e promover a habilidade de um or-
ganismo se tornar invasor de dife-
rentes ecossistemas. Deste modo, a
transferência de pólen de plantas de
milho-Bt para plantas selvagens apa-
rentadas é uma preocupação decor-
rente da adoção desta tecnologia
(Bergelson et al., 1998). No entanto,
esta transferência é limitada a regi-
ões do México e América Central
onde ocorrem plantas do grupo dos
teosíntos (Ellstrand et al., 1999).
O impacto das plantas genetica-
mente modificadas sobre a entomo-
fauna benéfica começou a receber
grande atenção após a publicação de
Losey et al. (1999) na revista Nature.
Este estudo mostrou que o pólen do
milho transgênico expressando toxi-
nas de Bt causou mortalidade de
cerca de 50% das lagartas da borbo-
leta monarca (Dannaus plexippus)
(Lepidoptera: Nymphalidae), quatro
dias após a ingestão. Porém, este
trabalho foi bastante criticado, prin-
cipalmente, por não relatar precisa-
mente a quantidade de toxina utiliza-
da nos bioensaios. Outros estudos,
como os realizados por Leong et al.
(1992) e Hansen & Obrycki (1999)
indicam que este inseto pode ser
afetado pelo milho-Bt, porém os ní-
veis de mortalidade são bastante in-
feriores aos verificados por Losey et
al., (1999). Glare & O´Callagham
(2000) ressaltam que o comporta-
mento do inseto, migração a partir de
áreas com esta toxina, poderia redu-
zir o efeito da toxina sobre esta
espécie.
Deve-se ressaltar que o im-
pacto das plantas geneticamente
modificadas sobre os organismos
não-alvos do controle pode ser
avaliado através de estudos
toxicológicos e/ou ecológicos
(Obrycki et al., 2001). Nos estudos
toxicológicos, o parâmetro avalia-
do é a mortalidade dos herbívoros
e dos consumidores de pólen quan-
do expostos às toxinas de Bt como
realizado por Losey et al. (1999).
Por sua vez, nos estudos ecológi-
cos são observados os efeitos da
utilização destas plantas sobre os
demais níveis tróficos constituin-
tes de uma cadeia alimentar (her-
bívoros predadores e parasitóides).
Ainda existem questionamentos
quanto ao impacto das toxinas pre-
sentes em plantas de milho-Bt so-
bre insetos polinizadores de ou-
tras plantas. Vandenberg (1990)
detectou valores significativos de
mortalidade de abelhas domestica-
das quando expostas à solução de
Bt tenebrionis, o qual é considera-
do específico para coleópteros. Ain-
da, segundo Obrycki et al. (2001),
os efeitos das plantas de milho-Bt
também deveriam ser avaliados
sobre decompositores presentes no
solo (ex: Collembola) e outros pre-
dadores vertebrados. Estes últimos
estudos se justificam já que algu-
mas espécies de pássaros e morce-
gos são predadoras de lepidópteros
que freqüentemente ocorrem em
campos de milho.
Em relação ao efeito de plan-
tas transgênicas sobre inimigos na-
turais, de acordo com Orr & Landis
(1997), o número de predadores e
o parasitismo de massas de ovos
de O. nubilalis não foram adversa-
mente afetados por plantas de mi-
lho-Bt expressando Cry1A(b). En-
tre os predadores foram avaliados
adultos e ninfas do percevejo pre-
dador Orius insidiosus, bem como
adultos e larvas de coccinelídeos e
crisopídeos.
Pilcher et al. (1997) conduziram
estudos em laboratório e campo para
determinar os efeitos de milho-Bt
expressando Cry1A(b) sobre insetos
predadores. No laboratório, não foi
verificado qualquer efeito detrimen-
tal agudo sobre o desenvolvimento
pré-imaginal e sobrevivência de
Coleomegilla maculata, O.
insidiosus e Chrysoperla carnea. No
campo, em estudo realizado por dois
anos consecutivos, não foram ob-
servados efeitos adversos sobre a
abundância de predadores de O.
nubilalis (coccinelídeos, crisopídeos
e antocorídeos) quando compara-
das a áreas de milho não genetica-
mente modificado. Ainda, os núme-
ros de predadores observados an-
tes, durante e após a liberação dos
grãos de pólen pelas plantas de
milho-Bt sugerem que movimento
dos inimigos naturais no campo não
foi afetado por este tipo de pólen.
Os efeitos de presas alimenta-
das com milho-Bt sobre a mortalida-
de e desenvolvimento de larvas do
predador C. carnea foram estuda-
dos em condições de laboratório por
Hilbeck et al. (1998a). O predador
foi criado com lagartas de O.
nubilalis, e Spodoptera litorallis ali-
mentadas com milho contendo a
toxina Cry1A(b). Foi observado pro-
longamento no período larval de
crisopídeos criadas continuamente
com presas que foram alimentadas
com o milho geneticamente modifi-
cado foi significativamente maior
comparada com a testemunha, bai-
xo valor nutricional. Ainda, foi ob-
servado prolongamento no período
larval de crisopídeos criados com
lagartas de O. nubilalis alimentas
com milho geneticamente modifica-
do. Este efeito pode ser atribuído à
exposição à toxina inseticida em
conjunto com o uso de presas de
baixo valor nutricional.
O desenvolvimento e mortali-
dade de formas larvais do preda-
dor Orius majusculus criadas so-
bre tripes Anaphothrips obscurus,
alimentados com milho genetica-
mente modificado expressando a
d-endotoxina Cry1A(b), foi estu-
dado por Zwahlen et al. (2000). A
atividade inseticida das plantas de
milho Bt foi comprovada através
de bioensaios utilizando-se lagar-
tas de O. nubilalis. Não houve
diferença significativa na mortali-
dade e no desenvolvimento das
formas imaturas do predador cria-
das em A. obscurus alimentados
com milho transgênico expressan-
do a toxina Cry1A(b), quando com-
parados à testemunha criada com
tripes não expostos à proteína in-
seticida de B. thuringiensis. Os
resultados obtidos não evidencia-
ram efeitos letais ou subletais nos
indivíduos de O. majusculus no
modelo de interação tritrófica (mi-
lho Bt – herbívoro – predador)
elaborado pelos autores. Segundo
os autores, a resposta de O.
majusculus alimentados com tripes
expostos à Cry1A(b) pode ser
explicada pela insensibilidade des-
te percevejo à toxina ou pela baixa
quantidade de proteína inseticida
ingerida pelos tripes que se ali-
mentaram do milho Bt.
AlDeeb & Wilde (2003) não
identificaram diferenças significati-
vas entre parcelas com milho Bt
Cry3Bb1 e o isogênico, com relação
ao número de insetos não alvos de
controle coletados em armadilhas
do tipo alçapão. As inspeções visu-
ais de adultos e formas imaturas de
C. maculata , O. insidiosus e
Hippodamia convergens também
não mostraram diferenças significa-
tivas entre os materiais testados.
Segundo Al-Deeb et al. (2001), não
houve diferença significativa entre o
número de adultos e ninfas de O.
insidiosus em plantas milho Bt ex-
pressando a toxina Cry1A(b) e mi-
lho convencional em condições de
campo, em duas localidades estuda-
das. Ainda os autores conduziram
teste em laboratório para avaliar os
efeitos de estilo-estigmas de milho-
Bt na mortalidade de formas imatu-
ras de O. insidiosus. Os resultados
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
mostraram que quando criados con-
tinuamente sobre estilo-estigmas de
milho convencional ou milho Bt as
ninfas deste percevejo predador
apresentaram 100% de mortalidade,
sugerindo que estes insetos sofre-
ram com insuficiência nutricional
nesta dieta. Porém, não houve dife-
rença significativa na mortalidade
das ninfas do percevejo quando ali-
mentadas com estilo-estigmas de mi-
lho-Bt ou convencional e ovos de O.
nubilalis em dias alternados.
Segundo Barton & Dracup et al.
(2000), as práticas agrícolas têm cau-
sado impactos ambientais nos ecos-
sistemas. Deste modo, os riscos e
benefícios em potencial da adoção da
tecnologia de plantas geneticamente
modificadas devem ser ponderados
tomando-se como referencial os im-
pactos ambientais decorridos dos sis-
temas atuais de produção agrícola.
Porém, os riscos ao ambiente das
plantas geneticamente modificadas
devem ser avaliados antes de sua
liberação para o plantio comercial, e
posteriormente as áreas ocupadas com
estas culturas devem ser monitoradas.
Portanto, conforme apontado por
Fernandes & Martinelli (2000), os es-
tudos com plantas transgênicas resis-
tentes a insetos em áreas extensas
com o objetivo de se determinar quais
são as espécies indicadoras de impac-
to ambiental destas plantas em um
determinado sistema devem ser
priorizados. Ainda há a necessidade
de se padronizar métodos de avalia-
ção e interpretação de resultados, pos-
sibilitando a avaliação destas plantas
por todo o Brasil. Deste modo, estes
resultados poderiam ser levados a
público promovendo uma ampla dis-
cussão sobre o tema.
Não obstante, a evolução da re-
sistência às toxinas presentes nas
plantas geneticamente modificadas
resistentes a insetos é uma das prin-
cipais preocupações para a liberação
comercial destas plantas. De acordo
com Heckel (1997) a partir do mo-
mento em que ocorrer a liberação
para plantio em áreas extensas, as
toxinas de Bt representarão um im-
portante fator de mortalidade para as
populações dos insetos-alvos. Esta
alta pressão de seleção pode condu-
zir à evolução da resistência a estas
21
 toxinas inseticidas nas populações
dos insetos expostos. Existem várias
conseqüências negativas no desen-
volvimento de resistência às toxinas
de Bt. Além da perda das plantas
transgênicas que expressam tais to-
xinas como opção no controle de
insetos, há o risco de que o uso de
formulações comerciais de insetici-
das à base de Bt não seja mais viável
para a aplicação em lavouras de mi-
lho ou em outras culturas. Os produ-
tores orgânicos perderiam uma im-
portante opção para o manejo de
pragas, o qual é certificado para o seu
sistema de produção. Além disso, as
possibilidades de substituição destes
produtos de origem biológica por
outros são mínimas. O aumento da
utilização de inseticidas sintéticos
também é outra conseqüência em
potencial do desenvolvimento da re-
sistência às toxinas de Bt (EPA, 1998).
3. Evolução da Resistência
a Produtos à Base de Bt e
Plantas Geneticamente
Modificadas
A resistência é um fenômeno
pré-adaptativo que se desenvolve
por seleção de indivíduos raros que
podem sobreviver à aplicação de
um inseticida a uma determinada
dose. Um grande número de fatores
genéticos, bio-ecológicos e opera-
cionais influenciam a taxa de evo-
lução da resistência. Os fatores ge-
néticos incluem a variabilidade na-
tural nas populações, número de
genes envolvidos na manifestação
da resistência e sua freqüência ini-
cial na população (Georghiou &
Taylor, 1977), a herança da caracte-
rística (ex: grau de dominância) e
custo adaptativo associado à resis-
tência (Van Rie & Ferré, 2000). O
potencial das populações de inse-
tos em desenvolver resistência aos
produtos formulados com Bt utili-
zados no controle de pragas é uma
das principais ameaças ao emprego
desta estratégia de controle de pra-
gas agrícolas. A evolução da resis-
tência dos insetos para inseticidas
químicos é bastante comum, com
mais de 500 espécies sendo resis-
tentes a um ou vários inseticidas Já
para os bioinseticidas é comparati-
22 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
vamente mais rara, principalmente
devido ao fato de que estes são
pouco utilizados, se compararmos
com a área tratada com inseticidas
químicos em todo mundo.
Há dois modos de estudar a influ-
ência da variabilidade em populações
naturais sobre a resistência a Bt. A
primeira envolve os estudo das dife-
renças na suscetibilidade entre e den-
tro de populações. Trabalhos neste
sentido foram desenvolvidos por van
Frankenhuyzen et al. (1995) e Huang
et al. (1997) para Choristoneura
fumiferana e O. nubilalis, respectiva-
mente. Outra estimativa da variabilida-
de para genes de resistência em popu-
lações naturais é medir a herdabilidade
(h2) em experimentos laboratoriais a
partir de uma amostra da população.
Este índice representa a proporção da
variação fenotípica de um determina-
do caráter responsável pela variação
genética. Tabashnik (1994a) estimou o
h2 para 8 espécies de insetos, com valor
relativamente alto para Plodia
interpunctella, mostrando abaixa vari-
ação fenotípica e alta variação genética
aditiva deste inseto.
A estimativa indireta da freqüên-
cia dos alelos de resistência é
fornecida por experimentos labora-
toriais que obtiveram êxito em sele-
cionar populações resistentes a Bt
(Van Rie & Ferré, 2000). Nestes ca-
sos, pelo menos uma cópia do alelo
de resistência deve estar presente
para o início da seleção. Em experi-
mentos com lepidópteros (Gould et
al., 1992; 1995), a freqüência de
alelos de resistência nas populações
testadas foi relativamente alta (de 1
a 5 x 10-3).
Quanto à herança da resistên-
cia, McGaughey (1985, 1988) mos-
traram que para P. interpunctella a
herança é autossômica de parcial-
mente a completamente recessiva.
O mesmo foi verificado para Plutella
xylostella por Tabashnik et al. (1992)
e Tang et al. (1997). Em outro traba-
lho com este mesmo inseto, (Ferré
et al., 1991) verificaram que a susce-
tibilidade da progênie F1 depende
do sexo do inseto no cruzamento
parental, ainda que a ligação com o
sexo tenha sido eliminada com base
na razão sexual 1:1 dos sobreviven-
tes da F1 a várias doses da Cry1Ab.
Já para H. virescens os trabalhos
demostraram que os resultados de-
pendem da linhagem do inseto estu-
dada. Por exemplo: para a linhagem
SEL a herança mostrou-se autossô-
mica, incompletamente dominante,
e controlado por vários fatores ge-
néticos (Sims et al., 1991).
Em relação ao número de genes
envolvidos na resistência, para P.
xylostella há trabalhos que indicam
a ocorrência de mais de um gene
envolvido (Tang et al., 1997). Po-
rém, segundo Glare & O´Callagham
(2000), a resistência deste inseto
para Cry1Ab mostra-se recessiva
controlada principalmente por um
único alelo autossômico e recessivo,
embora isto não seja sempre atribu-
ído ao mesmo “loci”. Tabashnik et
al. (1997) relatou que populações
do Hawai e Pensilvânia dividem um
“locus” em que uma mutação reces-
siva associada com a reduzida liga-
ção ao receptor confere resistência
extremamente alta a 4 toxinas de
Bt. Entretanto, outra população, das
Filipinas, mostrou um controle
“multilocus”, de espectro mais re-
duzido, e para algumas toxinas de
Bt, a herança genética não é reces-
siva e não está associada com a
redução da ligação ao receptor. Já
para Heliothis virescens é provável
que um gene principal parcialmen-
te recessivo confere resistência a
várias toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab,
Cry1Ac e Cry1Fa, causando modifi-
cações no receptor (Gould et al.,
1995; Lee et al., 1995).
Embora a resistência em labora-
tório seja obtida em poucas gera-
ções em alguns insetos, ela é na
maioria dos casos instável, reduzin-
do logo após a diminuição da pres-
são de seleção, como foi observado
por Tabashnik et al. (1994) e Tang et
al. (1997) para P. xylostella. O custo
adaptativo associado à evolução da
resistência é a causa mais provável
da instabilidade da resistência em P.
xyllostella. Groeters et al. (1994)
mostraram tal redução no custo adap-
tativo, sendo que após 5 gerações, a
eclosão das lagartas e fecundidade
foram reduzidos em 10% na linha-
gem resistente em comparação com
a suscetível. A compreensão desta
instabilidade pode indicar porque a
 Tabela 1 - Relatos de desenvolvimento de resistência a produtos à base de Bacillus thuringiensis ou
toxinas em laboratório (modificado de Glare & O´Callagham, 2000 e Tabashnik et al., 2003).
Nível de Resistência
Inseto Subespécie Toxina(s)
resistência cruzada
Choriston eura
sotto 3,8 x - -
fumiferan a
Crysomela scripta - acima 5.000 x Cry3Aa Cry1Ba
ten ebrion is 59 x Cry3 -
Ephestia cautella kurstaki 7x - -
Homeoeosoma
kurstaki 1,7 x -
electellum
Heliothis armigera Cry1Ac 13 - 57 x -
H. virescen s kurstaki HD-1 mais de 24 x Cry1 -
kurstaki HD-1 12- 69 x Cry1Ab -
- 50 - 53 x Cry1Ac Cry1Ab, Cry2A
Cry1Aa, Cry1Ab,
- 10.000 x Cry1Ac Cry1F, Cry1B, Cry1C
e Cry2A
Leptin otarsa
Cry3A acima 100 e 400 x
decemlin eata
Ostrin ia n ubilalis - baixo nível Cry1Ab
kurstaki acima 73 x - -
Pectin ophora
- 3.100 Cry1Ac -
gossypiella
Plodia in terpun ctella kurstaki acima de 250 x - -
thurin gien sis,
kurstaki (Dipel) acima 250 x - kurstaki (menos
HD-1) e galleriae
kurstaki (Dipel) acima de 25 x - -
kurstaki (Dipel) acima 106 x Cry1Ab -
cerca de 875 x Cry1Ab -
kurstaki 140 x - -
aizawai 28 - 61 x - -
en tomocidus 21 x - -
Plutella xylostella kurstaki 15 - 66 x - -
Cry1C, Cry1Aa,
- 22 - 62 x Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry1J
Cry1F e Cry2
Cry1C 12.400 -
300 - acima de 6.800
Cry1Ac -
x
Spodoptera exigua kurstaki 1-2 x - -
Cry1Ab, Cry1C,
850 x Cry1C Cry1E/Cry1C, Cry1H
e Cry2A
S. frugiperda kurstaki 4,9 x - -
Cry1D, Cry1E e
S. littoralis aizawai mais de 500 x Cry1C
Cry1Ab
Trichoplusia n i 31 x Cry1Ab Cry1Aa ou Cry1Ac
kurstaki + aizawai 15 x - -
kurstaki HD-1 307 x - -
aizawai HD-112 e HD-1, 198, 133 e
28 e 97 x -
HD-133 HD-1, 112 e 198
en tomocidus HD-
32 x HD-1, 112 e 133 -
198
kurstaki + aizawai 164 e 62-100 x en tomocidus -

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 23

 Tabela 2 - Relatos de possível desenvolvimento de resistência de insetos
para Bacillus thuringiensis em campo (Glare & O´Callagham, 2000).
Inseto Subespécie Nível de resistência Toxina(s)
Helicoverpa armigera kurstaki - campo (Tabashnik et al., 1997),
Heliothis virescen s MVP II Tolerante Cry1Ac
Plodia in terpun ctella kurstaki Baixo
Plutella xylostella kurstaki 25 - 426 x Cry1Ab
aizawai 3 - 20 x Cry1Ac
Spodoptera frugiperda kurstaki 1,48 x
evolução da resistência ao Bt é tão (Tabela 1). Para a maioria das espé-
rara e pode auxiliar na elaboração cies testadas a resistência evolui rapi-
de estratégias para incrementar a damente para Bt kurstaki, Bt
utilização deste bioinseticida entomocidus e Bt tenebrionis ou Bt
(Tabashnik et al., 1994). aizawai. Quando a diferença entre
A alteração da atividade proteo- as populações suscetíveis e resisten-
lítica (ativação da toxina) foi verifica- tes é menor que 10, não fica claro se
da em P. interpunctella para Bt a população desenvolveu resistên-
entomocidus e Bt kurstaki (Johnson cia, propriamente dita, ou se existe
et al., 1990; Oppert et al., 1997). Em tolerância entre subgrupos ou
trabalho semelhante realizado por genótipos da espécie em questão
Van Rie et al. (1990), foi observada a (Glare & O´Callagham, 2000).
redução de 50 vezes na afinidade da O primeiro exemplo de resistên-
toxina pelo receptor. Porém, os auto- cia em laboratório ocorreu com Musca
res não verificaram alteração no nú- domestica ao Bt thuringiensis, pro-
mero de receptores presentes para vavelmente envolvendo b-exotoxina.
Cry1Ab na linhagem resistente. Estes De modo semelhante, trabalhos mos-
dados indicam que a resistência, nes- traram uma evolução de resistência
te caso, é devida a alterações no de 10 da mesma toxina para
receptor de Cry1Ab, pois o mesmo Drosophila melanogaster em 30 ge-
decréscimo de afinidade não foi ob- rações (Harvey & Howell, 1964; Wil-
servado para Cry1Ca, que possui 3 son & Burns, 1968; Carlberg &
vezes mais receptores que a outra Lindstrom, 1987).
toxina. Este elevado número de re- A partir do primeiro relato de
ceptores pode explicar a alta susceti- resistência de Plodia interpunctella a
bilidade da linhagem selecionada para d-endotoxina (McGaughey &
Cry1Ca. Para H. virescens foi verifica- Beeman, 1988), vários relatos de de-
do por Lee et al. (1995) que a ligação senvolvimento de resistência em la-
da toxina Cry1Aa ao receptor foi boratório foram feitos. Em alguns
drasticamente reduzida, mas o mes- casos os estudos envolvem a suspen-
mo não foi verificado para Cry1Ab e são esporo + cristal enquanto que em
Cry1Ac. Porém, as toxinas do grupo outros casos apenas toxina(s). Em
Cry1A dividem os mesmos recepto- alguns casos níveis elevados de re-
res nesta espécie de inseto, portanto sistência foram obtidos em apenas
Cry1Ac e Cry1Ab também se ligam algumas gerações usando-se alta pres-
ao receptor de Cry1Aa. Consequen- são de seleção, como por exemplo:
temente foi considerada a hipótese P. interpunctella para Bt kurstaki e P.
que o receptor alterado para Cry1Aa xylostella para Bt aizawai Cry1C, de
causa resistência ao 3 subclasses de 3 e 6 gerações respectivamente (Glare
Cry1A (Van Rie & Ferré, 2000). & O´Callagham, 2000).
Exemplos de Resistência de In- 2) Em campo
setos a produtos à base de Bacillus
thuringiensis: Embora alguns trabalhos reali-
zados em laboratório com alta pres-
1) Em laboratório são de seleção de Bt sobre P.
xylostella (traça-das-crucíferas) [sic]
Existem vários relatos de evolu- não tenha sido verificado alteração
ção da resistência a Bt em laboratório significativa na suscetibilidade
24 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
(Devriendt & Martouret, 1976), este
inseto foi o primeiro a mostrar evo-
lução de resistência para Bt em
sendo, até o momento, o único
exemplo em que foi verificada a
evolução da resistência em campo
de um inseto para Bt, embora para
outras espécies de lepidópteros (Ta-
bela 1) tenha sido sugerido esta
possibilidade, porém pouca dife-
rença na suscetibilidade foi verifi-
cada entre as populações de campo
(resistente) e a de referência em
laboratório (suscetível). Segundo
Glare & O´Callagham (2000), ou-
tros relatos de resistência deste in-
seto a produtos à base de Bt foram
feitos em vários países como
Tailândia, Havaí, Japão, Coréia, Chi-
na, EUA e América Central.
A espécie influencia a probabi-
lidade de evolução da resistência
devido à variabilidade genética na
população e à possibilidade de en-
contrar o inóculo. Por exemplo, o
hábito migratório e polífago de
Helicoverpa punctigera leva à dilui-
ção de qualquer população resisten-
te devido ao cruzamento de indiví-
duos resistentes com suscetíveis,
entretanto, P. xylostella é um inseto
com mobilidade limitada, não ocor-
rendo à diluição da resistência, pelo
cruzamento com insetos suscetíveis
vindos de outras áreas (Glare &
O´Callagham, 2000).
A incidência de resistência cru-
zada é geralmente baixa, mas foi
verificada para várias toxinas (Ta-
bela 1). Esta parece estar ligada a
composição da toxina do isolado
utilizado. McGaughey & Johnson
(1994) realizam um estudo detalha-
do abordando a resistência para as
toxinas individualmente após a se-
leção para resistência aos isolados
Bt kurstaki (HD-1), Bt aizawai (HD-
112 e 133) e Bt entomocidus (HD-
198). Para P. interpunctella, HD-1
resultou em resistência para Cry1Ab
e Cry1Ac, mas não para Cry1Aa,
Cry1B, Cry1C e Cry2A. Resistência
para HD-133 e HD-198 resultou em
resistência a uma maior gama de
toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac,
Cry1B, Cry1C e Cry2A. Os autores
sugeriram que o espectro relativa-
mente limitado de resistência às
diferentes toxinas em Bt kurstaki
indicou que a resistência cruzada a
outras subespécies era menos pro-
vável de ocorrer, portanto produtos
baseados em Bt kurstaki deveriam
ser utilizados primeiro. A resistên-
cia de Heliothis virescens é normal-
mente relatada à toxina Cry1Ac,
porém existem relatos de resistên-
cia para outras toxinas como:
Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1F e Cry2A
(Gould et al., 1992).
4. Manejo da Resistência
Os programas de manejo da
resistência apresentam 3 objetivos
principais: evitar, retardar e rever-
ter a evolução da resistência (Croft,
1990). Estes objetivos são os mes-
mos para o manejo da resistência a
produtos à base de Bt sendo mui-
tas táticas baseadas nos princípios
mostrados para plantas genetica-
mente modificadas. No caso das
plantas Bt são preconizadas várias
estratégias, tais como plantas com
altas doses das toxinas associadas
a áreas de refúgio, misturas de
plantas com diferentes toxinas, mo-
saicos de plantas geneticamente
modificadas, combinações de toxi-
nas com diferentes modos de ação,
ou a combinação de plantas ex-
pressando baixas doses das toxi-
nas e controle complementar das
pragas pelos inimigos naturais e a
expressão das toxinas em determi-
nados tecidos ou em um período
de ataque mais intenso da praga
(Neppl, 2000).
A estratégia empregada nos
países com plantio de milho Bt
onde as pragas apresentam hábito
migratório dos adultos e alta mobi-
lidade nas formas larvais tem sido
a utilização de plantas expressan-
do altas doses das toxinas associa-
das às áreas de refúgio. Esta tática
começou a ser adotada baseando-
se no princípio de que os insetos
suscetíveis poderiam imigrar para
uma área com predominância de
insetos resistentes e, por cruza-
mento, diluir os alelos de resistên-
cia na população da praga. Este
princípio apenas é valido com a
expressão das toxinas de Bt em
altas doses de modo que a resis-
tência seja funcionalmente reces-
siva. Deste modo, apenas restari-
am na área com plantas genetica-
mente modificadas os indivíduos
resistentes. O refúgio pode variar
em tamanho e disposição e servir
como reservatório de insetos sus-
cetíveis. O sucesso desta estraté-
gia depende das seguintes condi-
ções: que o acasalamento seja ale-
atório entre os indivíduos resisten-
tes e suscetíveis, que os insetos
suscetíveis migrem da área de re-
fúgio para a área com as plantas
geneticamente modificadas e exis-
ta sincronia na emergência de in-
setos entre as duas áreas.
Outra estratégia possível para
a liberação de plantas genetica-
mente modificadas é a mistura de
sementes transgênicas e convenci-
onais na forma de linhas da cultura
ou faixas de plantio. Uma área que
utilize esta estratégia resulta numa
mistura de plantas-Bt e convencio-
nais. Deste modo, o refúgio de
plantas convencionais seria dis-
posto internamente na área com as
plantas transgênicas. Este refúgio
interno consistiria no reservatório
de suscetibilidade para o forneci-
mento de indivíduos suscetíceis
para acasalamento aleatório com
os resistentes que restariam nas
plantas geneticamente modifica-
das. A principal limitação deste
método é a taxa de movimento
entre plantas nas formas larvais da
praga-alvo de controle. Esta tática
é indicada para casos específicos
nos quais a forma larval da praga
que se encontra nas plantas con-
vencionais não se disperse para
plantas geneticamente modificadas
resistentes causando a morte dos
indivíduos suscetíveis.
A mistura de sementes na for-
ma de linhas de plantio com semen-
tes convencionais internamente à
área de algodão Bt têm sido utiliza-
da com sucesso no Arizona, EUA,
para o manejo de lagarta rosada
Pectinophora gossypiella. Neste
caso, a lagarta rosada permanece
dentro das maçãs atacadas o que
limita o movimento das formas
larvais desta espécie entre as plan-
tas garantindo a sobrevivência dos
indivíduos suscetíveis. Esta estraté-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
gia não seria adequada para o ma-
nejo de S. frugiperda já que está
espécie apresenta alta mobilidade
na sua larval. A técnica do plantio
em forma de mosaico envolve áreas
com plantas Bt expressando dife-
rentes toxinas inseticidas. Deste
modo, os insetos estariam sofrendo
diferentes pressões de seleção ao
longo da faixa de plantio de áreas
geneticamente modificadas. No
entanto, para que esta estratégia
funcione é importante que não ocor-
ra resistência cruzada entre as toxi-
nas empregadas. Além disso, exis-
tem críticas quanto à possível efici-
ência das diferentes áreas Bt em
atuarem como reservatórios de sus-
cetibilidade recíprocos, o que pos-
sibilitaria a imigração de indivíduos
suscetíveis entre as diferentes áre-
as para a diluição dos alelos de
resistência.
Outra alternativa viável é a rota-
ção de plantas dispondo deferentes
toxinas inseticidas. Assim como no
caso do mosaico, a resistência cruza-
da entre as toxinas pode comprome-
ter a eficácia deste método. As bases
teóricas na estratégia da rotação são
que o custo adaptativo associado à
resistência leva a redução da fre-
qüência dos indivíduos suscetíveis e
a imigração de indivíduos suscetí-
veis. (Hoy, 1988).
A expressão da toxina de Bt em
tecidos e estádio fenológicos ade-
quados específicos é uma estratégia
que visa diminuir a pressão de sele-
ção das plantas-Bt sobre a popula-
ção de insetos (Frutos et al., 1999).
Esta estratégia é similar ao uso de
áreas refúgio e mistura de sementes
no sentido que a própria planta
pode atuar como refúgio (Mallet &
Porter, 1992). As plantas poderiam
produzir as toxinas somente quando
o nível de dano fosse alcançado ou
em determinados tecidos mais pro-
pensos ao ataque. No entanto, esta
estratégia não funcionaria para pra-
gas que atacam todas as partes da
planta. Além disso, esta tática é
dependente de estudos avançados
em biologia molecular a fim de se
encontrar os promotores específi-
cos que seriam responsáveis pelo
direcionamento da expressão das
toxinas inseticidas.
25
 Embora estudos conduzidos em
laboratório relatem a casos de resis-
tência as toxinas de Bt e freqüência
inicial elevada de resistência, nos
países que adotam a tecnologia de
plantas Bt no manejo das pragas os
programas de monitoramento não
detectaram ainda aumento na
frequência de resistência (Tabashnik
et. al.,2003). Exemplos de progra-
mas de monitoramento estabeleci-
dos e bem sucedidos incluem O.
nubilalis (Estados Unidos – 6 anos),
P. gossypiella (Arizona-5 anos),
Helicoverpa armigera (Nordeste da
China-3 anos) e Helicoverpa zea (Ca-
rolina do Norte-2 anos).
Assim, torna-se fundamental o
desenvolvimento de programas de
monitoramento como parte dos pro-
gramas que visem manejar a evolu-
ção da resistência. Entretanto, as
estratégias para o manejo da resis-
tência somente obtêm o êxito espe-
rado se forem adequadamente
implementadas. É importante que o
agricultor compreenda estas estraté-
gias, além do monitoramento e as-
sistência técnica para o sucesso des-
tes programas (Neppl, 2000). Ainda
são necessários estudos para otimizar
os resultados obtidos com as estra-
tégias de manejo da resistência, en-
tre estes, destacam-se as pesquisas
voltadas para os hábitos dos insetos
(migração e acasalamento) que po-
dem influenciar decisivamente na
viabilidade das táticas empregadas.
Dificilmente pode-se assegurar o
êxito destes programas, pois em
campo muitas variáveis são soma-
das aos modelos propostos e, atual-
mente, nenhuma das táticas acima
descritas são completamente aceitá-
veis em termos de eficácia.
5. Considerações Finais
O uso das estratégias de mane-
jo implica significativa demanda de
mão-de-obra especializada, princi-
palmente no sentido de monitorar a
evolução da resistência em áreas
cultivadas com plantas genetica-
mente modificadas expressando
toxinas de Bt. Geralmente, a assis-
tência técnica disponível aos agri-
cultores limita-se a recomendação
de insumos para viabilizar sua ativi-
26 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
dade agrícola, de maneira que os
extensionistas dificilmente atuam
como agentes introdutórios de no-
vas tecnologias e conhecedores do
seu impacto sobre o meio onde
atuam. Além de determinar o im-
pacto das plantas transgênicas so-
bre o meio ambiente, é necessário
também instruir e qualificar tanto o
agricultor como o extensionista so-
bre o potencial desta moderna táti-
ca de controle de pragas. A imple-
mentação de estratégias de manejo
de resistência e programas de mo-
nitoramento são fundamentais para
a exploração sustentável da tecno-
logia das plantas Bt. Estas ativida-
des são exigentes em mão-de-obra
treinada e apoio logístico pelos pro-
dutores rurais, órgãos de assistên-
cia técnica, grupos de consultores
envolvidos com a cultura e das
empresas produtoras de sementes
geneticamente modificadas.
Por fim, não é correto se pensar
que as plantas geneticamente modi-
ficadas serão a alternativa definitiva
para o controle de pragas. O sistema
planta-inseto deve ser estudado e
avaliada a relação custo x benefício
da adoção destas plantas genetica-
mente modificadas resistentes a in-
setos. Deve-se conhecer toda a gama
de alternativas existentes e escolher
aquela que melhor viabiliza a ativi-
dade agrícola, porém levando-se em
conta o seu impacto sobre o meio
ambiente em comparação às demais
alternativas disponíveis para o con-
trole de pragas.
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27
 Pesquisa
Luiz Pereira Ramos, Ph.D.
Professor Adjunto IV, Departamento de Química,
Universidade Federal do Paraná
lramos@quimica.ufpr.br
Karla Thomas Kucek, B.Sc.
Mestranda em Química Orgânica, Departamento
de Química, Universidade Federal do Paraná
k.kucek@hotmail.com
Anderson Kurunczi Domingos, B.Sc.
Mestrando em Química Orgânica, Departamento
de Química, Universidade Federal do Paraná
anderson@quimica.ufpr.br
Helena Maria Wilhelm, Ph.D.
Pesquisadora, Unidade Tecnológica de Química
Aplicada, Depto. de Química Aplicada, Instituto
de Tecnologia para o Desenvolvimento, LACTEC
helenaw@lactec.org.br
Ilustrações cedidas pelos autores
28 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Biodiesel
Um projeto de sustentabilidade econômica e sócio-ambiental para o Brasil
1 - Introdução
Desde o século passado, os com-
bustíveis derivados do petróleo têm
sido a principal fonte de energia
mundial. No entanto, previsões de
que esse recurso deva chegar ao fim,
somadas às crescentes preocupações
com o ambiente, têm instigado a
busca de fontes de energia renovável
(Ghassan et al., 2003).
O Protocolo de Quioto, concebi-
do durante o fórum ambiental Rio-92
e ratificado, desde então, por mais de
93 países, vem tentando mobilizar a
comunidade internacional para que
promova uma ação conjunta com o
objetivo de estabilizar na atmosfera a
concentração dos gases causadores
do efeito estufa e, assim, limitar a
interferência antropogênica sobre o
sistema climático global (Greenpeace
International, 2003). Infelizmente, os
termos do referido acordo somente
entrarão rigorosamente em vigor
quando o conjunto de seus signatári-
os somar, no mínimo, 55% do total de
países emissores do globo, algo que
somente será possível com a ratifica-
ção de, pelo menos, uma das grandes
potências mundiais, a Rússia ou os
Estados Unidos. Em pronunciamen-
tos recentes, o Presidente da Rússia,
Vladimir Putin, declarou estar ainda
avaliando as condições que levarão o
seu país a tomar tal decisão, demons-
trando que, apesar da evidência de
que o acúmulo desses gases na at-
mosfera comprometa fortemente o
equilíbrio dos diferentes ecossiste-
mas terrestres, interesses geopolíticos
e/ou comerciais têm prevalecido so-
bre os mais eloqüentes interesses da
humanidade.
O Brasil, apesar de não ser um
grande emissor de gases poluentes,
vem promovendo medidas condizen-
tes com essa nova conjuntura, atra-
vés do desenvolvimento e da atuali-
zação periódica de inventários naci-
onais sobre o tema (Ministério da
Ciência e Tecnologia, 2002). No
momento em que o mercado de car-
bono estiver regulamentado, esses
inventários terão uma importância
vital para que o país possa conquistar
espaço e usufruir dessa nova estraté-
gia de redistribuição de riquezas e de
inclusão social.
Sabe-se que as metas estabele-
cidas pelo Protocolo de Quioto so-
mente poderão ser alcançadas pelo
uso sustentado da biomassa para
fins energéticos. No entanto, recen-
tes levantamentos demonstram que
apenas 2,2% da energia consumida
no mundo é proveniente de fontes
renováveis (Pessuti, 2003), o que
evidencia um extraordinário poten-
cial para a exploração de outras
fontes. Considerando-se apenas a
biomassa proveniente de ativida-
des agroindustriais, ou seja, resídu-
os agrícolas, florestais e agropecu-
ários, calcula-se que o potencial
combustível desse material seja
equivalente a, aproximadamente,
6.587 milhões de litros de petróleo
ao ano (Staiss e Pereira, 2001). Di-
ante de todo esse potencial, tem
havido uma crescente dissemina-
ção de projetos e de ações voltados
para o uso de óleos vegetais e de
resíduos urbanos e agroindustriais
para a geração de energia, particu-
larmente por meio de projetos de
co-geração (Cenbio, 2003).
2 - Óleos vegetais como
fonte de energia renovável
Por se tratar de uma fonte de
energia renovável e por seu uso
sustentado não provocar danos ao
meio ambiente, a biomassa tem atra-
ído muita atenção nos últimos tem-
pos (Ministério da Indústria e do
Comércio, 1985; Ministério da Ciên-
cia e Tecnologia, 2002; U.S.
Department of Energy, 1998). Den-
tre as fontes de biomassa pronta-
mente disponíveis, os óleos vege-
tais têm sido largamente investiga-
dos como candidatos a programas
de energia renovável, pois proporci-
onam uma geração descentralizada
de energia e um apoio à agricultura
familiar, criando melhores condi-
ções de vida (infra-estrutura) em
regiões carentes, valorizando po-
tencialidades regionais e oferecen-
do alternativas a problemas econô-
micos e sócio-ambientais de difícil
solução.
A utilização de óleos vegetais in
natura como combustível alternati-
vo tem sido alvo de diversos estudos
nas últimas décadas (Nag et al., 1995;
Piyaporn et al., 1996). No Brasil, já
foram realizadas pesquisas com os
óleos virgens de macaúba, pinhão-
manso, dendê, indaiá, buriti, pequi,
mamona, babaçu, cotieira, tingui e
pupunha (Barreto, 1982; Ministério
da Indústria e do Comércio, 1985;
Serruya, 1991) e nos testes realizados
com esses óleos em caminhões e
máquinas agrícolas, foi ultrapassada
a meta de um milhão de quilômetros
rodados (Ministério da Indústria e do
Comércio, 1985). No entanto, esses
estudos demonstraram a existência
de algumas desvantagens no uso di-
reto de óleos virgens: (a) a ocorrên-
cia de excessivos depósitos de carbo-
no no motor; (b) a obstrução nos
filtros de óleo e bicos injetores; (c) a
diluição parcial do combustível no
lubrificante; (d) o comprometimento
da durabilidade do motor; e (e) um
aumento considerável em seus cus-
tos de manutenção.
Outros autores (Goering e Fry,
1984; Kobmehl e Heinrich, 1998;
Ghassan et al., 2003) demonstraram
que a alta viscosidade e a baixa
volatilidade dos óleos vegetais in
natura podem provocar sérios pro-
blemas ao bom funcionamento do
motor. Dentre os problemas que
geralmente aparecem após longos
períodos de utilização, destacam-se
a formação de depósitos de carbono
por combustão incompleta, a dimi-
nuição da eficiência de lubrificação
do óleo pela ocorrência de polime-
rização (no caso de óleos poli-insa-
turados) e a atomização ineficiente
e/ou entupimento dos sistemas de
injeção (Peterson et al., 1983; Pryde,
1983; Ma e Hanna, 1999).
Para resolver as desconformi-
dades descritas acima, houve um
considerável investimento na adap-
tação dos motores para que o uso
de óleos vegetais in natura pudes-
se ser viabilizado, particularmente
na produção de energia elétrica em
geradores movidos por motores es-
tacionários de grande porte. Nesses
casos, o regime de operação do
motor é constante e isso facilita o
ajuste dos parâmetros para garantir
uma combustão eficiente do óleo
vegetal, podendo ser utilizada, in-
clusive, uma etapa de pré-aqueci-
mento (pré-câmaras) para diminuir
a sua viscosidade e facilitar a inje-
ção na câmara de combustão. No
entanto, para motores em que o
regime de funcionamento é variá-
vel (e.g., no setor de transportes),
foi necessário desenvolver uma me-
todologia de transformação quími-
ca do óleo para que suas proprieda-
des se tornassem mais adequadas
ao seu uso como combustível. As-
sim, em meados da década de 70,
surgiram as primeiras propostas de
modificação de óleos vegetais atra-
vés da reação de transesterificação
(Figura 1), cujos objetivos eram os
de melhorar a sua qualidade de
ignição, reduzir o seu ponto de
Figura 1. Reação de transesterificação de óleos vegetais e/ou gorduras animais.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
fluidez, e ajustar os seus índices de
viscosidade e densidade específica
(Shay, 1993, Stournas et al., 1995;
Ma e Hanna, 1999).
3 - O biodiesel como
alternativa para a matriz
energética nacional
Por definição, biodiesel é um
substituto natural do diesel de pe-
tróleo, que pode ser produzido a
partir de fontes renováveis como
óleos vegetais, gorduras animais e
óleos utilizados para cocção de ali-
mentos (fritura). Quimicamente, é
definido como éster monoalquílico
de ácidos graxos derivados de
lipídeos de ocorrência natural e
pode ser produzido, juntamente com
a glicerina, através da reação de
triacilgliceróis (ou triglicerídeos)
com etanol ou metanol, na presen-
ça de um catalisador ácido ou bási-
co (Schuchardt et al., 1998; Zagonel
e Ramos, 2001; Ramos, 1999, 2003).
Embora essa tenha sido a definição
mais amplamente aceita desde os
primeiros trabalhos relacionados
com o tema, alguns autores prefe-
rem generalizar o termo e associá-
lo a qualquer tipo de ação que
promova a substituição do diesel
na matriz energética mundial, como
nos casos do uso de: (a) óleos
vegetais in natura, quer puros ou
em mistura; (b) bioóleos, produzi-
dos pela conversão catalítica de
óleos vegetais (pirólise); e (c) mi-
croemulsões, que envolvem a inje-
ção simultânea de dois ou mais
combustíveis, geralmente
imiscíveis, na câmara de combus-
tão de motores do ciclo diesel (Ma
e Hanna, 1999). Portanto, é impor-
tante frisar que, para os objetivos
deste artigo, biodiesel é tão-somente
definido como o produto da tran-
sesterificação de óleos vegetais que
atende aos parâmetros fixados pe-
las normas ASTM D6751 (American
Standard Testing Methods, 2003) e
29
 DIN 14214 (Deutsches Institut für
Normung, 2003), ou pela Portaria
no 255 da ANP (Agência Nacional
do Petróleo, 2003) que, apesar de
provisória, já estabelece as especi-
ficações que serão exigidas para
que esse produto seja aceito no
mercado brasileiro. A grande com-
patibilidade do biodiesel com o
diesel convencional o caracteriza
como uma alternativa capaz de aten-
der à maior parte da frota de veícu-
los a diesel já existente no merca-
do, sem qualquer necessidade de
investimentos tecnológicos no de-
senvolvimento dos motores. Por
outro lado, o uso de outros com-
bustíveis limpos, como o óleo in
natura, as microemulsões, o gás
natural ou o biogás requerem uma
adaptação considerável para que o
desempenho exigido pelos moto-
res seja mantido (Laurindo, 2003).
Do ponto de vista econômico, a
viabilidade do biodiesel está relacio-
nada com o estabelecimento de um
equilíbrio favorável na balança co-
mercial brasileira, visto que o diesel
é o derivado de petróleo mais consu-
mido no Brasil, e que uma fração
crescente desse produto vem sendo
importada anualmente (Nogueira e
Pikman, 2002).
Em termos ambientais, a ado-
ção do biodiesel, mesmo que de
forma progressiva, ou seja, em adi-
ções de 2% a 5% no diesel de
petróleo (Ministério da Ciência e
Tecnologia, 2002), resultará em uma
redução significativa no padrão de
emissões de materiais particulados,
óxidos de enxofre e gases que con-
tribuem para o efeito estufa
(Mittelbach et al., 1985). Sendo as-
sim, sua difusão, em longo prazo,
Tabela 1. Número de iodo e composição química em ácidos graxos de alguns dos principais óleos vegetais
e gorduras animais disponíveis para a produção de biodiesel (adaptado de Alsberg e Taylor, 1928).
Número
Fonte
de I odo Láurico Mirístico Palmítico Esteárico Oléico Linoléico Linolênico
Sebo bovino 38-46 - 2,0
Banha (suínos) 46-70 - -
Côco 8,10 45,0 20,0
Oliva 79-88 - -
Amendoin 83-100 - -
Algodão 108-110 - -
Milho 111-130 - -
Flax 173-201 - 3,0
Soja 137-143 - -
30 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
proporcionará maiores expectati-
vas de vida à população e, como
conseqüência, um declínio nos gas-
tos com saúde pública, possibili-
tando o redirecionamento de ver-
bas para outros setores, como edu-
cação e previdência. Cabe aqui ain-
da ressaltar que a adição de biodiesel
ao petrodiesel, em termos gerais,
melhora as características do com-
bustível fóssil, pois possibilita a
redução dos níveis de ruído e me-
lhora a eficiência da combustão
pelo aumento do número de cetano
(Gallo, 2003).
Em diversos países, o biodiesel
já é uma realidade. Na Alemanha,
por exemplo, existe uma frota signi-
ficativa de veículos leves, coletivos
e de carga, que utilizam biodiesel
derivado de plantações específicas
para fins energéticos e distribuído
por mais de 1.000 postos de abaste-
cimento. Outros países também têm
desenvolvido os seus programas na-
cionais de biodiesel e, como conse-
qüência, o consumo europeu de bi-
odiesel aumentou em 200.000 ton.
entre os anos de 1998 e 2000. Já nos
Estados Unidos, leis aprovadas nos
estados de Minnesotta e na Carolina
do Norte determinaram que, a partir
de 1º/1/2002, todo o diesel consu-
mido deveria ter a incorporação de,
pelo menos, 2% de biodiesel em
base volumétrica.
No Brasil, desde as iniciativas
realizadas na década de 80, pouco se
investiu nesse importante setor da
economia, mas a reincidência de tur-
bulências no mercado internacional
do petróleo, aliada às pressões que o
setor automotivo vem sofrendo dos
órgãos ambientais, fez com que o
Governo atual iniciasse um novo tra-
Principais Ácidos Graxos
29,0 24,5 44,5
24,6 15,0 50,4
5,0 3,0 6,0
14,6 - 75,4
8,5 6,0 51,6
23,4 - 31,6
6,0 2,0 44,0
6,0 - -
11,0 2,0 20,0
balho com vistas à utilizar óleos ve-
getais transesterificados na matriz
energética nacional. Esse trabalho foi
recentemente materializado na for-
ma de um programa nacional,
intitulado PROBIODIESEL (Portaria
no. 702 do MCT, de 30 de outubro de
2002), cujo lançamento solene foi
realizado em Curitiba durante a ceri-
mônia de abertura do Seminário In-
ternacional de Biodiesel (24 a 26 de
outubro, Blue Tree Towers Hotel).
Naquela mesma ocasião, foi também
divulgada a criação do CERBIO, Cen-
tro Nacional de Referência em Bio-
combustíveis, nas dependências do
Tecpar, em Curitiba. A missão do
CERBIO será a de desenvolver o
conceito de biocombustíveis em sua
plenitude, desde a certificação de
produtos até o desenvolvimento tec-
nológico de novas rotas que contri-
buam para o aumento da viabilidade
e competitividade técnica do biodiesel
nacional.
Ao longo dos últimos anos, o
PROBIODIESEL vem se desenvol-
vendo por meio de ações integradas
entre instituições de tecnologia, en-
sino e pesquisa, e empresas e asso-
ciações direta ou indiretamente liga-
das ao tema, sob a forma de grupos
de trabalho que integram a chamada
Rede Brasileira de Biodiesel. Esse
programa tem como principal obje-
tivo promover o desenvolvimento
das tecnologias de produção e ava-
liar a viabilidade e a competitividade
técnica, sócio-ambiental e econômi-
ca do biodiesel para os mercados
interno e externo, bem como de sua
produção e distribuição espacial nas
diferentes regiões do país (Andrade,
2003; Ministério da Ciência e Tecno-
logia, 2002).
- -
10,0 -
- -
10,0 -
26,0 -
45,0 -
48,0 -
74,0 17,0
64,0 3,0
 4 - Principais matérias-
primas para a produção de
biodiesel
De uma forma geral, pode-se
afirmar que monoalquil-ésteres de
ácidos graxos podem ser produzi-
dos a partir de qualquer tipo de
óleo vegetal (Tabela 1), mas nem
todo óleo vegetal pode (ou deve)
ser utilizado como matéria-prima
para a produção de biodiesel. Isso
porque alguns óleos vegetais apre-
sentam propriedades não ideais,
como alta viscosidade ou alto nú-
mero de iodo, que são transferidas
para o biocombustível e que o tor-
nam inadequado para uso direto
em motores do ciclo diesel. Portan-
to, a viabilidade de cada matéria-
prima dependerá de suas respecti-
vas competitividades técnica, eco-
nômica e sócio-ambiental, e pas-
sam, inclusive, por importantes as-
pectos agronômicos, tais como: (a)
o teor em óleos vegetais; (b) a
produtividade por unidade de área;
(c) o equilíbrio agronômico e de-
mais aspectos relacionados com o
ciclo de vida da planta; (d) a aten-
ção a diferentes sistemas produti-
vos; (e) o ciclo da planta (sazonali-
dade); e (f) sua adaptação territorial,
que deve ser tão ampla quanto
possível, atendendo a diferentes
condições edafoclimáticas (Ramos,
1999, 2003).
Dada a grandeza do agrone-
gócio da soja no mercado brasilei-
ro, é relativamente fácil e imediado
reconhecer que essa oleaginosa
apresenta o maior potencial para
servir de modelo para o desenvol-
vimento de um programa nacional
de biodiesel. Apenas como exem-
plo, dados divulgados pela Abiove
(Associação Brasileira dos Produ-
tores de Óleos Vegetais) demons-
tram que o setor produtivo da soja
já está preparado para atender à
demanda nacional de misturar até
5% de biodiesel no diesel de petró-
leo, sendo que proporções superi-
ores a esta mereceriam uma nova
avaliação para que não haja dúvi-
das quanto ao abastecimento de
óleo a esse novo setor da econo-
mia. Por outro lado, segundo da-
dos oficiais da Embrapa (Peres e
Junior, 2003), o Brasil apresenta
um potencial de 90 milhões de
hectares disponíveis, em áreas de-
gradadas e/ou não exploradas, para
a expansão da atual fronteira agrí-
cola. Considerando-se apenas a uti-
lização da soja como matéria-pri-
ma para a produção de biodiesel,
serão necessários apenas 3 milhões
de hectares, ou 1,8 bilhões de li-
tros de óleo, para a implementa-
ção do B5 (mistura composta de
5% de biodiesel e 95% do petrodi-
esel), o que culminaria na geração
de cerca de 234 mil empregos dire-
tos e indiretos.
Além da soja, várias outras olea-
ginosas (e.g., Tabela 1), que ainda
se encontram em fase de avaliação
e desenvolvimento de suas cadeias
produtivas, podem ser empregadas
para a produção do biodiesel (Pa-
rente, 2003). A região norte, por
exemplo, apresenta potencial para
uso de dendê, babaçu e soja; a
região nordeste, de babaçu, soja,
mamona, dendê, algodão e coco; a
região centro-oeste, de soja,
mamona, algodão, girassol, dendê
e gordura animal; a região sul, de
soja, colza, girassol e algodão; e a
região sudeste, de soja, mamona,
algodão e girassol (Campos, 2003;
Peres e Junior, 2003). Várias dessas
oleaginosas já tiveram as suas res-
pectivas competitividades técnica e
sócio-ambiental demonstradas para
a produção de biodiesel, restando,
na maioria dos casos, um estudo
agronômico mais aprofundado que
ratifique os estudos de viabilidade.
Deve-se ainda destacar que a
inserção do biodiesel na matriz ener-
gética nacional representa um po-
deroso elemento de sinergia para
com o agronegócio da cana, cujo
efeito será extremamente benéfico
para a economia nacional (Ramos,
1999, 2003). A produção de etanol
é expressiva em, praticamente, to-
das as regiões do país, e o novo
programa somente terá a contribuir
para o aumento da competitividade
do setor, valendo-se, inclusive, da
rede de distribuição já existente e
do excelente desempenho das tec-
nologias desenvolvidas para a ca-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
deia produtiva da cana (Campos,
2003). Nesse contexto, o Brasil se
encontra em uma condição que país
algum jamais esteve na história do
mundo globalizado. Com a eviden-
te decadência das fontes fósseis,
nenhuma outra região tropical tem
porte e condições tão favoráveis
para assumir a posição de um dos
principais fornecedores de biocom-
bustíveis e tecnologias limpas para
o século XXI (Vidal, 2000).
5 - O processo de produção
de biodiesel por catálise
homogênea em meio
alcalino
A transesterificação de óleos ve-
getais ou gordura animal, também
denominada de alcoólise, pode ser
conduzida por uma variedade de ro-
tas tecnológicas em que diferentes
tipos de catalisadores podem ser em-
pregados, como bases inorgânicas
(hidróxidos de sódio e potássio e
bases de Lewis), ácidos minerais (áci-
do sulfúrico), resinas de troca iônica
(resinas catiônicas fortemente ácidas),
argilominerais ativados, hidróxidos
duplos lamelares, superácidos,
superbases e enzimas lipolíticas
(lipases) (Schuchardt et al., 1998; Ra-
mos, 2003). Não há dúvidas de que
algumas dessas rotas tecnológicas,
particularmente aquelas que empre-
gam catalisadores heterogêneos, apre-
sentam vantagens interessantes como
a obtenção de uma fração glicerínica
mais pura, que não exija grandes
investimentos de capital para atingir
um bom padrão de mercado. Porém,
é também correta a afirmação de que
a catálise homogênea em meio alcali-
no ainda prevalece como a opção
mais imediata e economicamente viá-
vel para a transesterificação de óleos
vegetais (Zagonel e Ramos, 2001; Ra-
mos, 2003). Um fluxograma simplifi-
cado do processo de produção de
biodiesel, utilizando a transesterifica-
ção etílica em meio alcalino como
modelo, encontra-se apresentado na
Figura 2.
Seja qual for a rota tecnológica
escolhida, a transesterificação de
óleos vegetais corresponde a uma
reação reversível, cuja cinética é
31

Figura 2. Fluxograma simplificado de produção de ésteres etílicos a partir de óleos
vegetais e gordura animal.
regida pelo princípio enunciado em
1888 pelo químico francês Henry-
Louis Le Chatelier (1850-1936) (Fi-
gura 1). Portanto, o rendimento da
reação dependerá do deslocamen-
to do equilíbrio químico em favor
dos ésteres, através da otimização
de fatores, tais como a temperatura
de reação, a concentração e caráter
ácido-base do catalisador, bem
como o excesso estequiométrico
do agente de transesterificação (ál-
cool). Porém, conversões totais se-
rão literalmente impraticáveis em
uma única etapa reacional, pois,
além de reversível, tem-se a ocor-
rência de reações secundárias como
a saponificação. Para limitar a pre-
sença de triacilgliceróis não reagi-
dos além dos limites tolerados pelo
motor, muitos processos recorrem
32 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
à condução da reação em duas eta-
pas seqüenciais, que garantam ta-
xas de conversão superiores a 98%.
Por outro lado, a eliminação de
sabões, catalisador residual e
glicerol livre somente é possível
através de etapas eficientes de la-
vagem.
De acordo com a literatura, a
reação de obtenção do éster metílico
exige um excesso estequiométrico de
metanol igual a 100% (razão molar
álcool:óleo de 6:1), e uma quantidade
de catalisador alcalino equivalente a
0,5% a 1,0% em relação à massa de
óleo, para que sejam obtidos rendi-
mentos superiores a 95% (Freedman
et al., 1986). No entanto, duas obser-
vações limitam a simples aplicação de
uma recomendação como esta: (a)
primeiramente, a matéria-prima a ser
utilizada em cada região é diferente e
isso implica na necessidade de estu-
dos localizados, que permitam uma
otimização realística ligada a avalia-
ções confiáveis de toda a cadeia pro-
dutiva; e (b) as condições utilizadas
para a reação de metanólise não po-
dem ser transferidas para situações
em que outros álcoois, como o etanol,
sirvam de modelo. Com efeito, a tran-
sesterificação com metanol é tecnica-
mente mais viável do que a com
etanol comercial, porque a água exis-
tente no etanol (4%-6%) retarda a
reação. O uso de etanol anidro efeti-
vamente minimiza esse inconvenien-
te (Figura 2), embora não implique
solução para o problema inerente à
separação da glicerina do meio de
reação que, no caso da síntese do
éster metílico, é indiscutivelmente
muito mais facilitada (Freedman et al.,
1986; Schuchardt et al., 1998; Ramos,
1999). No entanto, basta um ajuste nas
condições de reação para que a sepa-
ração de fases aconteça espontanea-
mente, sendo que a eficiência do
processo de decantação (da fração
glicerínica) pode ser acelerada pelo
uso de centrífugas contínuas, auxilia-
das ou não pela adição de compostos
tensoativos (Ramos, 2003).
O processo de produção de bi-
odiesel deve reduzir ao máximo a
presença de contaminações no pro-
duto, como glicerina livre e ligada,
sabões ou água (Figura 2). No caso
da glicerina, reações de desidrata-
ção que ocorrem durante a combus-
tão podem gerar acroleína, um
poluente atmosférico muito perigo-
so, que pode, devido a sua
reatividade, envolver-se em reações
de condensação, que acarretam um
aumento na ocorrência de depósitos
de carbono no motor (Mittelbach et
al., 1985). Sabões e ácidos graxos
livres acarretam a degradação de
componentes do motor, e a umida-
de, desde que acima de um limite
tolerável, pode interferir na acidez
do éster por motivar a sua hidrólise
sob condições não ideais de estoca-
gem. Por essas e outras razões, é
imprescindível que sejam definidas
especificações rígidas para o biodi-
esel, de forma que o sucesso do
programa não venha a ser compro-
metido por ocorrências associadas
ao mau controle de qualidade do
produto.
Independentemente da rota
tecnológica, a aceitação do biodie-
sel no mercado precisa ser assegu-
rada e, para isso, é indispensável
que esse produto esteja dentro das
especificações internacionalmente
aceitas para o seu uso. No Brasil,
esses parâmetros de qualidade en-
contram-se pré-fixados pela Porta-
ria n o. 255 da ANP, cuja proposta foi
baseada em normas já existentes na
Alemanha (DIN) e nos Estados Uni-
dos (ASTM). Tais características e/
ou propriedades, determinantes dos
padrões de identidade e qualidade
do biodiesel, incluem ponto de ful-
gor, teor de água e sedimentos,
viscosidade, cinzas, teor de enxo-
fre, corrosividade ao cobre, núme-
ro de cetano, ponto de névoa, resí-
duo de carbono, número de acidez,
curva de destilação (ou a tempera-
tura necessária para a recuperação
de 90% do destilado), estabilidade
à oxidação, teor de glicerina livre e
total, cor e aspecto (Agência Naci-
onal do Petróleo, 2003). Dentre
esses parâmetros, alguns têm mere-
cido críticas da comunidade cientí-
fica por não apresentarem aplica-
ção direta ao biodiesel, como o
índice de corrosividade ao cobre e
a curva de destilação. Por essa ra-
zão, a especificação definida pela
portaria é ainda provisional e pode-
rá ser modificada em função de
novas argumentações e dados ex-
perimentais gerados pela comuni-
dade científica.
Um aspecto extremamente im-
portante da Portaria no 255 da ANP
está relacionado com as limitações
que oferece para o aproveitamento
de todos os óleos vegetais que se
encontram disponíveis no território
nacional. No entanto, é importante
esclarecer que a especificação defi-
ne a qualidade do produto a ser
utilizado puro, ou seja, sem a sua
diluição com diesel de petróleo.
Por outro lado, se a concepção do
programa nacional é a de facultar o
uso de misturas dos tipos de B2 a
B20, restringindo o uso de B100
apenas a situações especiais (como
na geração de energia elétrica em
grupo-geradores), talvez fosse ade-
quada (e possível) a flexibilização
das especificações com vistas a uma
maior inserção das diferentes olea-
ginosas que compõem o conjunto
de alternativas regionais de nosso
território. Essa flexibilização esta-
ria, portanto, restrita somente ao
uso do biodiesel em misturas, va-
lendo-se do fator de diluição que a
razão volumétrica definida pela
mistura proporciona (Ramos, 2003).
Vale ressaltar que a adição de um
biodiesel de qualidade ao diesel,
até um limite de 20% (B20), não
modifica drasticamente as suas pro-
priedades e não o desqualifica pe-
rante a Portaria no. 310 da ANP, cujo
conteúdo estabelece as especifica-
ções para comercialização de óleo
diesel automotivo em todo o terri-
tório nacional. Obviamente, tal hi-
pótese precisa ser estudada em to-
das as suas implicações, pois preci-
sam ser dadas garantias para que a
credibilidade do programa não so-
fra o impacto de serem considera-
das experiências mal sucedidas
possíveis falhas no funcionamento
do motor e o subseqüente aumento
nos seus custos de manutenção.
Da mesma forma como foram
definidos alguns aspectos agronô-
micos essenciais para que um deter-
minado óleo vegetal apresente com-
petitividade como matéria-prima
para a produção de biodiesel, im-
portantes aspectos tecnológicos tam-
bém precisam ser atendidos e estes
estão relacionados: (a) à complexi-
dade exigida para o processo de
extração e tratamento do óleo; (b) à
presença de componentes indesejá-
veis no óleo, como é o caso dos
fosfolipídeos presentes no óleo de
soja; (c) ao teor de ácidos graxos
poli-insaturados; (d) ao tipo e teor
de ácidos graxos saturados; e (e) ao
valor agregado dos co-produtos,
como hormônios vegetais, vitami-
nas, anti-oxidantes, proteína e fibras
de alto valor comercial.
Diferentes oleaginosas apre-
sentam diferentes teores em óleos
vegetais (Tabela 1) e a complexida-
de exigida para a extração do óleo
pode contribuir negativamente para
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
a viabilidade do processo (Alsberg
e Taylor, 1928). Oleaginosas de
baixo teor de óleo, como a soja,
exigem procedimentos de extração
caros e relativamente complexos
que praticamente restringem a via-
bilidade dessa matéria-prima àque-
las regiões em que já exista uma
razoável capacidade instalada para
o esmagamento de grãos. Porém,
oleaginosas de maior teor em óleos
vegetais, cujos processos de extra-
ção sejam mais simplificados, cer-
tamente apresentarão melhor com-
petitividade econômica por não exi-
girem a instalação de operações
unitárias complexas para esse obje-
tivo. Por outro lado, a qualidade do
óleo poderá exigir uma etapa de
refino para que também a qualida-
de no produto final seja garantida.
Esse é certamente o caso da soja,
que depende do refino para reduzir
a presença de gomas e fosfolipíde-
os no biodiesel. Mais uma vez, é
provável que essa observação te-
nha pouco significado para regiões
onde a agroindústria da soja esteja
verticalizada ao óleo refinado, mas,
onde não haja esse potencial
agroindustrial, seria desejável que
as matérias-primas selecionadas
para a produção não apresentas-
sem tal limitação e pudessem sofrer
a alcoólise sem exigir a implanta-
ção de uma unidade de refino. Há
evidências de que alguns óleos ve-
getais podem oferecer essa vanta-
gem, como os de girassol e de
várias espécies de palmáceas (óle-
os laurílicos).
O tipo e o teor de ácidos graxos
presentes no óleo vegetal (Tabela
1) têm um efeito marcante sobre a
estabilidade do biodiesel diante do
armazenamento e da oxidação. Por
exemplo, quedas bruscas na tem-
peratura ambiente promovem o au-
mento da viscosidade e a cristaliza-
ção de ésteres graxos saturados
que, eventualmente, podem causar
o entupimento de filtros de óleo e
sistemas de injeção. A tendência à
“solidificação” do combustível é
medida através dos pontos de né-
voa e de fluidez (ou de entupimen-
to), que devem ser tanto mais baixo
quanto possível. Abaixamentos no
33
 ponto de fluidez, muitas vezes mo-
tivados pela aditivação de inibido-
res de cristalização (Stournas et
al., 1995; Ramos, 2003), represen-
tam menores restrições do biocom-
bustível à variações de temperatu-
ra, evitando problemas de estoca-
gem e de utilização em regiões
mais frias. Obviamente, esse pro-
blema não é exclusivo do biodiesel,
pois o diesel de petróleo contém
parafinas que apresentam tipica-
mente o mesmo comportamento.
A formação de depósitos por
precipitação também ocorre em fun-
ção do envelhecimento e/ou oxida-
ção do biodiesel. Testes realizados
pela Bosch (Dabague, 2003), em
parceria com a ANFAVEA (Associa-
ção Nacional dos Fabricantes de
Veículos Automotores), AEA (Asso-
ciação Brasileira de Engenharia
Automotiva) e Sindipeças (Sindica-
to Nacional da Indústria de Compo-
nentes para Veículos Automotores),
constataram que a degradação
oxidativa do biodiesel gera resinifi-
cação que, por aderência, constitui
uma das principais causas da for-
mação de depósitos nos equipa-
mentos de injeção. Em decorrência
desse fenômeno, foi também ob-
servada uma queda no desempe-
nho, aumento da susceptibilidade à
corrosão e diminuição da vida útil
dos motores.
O ranço oxidativo está direta-
mente relacionado com a presença
de ésteres monoalquílicos insatura-
dos. Trata-se da reação do oxigênio
atmosférico com as duplas ligações
desses ésteres, cuja reatividade au-
menta com o aumento do número
de insaturações na cadeia (Moretto
e Fett, 1989). Assim, por ser relati-
vamente insaturado, o biodiesel de-
rivado do óleo de soja é muito
susceptível à oxidação. Os ácidos
linoleico e linolênico, que, juntos,
correspondem a mais de 61% da
composição desse óleo, apresen-
tam, respectivamente, duas e três
duplas ligações, que podem reagir
facilmente com o oxigênio.
A oxidação de óleos insatura-
dos representa um processo relati-
vamente complexo que envolve re-
ações entre radicais livres e oxigê-
34 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
nio molecular. Todo esse processo
é geralmente resumido em três eta-
pas, denominadas de iniciação, pro-
pagação e finalização. O processo
de polimerização pode ser iniciado
por traços de metais, calor (termó-
lise), luz (fotólise) ou radicais
hidroxila e hidroperoxila, gerados
pela cisão homolítica de moléculas
de água expostas à radiação
(Kumarathasan et al., 1992).
Os peróxidos e hidroperóxi-
dos produzidos através da reação
de auto-oxidação podem se poli-
merizar com outros radicais e pro-
duzir moléculas de elevada massa
molar, sedimentos insolúveis, go-
mas e, em alguns casos, pode que-
brar a cadeia do ácido graxo oxida-
do, produzindo ácidos de cadeias
menores e aldeídos (Prankl e
Schindlbauer, 1998). Estudos ante-
riores (Clark et al., 1984; Tao, 1995;
System Lab Services, 1997) consta-
taram que a formação desses ácidos
pode estar ligada à corrosão do
sistema combustível dos motores
porque, devido à alta instabilidade
dos hidroperóxidos, eles apresen-
tam forte tendência a atacar
elastômeros.
A maioria dos trabalhos até en-
tão realizados sobre a estabilidade
diante da oxidação do biodiesel re-
ferem-se ao estudo de ésteres
metílicos (Prankl e Schindlbauer,
1998; Ishido et al., 2001; Pedersen e
Ingermarsson, 1999), visto que a
maioria dos países que instituíram o
uso desse biocombustível não apre-
senta disponibilidade nem infra-es-
trutura para produzir etanol como o
Brasil. Esses trabalhos têm confir-
mado que, de um modo geral, o
biodiesel de natureza metílica se
oxida após curtos períodos de esto-
cagem, e que sua inércia química
está diretamente relacionada com
os óleos vegetais empregados na
sua produção (Prankl e Schindlbauer,
1998).
Um dos meios mais comumente
utilizados para se inferir sobre a
susceptibilidade de um determina-
do óleo à oxidação é a avaliação de
seu número de iodo. O número de
iodo revela o número de insatura-
ções de uma determinada amostra e
esse valor constitui um dos parâme-
tros de identidade dos óleos vege-
tais. Sendo assim, diferentes tipos
de biodiesel apresentam números
de iodo semelhantes aos dos trigli-
cerídeos de origem. No entanto,
deve-se salientar que, quando o
objetivo é avaliar a estabilidade à
oxidação de um dado óleo, as infor-
mações obtidas através desse mé-
todo não são adequadas, pois o
número de iodo não discrimina que
compostos estão contribuindo para
o valor encontrado. Desse modo,
há óleos diferentes com números
de iodo semelhantes, porém, com
estabilidades à oxidação considera-
velmente distintas. Para se inferir
previsões acerca da estabilidade à
oxidação de um dado óleo é, por-
tanto, necessário que se conheça a
sua composição percentual em áci-
dos graxos, o que só é possível
através do emprego de métodos
cromatográficos de análise.
Somente através do conheci-
mento pleno das propriedades que
determinam os padrões de identi-
dade e a qualidade do biodiesel é
que será possível estabelecer pa-
râmetros de controle que garanti-
rão a qualidade do produto a ser
incorporado na matriz energética
nacional.
6 - Aspectos ambientais
relacionados com o uso do
biodiesel
Sabe-se que o aumento na con-
centração dos gases causadores do
efeito estufa, como o dióxido de
carbono (CO2) e o metano (CH4), tem
acarretado sérias mudanças climáti-
cas no planeta. Efeitos como o au-
mento da temperatura média global,
as alterações no perfil das precipita-
ções pluviométricas e a elevação do
nível dos oceanos poderão ser catas-
tróficos frente à contínua tendência
de aumento da população mundial
(Peterson e Hustrulid, 1998; Shay,
1993). Nesse sentido, a inserção de
combustíveis renováveis em nossa
matriz energética precisa ser incenti-
vada para frear as emissões causadas
pelo uso continuado de combustí-
veis fósseis.
 Vários estudos têm demonstra-
do que a substituição do diesel de
petróleo por óleos vegetais transes-
terificados reduziria a quantidade
de CO2 introduzida na atmosfera. A
redução não se daria exatamente na
proporção de 1:1, pois cada litro de
biodiesel libera cerca de 1,1 a 1,2
vezes a quantidade de CO2 liberada
na atmosfera por um litro de diesel
convencional. Todavia, diferente-
mente do combustível fóssil, o CO2
proveniente do biodiesel é reciclado
nas áreas agricultáveis, que geram
uma nova partida de óleo vegetal
para um novo ciclo de produção.
Isso acaba proporcionando um ba-
lanço muito mais equilibrado entre a
massa de carbono fixada e aquela
presente na atmosfera que, por sua
vez, atua no chamado efeito estufa.
Portanto, uma redução real no
acúmulo de CO2 somente será pos-
sível com a diminuição do uso de
derivados do petróleo. Para cada
quilograma de diesel não usado, um
equivalente a 3,11 kg de CO2, mais
um adicional de 15% a 20%, referen-
te à sua energia de produção, deixa-
rá de ser lançado na atmosfera. Foi
também estimado que a redução
máxima na produção de CO2, devi-
do ao uso global de biodiesel, será
de, aproximadamente, 113-136 bi-
lhões de kg por ano (Peterson e
Hustrulid, 1998).
A utilização de biodiesel no
transporte rodoviário e urbano ofe-
rece grandes vantagens para o meio
ambiente, tendo em vista que a
emissão de poluentes é menor que a
do diesel de petróleo (Masjuk e
Sapuan, 1995; Clark et al., 1984).
Chang et al. (1996) demonstraram
que as emissões de monóxido e
dióxido de carbono e material
particulado foram inferiores às do
diesel convencional, enquanto que
os níveis de emissões de gases nitro-
genados (NOx) foram ligeiramente
maiores para o biodiesel. Por outro
lado, a ausência total de enxofre
confere ao biodiesel uma grande
vantagem, pois não há qualquer
emissão dos gases sulfurados (e.g.,
mercaptanas, dióxido de enxofre)
normalmente detectados no escape
dos motores movidos a diesel.
Outro aspecto de interesse am-
biental está relacionado com as emis-
sões de compostos sulfurados. Sabe-
se que a redução do teor de enxofre
no diesel comercial também reduz a
viscosidade do produto a níveis não
compatíveis com a sua especificação
e que, para corrigir esse problema,
faz-se necessária a incorporação de
aditivos com poder lubrificante. Con-
sumada a obrigatoriedade na redu-
ção dos níveis de emissão de com-
postos sulfurados a partir da combus-
tão do diesel, a adição de biodiesel
em níveis de até 5% (B5) corrigirá
esta deficiência viscosimétrica, que
confere à mistura propriedades lubri-
ficantes vantajosas para o motor.
Trabalhos já desenvolvidos no
Brasil na década de 80, quando
foram utilizados vários óleos vege-
tais transesterificados, também de-
monstraram bons resultados quan-
do utilizados em motores de cami-
nhões e tratores, tanto puros quan-
to em misturas do tipo B30 (Minis-
tério da Indústria e do Comércio,
1985). Mais recentemente, foram
realizados testes no transporte ur-
bano da cidade de Curitiba com
ésteres metílicos de óleo de soja
(Laurindo, 2003). Cerca de 80 mil
litros de biodiesel foram cedidos
pela American Soybean Association
(EUA) e testados na forma da mis-
tura B20, apresentando resultados
bastante satisfatórios em relação ao
controle. Os testes foram realiza-
dos em 20 ônibus de diferentes
marcas durante três meses conse-
cutivos, no primeiro semestre de
1998; ao final dos trabalhos, os
resultados obtidos mostraram uma
redução média da fumaça emitida
pelos veículos de, no mínimo, 35%
(Laurindo e Bussyguin, 1999).
O caráter renovável do biodiesel
está apoiado no fato de as matérias-
primas utilizadas para a sua produção
serem oriundas de fontes renováveis,
isto é, de derivados de práticas agríco-
las, ao contrário dos derivados de
petróleo. Uma exceção a essa regra
diz respeito à utilização do metanol,
derivado de petróleo, como agente
transesterificante, sendo esta a maté-
ria-prima mais abundantemente utili-
zada na Europa e nos Estados Unidos.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Isso significa que a prática adotada no
Brasil, isto é, a utilização do etanol,
derivado de biomassa, torna o biodi-
esel um produto que pode ser consi-
derado como verdadeiramente
renovável (Zagonel, 2000). Assim, por
envolver a participação de vários seg-
mentos da sociedade, tais como as
cadeias produtivas do etanol e das
oleaginosas, a implementação do bio-
diesel de natureza etílica no mercado
nacional abre oportunidades para gran-
des benefícios sociais decorrentes do
alto índice de geração de empregos,
culminando com a valorização do cam-
po e a promoção do trabalhador rural.
Além disso, há ainda as demandas por
mão-de-obra qualificada para o pro-
cessamento dos óleos vegetais, per-
mitindo a integração, quando neces-
sária, entre os pequenos produtores e
as grandes empresas (Campos, 2003).
5 - Conclusão
A intensidade com que o tema
biodiesel tem sido abordado em reu-
niões políticas, científicas e tecnoló-
gicas tem dado testemunho do inte-
resse com que a sociedade e o setor
produtivo vem encarando essa nova
oportunidade de negócios para o
país. Com efeito, diante de tantos
benefícios, como a criação de novos
empregos no setor agroindustrial, a
geração de renda, o fomento ao
cooperativismo, a perspectiva de
contribuição ao equilíbrio de nossa
balança comercial e pelos compro-
vados benefícios ao meio ambiente,
pode-se dizer que o biodiesel tem
potencial para constituir um dos prin-
cipais programas sociais do governo
brasileiro, representando fator de
distribuição de renda, inclusão soci-
al e apoio à agricultura familiar. No
entanto, neste momento em que as
bases do programa nacional estão
sendo ainda definidas, o desenvol-
vimento de projetos de cunho cien-
tífico e tecnológico, que possam
oferecer maior segurança aos nos-
sos tomadores de decisão, é, no
mínino, estrategicamente imprescin-
dível ao país.
No que diz respeito à evolução
do programa nacional de biocom-
bustíveis, algumas ações governa-
35
 mentais poderiam ser de extrema
importância para acelerar o atendi-
mento às suas principais metas tec-
nológicas: (a) instalação de uma
unidade-piloto, desinteressada de
qualquer ganho comercial e prefe-
rencialmente estabelecida em par-
ceria com instituições públicas de
pesquisa e desenvolvimento, para
auxiliarem nos estudos de viabili-
dade técnica e econômica do biodi-
esel; (b) estabelecimento das espe-
cificações a serem exigidas para o
licenciamento do produto (proces-
so já iniciado pela ANP, através da
Portaria n o. 255); (c) ampliação
dos testes em frota cativa para diri-
mir quaisquer dúvidas que ainda
persistam sobre o desempenho e a
viabilidade do biodiesel, particu-
larmente de natureza etílica, seja
puro ou em misturas do tipo B2 a
B20; e (d) abertura de linhas de
financiamento para o desenvolvi-
mento de novas rotas tecnológicas,
com vistas a simplificar e/ou a
otimizar o processo, a ampliação
das perspectivas para a utilização
de seus subprodutos e a diversifica-
ção da matéria-prima para atender
a vocações regionais.
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37

Pesquisa
Marcos Barros de Medeiros
Doutor em Entomologia - ESALQ/USP
Professor Adjunto Centro de Formação de
Tecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras.
barros@iwpb.com.br;
ciagra@cft.ufpb.br
Paulo Alves Wanderley
Doutor em Agronomia - FCAV/UNESP,
Professor nível E do Centro de Formação de
Tecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras
Maria José Araújo Wanderley
Doutora em Agronomia - FCAV/UNESP,
Bolsista de Desenvolvimento Científico Regional
CNPq, UFPB Departamento de Ciências Básicas e
Sociais, Campus de Bananeiras
Ilustrações cedidas pelos autores
38 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Biofertilizantes
Líquidos
Processo trofobiótico para proteção de plantas em cultivos orgânicos
1 - Introdução
Nos países desenvolvidos e em
vários outros em desenvolvimento,
como o Brasil, os organoclorados fo-
ram proibidos para o uso agrícola.
Porém, essa foi apenas uma medida
isolada, uma vez que tais produtos
circulam hoje por toda a biosfera
(Paschoal, 1995). O uso de produtos
químicos sem a observação da com-
plexidade de fatores que interagem
nos agroecossistemas tem sido a mai-
or causa de desequilíbrio nesses siste-
mas, tais como o desenvolvimento de
resistência ao pesticida, ressurgimen-
to e desencadeamento de pragas se-
cundárias e quebra de cadeias alimen-
tares a partir da eliminação de seus
inimigos naturais (parasitóides e pre-
dadores) (Medeiros, 1998).
Até 1945 os ácaros fitófagos eram
tidos como pragas secundárias da
agricultura. No entanto, o desenvol-
vimento destas espécies nocivas vem
atingindo, cada vez mais, uma eleva-
da significação econômica, ao mes-
mo tempo em que sua lista não pára
de crescer. Antes de 1946, havia
apenas 10 espécies de insetos e car-
rapatos resistentes, todas a produtos
inorgânicos minerais. Em 1969 a re-
sistência foi confirmada para 424 es-
pécies, sendo 97 de importância
médica ou veterinária e 127 de im-
portância agrícola e florestal e de
produtos armazenados (Paschoal,
1979; Chaboussou 1980). Na década
de 90, pelo menos 504 espécies de
insetos e ácaros foram dadas como
resistentes a pelo menos um pesticida.
Destas, 23 espécies são benéficas e
481 são nocivas, sendo 283 de impor-
tância agrícola e 198 de importância
médico-veterinária (Georghiou &
Lagunes-Tejeda, 1991).
Uma nova teoria, hoje ampla-
mente difundida, converge ao expli-
car que, além destes fatores, estes
desequilíbrios também estão forte-
mente associados ao estado de
proteólise dominante nos tecidos da
planta. Estudos comprovam que pro-
dutos químicos sintéticos, tais como
agrotóxicos e fertilizantes minerais
solúveis, contêm substâncias que in-
terferem na proteossíntese, provocam
o acúmulo de aminoácidos livres e
açúcares redutores nos tecidos da plan-
ta, reduzindo sua resistência às pragas
e doenças (Alves et al., 2001;
Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002).
Segundo Primavesi (1998), três
condições são necessárias para que
uma planta seja atacada por pragas e
doenças: 1) a planta deve ser defici-
entemente nutrida, oferecendo algu-
ma substância utilizável para o agen-
te; 2) o agente possa se multiplicar
livremente sem controle biológico, o
que ocorre mais facilmente em
monoculturas; 3) o sistema de auto-
defesa da planta deve estar desequi-
librado, em função da nutrição e do
uso de agrotóxicos. Estes princípios
convergem com os fundamentados
por Francis Chaboussou, então dire-
tor do “Institut National de la
Recherche Agronomique” (INRA) na
França, que em 1979 formulou a
Teoria da Trofobiose. Segundo essa
teoria, todo processo vital está na
dependência da satisfação das ne-
cessidades dos organismos vivos,
sejam eles vegetais ou animais. Des-
sa forma, a planta, ou mais precisa-
 tação) ou afetando o seu desenvolvi-
mento e reprodução.

2 - Biofertilizantes líquidos
e sua aplicação na
proteção de plantas

Os biofertilizantes possuem com-

postos bioativos, resultantes da
biodigestão de compostos orgânicos
de origem animal e vegetal. Em seu
conteúdo são encontradas células vi-
vas ou latentes de microrganismos
de metabolismo aeróbico, anaeróbico
e fermentação (bactérias, leveduras,
Figura 01. Simulação da cinética de crescimento celular e da produção de metabólitos algas e fungos filamentosos) e tam-
ao longo da fermentação aeróbica do biofertilizante no processo de CLC. Metabólitos bém metabólitos e quelatos organo-
primários: (Etapas de anabolismo e catabolismo): Açúcares, aminoácidos, ácidos
graxos, proteínas, lipídeos, bases nitrogenadas (nucleotídeos e ácidos nucleicos),
minerais em soluto aquoso. Segundo
precursores moleculares etc. Metabólitos secundários: (Biossíntese de macro- Santos & Akiba (1996), os metabólitos
moléculas de elevado peso molecular): toxinas, antibióticos, fitoreguladores (IAA são compostos de proteínas, enzimas,
e giberelinas), ácidos graxos de cadeia longa, fosfolipídeos, polissacarídeos, terpenos antibióticos, vitaminas, toxinas,
fenóis, polifenois, citoquininas, etc. fenóis, ésteres e ácidos, inclusive de
ação fitohormonal produzidos e libe-
mente o órgão vegetal, será atacado et al., 2002) Os adubos minerais rados pelos microrganismos.
somente quando seu estado bioquí- solúveis, especialmente os nitroge- Na citricultura paulista, os bio-
mico, determinado pela natureza e nados, e os agrotóxicos orgânicos fertilizantes vêm sendo produzidos
pelo teor de substâncias nutritivas sintéticos, que quando absorvidos pelo método de compostagem líqui-
solúveis, corresponder às exigências pelas plantas e translocados em seu da contínua em “piscinas” escavadas
tróficas (de alimentação) da praga ou interior, são capazes de interferir no solo, revestidas de lona plástica
do patógeno em questão. com a fisiologia vegetal, reduzem a de polietileno, com capacidade de
Estudando-se a relação entre o proteossíntese, desencadeando pro- até 50 mil litros. No processo são
estado nutricional de plantas e sua cesso de acúmulo de aminoácidos utilizados água não clorada e o
resistência às doenças constatou-se livres e açúcares redutores, substân- inoculante à base de esterco fresco
que toda circunstância desfavorável cias prontamente utilizáveis pelas bovino, e posteriormente enriqueci-
ao crescimento celular tende a pro- pragas e agentes fitopatogênicos, o do com um composto orgânico nutri-
vocar um acúmulo de compostos que foi correlacionado positivamen- tivo. O Microgeo é um composto
solúveis não utilizados, como açú- te com o aumento populacional des- orgânico, com registro no Ministério
cares e aminoácidos, diminuindo a ses organismos (Chaboussou, 1985). da Agricultura e certificado pelo IBD,
resistência da planta ao ataque de Na agricultura orgânica o uso de preparado à base de diversas fontes
pragas e doenças (Dufrenoy, 1936). biofertilizantes líquidos, na forma de orgânicas e inorgânicas, sendo enri-
Comprovou-se mais tarde que a ação fermentados microbianos enriqueci- quecido com rochas moídas que con-
dos agrotóxicos na planta resulta na dos, têm sido um dos processos mais têm cerca de 48% de silicatos de
inibição da proteossíntese, resultan- empregados no manejo trofobiótico magnésio, cálcio, ferro e outros
do num aumento de ácaros, pulgões de pragas e doenças. Essa estratégia oligoelementos, fundamentais para
e lepidópteros e de doenças é baseada no equilíbrio nutricional estimulação do metabolismo primá-
(Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002). da planta (trofobiose), onde a resis- rio e secundário das plantas. Segun-
Espécies de pulgões, cochonilhas, tência é gerada pelo melhor equilí- do Alves et al. (2001) biofertilizantes
cigarrinhas, cigarras, tripes, outros brio energético e metabólico do ve- obtidos com o Microgeo vêm sendo
insetos sugadores e várias espécies getal (Chaboussou, 1985; Pinheiro & utilizados, em pulverização sobre as
de ácaros fitófagos, não são capazes Barreto, 1996). Os biofertilizantes fun- plantas, em mais de 8 milhões de pés
de desdobrar proteínas em aminoá- cionam como promotores de cresci- de laranja no estado de São Paulo.
cidos para serem posteriormente mento (equilíbrio nutricional) e como A potência biológica de um bio-
recombinados à conveniência de elicitores na indução de resistência fertilizante é expressa pela grande
cada um. Por isso, eles dependem sistêmica na planta. Além disso, aju- quantidade de microrganismos ali
de aminoácidos livres existentes na dam na proteção da planta contra o existentes, responsáveis pela libera-
seiva das plantas ou suco celular e ataque de doenças, por antibiose ção de metabólitos e antimetabólitos,
de microrganismos simbiontes (Bettiol et al, 1998) e contra o ataque entre eles vários antibióticos e
(Chaboussou, 1980; Panizzi & Parra, de pragas, por ação repelente, hormônios vegetais. Castro et al.
1991; Pinheiro & Barreto, 1996; Gallo fagodeterrente (inibidores de alimen- (1992) e Bettiol et al. (1998) isolaram

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 39


Figura 2. Produção de biofertilizantes pelo sistema de compostagem líquida contínua
a céu aberto, em recipientes plásticos.
várias leveduras e bactérias, desta-
cando Bacillus subitilis, reconhecido
produtor de antibióticos. Atualmente
os biofertilizantes vêm sendo aplica-
dos em diversas culturas associadas
com o fungo entomopatogênico
Beauveria bassiana, importante ini-
migo natural de pragas.
Os efeitos do biofertilizante no
controle de pragas e doenças de plantas
têm sido bem evidenciados. Efeitos
fungistático, bacteriostático e repelente
sobre insetos já foram constatados. San-
tos & Sampaio (1993) verificaram uma
propriedade coloidal do biofertilizante
que provoca a aderência do inseto
sobre a superfície do tecido vegetal. Os
autores destacaram também o efeito
repelente e deterrente de alimentação
contra pulgões e moscas-das-frutas.
Medeiros et al. (2000b) verificaram que
o biofertilizante à base de conteúdo de
rúmen bovino e o composto orgânico
MicrogeoÒ reduziu a fecundidade, perí-
odo de oviposição e longevidade de
fêmeas do ácaro-da-leprose dos citros,
Brevipalpus phoenicis, quando pulveri-
zado em diferentes concentrações. Es-
ses mesmos autores comprovaram que
este biofertilizante agiu sinergicamente
com Bacillus thuringiensis e o fungo B.
bassiana, reduzindo a viabilidade dos
ovos e sobrevivência de larvas do bi-
cho-furão-dos-citros (Ecdytolopha
aurantiana) (Medeiros et al. 2000c).
40 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Estudos recentes comprovaram a redu-
ção de até 95% da fecundidade do ácaro
rajado Tetranychus urticae, de hábito
polífago, em concentrações entre 5 e
50% (Medeiros et al., 2000a; Berzaghi et
al., 2001). Também verificou-se redu-
ção de até 64% da população do pulgão
Aphis sp., quando utilizado o biofertili-
zante (10%) associado aos inseticidas
Boveril® e Metarril®, 5 kg/ha, em cultivo
de acerola (Medeiros et al., 2001). Apli-
cações do biofertilizante associadas à
calda viçosa ou com o Bacillus
thuringiensis reduziram significativa-
mente o ataque da traça (Tuta absoluta)
e a broca pequena (Neoleucocinodes
elegantalis) em tomateiros (Picanço et
al., 1999; Nunes & Leal, 2001). Também
foi constatado menor severidade de
oídio e de cigarrinha verde em plantas
de feijoeiro pulverizadas com diferen-
tes misturas de biofertilizantes (Cunha
et al., 2000). Trabalhos conduzidos por
Medeiros (2002) no Laboratório de Pa-
tologia e Controle Microbiano de Inse-
tos da ESALQ/USP comprovaram que o
biofertilizante líquido reduziu de modo
crônico e significativamente a fecundi-
dade e o potencial de crescimento po-
pulacional e o tempo de desenvolvi-
mento de descendentes dos ácaros da
leprose dos citros Brevipalpus phoenicis,
criados sobre plantas tratadas com bio-
fertilizantes. O estudo comprovou que
o biofertilizante testado agiu por conta-
to direto e residual e também funcionou
de forma sistêmica na planta.
A ação antibiótica e indução de
resistência sistêmica da planta são
provavelmente os principais meca-
nismos de ação do biofertilizante
sobre a praga (D´Andréa & Medeiros,
2002). Os fenômenos podem estar
diretamente associados à complexa
e pouco conhecida composição quí-
mica e biológica dos biofertilizantes.
Compostos metabólitos (micro e
macromoléculas), tais como enzimas,
antibióticos, vitaminas, toxinas, fenóis
e outros voláteis, ésteres e ácidos,
inclusive de ação fitohormonal têm
sido identificados nos biofertilizan-
tes (Santos, 1992). Um composto
coloidal, de consistência mucilagino-
sa (goma) e de composição ainda
não conhecida, foi observado por
Medeiros (2002) causando a imobili-
zação e morte do ácaro B. phoenicis
sobre a folha devido à obstrução de
seu sistema digestivo.
3 - Processos envolvidos na
produção de
biofertilizantes
Não existe uma fórmula padrão
para produção de biofertilizantes.
Receitas variadas vêm sendo testadas,
utilizando-se componentes minerais
para o enriquecimento do meio de
cultivo (Santos, 1992; Magro, 1994).
O processo de fermentação é
complexo e os microrganismos exis-
tentes passam quatro fases distintas
de crescimento celular: 1) Latência -
Compreende o período de adaptação
dos microrganismos, após o qual as
células dão início à fermentação. 2)
Crescimento exponencial – Nessa fase
ocorre elevado processo de divisão
celular, com a produção de biomassa
e liberação dos metabólitos primári-
os: carboidratos, aminoácidos,
lipídeos, nucleotídeos, vitaminas e
proteínas e enzimas. 3) Fase estacio-
nária – As células param de se dividir
e as colônias, após juntarem-se, inici-
am um processo de diferenciação
celular produzindo metabólitos se-
cundários como forma de defesa (an-
tibióticos, toxinas, fenóis, ácidos or-
gânicos e outras proteínas de cadeia
longa, de alto interesse biotecnológi-
co). 4) Morte Celular-Esgotadas to-

Figura 3. Detalhes do experimento utilizando-se ácaros de B. phoenicis criados em
arena, sobre a folha a planta de Canavalia ensiformis. Fonte: Medeiros (2002)
das as reservas de energia, as células
começam a morrer numa velocidade
exponencial.
Cada microrganismo participan-
te degrada alimento para outro, numa
relação de interdependência mútua e
harmônica e, assim, o processo de
fermentação acaba sendo contínuo,
desde que seja alimentado com meio
nutritivo, o que fundamentou o pro-
cesso de compostagem líquida des-
crito por D’Andréa & Medeiros (2002).
4 - Produção do
biofertilizante pelo
processo de Compostagem
Líquida Contínua (CLC)
4.1 - Dimensionamento da
Produção
Tanques para compostagem do
biofertilizante podem ser utilizados
para volumes de até 1.000 litros, cai-
xas de fibrocimento ou plásticas. Para
volumes maiores constrói-se direta-
mente no solo, ‘piscinas’ com as di-
mensões do volume pretendido, e
com a profundidade máxima de um
metro, as quais são revestidas com
lona plástica. A localização do tanque
deve ser em área ensolarada, manten-
do-o descoberto. Para o dimensiona-
mento do volume do tanque, deverá
ser considerado um consumo diário
máximo de 10% de biofertilizante, da
sua capacidade. Exemplo: Para um
consumo diário de 100 litros de bio-
fertilizante, o tanque deverá ter o
volume de 1.000 litros.
4.2- CLC com uso de esterco e
composto orgânico enriquecido
Início da CLC: Para início da
produção do biofertilizante, adiciona-
se no tanque o esterco fresco de gado
(inoculante), um composto orgânico
enriquecido com minerais (Ex.:
MICROGEO MCO) e água (não
clorada). No caso do Microgeo,
pesquisado e desenvolvido pela equi-
pe do Laboratório de Patologia e Con-
trole Microbiano da ESALQ, o preparo
é feito nas seguintes proporções:1,0
quilo do composto orgânico / 4,0
litros esterco de gado / 20,0 litros água
(completando o volume ). Exemplo:
Para a produção de 1.000 litros de
biofertilizante, adiciona-se no tanque
50 quilos do composto, mais 200 litros
de esterco de gado de qualquer ori-
gem, completando com água o
volume de 1.000 litros do tanque.
Agitar duas vezes ao dia manualmen-
te com um ‘rodo’, que também permi-
tirá determinar a espessura da camada
orgânica (biomassa) depositada no
fundo do tanque, com o objetivo de se
quantificar a reposição do esterco de
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
gado no processo CLC. Iniciar o uso
do biofertilizante com aproximada-
mente 15 dias, após a mistura inicial
dos insumos. Manutenção da CLC:
Para manter a compostagem em meio
líquido de forma contínua, contabilizar
diariamente os volumes de biofertili-
zante consumidos repondo no tanque
os insumos nas seguintes proporções:
a) Reposição do composto orgânico:
para cada 30,0 a 40,0 litros de biofer-
tilizante usado, repor 1,0 quilo do
composto/inoculante. O intervalo de
reposição poderá ser semanal até
mensal, ou seja, intervalos menores
quanto maior o volume de biofertili-
zante utilizado. b) Reposição do ester-
co de gado: adicionar um volume de
esterco de gado (fresco) suficiente
para manter a mesma proporção
biomassa/ água do início do proces-
so, sempre quando se verificar com
ajuda do ‘rodo’ a diminuição da cama-
da orgânica no fundo do tanque. c)
Reposição da água: está em função do
volume de biofertilizante consumido,
da evaporação e das chuvas. O volu-
me de água a ser adicionado deverá
ser o suficiente para a manutenção do
nível inicial do tanque. A freqüência
de reposição poderá ser diária, usan-
do-se registro bóia ou até mensal,
também em função do volume de
biofertilizante usado. Nos períodos de
chuvas, recomenda-se fechar os tan-
ques de até 1.000 litros nos momentos
de ocorrência delas. Manter descober-
tos os tanques maiores de 1.000 litros,
retirando para uso posterior o volume
do biofertilizante que eventualmente
poderá transbordar, armazenando-o
em tambores. É importante sempre
manter as proporções de composto
inoculante e esterco de gado, descri-
tas acima, evitando o uso do bioferti-
lizante muito diluído (Microbiol, 2001;
D’Andréa & Medeiros, 2002).
5 - Recomendações de uso
Segundo Pinheiro & Barreto
(1996), devido aos elevados efeitos
hormonais e altos teores das substân-
cias sintetizadas, o uso de biofertili-
zantes em pulverizações foliares nor-
malmente são feitos com diluições
entre 0,1 e 5%. Concentrações maio-
res, entre 20 e 50%, foram utilizadas
por Santos & Akiba (1996) com o
41

Figura 4. Caracterização de cadáveres do ácaro da leprose dos citros Brevipalpus
phoenicis: (a) control, (b) Ácaro morto por ação de contato do biofertilizante; (c) e (d)
Foco microbiano e vista ventral e dorçal do gnatosoma e pernas anteriores aderidas
por uma substancia coloidal (goma). Fonte: Medeiros (2002).
biofertilizante “Vairo”. Porém, em
concentrações muito elevadas, o bi-
ofertilizante pode causar estresse fi-
siológico na planta retardando seu
crescimento, floração ou frutificação.
Isso se deve provavelmente ao ex-
cessivo desvio metabólico para pro-
dução de substâncias de defesa. Para
hortaliças recomendam-se pulveriza-
ções semanais, utilizando entre 0,1 e
3 % de concentração do biofertilizan-
te, considerando que as plantas são
de ciclo vegetativo curto e possuem
maior velocidade de crescimento, com
demanda constante de nutrientes.
Em fruteiras, pulverizações entre 1 e
5% do biofertilizante com Microgeo
produziram resultados significativos
na sanidade na cultura. Este bioferti-
lizante também vem sendo emprega-
do sobre o solo em concentrações de
até 20%. Este quando aplicado sobre
o mato roçado, como “input”
microbiano, é capaz de aumentar a
compostagem laminar, isto é direta-
mente no campo, acelerando os pro-
cessos bioquímicos e potencializando
maior atividade microbiana sobre o
solo (D’Andréa & Medeiros, 2002).
As aplicações de biofertilizantes
deverão ser realizadas durante as
fases de crescimento e/ou produção,
evitando-se no florescimento. Deve-
se dar preferência pelos dias de chu-
42 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
va ou irrigação e os horários vesper-
tino ou noturno, evitando-se os perí-
odos secos e as horas mais quentes
do dia. Altas concentrações do bio-
fertilizante podem provocar na plan-
ta demanda de água muito maior
para o seu equilíbrio. Mesmo assim,
pulverizações com o biofertilizante,
na diluição de 1%, nos períodos se-
cos são possíveis. Apesar de estarem
sob os efeitos do estresse hídrico, as
plantas estarão recebendo energia
entrópica (não utilizável pelos inse-
tos) e outros fatores de proteção.
6 - Biofertilizantes,
bioinseticidas e
biorremediação
O aumento da população e a
maior atividade industrial fizeram com
que o problema da poluição do am-
biente atingisse níveis alarmantes.
Além de contaminação por detritos
pouco biodegradáveis, como plásti-
cos e detergentes, soma-se o proble-
ma dos resíduos de industrias e, prin-
cipalmente, dos resíduos agroindus-
triais, como a vinhaça ou o vinhoto,
resultante da produção de etanol em
grande escala. Estes problemas po-
dem ser atacados pelo desenvolvi-
mento de linhagens microbianas ca-
pazes de degradar ou assimilar esses
compostos para uso como agentes
de biorremediação.
O processo da biorremediação
consiste na descoberta e procriação
de bactérias capazes de “comer” os
agrotóxicos que ficam por muitos anos
no solo e na água. Estas bactérias
devoram os componentes químicos
existentes nos venenos, fazendo com
que o produto perca sua capacidade
de poluir o solo, a água e até mesmo
o organismo humano. Estas bactérias
também não são prejudiciais ao meio
ambiente. Caso os resultados da pes-
quisa sejam confirmados, será um
grande avanço para a preservação do
meio ambiente, pois o uso do veneno
é um grande vilão que prejudica o
solo, a água, os animais e o homem
(Azevedo, 1998). Uma saída promis-
sora para esses problemas seria a
multiplicação em massa desses agen-
tes de biodegradação de agentes quí-
micos, em tanques abertos, adotando-
se a técnica de cultura em composta-
gem líquida contínua. A produção de
biofertilizantes líquidos, à base de
resíduos oriundos da agricultura e da
indústria, modificados por microorga-
nismos, gerarão substratos úteis como
fertilizantes de solo e como bioprote-
tores de plantas para a agricultura.
A partir de compostos ricos em
nutrientes, facilmente acessíveis e de
baixo custo operacional, como os
resíduos sólidos e líquidos oriundos
da agricultura e da indústria, é possí-
vel a adição de microrganismos (le-
veduras, bactérias e actinomicetos,
por exemplo) previamente selecio-
nadas, com as condições necessárias
de ecologia nutricional, que promo-
verem o rápido crescimento popula-
cional, resultando em alta produção
de massa microbiana.
Técnicas sofisticadas, porém com
o mesmo princípio, têm sido utiliza-
das em laboratórios, sob condições
controladas em biofermentadores, na
produção líquida de inseticidas à base
de microrganismos entomo patogê-
nicos (fungos, vírus, bactérias e
nematóides) capazes de controlar as
pragas em níveis aceitáveis, econô-
micos e ecológicos (Alves, 1998).
A preocupação em se gerar alter-
nativas ecológicas ao problema dos
rejeitos líquidos e sólidos na agricultu-
ra, transformá-los em insumos de bai-
 xo custo e capazes de serem aplicados
na atividade produtiva primária, em
cultivos orgânicos, representa um gran-
de avanço na preservação do meio
ambiente. Contudo, serão necessários
alguns anos de investigação e desen-
volvimento, para que se produzam
metodologias de elevado alcance soci-
al, e grandes esforços no sentido de se
consolidar o emprego desses proces-
sos bioquímicos como forma de se
promover a sustentabilidade dos ambi-
entes agrícolas.

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Pesquisa
Aplicações da ciência genômica no melhoramento de plantas para as regiões de várzea do sul do Brasil
Paulo Dejalma Zimmer, Dr.
Professor do Departamentode de Fitotecnia
FAEM / UFPel
djzimmer@ufpel.tche.br
Gaspar Malone
Doutorando do Programa de Pós Graduação em
Ciência e Tecnologia de Sementes / FAEM / UFPel
malone@gaspar.com.ar
Fernando Irajá Félix de Carvalho, PhD.
Professor do Departamento de Fitotecnia
FAEM / UFPel
carvalho@ufpel.tche.br
José Fernandes Barbosa Neto, PhD.
Professor do Departamento de Plantas de Lavoura
Faculdade de Agronomia / UFRGS
jfbn@ufrgs.br
Antonio Costa de Oliveira, PhD.
Professor do Departamento de Fitotecnia
FAEM / UFPel
acosta@ufpel.tche.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Iniciativas
Genômicas
melhoramento ge-
nético de plantas
tem contribuído de
forma decisiva para
o incremento da
produção mundial
de grãos (BORLAUG, 1983). Entre-
tanto, a necessidade e os desafios
para as próximas duas décadas são
imensos, o ganho genético para a
produtividade está se reduzindo a
cada ano e já não acompanha mais o
aumento da demanda por alimentos
(BORLAUG, 1997; MANN, 1997 e
1999). Atualmente, grandes esfor-
ços estão sendo direcionados no
sentido de elucidar o potencial ge-
nético das espécies cultivadas,
objetivando incrementar a produti-
vidade e a qualidade. Para o lança-
mento de novos cultivares que aten-
dam à demanda crescente por ali-
mentos, os programas de melhora-
mento de plantas necessitam de gran-
des mudanças, principalmente no
que tange à estrutura, à estratégia e
à própria ciência envolvida (STUBER
et al., 1999; KOORNNEEF & STAM,
2001). Além do foco na qualidade e
na produtividade, o melhoramento
genético também pode ser direcio-
nado no sentido de aumentar a adap-
tabilidade das espécies. Essa tam-
bém pode ser considerada uma for-
ma de incrementar a produção de
alimentos, pois áreas marginais po-
dem ser incorporadas ao sistema
produtivo mediante o desenvolvi-
mento de genótipos adaptados. No
Sul do Brasil, há cerca de 6,8 mi-
lhões de hectares de terras baixas,
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
caracterizadas por solos hidromórfi-
cos, que têm o seu sistema agrícola
alicerçado na pecuária extensiva e
no plantio do arroz irrigado. A ex-
ploração inadequada dessa região,
possivelmente associada às dificul-
dades operacionais, não tem permi-
tido uma apropriada rotação de cul-
turas nem o requerido tempo de
pousio, o que favorece a infestação
da cultura por espécies daninhas,
principalmente o arroz vermelho. A
degradação das características físi-
cas do solo provocada pela intensa
movimentação de máquinas e equi-
pamentos extremamente pesados
também impõe a necessidade de
pousio (Figura 1).
Dessa forma, extensas áreas
estão sendo inviabilizadas a cada
ano, tornando-se, muitas vezes, ex-
tremamente árdua a sua recupera-
ção. A busca de alternativas para
compor o sistema agrícola regional
tem motivado iniciativas importan-
tes nas Universidades Federais de
Pelotas e do Rio Grande do Sul
(UFPel e UFRGS) e na Embrapa
Clima Temperado (PORTO et al.,
1998). A inclusão de novas cultu-
ras, como a aveia, o milho e o
azevém, no sistema agrícola das
áreas de várzea tem recebido aten-
ção especial, porém a simples in-
trodução de genótipos não é sufici-
ente para a correção, em função da
inexistência de constituições gené-
ticas adaptadas à condição de en-
charcamento dos locais. Desse
modo, há uma grande demanda por
iniciativas voltadas para a geração
45
 de variabilidade genética, seleção de
constituições genéticas adaptadas às
condições do ambiente e aumento da
eficiência dos programas de melho-
ramento de plantas.
Advento das Técnicas
Moleculares
Até a década de 70, pouco se
conhecia sobre a organização do
DNA. A composição dos pequenos
segmentos com função conhecida,
os genes, era a jóia mais desejada
naquela época. Nos últimos anos,
com o surgimento das técnicas
moleculares, e entre elas a técnica
de clonagem molecular, tornou-se
possível o isolamento e a purifica-
ção de porções genômicas. Esses
avanços contribuíram para tornar a
molécula de DNA o foco das princi-
pais investigações nos últimos anos.
A clonagem molecular consiste no
isolamento e na multiplicação de
moléculas de DNA idênticas, e com-
preende, pelo menos, dois estágios
importantes: primeiro, o fragmento
do DNA de interesse, chamado de
inserto, é ligado a uma outra molé-
cula de DNA, denominada vetor,
para formar o que se chama de DNA
recombinante; segundo, a molécu-
la do DNA recombinante é introdu-
zida numa célula hospedeira com-
patível, num processo chamado
transformação bacteriana. A célula
hospedeira que adquiriu a molécu-
la do DNA recombinante passa,
então, a ser chamada transformante
ou célula transformada. Atualmen-
te, as fronteiras da Tecnologia do
DNA recombinante, principalmen-
te para fins comerciais, parecem ser
ilimitadas. Além dos reflexos dire-
tos, a tecnologia do DNA recombi-
nante proporcionou avanços em
todas as áreas da bioquímica, da
fisiologia e da genética. Esses avan-
ços permitiram a caracterização, a
identificação e a clonagem de uma
série de genes de enzimas, que se
tornaram ferramentas decisivas para
o surgimento de técnicas como a de
marcadores moleculares e de se-
qüenciamento de DNA, o que con-
46 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 1 - Sistema de preparação do solo para plantio de arroz pré-germinado em solos
de várzea, utilizando máquinas extremamente pesadas em solos inundados. Essa
associação afeta negativamente a estrutura física do solo. Cortesia Prof. Silmar Peske.
tribuiu para a elucidação de impor-
tantes vias de biossíntese.
No que tange aos desafios para
tornar eficiente o melhoramento de
plantas e para incrementar a produ-
ção mundial de grãos, várias ferra-
mentas moleculares podem ser in-
corporadas aos programas de melho-
ramento de plantas com o objetivo de
otimizar a obtenção de genótipos
superiores, por exemplo, a transgenia
(YE et al., 2000), a seleção assistida
por marcadores (FRARY et al., 2000),
a mutação induzida (MALUSZYNSKI,
1998) e a genômica (LIU, 1998;
McCOUCH, 2001).
A busca por soluções para diver-
sificar o sistema agrícola nas áreas de
várzea do sul do Brasil passa pela
elucidação dos mecanismos fisioge-
néticos envolvidos na tolerância dos
cereais ao encharcamento. Embora já
tenham sido relatadas (DANTAS et al.,
2001), algumas respostas à deficiên-
cia de oxigênio no solo provocada
pelo excesso de água (encharcamen-
to), ainda permanecem muitas dúvi-
das relacionadas com as interações
genéticas que facultam algumas espé-
cies ou variedades a suportarem solos
com hipoxia decorrente do excesso
de água. A incorporação de tecnologias
moleculares e a formação de
melhoristas treinados para selecionar
genes poderão se refletir em grandes
ganhos de eficiência nos programas
de melhoramento de plantas.
Sintenia e Genomas
Modelos
A sintenia é caracterizada pela
conservação na ordem e no conteú-
do de genes, ou grupos gênicos,
entre espécies relacionadas. Essa
característica também é denomina-
da colinearidade, e poderá ser alta-
mente informativa para estudos
comparativos de função, ação e
regulação gênica entre diferentes
genomas (Figura 2). Embora não
seja uma condição estável, pois a
sintenia pode ser perdida no decor-
rer da evolução, vários trabalhos
evidenciam a importância das regi-
ões cromossômicas conservadas
para estudos genéticos comparati-
vos (BENNETZEN et al., 1998; GALE
& DEVOS, 1998; DEVOS et al., 1999;
FEUILLET & KELLER, 2002).
A sintenia é bastante estudada
na família Brassicaceae e na família
Gramineae, atualmente denomina-
da Poaceae. Essa família é constitu-
ída por muitas espécies, entre elas
algumas das principais espécies agrí-
colas como milho, arroz, trigo, sorgo,
cevada, centeio e aveia (cereais).
Além das variações fenotípicas e
genotípicas existentes entre os cere-
ais, há muitas variações na estrutura
desses genomas. A variação pode
ser no número de cromossomos, no
nível de ploidia e no tamanho do
genoma - estimado em pares de

Figura 2 – Sintenia entre os genomas do arroz, milho, cevada e trigo. As informações
provenientes do genoma menor podem ser utilizadas para guiar ações no sentido de
localizar, mapear e clonar genes em genomas maiores. Os pontos em amarelo
indicam o posicionamento de alguns genes e os números indicam o cromossomo
(Modificado de GALE & DEVOS, 1998).
bases (pb), podendo existir genomas
muito grandes como o genoma do
trigo, com cerca de 16 bilhões de
bases, como também pode ocorrer
genomas muito pequenos, como é o
caso do do arroz, com cerca de 430
milhões de bases. A estratégia atual
está sendo estudar e caracterizar os
sistemas gênicos em genomas pe-
quenos (arabidopsis e arroz) e, con-
siderando a sintenia existente, infe-
rir sobre os genomas grandes (milho
– 2 500 Mpb, trigo – 16 000 Mpb e
cevada - 4 800 Mpb, por exemplo).
Características de um
Genoma Modelo
A presença de determinadas ca-
racterísticas numa espécie pode
torná-la altamente atraente para a
ciência. Sob esse enfoque, as carac-
terísticas mais atraentes numa espé-
cie vegetal, as quais poderão contri-
buir para que ela se torne um mode-
lo, estão relacionadas com a dura-
ção do ciclo, com o número de
sementes produzidas, com o tama-
nho do seu genoma, com a capaci-
dade de multiplicação em diferentes
ambientes, com a facilidade de ma-
nipulação da polinização (direcio-
namento de cruzamentos), com a
capacidade de cultivo in vitro e com
a disponibilidade de informações já
existentes (banco de dados para a
espécie). Essas características geral-
mente definem a facilidade de se
obterem resultados, bem como o
seu volume e sua qualidade. A pri-
meira espécie vegetal utilizada como
modelo para estudos genéticos foi a
ervilha (Pisum sativum L.), quando
Gregor Mendel publicou os resulta-
dos dos primeiros estudos genéti-
cos, no ano de 1865. É lógico que
naquela época Mendel não conside-
rou os critérios utilizados atualmen-
te, mas certamente escolheu a ervi-
lha pela familiaridade que ele tinha
com o cultivo daquela espécie. Em-
bora as leis de Mendel não tenham
sido validadas até o seu redescobri-
mento, no início do século XX, cons-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
tituíram a base científica dos estu-
dos realizados até hoje. Na história
recente da Biologia de Plantas, uma
outra espécie apresentava muitas
características atraentes e surgia
como modelo entre as dicotiledône-
as; tratava-se da Arabidopsis
thaliana. Essa espécie vegetal é
membro da família Brassicaceae, a
qual inclui espécies cultivadas como
o repolho, o rabanete e a canola.
Embora a arabidopsis não possua
importância agronômica, essa espé-
cie apresenta vantagens importan-
tes para a pesquisa básica em gené-
tica e biologia molecular. Além dis-
so, ou como conseqüência disso,
essa espécie possui o maior volume
de informação disponível dentre to-
dos os vegetais. No entanto, o mo-
delo genético Arabidopsis thaliana
limitava-se principalmente ao siste-
ma genético das dicotiledôneas,
quando um complemento para as
monocotiledôneas começou a ser
procurado. Nos últimos anos, está
sendo dispensada muita atenção a
uma outra espécie, o arroz (Oryza
sativa L.), por ele possuir também
bons atributos para se tornar um
modelo genético vegetal. Embora
seu genoma seja pouco maior, cerca
de três vezes maior que o genoma
de Arabidopsis thaliana L., ainda
assim é cerca de 40 vezes menor do
que o genoma do trigo (Triticum
aestivum L.). Entretanto, a estraté-
gia de direcionar os esforços para
tornar o arroz um genoma modelo
está alicerçada no interesse de se
obter um modelo entre as gramíneas,
principalmente aquelas produtoras
de grãos, pois, praticamente, todas
as ações dos programas de melhora-
mento de plantas estão voltadas para
produtividade, resistência a molés-
tias e adaptabilidade. Outro fator
fundamental no interesse de tornar
o arroz um genoma modelo é a
existência de sintenia ou colineari-
dade entre os genomas dessa famí-
lia. Atividades voltadas para a iden-
tificação e a clonagem de genes com
a utilização de genomas modelos,
como o arroz, são bem mais eficien-
tes do que em genomas grandes.
47
 Portanto, atualmente a estratégia
mais racional será estudar o arroz,
identificar, clonar e caracterizar seus
genes e, quando tudo estiver
mensurado, atingir os genomas mais
complexos, como os do trigo e do
milho. Dessa forma, os programas de
melhoramento de plantas poderão
aumentar em muito sua eficiência.
A particularidade que o arroz
possui, de ser cultivado sob irrigação
por inundação (várzeas) e sequeiro
(terras altas), também torna essa es-
pécie modelo para o entendimento
dos mecanismos que controlam a adap-
tabilidade das plantas. O Centro de
Genômica e Fitomelhoramento (CGF)
da UFPel está buscando, mediante a
utilização de tecnologias modernas, o
entendimento do sistema de raízes do
arroz (modelo genético). A identifica-
ção de mecanismos morfofisiológicos
e os respectivos controles genéticos
permitirão a identificação e a clonagem
dos genes envolvidos. A sintenia e a
utilização de ferramentas genômicas
adequadas conduzirão à rápida utili-
zação desse conhecimento para o de-
senvolvimento e lançamento de
genótipos superiores, de diversas es-
pécies que poderão ser adaptadas aos
solos encharcados do sul do Brasil.
Seqüenciamento de
Genomas
Os primeiros passos para o se-
qüenciamento de DNA foram dados
por Sanger, em 1977, com o desenvol-
vimento do método de seqüencia-
mento manual conhecido também
como método da cadeia interrompi-
da. Hoje o método de Sanger baseia-
se na amplificação, por PCR, de frag-
mentos de DNA clonados previamen-
te dentro de vetores conhecidos. Des-
sa forma, oligonucleotídeos iniciado-
res (primers), complementares à se-
qüência do vetor, são utilizados para
amplificar o inserto do DNA a ser
seqüenciado. A metodologia foi cha-
mada de “cadeia interrompida” em
função de que são utilizados dNTPs
(deoxi-Nucleotídeos Trifosfatos) mo-
dificados, os ddNTPs (dideoxi-Nucle-
otídeos Trifosfatos), os quais, quando
48 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 3 – Esquema representativo do método de seqüenciamento desenvolvido por
Sanger (A) e do método de seqüenciamento automatizado (B). Consulte o texto para
conferir os detalhes de cada método.
incorporados pela enzima Taq poli-
merase (a enzima que amplifica o
DNA), não permitem a inclusão do
nucleotídeo seguinte por não apre-
sentarem a hidroxila no carbono 3 da
dideoxi-ribose do nucleotídeo
terminador. Portanto, a síntese da
molécula de DNA pára nesse ponto
(Figura 3).
Pelo método de Sanger, o pro-
cesso de seqüenciamento é realizado
em quatro reações independentes.
Em cada uma delas é adicionado um
ddNTP diferente (ddATP, ddCTP,
ddGTP e ddTTP), geralmente marca-
dos radiativamente com 32P. Na cópia
de cada fita de DNA, a partir do
molde, as moléculas são sintetizadas
até que incorporem o nucleotídeo
terminador (ddNTP). O acúmulo de
moléculas terminadas numa mesma
base possibilita sua visualização no
gel. A geração aleatória de moléculas
terminadas nas bases distintas de uma
fita molde de DNA permitirá o estabe-
lecimento da seqüência de nucleotí-
deos do referido molde. A leitura da
seqüência de bases é realizada medi-
ante a separação, num gel de poliacri-
lamida de alta resolução, dos frag-
mentos amplificados por PCR. Nesse
tipo de técnica, é possível identificar
cerca de 200 a 300 nucleotídeos. A
Figura 3 apresenta um esquema sinte-
tizado dessa metodologia.
Na última década, o surgimento
dos seqüenciadores automáticos, ali-
ado à elevada capacidade de proces-
sar informações que a informática
proporcionou, revolucionou a
genômica, dando origem a bioinfor-
mática. O seqüenciamento automáti-
co mantém o mesmo princípio do
método de seqüenciamento manual
proposto por Sanger, mas a possibi-
lidade de utilizar ddNTPs marcados
fluorescentemente com cores distin-
tas para cada um deles (ddCTP,
ddGTP, ddATP e ddTTP) permitiu
automatizar o processo (veja Figura
3). Outra grande vantagem do se-
qüenciamento automático é a incor-
poração de metodologias laser e pro-
gramas computacionais que fazem a
leitura dos resultados. As moléculas
fluorescentes utilizadas nos ddNTPs,
quando sensibilizadas pelo laser, emi-
tem um comprimento de onda, que é
capturada por uma câmera acoplada
ao seqüenciador. A informação é pro-
cessada e transformada em seqüênci-
as nucleotídicas por softwares ade-
quados.
Devido à baixa capacidade de
produção proporcionada pelo méto-
do de Sanger, as primeiras seqüências
nucleotídicas foram geradas para es-
tudos pontuais, como o estabeleci-
mento da seqüência de alguns genes
e de pequenas regiões cromossômi-
 Figura 5 – Esquema representativo das principais etapas na geração de bibliotecas
de seqüenciamento. A – Para seqüenciamento estrutural via construção de biblioteca
BAC (Bacterial Artificial Chromosomes). 1 – DNA genômico; 2 – Alinhamento de
fragmentos de 100 a 200 kb em mapa físico (Biblioteca BAC); 3 – Fragmentação
individual dos BACs; 4 – Subclonagem de fragmentos entre 2 e 5 kb. B – Para
seqüenciamento de ESTs (Expressed sequence tags) ou do transcriptoma. 1 – Extração
de RNA mensageiro; 2 – Síntese reversa utilizando RT-PCR; 3 – Síntese de cDNA dupla
fita; 4 – Clonagem dos cDNAs.

mada de Iniciativa Genoma da Arabi- a subespécie japonica. Essa associa-

Figura 4 – Detalhes de um exemplar de
Arabidopsis thaliana L. cultivado em
laboratório. Cortesia Dra. M. E. Alvarez.
CIQUIB – CONICET, Universidad Nacio-
nal de Córdoba – Argentina.
cas. À medida que foram desenvolvi-
dos os seqüenciadores de nucleotíde-
os automatizados, a capacidade de
produção de seqüências foi aumenta-
da muito rapidamente. Em função
disso, surgiram, mediante a associa-
ção de grupos de pesquisa, várias
iniciativas voltadas para o seqüencia-
mento de alguns genomas. Os primei-
ros esforços foram direcionados para
alguns microorganismos e, em segui-
da, para a Arabidopsis thaliana (The
Arabidopsis Genome Initiative*, 2000)
e para a Drosophila melanogaster
(ADAMS et al., 2000), dois organis-
mos utilizados como modelo na biolo-
gia. Na seqüência, apresentaremos o
que já foi realizado com o intuito de
gerar informações genéticas das prin-
cipais espécies, com vistas ao melho-
ramento vegetal.
Arabidopsis thaliana - o
genoma da Arabidopis (125 milhões
de nucleotídeos – 125 Mpb) foi
seqüenciado por uma associação in-
ternacional de pesquisadores cha-
dopsis (The Arabidopsis Genome
Initiative*, 2000). A seqüência, o mapa
e as anotações disponíveis atualmen-
te são resultado de esforços conjun-
tos do TIGR (The Institute for
Genomic Research), MIPS (Munich
Information Center for Protein
Sequences) e TAIR (The Arabidopsis
Information resource). Veja uma foto
dessa espécie vegetal observando a
Figura 4.
Arroz (Oryza sativa L.) – Fo-
ram empregados esforços públicos e
privados para seqüenciar essa espé-
cie. O primeiro esforço privado foi
realizado pela Monsanto (PENNISI,
2000). Mais tarde, os resultados gera-
dos seriam somados aos resultados do
IRGSP (International Rice Genome
Sequencing Project). O segundo es-
forço privado, uma associação entre
duas empresas, a Myriad Genetics e a
Syngenta, utilizou o método whole
genome shotgun, e não acrescentou
resultados significativos ao conjunto
de dados disponibilizados pelos ou-
tros projetos (GOFF et al., 2002).
Foram implementados também dois
esforços públicos para o seqüencia-
mento do arroz. O primeiro deles, o
Projeto Internacional de Seqüencia-
mento do Genoma do Arroz (IRGSP –
International Rice Genome Sequencing
Project), teve como objetivo seqüenciar
ção teve início no ano de 1997, em
uma reunião do Simpósio Internacio-
nal de Biologia Molecular de Plantas
realizado em Singapura. Naquela oca-
sião, o objetivo da comunidade cien-
tífica era socorrer o idealizador do
projeto de seqüenciamento estrutural
do arroz, o RGP (Rice Genome Project)
do Japão. O segundo esforço público
foi liderado pela Academia Chinesa
de Ciências (Chinese Academy of
Sciences) de Beijing, China. Esse pro-
jeto iniciou-se em abril de 2000 e, dois
anos mais tarde, seus resultados fo-
ram publicados pela revista Science
(YU et al., 2002). A grande distinção
estabelecida entre as subespécies
seqüenciadas por esses dois esforços
públicos foi em relação à importância
econômica e geográfica que elas apre-
sentam. A subespécie seqüenciada
pelo grupo liderado pelos japoneses,
spp japonica, é amplamente cultiva-
da no Japão, nos Estados Unidos, na
Coréia do Sul e em parte da China. Por
outro lado, a subespécie seqüenciada
pelos chineses, spp indica, é bastante
cultivada na China e no Sudeste Asiá-
tico, bem como no Sul do Brasil. Além
disso, as estratégias de seqüencia-
mento utilizadas pelos dois grupos
foram distintas; enquanto o grupo dos
chineses focava a anotação de genes,
pois utilizou a estratégia whole genome
shotgun, o grupo liderado pelo RGP

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 49

 Figura 6 – Detalhes de uma lavoura de
arroz irrigado do cultivar BRS 7 “Taim”.
Cortesia Prof. Silmar Peske.
Figura 7 – Detalhes de uma lavoura de
trigo (Triticum aestivum). Cortesia Prof.
Silmar Peske.
focou, além da anotação dos genes, a
geração de informações precisas ao
nível de estruturação e organização
do genoma, pois utilizou a técnica de
seqüenciamento estrutural via cons-
trução de bibliotecas BAC (Bacterial
Artificial Chromosomes) (Figura 5 A).
Veja uma foto dessa espécie vegetal
observando a Figura 6.
Trigo (Triticum aestivum) –
os esforços para determinar a se-
qüência de nucleotídeos do trigo
50 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 8 - Detalhes de uma lavoura de cevada (Hordeum vulgare), safra 2003, da
Linhagem CEV 97043 da propriedade do Produtor Adelar Crespi.
depararam-se com duas grandes bar-
reiras. A primeira delas se refere ao
tamanho do genoma, que é, aproxi-
madamente, de 16 bilhões de nucle-
otídeos (16.000 Mpb) - cerca de 40
vezes maior que o genoma do arroz.
A segunda delas é que o seu genoma
é diferente do do arroz e da
arabidopsis, ambos diplóides, en-
quanto o trigo é hexaplóide. Esses
impedimentos impuseram uma es-
tratégia preliminar para que fossem
determinadas as seqüências trans-
critas: o transcriptoma (bibliotecas
de cDNA) de diferentes estádios do
desenvolvimento da planta (Figura
5 B) Portanto, considerando a estru-
tura e o tamanho do genoma do
trigo essa ação é mais lógica do que
pensar num inexeqüível projeto de
seqüenciamento estrutural dessa es-
pécie. De uma forma geral, a estra-
tégia visa a gerar seqüências nucle-
otídicas dos genes transcritos em
determinados estádios de desenvol-
vimento ou sob determinados
estresses do ambiente. O esboço de
uma associação internacional volta-
da para a geração dessas informa-
ções começou a ser definido em
1998, com a criação de uma ação
Internacional Cooperativa para a pro-
dução de ESTs (Expressed Sequence
Tags) de trigo. Atualmente, as ações
com a intenção de determinar a
posição no mapa dos transcritos são
coordenadas pelo International
Triticeae Mapping Initiative. Os prin-
cipais esforços para a criação de
uma coleção de ESTs representati-
vos do trigo estão sendo liderados
pelos EUA (U. S. Wheat Genome
Project), pelo Canadá (AAFC –
Agriculture and Agri-Food Canada)
e pela Inglaterra (BBSRC –
Biotechnology and Biological
Sciences Research Council). Veja uma
foto dessa espécie vegetal obser-
vando a Figura 7.
Cevada (Hordeum vulgare) –
os esforços para determinar a se-
qüência de nucleotídeos da cevada
também sofrem impedimentos devi-
do ao tamanho do seu genoma ~ 4,8
bilhões de nucleotídeos (4800 Mpb).
O primeiro passo para contornar esse
impedimento foi a produção de ma-
pas físicos do genoma da cevada com
alta densidade de marcadores; isso
proporcionará a realização de com-
parações com o genoma do arroz. O
próximo passo será a criação do
transcriptoma da espécie. Essas deci-
sões estão sendo implementadas em
um esforço combinado entre cientis-
tas da América do Norte (North
American Barley Genome Mapping

Figura 9 – Detalhes de uma lavoura de milho (Zea mays) e de espigas maduras
(direita inferior). Cortesia Prof. Silmar Peske.
Project, USA e North American Barley
Genome Mapping Project, Canadá) e
da Europa (Plant Genome Resource
Centre, Alemanha e Scottish Crop
Research Institute, Inglaterra), para
criar uma biblioteca de ESTs
(Expressed Sequence Tags) o mais
completa possível (Figura 5 B). Veja
uma foto dessa espécie vegetal ob-
servando a Figura 8.
Milho (Zea mays) – a principal
iniciativa para seqüenciamento do
genoma do milho foi anunciada em
setembro de 2002 pelo NFS (National
Science Foundation) dos Estados
Unidos. No entanto, há muito tempo
os geneticistas da área do milho
buscavam somar esforços com esse
objetivo (BENNETZEN et al., 2001).
Quatro fatores contribuíram para que
essa iniciativa fosse retardada até
2002. Primeiro, os avanços na
tecnologia de seqüenciamento re-
duziram consideravelmente o custo
em comparação com o passado. Se-
gundo, novas metodologias de
fingerprinting, de alta resolução e
produção, permitiram aumentar a
eficiência na seleção de clones para
o seqüenciamento, reduzindo ao mí-
nimo a sobreposição de regiões
seqüenciadas. Terceiro, foram de-
senvolvidas novas metodologias para
preparar frações do genoma do mi-
lho ricas em genes (YUAN et al.,
2002). Quarto, análises comparati-
vas do milho com o arroz (Oryza
sativa) ou Arabidopsis sugerem que
a seqüência do genoma dessas duas
espécies não serão suficientes para
entender detalhadamente o conteú-
do de genes do milho e sua expres-
são (BENNETZEN et. al., 2001;
CHANDLER & BRENDEL, 2002).
Além disso, algumas características
no genoma do milho sempre dificul-
taram a implementação de projetos
de seqüenciamento da espécie. Des-
taca-se a existência de várias
subespécies importantes (Zea mays
spp. Huehuetenangensis, Zea mays
spp. mays (mayze), Zea mays spp.
mexicana (teosinto), e Zea mays
spp. Parviglumis); o elevado con-
teúdo de DNA repetitivo (regiões
duplicadas) presente no genoma do
milho (HELENTJARIS, 1995) e o ta-
manho do seu genoma, cerca de
2500 Mpb.
Da mesma forma que está ocor-
rendo na geração de seqüências
nucleotídicas da cevada e do trigo, o
foco para o milho também será a
geração de seqüências dos genes (o
transcriptoma). As interações do sis-
tema gênico poderão ser obtidas em
genomas como o arroz, principal-
mente devido à ocorrência da
sintenia entre os cereais. Veja uma
foto dessa espécie vegetal obser-
vando a Figura 9.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Reflexos da Tecnologia na
Produção de Cereais
Os grandes avanços na produ-
ção mundial de grãos, gerados a
partir de meados do século passado,
são decorrentes de uma contribuição
decisiva do melhoramento clássico
de plantas (BORLAUG, 1983). Ao
contrário do que alguns entusiastas
esperavam, as grandes expectativas
decorrentes das inovações científicas
dos últimos 30 anos não se refletiram
em significativos incrementos na pro-
dução de grãos. Para que as
tecnologias moleculares possam ren-
der os resultados esperados, algu-
mas barreiras precisam ser supera-
das. A principal delas diz respeito à
mudança de cultura nos programas
de melhoramento de plantas, sendo
necessário selecionar genes ao invés
de selecionar plantas (KOORNNEEF
& STAM, 2001). Superadas as barrei-
ras culturais, a eficiência na imple-
mentação de ferramentas molecula-
res em programas de melhoramento
de plantas poderá ser incrementada
mediante a automatização dos pro-
cessos de extração de DNA, a gera-
ção de um maior número de seqüên-
cias ligadas (marcadores) a caracteres
de importância agronômica e o bara-
teamento dos equipamentos e
insumos utilizados. O treinamento
de novos melhoristas também deve-
rá merecer atenção especial, pois,
além da sólida formação em melho-
ramento clássico e em estatística, é
recomendado que esses profissio-
nais sejam treinados em genética
molecular e técnicas moleculares
aplicadas ao melhoramento de plan-
tas. Principalmente por que é através
desses novos profissionais que os
programas de melhoramento clássi-
cos poderão incorporar as novas fer-
ramentas da biologia molecular.
O setor de melhoramento de
plantas também necessita se articu-
lar para melhorar a capacidade de
processamento das informações já
disponíveis, principalmente aque-
las decorrentes dos diferentes proje-
tos de seqüenciamento de genomas.
Atualmente, dois fatores contribu-
51
 em para que as informações dispo-
níveis não sejam aplicadas rotineira-
mente. A primeira delas é que há
carência de bons sistemas de
informática capazes de trocar infor-
mações com os bancos de dados
com a agilidade requerida; a segun-
da é que poucos profissionais estão
habilitados a realizarem buscas e a
fazerem comparações de seqüênci-
as através de computadores.
Buscando alternativas para com-
por o sistema agrícola das várzeas do
Sul do Brasil, sugerimos a implemen-
tação de ferramentas moleculares e
de bons sistemas de informática para
os programas de melhoramento lo-
cais. Essas ações devem estar volta-
das para a: i) identificação de genes
de tolerância a estresses abióticos em
genomas “modelo” (arroz), com pos-
terior caracterização em espécies de
interesse (trigo, milho, cevada, sorgo,
aveia e azevém); ii) caracterização
molecular do germoplasma local; iii)
identificação de “genes maiores”, res-
ponsáveis pela adaptação do arroz
ao encharcamento; e, iv) criação de
um banco de mutantes para o sistema
de raízes.
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* A autoria deste trabalho deverá ser “The Arabidopsis Genome Iniative”. Uma lista completa dos colaboradores aparece no final do artigo original
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 Associação de mutações nos
Pesquisa
genes BRCA1 e BRCA2
Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 causadoras do câncer de mama hereditário
Paulo Henrique Machniewicz
Biólogo - Faculdades Integradas “Esprírita”
Especialista em Genética Humana PUC-PR,
Responsável pelos laboratórios de Genética,
Imunologia e Microbiologia do Centro Universitário
Campos de Andrade - UniAndrade - Curitiba-PR
paulo.mach@bol.com.br
Fábio Rueda Faucz, Dr
Biologo - UFPR
Mestrado em Ciências Biológicas - UFPR
Doutorado em Genética - UFPR
Professor adjunto - PUC-PR
Professor Titular - UNICEMP-PR
fabiogenetica@yahoo.com
Ilustrações cedidas pelos autores
Resumo
Cerca de 10% dos cânceres de
mama podem ser associados a muta-
ções na linhagem germinativa. Em
1990, foi identificado, no cromosso-
mo 17, o gene BRCA1, composto de
24 exons e codifica para uma proteína
de 1.863 aminoácidos. Mutações nes-
te gene são responsáveis por metade
de todos os casos familiares de câncer
de mama. Já em 1995, identificaram o
BRCA2, com 27 exons, codificando
para uma proteína de 3.350 aminoáci-
dos. Este gene encontra-se no cro-
mossomo 13. Mutações neste gene
são responsáveis por cerca de 35%
dos casos familiares precoces de cân-
cer de mama. Estes dois genes, asso-
ciados a outras proteínas, desencadei-
am a doença que mais mata mulheres.
No Brasil, registram-se cerca de 35.000
novos casos de câncer de mama por
ano. O câncer representa uma proli-
feração maligna das células ou lóbu-
los epiteliais que revestem os ductos
ou lóbulos da mama. O câncer femini-
no é raramente encontrado antes dos
25 anos de idade, exceto em casos
hereditários. A transmissão hereditá-
ria de câncer de mama segue o clássi-
co padrão mendeliano de transmissão
autossômica dominante, com 50% das
crianças de carreadoras, herdando mu-
tações BRCA1. As portadoras femini-
nas de mutações são estimadas a
terem um risco de 85% de desenvolvi-
mento de câncer de mama e ovário,
com maior incidência de câncer bila-
teral e mais de 50% dos cânceres de
mama, ocorrendo, antes dos 50 anos.
A prevalência de mutações de BRCA1
e BRCA2 é ocasionalmente mais alta
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
que o esperado, devido à transmissão
aumentada de algumas mutações, em
certas populações, devido ao efeito
do fundador. A população de Judeus
Askenazi é a que representa um exem-
plo claro de mutações, devido ao
efeito do fundador, por cultivarem
suas tradições de união restrita. Por
conseqüência, as mutações encontra-
das nesta população são iguais em
inúmeros países para onde migraram.
Outras populações, como Espanhóis,
Indianos, Paquista-neses, Russos e até
tribos Aborígines do Canadá, também
apresentam algumas mutações que
são mais freqüentes e que podem ser
atribuídas ao efeito do fundador.
1. Introdução
O nosso organismo é constituído
por trilhões de células, que se repro-
duzem pelo processo de divisão celu-
lar. Este é um processo ordenado e
controlado, responsável pela forma-
ção, crescimento e regeneração de
tecidos saudáveis do corpo. Algumas
vezes, no entanto, as células perdem
a capacidade de limitar e comandar
seu próprio crescimento, passando,
então, a se multiplicarem muito rapi-
damente e de maneira aleatória e
desordenada, formando nódulos.
O câncer surge por causa de
alterações no DNA, que resulta na
proliferação incontrolável de célu-
las. A maioria dessas alterações en-
volve modificações seqüenciais re-
ais de DNA. Elas podem surgir como
conseqüência de erros de replicação
aleatórios, exposição a carcinógenos,
ou processos defeituosos de reparo
do DNA.
53
 As lesões da mama limitam-se,
predominantemente, ao sexo femi-
nino por possuir uma estrutura ma-
mária mais complexa, volume ma-
mário maior e extrema sensibilidade
às influências endócrinas predis-
põem esse órgão a diversas condi-
ções patológicas (COTRAN, KUMAR,
COLLINS, 2001).
As neoplasias constituem as le-
sões mais importantes da mama fe-
minina, apesar de não serem as mais
comuns. Elas podem surgir a partir
de epitélio escamoso, estruturas glan-
dulares e tecido conjuntivo.
Existem três grupos de influên-
cias importantes no câncer de mama:
• Fatores genéticos;
• Influências hormonais;
• Fatores ambientais.
No Brasil, registram-se 35.000
novos casos de câncer de mama por
ano, 11.000 deles, só no Estado de São
Paulo. Fatores de risco de câncer na
família, alimentação rica em gorduras,
início precoce da menstruação, me-
nopausa tardia, 1ª gestação após os 30
anos e o fato de a mulher nunca ter
engravidado são alguns dos fatores
que influenciam para desenvolver um
tumor maligno na mama.
O câncer de mama representa
uma proliferação maligna das célu-
las epiteliais que revestem os ductos
ou lóbulos da mama. É considerado
o mais comum em mulheres, poden-
do existir por um longo período,
como doença não-invasiva ou
invasiva, mas não-metástica. Este
fato torna-se mais urgente a necessi-
dade do diagnóstico precoce e da
conduta apropriada.
Cerca de 10% dos cânceres de
mama podem ser associados a muta-
ções na linhagem germinativa. Esta
área tem sofrido uma elevação notá-
vel com a identificação de genes
responsáveis por casos em famílias
(BATES, HOCKELMAN, 1982 ).
KING, et al. (1990), usou análise
genética de ligação para identificar o
gene BRCA1 localizado no cromos-
somo 17q21. Ele é responsável por
aproximadamente metade de todos
os casos familiares precoces de cân-
cer de mama, bem como pela maioria
dos casos familiares de câncer de
mama e ovário.
54 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
SCHUTTE, et al. (1995), identifi-
cou um gene na região 13q12-q13,
com seis mutações diferentes em famí-
lias com câncer de mama e identificou
como BRCA2. Mutações nesse gene
são responsáveis por aproximadamente
35% dos casos familiares precoces de
câncer de mama. Estão ainda associa-
dos a um risco aumentado de câncer de
mama e de próstata em homens, e de
câncer ovariano e pancreático.
Estes dois genes associados a
outras proteínas desencadeiam a do-
ença que mais mata mulheres.
Para que se tenha uma avaliação
precisa do risco de desenvolver um
câncer é necessário que se obtenha
uma história da paciente, uma
genealogia do câncer precisa, onde é
possível confirmar os tipos de cânce-
res através de documentos hospitala-
res e exames.
Devido aos altos custos e difi-
culdades para testar mutações em
BRCA1 e BRCA2, são realizadas pro-
vas nas mutações mais prováveis
nas populações. Nas famílias de Ju-
deus as três principais mutações de
fundador mais freqüentes, 185 del
AG, 5382 ins C em BRCA1 e 617 del
T em BRCA2. Estas três mutações
mais freqüentes respondem por mais
de 90% da população. Quando uma
mutação de fundador é encontrada,
esta já é suficiente para autorizar a
blindagem para todos as três muta-
ções (BAST, et al 2000).
2. Localização da mama
A mama está localizada entre a
2ª e a 6ª costela, entre a margem
esternal e a linha medioaxilar. O
tecido mamário possui três compo-
nentes principais:
• Tecido glandular: é organiza-
do em 12 a 20 lobos, onde cada
qual termina num canal que se
abre na superfície do mamilo.
• O tecido glandular é sustenta-
do por tecido fibroso, incluindo
os ligamentos suspensórios que
estão conectados tanto à pele
quanto à fascia que fica por
debaixo da mama.
• A gordura circunda a mama e
predomina tanto superficial-
mente, quanto na periferia
(SPENCER, 1991).
Os vasos linfáticos de grande
parte da mama drenam para a axila.
A borda anterior da axila é formada
pelos músculos peitorais; as bordas
posteriores incluem o subescapular e
o grande dorsal; a borda interna pelo
quadril cortal e músculo denteado
anterior; e a borda externa pela parte
superior do braço.
Os gânglios axilares na parte
alta da axila, perto das costelas e do
denteado anterior. Para dentro deles,
drenam canais provenientes de três
outros grupos de gânglios linfáticos:
1. o grupo peitoral ou anterior;
2. o grupo subescapular (poste-
rior);
3. o grupo lateral;
Convém observar que nem to-
dos os linfáticos da mama drenam
para a axila. Dependendo da locali-
zação de uma lesão no seio, a disse-
minação pode se processar direta-
mente para os gânglios infraclavicu-
lares, para dentro dos canais profun-
dos existentes no interior do tórax ou
do abdômen, e até para a mama
oposta (BATESE, HOCKENAM, 1982).
Na glândula mamária, os lobos
possuem muitas subdivisões que
são chamadas de lóbulos; estes ter-
minam em dezenas de pequenos
bulbos produtores de leite. Os lo-
bos, lóbulos e bulbos são interliga-
dos por tubos finos denominados
ductos. Estes ductos vão até o ma-
milo (papilo), localizado no centro
da área escura da pele que se cha-
ma auréola.
Somente com o início da gravi-
dez é que a mama assume a
maturação morfológica e atividade
funcional completa. Após a cessa-
ção da lactação, os lóbulos regridem
e sofrem atrofia, havendo uma re-
dução notável no tamanho total da
mama. A maioria das neoplasias
mamárias não contém tecido
adiposo e, em exames como a ma-
mografia, elas aparecem como mas-
sas de maior densidade, contras-
tando com o estroma circundante.
Por conseguinte, a mamografia é
menos sensível em mulheres jo-
vens, nas quais essas massas po-
dem ser obscurecidas por tecido
denso circundante (COTRAN,
KUMAR, COLLINS, 2001).
3. Sinais visíveis de Câncer
Mamário
BATES, HOCKELMAN, (1982)
descreveram alterações na mama que
caracterizam um tumor, entre elas
destacam-se:
• Produção de fibrose, ou for-
mação de tecido cicatricial;
• Sinais de retração que inclu-
em covas cutâneas, alterações
nos contornos mamários e acha-
tamento ou desvio do mamilo;
• Aparecimento de nódulo ou
endurecimento da mama ou em-
baixo do braço;
• Mudanças no tamanho e ou
formato da mama;
• Alteração na coloração ou na
sensibilidade da pele da mama
ou da auréola;
• Secreção contínua por um
dos ductos;
• Retração da pele da mama ou
do mamilo;
• Inchaço significativo ou
distorção da pele.
• As alterações no contorno
são identificadas por inspeção
cuidadosa das superfícies nor-
malmente convexas das ma-
mas e comparando uma mama
com a outra.
• Edema de pele, produzindo
por bloqueio linfático.
4. Classificação dos tipos
de Câncer de Mama
O câncer de mama é subdividi-
do em dois grandes grupos:
• Carcinomas: que podem ser
diferenciados em câncer lobular
onde começa nos bulbos (pe-
quenos sacos que produzem
leite); ou câncer dos ductal,
que se formam nos ductos que
levam o leite dos lóbulos para o
mamilo (papila).
• Sarcomas: formam-se nos
tecidos conjuntivos, onde é mais
comum o câncer se dissipar
para outras partes do corpo.
O carcinoma é o mais comum.
Ele é mais comumente encontrado e
diagnosticado na mama esquerda do
que na mama direita.
Os cânceres são bilatérias ou
seqüenciais na mesma mama em 4%
ou mais dos casos. Entre os carcinomas
de mama pequenos o suficiente para
identificar sua área de origem, cerca de
50% surgem no quadrante superior
externo, 10% em cada um dos
quadrantes restantes e cerca de 20% na
região central ou subareolar, o local de
origem influência de modo considerá-
vel o padrão de metástase linfonodal.
Os carcinomas são divididos em
carcinomas não–inflitrantes ou in situ
e carcinomas inflitrantes.
♦ Carcinomas in situ:
• Carcinoma ductal in situ;
• Carcinoma lobular in situ;
♦ Carcinomas Invasivos (infil-
trante):
• Carcinoma ductal infiltrante
sem tipo específico;
• Carcinoma lobular invasivo
ou infiltrante;
• Carcinoma medular;
• Carcinoma colóide;
• Carcinoma tubular;
• Carcinoma papilar invasivo.
5. Estágios de
desenvolvimento do
Câncer de Mama
Os diferentes tipos de câncer de
mama, quando são diagnosticados e
confirmados com exame laboratorial,
são classificados conforme o seu ta-
manho e presença de metástases nos
linfonodos e a distância. Esta classi-
ficação foi criada para que o médico
possa saber indicar qual o tratamento
mais adequado para o paciente (
HARRISON, et al. 1998 ).
• TX: tumor primário que não
pode ser demonstrado.
• T0: não existe evidência de
tumor primário.
• TIS carcinoma in situ: carci-
noma intraductal e carcinoma
lobular in situ.
• T1: tumor de até 2 cm.
• T1a: tumor de até 0,5 cm.
• T1b: tumor 0,5 > 1 cm.
• T1c: tumor 1cm > 2 cm.
• T2: tumor com mais de 2 cm
e menos de 5 cm.
• T3: tumor com mais de 5 cm.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
• T4: tumor de qualquer tama-
nho com possível extensão di-
reta a parede do tórax.
• T4a: extensão a parede do
tórax.
• T4b: edema, ou ulceração, ou
nódulos satélites na parede da
mesma mama.
• T4c: quando encontra-se T4a
e T4b.
• T4d: carcinoma inflamatório.
Gânglios Linfáticos (N)
• NX: quando não se pode afirmar
o comprometimento dos gânglios.
• N0: sem metástase em gânglios
regionais.
• N1: metástase em gânglios axi-
lares unidos uns aos outros e a outras
estruturas.
• N3: metástase em gânglios lin-
fáticos da mama interna.
Classificação Patológica
• PNX: quando não se pode
excluir a presença de gânglios.
• PN0: sem metástase em gân-
glios regionais.
• PN1: metástase em gânglios
regionais laterais móveis.
• PN1a: somente micrometásta-
ses < 0,2 cm.
• PN1b: metástase em gânglios
maiores de 0,2 cm.
• PN1b1: metástase de 1 a 3
gânglios > 0,2 < 2 cm.
• PN1b2: metástases de 4 ou
mais gânglios > 0,2 a < 2 cm.
• PN1b3: quando atravesa a
parede do gânglio < 2 cm.
• PN1b4: metástase a gânglios
linfáticos de 2 cm ou massa e
dimensão maior.
• PN2: metástase em gânglios
axilares unidos uns aos outros e
a outras estruturas.
• PN3: metástase em gânglios
linfáticos da mama interna.
Metástase a Distância (M)
• MX: presença de metástase à
distância, mas que não pode ser
demonstrado.
• M0: não há evidência de
metástase à distância.
• M1: presença de metástase
supraclaviculares.
55
 São considerados cinco estágios
de desenvolvimento de tumor segun-
do o Comitê Americano de Câncer.
• Estágio 0:Carcinoma ductal in
situ e carcinoma lobular in situ.
Sem evidência de tumor nos
linfonodos e metástase à dis-
tância.
• Estágio 1: Quando o tumor
tem até 2 cm , mas sem qual-
quer evidência de ter se espa-
lhado pelos gânglios linfáticos
próximos.
• Estágio 2: Inclui tumores de
até 2 cm, mas com envolvimen-
to de gânglios linfáticos, ou,
então, um tumor primário de
até 5 cm, com linfonodos axila-
res afetados, porém móveis, sem
metástase à distância, ou tumor
com mais de 5 cm sem compro-
metimento linfonodal nem
metástases distantes.
• Estágio 3: Quando o tumor
tem mais de 5 cm e há envolvi-
mento dos gânglios linfáticos
da axila do lado da mama afeta-
da.
• Estágio 4: Quando existem
metástases distantes, como no
fígado, ossos, pulmão, pele ou
outras partes do corpo.
6. Frequência e
epidemiologia
O câncer de mama feminino é
raramente encontrado antes dos 25
anos de idade, exceto em casos
familiares. A idade habitual que se
identifica gira em torno dos 30–80
anos, sendo mais comum na meia
idade e velhice.
Encontra-se entre as doenças
mais comuns e a que mais mata
mulheres no Brasil. Dados do Insti-
tuto Nacional do Câncer –I NCA
mostram que foram diagnosticados
neste ano cerca de 30 mil casos
novos e oito mil morreram por causa
da doença.
Este tipo de tumor foi considera-
do o 3º que mais mata no Brasil. A
obtenção de uma história familiar
constitui um fator de risco para de-
senvolvimento do câncer de mama; 5
a 10% dos casos são atribuíveis á
herança de um gene autossômico
dominante.
56 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
A probabilidade de herança ge-
nética aumenta se houver vários pa-
rentes afetados e se for constatada a
ocorrência do câncer numa idade
jovem.
Dois genes são responsáveis pela
maioria dos cânceres de mama here-
ditário: o BRCA1 e BRCA2.
O BRCA1, localizado no cro-
mos-somo 17, quando mutante, é
capaz de produzir alto risco (talvez
até 85% ao longo da vida) de câncer
de mama e também de câncer ovari-
ano (talvez50% de risco ao longo da
vida). Cerca de 1/500 mulheres car-
regam uma mutação BRCA1 na linha-
gem germinativa, com freqüência,
dando origem a uma história familiar
consistente. Homens com mutações
BRCA1 podem ter um aumento mo-
desto no risco de câncer de próstata.
“... há uma série de heteroge-
neidade mutacional descrito para o
BRCA1, como em geral é o caso nos
distúrbios genéticos. Uma exceção são
as populações Judia Askenazi, em
que um de 100 indivíduos carregam
uma deleção 2-pb particular a 185
del AG no BRCA1.” 1
Mutações em outro gene no cro-
mossomo 13, o BRCA2 também
confere alto risco de câncer de mama,
e um risco um pouco menor de
câncer ovariano; em homens essas
mutações também os tornam pro-
pensos ao desenvolvimento de cân-
cer de mama.
“Estima-se que a freqüência das
Mutações BRCA 2 seja cerca da
metade da freqüência do BRCA 1 .
Cerca de 1% de Judeus Askenazi
outra vez tem uma mutação comum
há 6174 del T .” 2
A incidência global do câncer de
mama é menor em mulheres negras.
As mulheres nesse grupo desenvol-
vem câncer com uma idade mais
avançada e apresentam um aumento
da taxa de mortalidade, em compara-
ção com as caucasóides.
Os Estados Unidos e a Europa
Setentrional apresentam a maior inci-
dência da doença.
Tumores de mama associados
ao BRCA1 são mais prováveis em
mulheres com filhos, possuem uma
fase S maior, e quantidade elevada
de estrógeno e baixos receptores de
progesterona.
7. Hereditariedade
A transmissão hereditária de cân-
cer de mama segue o clássico padrão
mendeliano de transmissão autossô-
mica dominante, com 50% das crian-
ças de carreadoras herdando muta-
ções BRCA1.
As portadoras femininas de mu-
tações são estimadas a ter um risco
de 85% de desenvolvimento de cân-
cer de mama e/ou ovariano, com
uma maior incidência de câncer bila-
teral e mais de 50% dos cânceres de
mama ocorrendo antes dos 50 anos.
(BIESECKER, et al. 1993).
“... o câncer de mama genético
incide, geralmente, em mulheres jo-
vens, antes dos 50 anos de idade. A
ocorrência de mais de 2 casos em
uma família de mulheres jovens,
com menos de 50 anos, sugere que
existe a possibilidade de que seja um
defeito genético na família. Além dis-
so, estes tumores costumam ser bila-
terais; é freqüente que surjam nas
duas mama, ás vezes não ao mesmo
tempo. A ocorrência de múltiplos ca-
sos em mulheres jovens de tumores
bilaterais, chama a atenção para
que esta seja pela falta de risco .
Outro sinal se dá pelo fato de o câncer
de mama estar associado, nestes ca-
sos genéticos, ao câncer de ovário. A
incidência, em uma mesma família,
de uma mutação genética que pre-
disponha à ocorrência do câncer.
Estes casos constituem, aproximada-
mente, de 6% a 10% dos casos gené-
ticos de câncer de mama. De 90% a
94% não temos uma história famili-
ar.” 3
CROOP, et al (1990), constata-
ram que mutações na linhagem ger-
minativa do BRCA1 são responsáveis
por 2% a 4% de todos os cânceres
mamários. Embora mais que 90%
deles sejam casos esorádicos ocor-
rendo em mulheres sem evidências
de susceptibilidade hereditária, aná-
lises de espécies de tumores mamá-
_________________________________________________________________
1
COLLINS,Francis S. 1998.
2
TRENT, Jeffrey M. 1998.
3
Revista Hands nº3 , 2002.
rios sugerem que anormalidades kb codificando para uma proteína de
somáticas adquiridas no BRCA1 pos- 3.418 aminoácidos.
sam também desempenhar um papel Acredita-se que o BRCA1 e o
em muitos desses cânceres. BRCA2 se comportam como genes
supressores de tumores clássicos, e
8. Estudo de associação que com a perda de uma cópia pre-
dispõem o portador ao desenvolvi-
Os dois principais genes respon- mento do câncer (BAST, et al. 2000).
sáveis pela transmissão hereditária do WOOSTER, et al. (1994), estuda-
câncer de mama, o BRCA1 e BRCA2, ram o acoplamento do genoma em
codificam proteínas de 1.863 e 3.350 15 famílias com alto risco de câncer
aminoácidos, respectivamente (Ane- de mama no BRCA1 em 17q21. Esta
xo 03). Ambos os genes são comple- análise descobriu um segundo lugar
xos formados por mais de 20 exons. suscetível ao câncer de mama, o
O BRCA1 foi identificado no BRCA2 no cromossomo 13q12–q13.
lócus 17q21. Este gene codifica uma O estudo em BRCA2 confere um alto
proteína zíncica cujo produto pode, risco de câncer de mama e não con-
portanto, atuar como fator de trans- fere um risco substancialmente ele-
crição. (FAUCI, et al 1998) descreveu vado de câncer ovariano, como é o
que este gene possui 22 exons codi- risco do BRCA1.
ficantes e 2 exons não-codificantes, Várias pesquisas indicaram uma
estendendo-se por cerca de 100 kb associação entre BRCA1 e a proteína
de seqüência genômica. Seu produto p53, e o encarecimento subseqüente
é uma proteína de 1.863 aminoácidos. de atividade de p53 incrimina BRCA1.
O BRCA2, localizado no cro- O BRCA1 forma complexos com
mos-somo 13q12-q13, está associado BRCA2 e Rad 51, que é homólogo do
com uma maior incidência de câncer gene Rec A da E. coli em humanos e
da mama em homens do que em que é essencial à recombinação nor-
mulheres, (FAUCI, et al 1998). Este mal e estabilidade do genoma (BAST,
gene possui 27 exons dispersos por et al 2000).
70 kb de DNA genômico, e seu trans- O BRCA1 também pode fazer
crito estende-se por cerca de 10 à 12 um papel de regulação na transcri-
Tabela 1: Quadro comparativo mostrando as propriedades e funções dos genes BRCA1 e BRCA2
BCRA1
Cromossomo 17q21
Gene 100kb
Proteína 1.863 aminoácidos Componente da
holoenzima RNA-polimerase
Função Supressor tumoral Interage com
proteínas nucleares Possível papel no
reparo do DNA
Mutações > 500 identificadas
Risco de câncer de mama Mais de 70% aos 80 anos de idade
Idade de início Idade mais jovem (quarta á quinta
década de vida)
Risco de outros tumores Risco de câncer ovariano de 30-60% aos
70 anos de idade Próstata, cólon.
Mutações no câncer não - Muito raras (<5%)
familiar
Epidemiologia Mutações específicas mais comuns em
alguns grupos étnicos (p. ex., presença
de uma mutação em 20 a 30% dos
cânceres de mama em mulheres Judias
Ashkenazi).
Patologia dos cânceres de Maior incidência:13% de carcinomas
mama medulares e tumores de maior grau
Carcinoma ductal in situ menos
freqüente.
Fonte: COTRAN, R.S.; KUMAR,V.;COLLINS,T. 2001.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
ção, controle do ciclo celular e de-
senvolvimento. O BRCA1 foi associ-
ado com a RNA polimerase holoenzi-
ma 32 e fita CREB33, que implica na
regulação de transcrição.
Em uma mulher que desenvolve
câncer de mama, antes dos 40 anos, a
chance que ela leva uma mutação em
BRCA1 pode ser tão alta quanto 10%.
O que não é aplicado para BRCA2,
que pode ser associado a uma idade
ligeiramente mais elevada.
A prevalência de certas muta-
ções de BRCA1 e BRCA2 é ocasional-
mente mais alta que o esperado,
devido à transmissão aumentada de
algumas mutações, em certas popu-
lações, devido ao efeito do fundador
(BAST, et al. 2000).
Foram identificadas mutações de
fundador características para BRCA1
e BRCA2 em famílias de Judeus
Ashkenazi e de descendentes na Is-
lândia, Finlândia, Hungria, Rússia,
França, Holanda, Bélgica, Suécia, Di-
namarca e Noruega. A maioria dos
estudos realizados em BCRA1 e
BCRA2 foram feitos em caucasóides
dos Estados Unidos e Europa (BAST,
et al. 2000).
Significantemente, existem me-
nos dados sobre as taxas de muta-
BCRA2
13q12
70kb
3.418 aminoácidos
Supressor tumoral Interage com
proteínas nuclearesPossível papel no
reparo do DNA
>200 identificadas
Mais de 60% aos 70 anos de idade
50 anos; mais idosa do que o BCRA1.
Câncer de mama masculina, ovário,
bexiga, próstata, pâncreas.
<5%
Mutações específicas mais comuns em
alguns grupos étnicos
Tipos variáveis podendo depender de
mutações específicas.
57
 ções de BRCA1 e BRCA2 em famílias
de outros grupos étnicos e raciais
(BAST, et al 2000).
TRAVTIGIAN, et al (1996), ob-
servaram como o BRCA1, a proteí-
na de BRCA2 é altamente carrega-
da, ¼ dos resíduos é ácido ou bási-
co. Porém, havia poucas pistas so-
bre a função bioquímica de BRCA2.
Foram observados níveis mais altos
de expressão em mama e timo, e
ligeiramente níveis mais baixos em
pulmão, ovário e baço. Em estudo
de 18 famílias, em 9 foi observado
a deleção de 3 nucleotídeos que
altera a armação de leitura, e con-
duzem a mutilação da proteína
BRCA2. Os autores notaram que o
BRCA2 é notavelmente semelhante
a BRCA1. Ambos possuem o exon
11 grande; em ambos a tradução
começa no exon 2; ambos têm su-
cessões de codificação que são ri-
cas em Adenina; e são compostos
de aproximadamente 70 Kb de Dna
genômico. O BRCA2 é composto de
27 exons.
WEBER, et al. (1996), estudaram
3 exons de BRCA2 ( exons 10, 11 e
27) em 69 amostras aleatórias de
tumor de mama congelados. Eles
identificaram uma mutação somática
truncada de BRCA2 em carcinoma
ductal primário: deleção de 1 par de
bases e substituídas pela adição de 9
aminoácidos modernos e terminação
da tradução no códon 894.
CONNOR, et al. (1997), em seus
estudos com ratos observaram que o
BRCA1 e BRCA2 são altamente ex-
pressos proliferando células ao limi-
te de G1/S do ciclo celular da mama
comum vistos em pacientes com
mutações nestes genes, sugere que
BRCA1 e BRCA2 possam estar agin-
do no mesmo tempo.
SARAN, et al. (1997), identifica-
ram uma interação de proteína de
BRCA2 com a proteína de DNA con-
serto Rad51. DAVIS, et al. (2001)
mostrou que o BRCA2 faz um papel
duplo na regulação da Rad51, que é
uma proteína essencial para a recom-
binação homóloga e conserto de DNA.
Primeiramente, as interações de
Rad51 e o BCR3, ou regiões de BCR4
do BRCA 2, bloqueiam a formação de
filamentos nucleoprotéicos por
Rad51. Alterações para a região de
BCR3 que imitam mutações associa-
58 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
das ao câncer de BRCA2 não exibem
este efeito.
Em segundo, o transporte de
Rad51 para o núcleo estava defeituo-
so em células que carregam uma
mutação associada ao câncer de
BRCA2. Assim, BRCA2 regula a loca-
lização intracelular e a habilidade de
ligação de DNA de Rad51.
STRUEWING, et al. (1997), estu-
daram 120 portadoras de mutações
em BRCA1 e BRCA2. As mutações
em BRCA1 estudadas eram 185delAG,
e 5382insC; a mutação de BRCA2
estudada era 6174delT. O risco calcu-
lado de câncer de mama em pacien-
tes com até 70 anos era de 56%, de
câncer ovariano 16%; e de câncer de
próstata 16%, não havia diferença
significante no risco de câncer de
cólon entre os parentes dos portado-
res. Concluíram que de 2% de Judeus
Ashkenazi levam mutações em
BRCA1 e BRCA2, o que confere um
risco aumentado de câncer de mama,
ovário e próstata.
NEUHAUSEN, et al. (1998), ana-
lisaram famílias Judias e identificou 3
mutações mais freqüentes, possivel-
mente através do efeito do fundador
que são: 185del AG e 5832 ins C em
BRCA1 e 6174 del T em BRCA2.
JERNISTON, et al. (1999), con-
cluíram em seus estudos que os por-
tadores do BRCA1 e mutações do
BRCA2, que têm filhos, estão mais
suscetíveis a desenvolverem câncer
de mama, antes dos 40 anos, que as
portadoras que são nulíparas. Cada
gravidez aumenta o risco de desen-
volver câncer de mama.
As mutações da linhagem ger-
minativa do BRCA1 são responsáveis
por 2% a 4% de todos os cânceres
mamários. Embora mais que 90%
deles sejam casos esporádicos, ocor-
rendo em mulheres sem evidências
de susceptibilidade hereditária, aná-
lises de espécies de tumores mamá-
rios sugerem que anormalidades
somáticas adquiridas no BRCA1 pos-
sam também desempenhar um papel
em muitos desses cânceres (CROOP,
et al. 1990).
FODOR, et al. (1998) determi-
nando a freqüência do BRCA1 co-
mum e mutações de BCRA2: 185 del
AG, 5382 ins C e 6174 del T, o DNA
foi analisado para as 3 mutações
através de hibridização de oligonu-
cleotídeos alelo–específicos (ASO).
Oito pacientes (3%) eram heterozi-
gotos para a mutação 185 del AG,
dois pacientes (0,75%) para 5382 ins
C e oito pacientes (3%) para 6174
del T. O risco vitalício para câncer
de mama em Judeus Ashkenazi por-
tadores do BCRA1 185del AG ou
BRCA2 6147 del T foram calculadas
para ser 36%, aproximadamente 3
vezes o risco global para a popula-
ção em geral.
Na Austrália, BAHAR, et al.
(2001), encontraram em Judeus
Ashkenazi a mesma prevalência alta
de 4 mutações do fundador, da mes-
ma forma que acha em Judeus
Ashkenazi nos Estados Unidos e Isra-
el. As quatro mutações analisadas era
185 del AG e 5182 ins C em BRCA1;
6174 del T em BRCA2 e 11307K em
APC.
STRUEWING, et al. (1995) de-
clarou que mais de 50 mutações sem
igual tinham sido descobertas no gene
BRCA1, em indivíduos com câncer
de mama e ovário. Em genealogias
de alto risco, portadoras femininas
de uma mutação de BRCA1 tiveram
80 a 90% de risco vitalício em câncer
de mama e 40 a 50% de risco de
câncer de ovário.
STRUEWING, et al. (1995), de-
terminaram a freqüência da mutação
185 del AG em 858 Ashkenazi, que
buscam prova genética para condi-
ções sem conexão para câncer, e em
815 pessoas de referência não seleci-
onadas pela origem étnica. Eles acha-
ram a mutação 185 del AG em 0,9%
de Ashkenazi . Os resultados sugeri-
am que 1/100 mulheres de descen-
dência Ashkenazi possam ter alto
risco de desenvolver câncer de mama
ou ovário.
Entre as 39 mulheres Judias com
câncer de mama antes dos 40 anos,
(FITZ, et al. 1996) acha que 8 (2%)
carregam a mutação 185 del AG.
Em câncer de mama esporádico,
(THOMPSON, et al. 1995) acha o
RNAm do BRCA1 em níveis notada-
mente diminuídos durante a transcri-
ção de carcinoma in situ para câncer
invasivo.
THOMPSON, et al. (1995), acha-
ram que aquela inibição experimen-
tal da expressão de BRCA1 com oli-
gonucleotídeos antisense produziu
crescimento acelerado de células nor-
mais e células malignas, mas não
teve nenhum efeito em células
epiteliais não mamárias. Eles inter-
pretaram estes resultados como indi-
cado que o BRCA1, normalmente
pode servir como um regulador ne-
gativo de crescimento de células
epiteliais mamárias.
HEDENFALK, et al. (2001),
usando a tecnologia de microarray
para determinar a expressão de
genes em câncer de mama, foi acha-
do BRCA1 positivos como constata-
do com cânceres de mama BRCA2
positivos. A suspeita de que uma
diferença poderia ser achada veio
do fato que os 2 tipos de tumores
são freqüentemente distintos,
histologicamente. Além disso, tu-
mores com mutações de BRCA1 são
geralmente negativos para estróge-
no e receptores de progesterona,
considerando que a maioria dos
tumores, com mutações de BRCA2,
é positivo para receptores de
hormônios. Amostras de RNA de
tumores primários de 7 portadores
da mutação de BCRA1 e 7 portado-
res da mutação de BCRA2 foi com
um microarray de 6.512 clones de
cDNA de 5.361 genes.
ROA, et al. (1996), observaram a
mutação 185 del AG em 1,09% de
aproximadamente 3000 Judeus
Ashkenazi, e a mutação 5382 ins C
em 0,13%, a análise do BCRA2 em
3.058 indivíduos da mesma popula-
ção mostraram uma freqüência de
portador de 1,52% pela 6174 del T.
Estes dois alelos são os mais freqüen-
tes, que predispõem o câncer de
mama hereditário entre Judeus
Ashkenazi .
BAR–SADE, et al. (1997), em
estudo com 639 Judeus Iraquianos
saudáveis, que são um grupo de
pouco risco para a mutação 185 del
AG, que é predominantemente em
Ashkenazi, foram identificados 3 in-
divíduos portadores da mutação 185
del AG . As análises de haplótipo
iraquiano mostram que 2 comparti-
lham um haplótipo em comum com 6
portadores Ashkenazi, e um terço
teve um haplótipo que diferiu por um
único marcador. Isto sugeriu que a
mutação 185 del AG do BCRA1 pode
ter sugerido antes da dispersão das
pessoas judias no Diáspora, pela
mesma época de Cristo.
Alelos mutantes de genes
supressores de tumores, quando her-
dados, predispõem os indivíduos a
tipos particulares de câncer. Além
de um envolvimento na suscetibili-
dade herdada para câncer, estes
genes de supressão tumoral são
objetivos para mutações somáticas
em tipos de câncer esporádicos. Uma
exceção é o BRCA1, que contribui
com uma fração significante de cân-
cer de mama e ovário, mas sofre
mutação a taxas baixas em câncer
de mama e ovário esporádicos. Este
achado sugere que outros genes
possam ter como objetivo principal
causar mutações somática em carci-
noma de mama. O outro gene BRCA2
conta, neste estudo, com uma pro-
porção quase igual a do BRCA1. O
BRCA1 e o BRCA2 se comportam de
forma dominante, tendo em vista
que herda um alelo mutante e têm
um risco maior de desenvolver um
tumor; tumores que eles desenvol-
verem perdem o alelo do tipo selva-
gem através da perda da heterogozi-
dade. (TENG, et al. 2002.)
STEPHENSON, em (2003), estu-
dou mulheres com mutações no
BRCA1 e BRCA2, que têm um risco
mais elevado de desenvolverem cân-
cer de mama, se fizeram uso de
métodos contraceptivos orais, por,
pelo menos, 5 anos ou antes de 1975
(quando preservativos orais geral-
mente tinham um conteúdo de estró-
geno mais alto que os produzidos
depois). Estas têm um risco vitalício
de 50 a 80% de desenvolverem cân-
cer de mama. O estudo contou com
1311 pares de mulheres que eram
portadoras de mutações danosas, em
um ou ambos genes, a metade de
quem teve câncer de mama e a meta-
de de quem não tiveram.
LLORT, et al. (2002), em seus
estudos com pacientes espanholas,
analisando mutações em BRCA1 e
BRCA2 têm uma proporção hereditá-
ria significativa baixa, no que diz
respeito ao câncer de mama. O espec-
tro mutacional nestes genes é muito
grande, com centenas de mutações de
BRCA diferentes mundialmente infor-
madas. Mutações devido ao efeito do
fundador têm uma fração significativa
de todas as mutações de grupos étni-
cos. Em estudo com 35 famílias espa-
nholas que desenvolveram câncer de
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
ovário e mama, foram achadas 13
mutações, das quais se tinham notíci-
as de apenas 3, na Espanha. As dez
mutações modernas são: IVS5+1G>A,
1491delA Leu 1086 Ter, e Gln 895Ter
em BRCA1; Glu 49 Ter, 5373del GTAT,
5947del CTCT, 6672 del TA, 8281 ins
A, e Pro 3039 Leu em BRCA2. Este
estudo, comparado com outros reali-
zados no país, mostra que das várias
mutações encontradas na Espanha,
nenhuma parece ter relação, com efei-
to, do fundador.
KUMAR, et al. (2002), analisa-
ram a sucessão de codificação do
gene BRCA1 e BRCA2 em 14 pacien-
tes de câncer de mama hereditário
em mulheres Indianas. A análise foi
realizada em gel de eletroforese sen-
sível (CSGE), seguido de seqüencia-
mento. Três mutações delas moder-
nas no exon 7, enquanto a outra é um
apagamento de par básico no exon
11 que resulta em mutilação de pro-
teína. A mutação 185 del AG, previ-
amente descrita, em Judeus Askenazi,
também foi encontrada nesta popu-
lação. Mesmo este sendo o 1º estudo
realizado com famílias da Índia (14
no total) sugestiona uma baixa
prevalência, mas com um envolvi-
mento definitivo de mutações no
gene BCRA1, entre mulheres India-
nas com câncer de mama.
A população do Paquistão pos-
sui uma taxa de câncer de mama
extremamente alta para populações
Asiáticas e uma das taxas mais altas,
mundialmente, do câncer ovariano.
Neste estudo com 341 casos de cân-
cer de mama, 120 casos de câncer
ovariano e 200 controles femininos.
A prevalência de mutações no BRCA1
e BRCA2 em pacientes com câncer
de mama são de 6,7%, de câncer
ovariano são 15,8%. Mutações no
gene BRCA1 respondem por 84% das
mutações de câncer ovariano e 65%
das mutações de câncer de mama. A
maioria das mutações descobertas
são novas para o Paquistão. Cinco
mutações de BRCA1: 2080 ins A,
3889 del AG, 4184 del 4, 4284 del AG,
e IVS14 – 1A>G , e uma mutação de
BRCA2 3337C>T, foram encontradas
em múltiplos casos e representam
fortes candidatos ao efeito do funda-
dor, segundo (LIEDE, et al. 2002).
TERESCHENKO, et al. (2002), es-
tudaram 25 famílias Russas com cân-
59
 cer de mama e ovário, onde analisa-
ram mutações nos genes BRCA1 e
BRCA2, usando análise de heterodu-
plex e multiplex. Além disso, foram
testadas 22 pacientes com câncer de
mama diagnosticados antes dos 40
anos, sem história familiar e 6 pacien-
tes com câncer de mama bilateral. A
freqüência de mutações no BRCA1
era de 16%. Uma mutação de BRCA1,
5382 ins C, foi achada em 3 famílias.
Este estudo juntamente com outro
sugere que 5382 ins C no BRCA1 é
uma mutação de fundador na popula-
ção Russa. No BRCA2 foram encontra-
das 3 mutações em pacientes com
câncer de mama sem história familiar,
2 em pacientes jovens e 1 em pacien-
tes com câncer bilateral. Foram en-
contradas 4 mutações modernas : 695
ins T, 1528 del 4, 9318 del 4, S1099X.
No ano de 2000 foram diagnosti-
cados quase 80.000 casos novos de
câncer de mama na Índia. Embora a
identificação de BRCA1 e BRCA2 au-
mentou a compreensão na genética
do câncer de mama em populações de
descendência da Europa Ocidental, o
papel destes genes no restante da
população indiana é inexplorado. A
análise de 20 pacientes com câncer de
mama com qualquer história familiar,
ou idade precoce, conduziu a identi-
ficação de duas variantes (331+1G>T;
4476+2T>C) em BRCA1 (10%)
(SAXENA, et al. 2002).
RUIZ, et al. (2002), analisaram
heteroduplex de pacientes mexica-
nos com câncer de mama, onde
identificaram mutação truncada em
BRCA1 e BRCA2 (3857 del T; 2663 –
2664 ins A) e oito variantes raras de
significação desconhecida, princi-
palmente no gene BRCA2, um caso
de câncer de mama masculino tam-
bém foi identificada. A maioria das
alterações parecia ser distinta com
uma única observada em mais de
uma família.
LIEDE, et al. (2002), encontra-
ram duas famílias de descendência
aborígines, ambas com as mesmas
alterações de BRCA1 (1510 ins G;
1506 A>G). As famílias representam
duas Aborígines de tribos canaden-
ses, embora uma origem ancestral
comum é provável. Esta é a primeira
evidência de uma mutação de BRCA1,
específica para pessoas aborígines
do Norte da América.
60 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
A detecção de mutações nos genes
BRCA1 e BRCA2 é feita por técnicas de
biologia molecular capazes de identifi-
car a alteração de uma única base na
seqüência de DNA. Devido ao grande
tamanho das seqüências de BRCA1 e 2,
primeiramente, busca-se identificar qual
exon contém o sítio mutado, antes de
se proceder ao sequenciamento do
DNA. A seqüência de DNA correspon-
dente aos vários exons é amplificada
por PCR (reação em cadeia da polime-
rase) para a realização desses testes.
Para o screening inicial de muta-
ções, uma técnica muito utilizada é a
de single strand conformation
polymorphism - SSCP, combinada
com heteroduplex analysis. A técnica
de SSCP baseia-se no fato de que a
conformação tridimensional de frag-
mentos de DNA de fita simples
depende da seqüência de nucleotí-
deos, sendo que a diferença de um
nucleotídeo altera o padrão de mi-
gração eletrofo-rética. A técnica de
heteroduplex analysis deriva da ob-
servação de que, em reações de PCR,
onde estão presentes moléculas de
DNA selvagens e mutantes, durante
os últimos ciclos, podem ser forma-
dos heteroduplex entre essas duas
espécies de moléculas, os quais terão
um padrão de migração eletroforética
diferente dos homoduplexes. Utili-
zando-se fragmentos de tamanho en-
tre 100 e 350 pares de bases, a taxa de
detecção de mutações para o SSCP
como para o heteroduplex analysis, e
a associação dos dois métodos pode
elevar essa taxa para perto de 100%
(sob condições bem controladas e
processamento semi-automatizado).
Após a identificação do exon,
que a abriga a mutação, esta é carac-
terizada pelo sequenciamento do
DNA. Conhecida a mutação, torna-se
possível, também, por sequenciamen-
to, pesquisá-lo em outros membros
da família do paciente, com vistas ao
aconselhamento genético.
9. Discussão
Com a identificação dos dois
principais genes responsáveis pelo
câncer de mama hereditário, o BRCA1
e o BRCA2, a genética deu um grande
salto em busca da cura de doenças
que são estritamente comuns e que
mais matam mulheres.
Em muitas populações, algumas
mutações tornam-se mais freqüentes
devido ao efeito do fundador. Uma
das populações que teve suas muta-
ções amplamente estudadas foi o de
Judeus Askenazi, onde cerca de 2%
da população leva mutações em
BRCA1 e BRCA2 o que confere um
risco aumentado de câncer de mama,
ovário e próstata.
Em Judeus Askenazi, as princi-
pais mutações encontradas devido
ao efeito do fundador e que já
foram descritas em inúmeros paí-
ses, são a 185 del AG e 5382 ins C
no gene BRCA1, e no BRCA2 a 6174
del T. A prevalência alta destas
mutações de fundador na linhagem
germinativa são responsáveis por
2% a 4% de todos os tipos de câncer
mamário.
Em pacientes Espanholas, das
inúmeras mutações já analisadas em
BRCA1 e BRCA2 tem uma proporção
hereditária significativa baixa. A com-
paração com outros estudos realiza-
dos no país mostra que nenhuma tem
relação, com efeito, do fundador.
Em mulheres indianas, 3 muta-
ções modernas foram encontradas e
a 185 del AG foi amplamente encon-
trada. Existe uma baixa prevalência,
mas com um envolvimento definitivo
de mutações no gene BRCA1.
No Paquistão, dentre as muitas
mutações já descritas, a 3337 C>T no
BRCA2 representam uma forte
candidata ao efeito do fundador.
Na Rússia, a mutação no BRCA1
5382 ins C foi caracterizada por ser
uma mutação de fundador, e tribos
do Canadá também têm 2 mutações
que são estritamente freqüentes.
A identificação de portadoras de
mutações BRCA1 está limitada a um
número contado de laboratórios, com
acesso para raras famílias, na qual a
análise de vários parentes oferece
informação suficiente para identifi-
car carreadores com um alto grau de
certeza. Com base na taxa de
carreadoras de uma em 200 a 400
mulheres, a demanda para um
rastreamento populacional será pro-
vavelmente substancial.
A atenção deve ser voltada para
os riscos sociais do teste genético,
como potencial perda de seguro,
estigmatização e discriminação do
empregado.
 Uma vez que o gene BRCA1 e
BRCA2 tenham sido identificados e
um teste clínico para mutações co-
muns esteja disponível, os proble-
mas levantados no aconselhamento
de uma única família irão assumir
enormes proporções. A prevalência
de carreadoras de mutações BRCA1,
com um risco de aproximadamente
85% de desenvolverem câncer de
mama, em muito excedem a inci-
dência de qualquer outra doença
genética para qual o rastreamento
pré-sintomático esteja atualmente
disponível.
O rastreamento para mutação
BRCA1 é provavelmente o 1º teste
pré-sintomático que terá lugar na
prática clínica geral, e um sucesso
ou falha desses esforços trará um
grande impacto no futuro deste cam-
po, com todo o seu potencial para o
avanço da medicina preventiva,
evitando doenças e reduzindo os
custos da saúde. Tem-se a esperan-
ça de que, com o rastreamento ge-
nético, a suscetibilidade ao câncer
de mama, muitas armadilhas pos-
sam ser evitadas.
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 Biosurfatantes a partir de
Pesquisa
resíduos agroindustriais
Avaliação de resíduos agroindustriais como substratos para a produção de biosurfatantes por Bacillus
Márcia Nitschke
Doutoranda em Ciência de Alimentos
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
nitschke@bol.com.br
Gláucia Maria Pastore
Profa Dra - Laboratório Bioquímica de Alimentos
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
glaupast@fea.unicamp.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Introdução
Os surfatantes constituem uma
classe importante de compostos quí-
micos amplamente utilizados em di-
versos setores industriais. Estima-se
que a produção mundial de surfatan-
tes exceda 3 milhões de toneladas
por ano (Banat, 2000), sendo utiliza-
dos principalmente como matéria-
prima na fabricação de detergentes
de uso doméstico.
A grande maioria dos surfatan-
tes disponíveis comercialmente é
sintetizada a partir de derivados de
petróleo. Entretanto, o crescimento
da preocupação ambiental dos con-
sumidores combinado com novas
legislações de controle do meio am-
biente levaram os cientistas a
pesquisar surfatantes biológicos
como alternativa para os produtos
existentes.
Os biosurfatantes produzidos
por microrganismos vêm, nos últi-
mos anos, despertando considerá-
vel interesse devido à sua natureza
biodegradável, baixa toxicidade e
diversidade de aplicações. Entre as
aplicações comerciais dos biosurfa-
tantes destacam-se a recuperação
do petróleo, biorremediação de
poluentes, formulação de lubrifican-
tes, além de diferentes utilizações
na indústria têxtil, cosmética, ali-
mentícia e farmacêutica.
Atualmente, os biosurfatantes
ainda não são amplamente utilizados
pela indústria, devido ao seu alto
custo de produção, associado a mé-
todos ineficientes de recuperação do
produto e ao uso de substratos caros.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Porém, o problema econômico da
produção de biosurfatantes pode ser
significativamente reduzido por meio
do uso de fontes alternativas de nu-
trientes facilmente disponíveis e de
baixo custo.
Uma possível alternativa para
a produção de biosurfatantes seria
o uso de subprodutos agrícolas ou
de processamento industrial. Atual-
mente, o aproveitamento de resí-
duos vem sendo incentivado por
contribuir para a redução da polui-
ção ambiental, bem como por per-
mitir a valorização econômica dos
resíduos que seriam simplesmente
descartados.
O que são biosurfatantes?
Os biosurfatantes possuem uma
estrutura comum: uma porção
lipofílica, usualmente composta por
cadeia hidrocarbonada de um ou mais
ácidos graxos, que podem ser
saturados, insaturados, hidroxilados
ou ramificados, ligados a uma porção
hidrofílica, que pode ser um éster,
um grupo hidróxi, fosfato, carboxilato
ou carbohidrato (Cameotra & Makkar,
1998; Bognolo, 1999). Os microrga-
nismos produtores distribuem-se em
diversos gêneros, sendo a maioria
produzida por bactérias. As princi-
pais classes de biosurfatantes inclu-
em glicolipídios, lipopeptídios e
lipoproteínas; fosfolipídios e ácidos
graxos; surfatantes poliméricos e sur-
fatantes particulados (Desai &
Desai,1993).
Em relação aos surfatantes con-
vencionais, os biosurfatantes apre-
63
 sentam vantagens como (Bognolo,
1999):
• elevada atividade superficial e
interfacial, o que os torna com-
paráveis ou superiores aos sinté-
ticos (detergentes aniônicos
sulfatados) em termos de
efetividade e eficiência;
• maior tolerância a pH, tem-
peratura e força iônica;
• biodegradabilidade;
• baixa toxicidade.
Os biosurfatantes apresentam
ainda a vantagem de poder ser sin-
tetizados a partir de substratos
renováveis e de possuir grande di-
versidade química, possibilitando
aplicações específicas para cada caso
particular (Desai & Banat, 1997).
Outra vantagem dos biosurfatantes
reside no fato de não serem com-
postos derivados de petróleo, fator
importante à medida que os preços
do petróleo aumentam. Além disso,
a estrutura química e as proprieda-
des físicas dos biosurfatantes po-
dem ser modificadas através de ma-
nipulações genéticas, biológicas ou
químicas, permitindo o desenvolvi-
mento de novos produtos para ne-
cessidades específicas.
Substratos não convencionais
O sucesso da produção indus-
trial de biosurfatantes depende do
desenvolvimento de processos mais
baratos e do uso de matérias-primas
de baixo custo, uma vez que estas
representam entre 10% a 30% do
custo total (Cameotra & Makkar,
1998). Apesar disso, poucos traba-
lhos têm sido publicados com vistas
a produzir biosurfatantes a partir de
resíduos (Tabela 1). A dificuldade
Tab ela 1. E xemplo s d e u tilização d e resíd u o s n a pro d u ção d e b io su rfatan tes
Su b strato s
Efluente extração óleo oliva
Residuos refino óleo de soja
Água lavagem de batatas
Melaço
Soro de leite
Água de turfa
Óleo de fritura usado
Óleo lubrificante usado
Soro leite desproteinizado
Manipueira
64 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
na seleção de um resíduo está em
encontrar a composição adequada
de nutrientes que permita o cresci-
mento celular e o acúmulo do pro-
duto de interesse. Em geral, substra-
tos agroindustriais que contenham
altos níveis de carbohidratos ou de
lipídeos suprem a necessidade de
fonte de carbono para a produção
de biosurfatantes. O estabelecimen-
to de um processo biotecnológico a
partir desses substratos alternativos
também apresenta outra dificulda-
de, que é a padronização devido às
variações naturais de composição,
bem como os custos de transporte ,
armazenagem e tratamento prévio
necessários. Entretanto, a utilização
de resíduos pode diminuir os custos
de produção para níveis competiti-
vos em relação aos similares obtidos
por via petroquímica e, ao mesmo
tempo, reduzir os problemas ambi-
entais relativos ao descarte e aos
custos do tratamento (Mercade &
Manresa, 1994; Makkar & Cameotra,
1999a; Makkar & Cameotra, 2002).
Finalmente, deve-se considerar que
o Brasil é um país essencialmente
agrícola e que, portanto, a quantida-
de e a facilidade de acesso aos
subprodutos agroindustriais é bas-
tante significativa.
Figura 1. Estrutura da surfactina produzida por Bacillus subtilis.
C lasse q u ímica Micro rgan ismo
rhamnolipídeos Pseu domonas sp.
rhamnolipídeos P. aeru ginosa
lipopeptídeos B. su bt ilis
lipopeptídeos B. su bt ilis
rhamnolipídeos P. aeru ginosa
lipopeptídeos B. su bt ilis
rhamnolipídeos P. aeru ginosa
glicolipídeos Rhodococcu s sp.
sophorolipídeos C. bombicola
lipopeptídeos B. su bt ilis
Biosurfatantes produzidos por
Bacillus
Algumas bactérias do gênero
Bacillus produzem diversos lipo-
peptídeos que demonstram ativida-
de tensoativa ( Rosenberg & Ron,
1999). As culturas de Bacillus
subtilis produzem um lipopeptídeo
cíclico conhecido como surfactina
ou subtilisina (Arima et al., 1968),
considerado um dos mais potentes
biosurfatantes conhecidos (Figura
1). A surfactina também demons-
trou atividade anticoagulante, anti-
tumoral, antimicrobiana, e, mais re-
centemente, estudos comprovaram
atividade antiviral e antimicoplas-
ma (Vollenbroich et al, 1997a,
1997b).
O objetivo deste estudo foi veri-
ficar a potencialidade do uso de subs-
tratos alternativos para a produção
de biosurfatante por isolados de
Bacillus.
Materiais e Métodos
Foram utilizados cinco isola-
dos de Bacillus sp. produtores de
biosurfatante pertencentes à cole-
ção de culturas do Laboratório de
Bioquímica de Alimentos. Para a
R eferên cia
Mercade et al., 1993
Abalos et al, 2001
Fox & Bala, 2000
Makkar & Cameotra,1997
Koch et al, 1988
Sheppard& Mulligan 1987
Haba et al, 2000
Mercade et al, 1996
Daniel et al, 1998
Santos et al, 1999
produção de biosurfatante foram
utilizados:

• melaço (3% v/v sólidos solú-

veis) pH 6,0;
• manipueira (resíduo líquido
proveniente da fabricação de fa-
rinha de mandioca) pH 5,8-5,9;
• soro de leite (fabricação de
queijo mussarela) pH 6,4 ;
• meio sintético proposto por
Cooper et al. (1981) pH 6,8-6,9.

A manipueira foi tratada previa-

mente com aquecimento a 100°C,
por 3 minutos e centrifugação a
10.000 rpm, por 20 minutos, para
remoção de sólidos. O pH dos resí-
duos não foi ajustado. Os meios Figura 2. Percentagem de redução na tensão superficial obtida por isolados de Bacillus
foram esterilizados em autoclave a sp. em diferentes substratos.
121°C, por 20 minutos.
Uma alçada das culturas mantidas
a 4°C foi transferida para erlenmeyer de
50 mL, com 20 mL de caldo nutriente e
incubada em agitador rotatório a 120
rpm, 30°C, por 24 horas. Após, 1 mL de
cada cultura a ser testada foi inoculado
em frascos erlenmeyers de 50 mL con-
tendo 15 mL dos respectivos meios,
que foram incubados em agitador
rotativo tipo shaker a 30°C e 150 rpm,
por 72 horas. Os meios foram centrifu-
gados a 10.000 rpm, por 15 minutos, e
o sobrenadante, livre de células, utiliza-
do para determinações analíticas.
A tensão superficial foi determi-
nada em tensiômetro Krüss, modelo
K12, utilizando o método da placa. O
biosurfatante foi isolado do meio de
cultivo por precipitação ácida a pH
2,0, seguida de extração com cloro-
Figura 3. Atividade emulsificante (E24) de solução de biosurfatante frente à diferentes
fórmio/metanol (65:15), segundo
hidrocarbonetos. (1) Hexano, (2) Tolueno, (3) Heptano, (4) Decano, (5) Querosene,
Makkar & Cameotra (1999b). A ativi- (6) Tetradecano, (7) Hexadecano, (8) Óleo de soja, (9) Gordura de côco.
dade emulsificante (E24) foi realizada
em tubos com tampa rosca contendo colocadas em erlenmeyer de 250 mL, Resultados e Discussão
4 mL de solução aquosa, 1mg/mL de adicionando-se-lhe 20 mL de água
biosurfatante (obtido em manipueira) (frasco controle) e 20 mL de solução Os resultados obtidos nos en-
adicionados de 6 mL de hidrocarbo- aquosa 1mg/mL de biosurfatante ob- saios de produção de biosurfatante em
netos, sendo que cada tubo foi sub- tido (frasco teste). Os frascos foram diferentes substratos alternativos são
metido a vortex máximo por 2 minu- agitados a 150 rpm, por 12 horas em mostrados na Figura 2. Nota-se que
tos e deixado em repouso por 24 temperatura ambiente. Retirou-se todos os isolados testados demonstra-
horas. O índice E24 foi determinado deles o líquido da primeira lavagem e ram capacidade de produzir biosurfa-
medindo-se a altura da camada emul- procedeu-se a uma segunda adição de tante e, conseqüentemente, de reduzir
sionada (cm) dividindo-a pela altura 20 mL de água e biosurfatante, incu- a tensão superficial dos meios testa-
total de líquido x 100. A remoção de bando-os nas mesmas condições aci- dos, sendo que a manipueira forneceu
petróleo de areia contaminada foi ma. O líquido da segunda lavagem foi as maiores percentagens de redução ,
testada através da saturação de 60g de removido e a areia foi retirada do na ordem de 42% , para todos os
areia com 5 mL de petróleo. Porções frasco sendo colocada em estufa a isolados testados; entretanto, o soro de
de 20g da areia contaminada foram 50°C até a secagem. leite apresentou uma redução média

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 65

 Figura 4. Capacidade de remoção de petróleo de amostra de areia utilizando solução de biosurfactante.
(1) Biosurfatantes, (2) controle, (3) água.
Tab ela 2. A tivid ad e
emu lsifican te d o b io su rfatan te
o b tid o em man ipu eira
Hidrocarboneto E 24 (%)
Hexano 66,6
Tolueno 72,7
Heptano 66,6
Decano 70,4
Querosene 70,4
Tetradecano 70,9
Hexadecano 69,0
Óleo de soja 74,0
Gordura e côco 70,9
Petróleo 69,0
de 10% , ressaltando que o isolado
LB5a não produziu surfatante nesse
resíduo. O melaço também demons-
trou boa potencialidade como substra-
to para produção de biosurfatante pe-
los microrganismos testados e apre-
sentou redução média de, aproxima-
damente, 33%. O meio sintético utili-
zado como padrão foi definido por
Cooper et al. (1981), para a produção
de surfactina por Bacillus subtilis ATCC
21332 e vem sendo utilizado, desde
então, como uma referência para a
produção de biosurfatantes de Bacillus. Figura 5 . Águas de lavagem da areia impregnada com petróleo.
Nota-se que, apesar de permitir a pro- A1-A2: água; BS1-BS2: solução biosurfatante 1mg/mL.
dução de biosurfatante por todos os
isolados, esse meio mostrou resulta- rais como P, K, Mg, Mn, S, Fe, Cu, Zn, et al, 1991). A capacidade emulsificante
dos inferiores (com redução média de Ca (Cereda, 1994). Segundo Cooper et do biosurfatante obtido em manipueira
21,5%) aos da manipueira e do mela- al. (1981), os sais minerais, principal- pelo isolado LB5a foi avaliada através
ço, sugerindo que estes dois resíduos mente Fe e Mn, são fatores nutricionais do índice E24 com diferentes hidrocar-
possuem uma composição de nutrien- importantes para a produção de surfa- bonetos (Tabela 2). Os índices obtidos
tes adequada para a produção de bio- tantes por linhagens de Bacillus. A (60%-80%) revelam alta especificida-
surfatantes. presença desses minerais, além de de do biosurfatante contra todos os
Embora a composição química fontes de carbono e nitrogênio, seja, hidrocarbonetos testados, formando
varie de acordo com a época do ano e provavelmente, o principal motivo de emulsões estáveis do tipo A/O (Figura
com o tipo de cultivar de mandioca, a haver maior produção de biosurfatan- 3). O composto obtido possui potenci-
manipueira possui em sua composição tes nesse resíduo. al para uso na biorremediação, recupe-
uma grande quantidade de carbohidra- Em adição à tensão superficial, ração de petróleo e emulsificação de
tos (40-60 g/L ) destacando-se ainda a a estabilização de emulsões é freqüen- óleos e gorduras.
presença de frutose, glicose e sacarose, temente utilizada como um indicador Com vistas a avaliar a capacida-
além de nitrogênio (1-2 g/L) e mine- da atividade superficial (Abu-Ruwaida de do biosurfatante produzido em

66 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

manipueira pelo isolado LB5a em re-
mover petróleo de areia contamina-
da, procedeu-se a um experimento
ilustrado nas Figuras 4 e 5, onde se
observa que a areia tratada com solu-
ção de biosurfatante apresenta aspec-
to mais claro e as respectivas águas de
lavagem demonstram maior capaci-
dade de recuperação do petróleo em
relação ao tratamento sem tensoativo.
Conclusões
Entre os resíduos agroindustriais
testados, a manipueira foi que de-
monstrou a maior potencialidade para
uso como substrato alternativo na
produção de biosurfatantes por isola-
dos de Bacillus, sendo que o compos-
to obtido apresentou capacidade para
uso em biorremediação de poluentes
e em recuperação de petróleo.
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67
 Controle de qualidade
Pesquisa de ervas medicinais
Gabrielle Mouco
Aluna de graduação em Farmácia - UNIP
gabimouco@yahoo.com.br
Maira Jardim Bernardino
Aluna de graduação em Farmácia - UNIP
mjb@ajato.com.br
Melânia Lopes Cornélio, Ph.D
Farmacêutica, Ph.D- Química de Produtos Naturais
Professora Titular da Disciplina de Farmacognosia
UNIP - Universidade Paulista-SP
melaniacornelio@yahoo.com.br
Ilustrações cedidas pelos autores
68 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Controle de qualidade de Phyllanthus niruri L. (quebra-pedra)
Introdução
O controle de qualidade da
droga vegetal é imprescindível,
pois muitas espécies vegetais são
vendidas sem nenhuma garantia
de qualidade, o que favorece des-
de a venda de espécies falsificadas
até o armazenamento inadequado
da droga vegetal durante a sua
comercialização. A análise aqui des-
crita foi realizado com a droga
vegetal adquirida e conhecida po-
pularmente como quebra-pedra. O
controle de qualidade dessa droga
vegetal foi feito a começar da sua
descrição microscópica, para veri-
ficar a autenticidade da espécie a
fim de evitar equívocos. Também
foram realizados testes químicos
para confirmar as principais clas-
ses de seus constituintes químicos
descritos na literatura (De Souza
et. al., 2002; Duke, 2000). Os inte-
resses terapêuticos do Phyllanthus
niruri L. provêm principalmente
de suas propriedades diuréticas
para o combate de cálculos renais.
Devido a isso, estão sendo desen-
volvidos vários estudos para isolar
a substância responsável por tais
propriedades, além de elucidar a
melhor maneira de tratamento
(Teske et. al., 1995).
Estudos experimentais com as
folhas e as sementes também têm
demonstrado a sua ação hipoglice-
miante, antibacteriana e anticance-
rígena. Em ensaios especiais, mos-
trou-se que é ativa contra o vírus da
hepatite B in vivo e in vitro. Além
disso, possui a virtude de dissolver
cálculos renais, impedindo a con-
tração do ureter e promovendo a
sua desobstrução. Desenvolve ati-
vidade diurética pela elevação da
filtração glomerular e excreção
urinária dos sais de uratos (Tona et.
al., 2001; Teske et. al., 1995; Ogata
et. al., 1992).
Outro estudo realizado mos-
trou o efeito do Phyllanthus niruri
sobre a cristalização do oxalato de
cálcio in vitro. Por meio desse estu-
do, pôde-se concluir que o extrato
de quebra-pedra interfere no cres-
cimento e na agregação dos cristais
na urina humana, sugerindo que
essa planta tem um papel potencial
na prevenção de cálculo renal ou
do desenvolvimento (Barros, 2002;
Freitas et. al., 2002; Campos et. al.,
1999; Dias et. al., 1995).
Materiais e Métodos
1 - Dados da Amostra
A amostra analisada foi adqui-
rida em uma farmácia comercial e
apresentava as folhas secas em frag-
mentos de 0,5 cm a 1,0 cm.
Apresentava uma coloração
esverdeada que indicava que a
amostra havia passado por proces-
so de secagem.
2 - Controle Físico
Processo de Catação -
Determinação da Pureza
Esse processo visou a avaliar
se a amostra apresentava material
estranho, partículas que não cor-
respondessem à droga analisada. A
quantidade de amostra analisada
foi de 25 g de material vegetal.
3 - Descrição
microscópica
Os fragmentos da parte da fo-
lha foram submetidos a estudo
histológico, e neles foram realiza-
dos cortes do tipo paradérmico e
transversal
4 - Análise química
As folhas secas foram submeti-
das a processos químicos de iden-
tificação das seguintes classes de
constituintes químicos: taninos,
heterosídeos flavanoídicos, hetero-
sídeos saponínicos, heterosídeo
antraquinônicos, alcalóides e óleos
voláteis (Costa, 2001).
A seguir serão apresentadas as
metodologias dos ensaios de iden-
tificação das classes dos constitu-
intes químicos mencionados. Vale
lembrar que são testes qualitativos
com vistas a somente verificar a
presença ou a ausência do constitu-
inte químico em questão.
4.1 - Métodos de Identificação
4.1.1 - Taninos
Os taninos são substâncias
polifenólicas, polihidroxiladas, de
alto peso molecular, de origens ve-
getais, capazes de precipitar prote-
ínas, pectinas, alcalóides e metais
pesados em solução aquosa (Simões
et. al., 2001).
A estrutura química é complexa
na sua maioria, apresenta caracterís-
ticas adstringentes ao paladar e são
capazes de curtir a pele dos animais,
transformando-a em couro.
Os taninos são sólidos, amorfos
na sua maioria, solúveis em água,
álcool, glicerina e polietilenoglicol.
São insolúveis em solventes orgâni-
cos apolares.
Classifica-se em gálicos, hi-
drolisáveis, catequínicos ou con-
densados.
Extração Genérica de Taninos
Pesou-se cerca de 2g da droga
(quebra-pedra) pulverizada;
Extraíram-se os taninos com
cerca de 40 mL de água destilada,
deixando-a ferver durante, aproxi-
madamente, 2 minutos;
Filtrou-se em papel de filtro,
procurando manter o pó no fundo
do recipiente;
Repetiram-se mais duas extrações,
com cerca de 10 mL de água cada;
Filtrou-se novamente, como in-
dicado anteriormente;
Utilizou-se o filtrado para as
reações de identificação seguintes.
Reação com Cloreto Férrico
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se cerca de 1,0 mL da solução
extrativa e adicionaram-se-lhe 5,0
mL de água destilada e uma gota de
cloreto férrico 2% (escorrendo-o
pela parede do tubo).
Foi necessário que se obser-
vasse a formação de um precipita-
do ou o aparecimento de colora-
ções: preta, verde, azul, conforme o
tipo de estrutura química.
Reação com Solução Aquosa de
Alcalóides
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se 1,0 mL da solução extrativa,
diluída a uma proporção 1:5. Adici-
onaram-se-lhe 5 gotas de ácido clo-
rídrico a 5% e 1 ou 2 gotas de
solução de sulfato de alcalóides.
Esperou-se para observar a for-
mação de um precipitado branco
ou castanho esbranquiçado.
Reação com Acetato Neutro de
Chumbo
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se 1,0 mL da solução extrativa
diluída na proporção 1:5. Adicio-
naram-se-lhe 1 ou 2 gotas de solu-
ção aquosa de acetato neutro de
chumbo a 10%.
Esperou-se para observar a for-
mação de um precipitado castanho
avermelhado volumoso e denso.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Reação com Solução de Acetato
de Cobre
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se cerca de 1,0 mL de solução
extrativa diluída na proporção de
1:5. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 go-
tas de solução aquosa de acetato de
cobre a 5%.
Esperou-se para se observar a
formação de um precipitado casta-
nho avermelhado.
Reações Específicas de
Taninos:
Reação com Acetato de
chumbo e Ácido Acético
Glacial
Em um tubo de ensaio coloca-
ram-se cerca de 3 mL de solução
extrativa e adicionaram-se-lhe cer-
ca de 2 ml de ácido acético glacial
a 10% e 3 mL da solução de acetato
de chumbo a 10%.
Esperou-se para observar a for-
mação de um precipitado castanho
avermelhado que indicasse a pre-
sença de taninos gálicos.
Obs: A adição de ácido acético
impede a precipitação de taninos
catequínicos.
Reação com Reativo de
Wasicky
Eliminou-se o precipitado da
reação com acetato de cobre (ante-
rior) por filtração e utilizou-se o
filtrado.
Adicionaram-se cerca de 0,5
mL de solução de poli-metil-amino-
benzaldeído. Esperou-se para ob-
servar a formação de um precipita-
do carmim ou róseo que indicasse a
presença de tanino catequínico.
4.1.2– Saponinas
Saponinas são glicosídeos de
esteróides ou terpenos policíclicos.
Esse tipo de estrutura, que possui
uma parte lipofílica (triterpeno ou
esteróide) e outra hidrofílica (açú-
cares), determina a propriedade de
redução da tensão superficial da
69
 água, característica de suas ações
detergente e emulsificante (Simões
et. al., 2001).
Extração Genérica das
Saponinas
Em um aparelho de refluxo
colocaram-se 90 mL de extrato aquo-
so 1% da droga.
Adicionaram-se-lhe cerca de 10
mL de ácido clorídrico.
Deixou-se o processo em re-
fluxo por aproximadamente uma
hora para, em seguida, desligá-lo e
deixá-lo esfriar.
Transferiu-se o líquido para um
funil de separação de 200 mL e
adicionaram-se-lhe 50 mL de cloro-
fórmio. Repetiu-se a extração com
clorofórmio por mais duas vezes.
Reduziu-se o volume a 75 mL
em banho-maria.
Processos Gerais de
Identificação de Saponinas
Obs.: Para cada reação de iden-
tificação, evaporou-se cerca de 5
mL da fase orgânica obtida anteri-
ormente.
Reação de Rossol: No tubo de
ensaio onde se realizou a evapora-
ção de 5 mL da fase orgânica, adici-
onou-se uma gota de ácido sulfúri-
co concentrado.
Esperou-se para observar o
aparecimento de uma coloração ver-
melha ou violeta que indicasse a
presença da sapogenina.
Reação de Mitchell: No tubo
de ensaio onde se realizou a evapo-
ração de 5 mL da fase orgânica,
adicionou-se uma gota de ácido
sulfúrico concentrado e vestígios
de nitrato de prata.
Esperou-se para observar o apa-
recimento de uma coloração aver-
melhada que indicasse a presença
de sapogenina.
Reação de Rosenthalen: No
tubo de ensaio onde se realizou a
evaporação de 5 mL da fase orgâni-
ca, adicionaram-se uma ou duas
70 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
gotas de solução de vanilina a 1%
em ácido clorídrico.
Esperou-se para observar o
aparecimento de coloração azul que
se desenvolvesse somente a quente.
Reação com Reativo de
Sulfo-vanílico: No tubo de en-
saio onde se realizou a evapora-
ção de 5 mL da fase orgânica,
adicionaram-se uma ou duas go-
tas de solução de vanilina 1% em
ácido sulfúrico.
Esperou-se para observar o
aparecimento de coloração violeta-
azulada.
Reação de Liebermann: No
tubo de ensaio onde se realizou
a evaporação de 5 mL da fase
orgânica, dissolveu-se o resíduo
em 2 mL de ácido acético glacial.
Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas
de cloreto férrico a 3%. Em se-
guida, verteram-se , pela parede
do tubo, 1 ou 2 mL de ácido
sulfúrico sem agitar . Na superfí-
cie de contato entre os dois lí-
quidos, poderia formar-se um
anel com coloração pardo-aver-
melhada ou verde, que indicaria
a presença de derivados esteroi-
dais, ou com coloração azul, que
indicaria a presença de deriva-
dos triterpenóides.
4.1.3- Flavonóides
Os flavonóides, biossintetiza-
dos a partir da via dos fenilpropa-
nóides, constituem uma importante
classe de polifenóis, presentes com
relativa abundância entre os
metabólitos secundários de vege-
tais (Simões et. al. 2001).
Extração Genérica de
Compostos Flavonoídicos:
Pesaram-se cerca de 2,0 g da
droga;
Colocada em um béquer, adici-
onaram-se-lhe cerca de 15 mL de
etanol a 75%;
Foi fervida por alguns minutos;
Em seguida, foi esfriada e fil-
trada em papel de filtro;
Reservou-se esse extrato para
executar as reações gerais de iden-
tificação.
Reações Genéricas de
Identificação de Flavonóides
Reação de Shinoda: Adicio-
naram-se cerca de 5 mL do extrato
em um tubo de ensaio que continha
uma pitada de magnésio metálico.
Acrescentaram-se-lhe 0,5 - 1,0 mL
de ácido clorídrico.
Observou-se o desenvolvimen-
to de coloração rósea-avermelhada
indicaria a presença de flavonóis;
violeta indicaria a presença de
flavanonas e laranja indicaria a pre-
sença de flavonas.
Obs.: O desenvolvimento da
cor pode ocorrer imediatamente ou
após algum tempo.
Reação com Cloreto de Alu-
mínio: Sobre um papel de filtro,
demarcaram-se duas áreas A e B.
Depositaram-se em cada uma de-
las algumas gotas do extrato da
droga e esperou-se secar. Em se-
guida, colocou-se em uma das áre-
as 1 gota de solução de cloreto de
alumínio 5% em etanol. Eliminou-
se o etanol. Verificou-se o com-
portamento da substância nas duas
áreas frente à luz ultravioleta. Ob-
servou-se o aspecto fluorescente
que indicasse a presença de
flavonóides.
Reação com Cloreto Férri-
co: Diluiu-se o extrato com água na
proporção de 1:5, em seguida, co-
locaram-se em dois tubos de ensaio
5 mL do extrato diluído. Adicionou-
se pela parede de um dos tubos 1
gota de cloreto férrico 2%.
Esperou-se para observar o de-
senvolvimento de cor, que poderia
variar entre verde, amarelo-casta-
nho e violeta, de acordo com o tipo
de composto flavonoídico.
Reação com Hidróxido de
Sódio: Diluiu-se o extrato na pro-
porção de 1:5. Colocaram-se 5 mL
desse extrato diluído em um tubo
de ensaio e adicionaram-se-lhe 1
ou 2 gotas de NaOH 5%.
Observou-se o desenvolvimen-
to de coloração amarela, que varia
de intensidade.
4.1.4- Glicosídeos
Antraquinônicos
São compostos naturais encon-
trados sob forma glicosídica ou
livres derivados do núcleo antra-
cênico. Relacionam-se diretamen-
te com antraquinona, uma dicetona
insaturada. Possuem ação catártica
e são classificadas, como catártico
estimulante (Akisue, 2002).
Extração dos glicosídoes
antraquinônicos
Reação de Bornträeger: Pesou-
se cerca de 1g da droga, adiciona-
ram-se-lhe cerca de 20 mL de etanol
a 75% e foi aquecida durante 2
minutos em banho-maria.
Em seguida, realizou-se a fil-
tração em funil simples e adicio-
naram-se ao filtrado cerca de 2mL
de ácido sulfúrico que foi leva-
do ao banho-maria durante 1 mi-
nuto.
Deixou-se o filtrado acidificado
esfriar.
Realizou-se a extração em um
funil de separação com 10 mL de
acetato de etila, e repetiu-se a ex-
tração por mais duas vezes.
Mediram-se cerca de 5 mL da
fase orgânica e adicionaram-se-lhe
cerca de 1 ou 2 gotas de hidróxido
de amônio.
Esperou-se para observar a for-
mação de uma coloração amarela,
que indicasse a presença da antra-
quinona na forma reduzida, ou ver-
melha, que indicasse a presença da
antraquinona na forma oxidada.
Reação com Hidróxido de
sódio: Pesaram-se 0,5 g de dro-
ga, que foi colocada em um vidro
de relógio e adicionaram-se-lhe
algumas gotas de hidróxido de
sódio a 0,5%.
Esperou-se para observar o
aparecimento de uma coloração
amarelada, que indicasse a pre-
sença da antraquinona na forma
reduzida, ou de uma coloração
avermelhada que indicasse a pre-
sença da antraquinona na forma
oxidada.
4.1.5 - Alcalóides
Os alcalóides que contêm um
átomo de nitrogênio em um anel
heterocíclico são chamados de
alcalóides verdadeiros e são classi-
ficados de acordo com o sistema
anelar presente na molécula. As
substâncias com o átomo de nitro-
gênio que não pertença a um siste-
ma heterocíclico são denominados
de protoalcalóides.
Compostos nitrogenados com
e sem anéis heterocíclicos, que não
são derivados de aminoácido, são
chamados de pseudoalcalóides
(Simões et. al., 2001).
Métodos de Identificação de
Alcalóides
Pesar cerca de 1g da droga em
um béquer, adicionar 30 mL de
solução de HCL 1,5% e aquecer por
aproximadamente 3 minutos. Em
seguida, filtrar o sobrenadante em
algodão e transferir o filtrado para
um funil de separação.
Testes de Identificação
Alcalinizar o filtrado obtido
anteriormente com solução de
Hidróxido de Amônio (NH 4OH)
até atingir um pH entre 9 e 10
(utilizar papel tornassol para de-
terminar o pH).
Em seguida, adicionar ao filtra-
do alcalinizado cerca de 15 mL de
Clorofórmio (CHCl3) e agitar para
que os alcalóides presentes passem
para a porção orgânica. Colocar
cinco gotas do extrato em cada
cápsula de porcelana, colocá-las em
uma chapa e esperar secar, após
isso, dissolver o resíduo com 4 go-
tas de solução de HCl 1,5% em
todas as cápsulas e em cada uma
adicionar o reagente de identifica-
ção de alcalóides:
Reagente de Sheibler - Adicio-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
nar algumas gotas sobre o resíduo e
observar desenvolvimento de colo-
ração amarelo claro.
Reagente de Bourchardat - Adi-
cionar algumas gotas sobre o resí-
duo e observar o desenvolvimento
de coloração amarelo tijolo.
Reagente de Bertrand - Adicio-
nar algumas gotas sobre o resíduo e
observar o desenvolvimento de co-
loração amarelo tijolo.
Reagente de Mayer - Adicionar
algumas gotas sobre o resíduo e
observar desenvolvimento de um
precipitado floculoso branco.
Reagente de Dragendorff - Adi-
cionar algumas sobre o resíduo e
observar desenvolvimento de colo-
ração amarelo tijolo.
4.1.6 - Óleos voláteis
Os óleos voláteis são definidos
como produtos obtidos de partes de
planta por meio da destilação por
arraste com vapor d’água. São mis-
turas complexas de substâncias vo-
láteis lipofílicas, geralmente odorí-
feras e líquidas (Simões et. al., 2001).
Pesar cerca de 1 g da droga a
ser analisada, colocar em um gral
de vidro, adicionar cerca de 1 mL de
etanol absoluto e triturar. Pingar
uma gota em um papel de filtro,
evaporar e sentir o aroma, o qual
indica a presença de óleos voláteis.
5 - Resultados
Na amostra continha fragmen-
tos de folhas e caules de tamanhos
que variavam de 0,1 a 1,0 cm de
tamanho.
Observou-se que em 25 g da
amostra que 0,75 g correspondia a
fragmentos de materiais estranhos
à planta. A Farmacopéia Brasileira
recomenda que a porcentagem de
material estranho de outra parte da
planta tenha um limite de tolerência
em torno de 10%.
A análise microscópica da dro-
ga vegetal através dos cortes
histológicos e a sua descrição
macroscópica foram comparadas
com dados da literatura, o que per-
mitiu confirmar que a droga vegetal
71
 Tabela 1- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de taninos em P. niruri
Reativos Anacardium occidentale Phyllanthus niruri
Reação com cloreto Férrico (Gerais) PRECIPITADO AZUL -
Reação com Solução Aquosa de
PRECIPITADO CASTANHO -
Alcalóides
Reação com Acetato Neutro de
Chumbo PRECIPITADO CASTANHO -
Reação com Solução de Acetato de PRECIPITADO CASTANHO -
Cobre
Reação com Acetato de Chumbo e
PRECIPITADO CASTANHO -
Ácido acético Glacial
Reativo de WASICKY PRECIPITADO ROSA -
Reação com Cloreto Férrico
(Específica) COLORAÇÃO VERDE -
(-) ausência
Tabela 2- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de glicosídeos saponínicos.
Reativos Quilaia saponaria Phyllanthus niruri
Rossol + -
Mitchell + -
Rosenthalen + -
Reativo Sulfo-Vanílico + -
Liebermann + -
(+) presença
(-) ausência
Tabela 3- Resultado das reações indicativas da presença ou ausência de glicosídeos flavanoídicos.
Reativos Ginkgo biloba Phyllanthus niruri
Shinoda VERDE (flavonas) VERDE (flavonas)
Cloreto de Alumínio FLORESCÊNCIA AMARELO- FLORESCÊNCIAAMARELO-ACASTA-
ACASTANHADO ( flavonol) NHADO (flavonol)
AMARELO-ACASTANHADO
Cloreto Férrico VERDE (flavonas)
(flavonol)
Hidróxido de sódio AMARELA (flavonol) AMARELA (flavonol)
Tabela 4- Resultado das reações da presença ou ausência de glicosídeos antraquinônicos.
Reativos Dimorphandra mollis Phyllanthus niruri
Bornträeger vermelho vermelho
Hidróxido de Sódio vermelho vermelho
Tabela 5- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de alcalóides.
Reativos Chichona calisaya Phyllanthus niruri
Sheibler AMARELO CLARO AMARELO CLARO
Bourchardat AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO
Dragendorff AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO
Bertrand AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO
Mayer BRANCO BRANCO
em análise era mesmo a espécie 5.1 - Saponinas 5.2 - Flavonóides
Phyllanthus niruri L (Souza, 2003).
Nos testes realizados para iden- Para as reações de identifica- Para as reações de identificação
tificar os taninos, foi usada como ção de heterosídeos saponínicos de flavonóides, utilizou-se como dro-
droga padrão o cajueiro (Anacardium foi utilizada como droga padrão a ga padrão a Ginkgo (Ginkgo biloba
occidentale), droga vegetal que tem quilaia (Quilaia saponaria) para ). Os resultados das análises mostra-
como principais constituintes quími- compará-la com a droga em estudo. ram que a espécie P. niruri apresen-
cos os taninos, e a droga em estudo Os resultados demonstraram que a tou flavonóides na sua composição
não indicou a presença de taninos P. niruri não possui saponinas (Ta- química, de acordo com que se pode
nos testes realizados (Tabela-1). bela-2). observar na tabela (Tabela-3).

72 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

 5.3 - Glicosídeos
Antraderivados
Para os resultados das rea-
ções indicativas da presença ou
ausência foi utilizada como droga
padrão o faveiro (Dimorphandra
mollis ) e a droga vegetal em
análise - P. niruri – apresentou,
na sua composição química,
indicativo da presença de glicosí-
deos antraquinônicos na forma
oxidada, como podemos observar
na tabela (Tabela-4).
5.4 - Alcalóides
Para as reações de identifica-
ção de alcalóides, utilizou-se como
droga padrão a quina (Chichona
calisaya) e a espécie P. niruri em
estudo apresentou resultado posi-
tivo na presença dos reativos para
alcalóides, como se pode observar
na tabela (Tabela-5).
5.5 - Óleos Voláteis
No teste realizado para indi-
car a presença ou ausência de
óleos voláteis, não foi possível,
por meio dele, verificar a presen-
ça de óleos voláteis na espécie em
análise - P. niruri
6 - Discussão
Por meio das análises realiza-
das, foi possível identificar a dro-
ga vegetal em estudo como
Phyllanthus niruri (quebra-pe-
dra). Antes de se utilizar qualquer
droga no preparo de medicamen-
tos, deve-se submetê-la a uma
análise rigorosa. A identificação e
a pureza da droga, bem como a
avaliação de seus princípios ati-
vos são tarefas indispensáveis
àqueles que buscam produtos de
qualidade.
De acordo com a literatura, o
Phyllanthus niruri apresenta em
sua constituição substâncias como
glicosídeos antraquinônicos, fla-
vonóides e alcalóides, além de
outras que não foram investigadas
no presente trabalho, mas que se
sabe fazem parte da constituição
química da planta. Acredita-se que
algumas dessas substâncias sejam
responsáveis pelo efeito terapêu-
tico atribuído ao quebra-pedra,
porém não se sabe ao certo qual
dessas substâncias é especifica-
mente a responsável por tal pro-
priedade. Assim, os constituin-
tes identificados na análise
fitoquímica foram suficientes para
afirmarmos que a planta utilizada
era realmente o Phyllanthus
niruri, sendo identificada a droga
como verdadeira.
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73
 Nitrato Redutase em
Pesquisa
Fungos Filamentosos
O potencial multifuncional da nitrato redutase em pesquisas com biologia molecular de fungos
Jorge Fernando Pereira
Biólogo, MS em Microbiologia Agrícola,
Doutorando em Microbiologia Agrícola;
Universidade Federal de Viçosa.
dgfernando@yahoo.com
Juliana Oliveira Lima
Bióloga; Mestranda em Microbiologia Agrícola;
Universidade Federal de Viçosa.
ju.olima@bol.com.br
Rodrigo Barros Rocha
Biólogo; Mestrando em Genética e Melhoramento;
Universidade Federal de Viçosa.
rodrigobarrosrocha@yahoo.com.br
Pilar Ximena Lizarazo Medina
Bacteriologista; MS em Microbiologia Agrícola;
Doutoranda em Microbiologia Agrícola;
Universidade Federal de Viçosa.
pixilime@hotmail.com
Elza Fernandes de Araújo
Bióloga; DS em Genética UFRGS;
Profª Titular do Departamento de Microbiologia;
Universidade Federal de Viçosa.
ezfa@ufv.br
Marisa Vieira de Queiroz
Bióloga; DS em Genética e Melhoramento ESALQ-
USP; Professora Adjunta do Departamento de
Microbiologia; Universidade Federal de Viçosa.
mvqueiro@ufv.br
Ilustrações cedidas pelos autores
74 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Introdução
ungos filamentosos podem
metabolizar uma série de
compostos nitrogenados
para obterem o requeri-
mento nutricional neces-
sário para seu desenvolvi-
mento. Nesses organismos, o meta-
bolismo do nitrogênio é um processo
altamente controlado por um com-
plexo de proteínas reguladoras, que
assegura grande eficiência na utiliza-
ção das fontes de nitrogênio disponí-
veis. Esse complexo é constituído
por uma série de proteínas que são
requeridas para que vários compos-
tos secundários sejam assimilados
quando as fontes preferenciais de
nitrogênio, isto é, o amônio ou a
glutamina, não estão disponíveis
(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).
Entre os compostos secundários, o
nitrato inorgânico é uma excelente
fonte utilizável por muitos fungos
filamentosos. Seu transporte para o
meio intracelular é mediado pela
permease do nitrato, e após sua assi-
milação, ocorre a redução seqüencial
do nitrato a nitrito e do nitrito a
amônio, catalisada, respectivamen-
te, pelas enzimas nitrato e nitrito
redutase. O amônio é considerado o
ponto de partida para o metabolismo
anabólico do nitrogênio em fungos e
a sua incorporação em moléculas
orgânicas é, então, realizada por dois
sistemas: glutamato desidrogenase
(GDH) ou glutamina sintase (GS)/
Glutaminaamida: 2-oxoglutarato
amino transferase (GOGAT), que pro-
duzem glutamato e glutamina (Griffin,
1994) (Figura 1). A enzima nitrato
redutase de fungos é um grande
complexo multiredox, que possui
duas subunidades idênticas, cada uma
composta de três grupos prostéticos
em domínios separados. Na extremi-
dade C-terminal, localiza-se o domí-
nio FAD, mais ao centro da proteína,
o domínio heme, e, na extremidade
N-terminal, o domínio molibdênio. A
reação catalítica envolve a transfe-
rência de um par de elétrons do
NADH ou NADPH para os domínios
FAD, heme e molibdênio e, então,
para o nitrato. A especificidade pelo
doador de elétrons é utilizada para
classificar as nitrato redutases
eucarióticas em 3 grupos: NADH-
específica (EC 1.6.6.1), que está pre-
sente na maioria das plantas superi-
ores e em algumas algas, NADPH-
específica (EC 1.6.6.2), que é encon-
trada em fungos e NAD(P)H-
biespecífica, que é encontrada em
algumas plantas e em algumas algas
(Losada, 1976; Shen et al., 1976;
Renosto et al., 1982).
Em 1989, foi descrito o isola-
mento do primeiro gene da nitrato
redutase de fungos filamentosos uti-
lizando-se o organismo modelo
Aspergillus nidulans (Malardier et al.,
1989). Desde então, genes que codi-
ficam para a enzima nitrato redutase
vêm sendo clonados e seqüenciados
em diversas espécies de fungos
filamentosos representados por or-
ganismos modelos de estudos gené-
ticos em eucariotos, espécies com
potencial de aplicação industrial ou
com importância fitopatológica e
micorrízica. O interesse na clonagem
desse gene é baseado, principalmen-
te, no estabelecimento de protocolos
de transformação genética cujo valor
biotecnológico é muito importante
por representar um método de sele-
ção geral e conveniente. Mas, além
de marca de seleção para transforma-
ção, esse gene também pode ser
utilizado para estudos de organiza-
ção e regulação gênica, análises
filogenéticas, obtenção de mutantes,
estudos de grupos de compatibilida-
de vegetativa e como isca para
detecção e isolamento de elementos
transponíveis. Baseado nesse con-
texto, este trabalho tem como objeti-
vo apresentar resultados que contri-
buam para esse potencial multifunci-
onal do gene da nitrato redutase em
fungos filamentosos. Mesmo que,
muitas vezes, dentro de uma mesma
espécie, esse gene possa não ser
utilizado com toda essa potencialida-
de, ele representa uma das maiores
versatilidades de uso na micologia
molecular.
Organização dos genes de
assimilação do nitrato
O seqüenciamento e a compara-
ção das seqüências de genes que
codificam para nitrato redutase têm
contribuído para estudos de organi-
zação gênica em fungos filamento-
sos, sendo esses estudos imprescin-
díveis para o conhecimento de carac-
terísticas importantes como número
e tamanho de íntrons, seqüências
envolvidas com mecanismo de
splicing, tamanho de regiões promo-
toras, ligação de genes e sentido da
transcrição entre genes ligados. Um
quadro comparativo da organização
gênica entre os genes da nitrato
redutase de 16 diferentes espécies de
fungos filamentosos é apresentado
na Figura 2.
A análise de seqüências do gene
da nitrato redutase revela a ausência
de íntrons nos fungos Ustilago maydis
Figura 1 - Assimilação de nitrato em fungos filamentosos.
(Banks et al., 1993) e Botryotinia
fuckeliana (Levis et al., 1997a) e um
máximo de 12 íntrons para Hebeloma
cylindrosporum (Jargeat et al., 2000).
Em Aspergillus fumigatus, A.
nidulans, A. niger, A. oryzae, A.
parasiticus, Penicillium chrysogenum
e P. griseoroseum, ocorre a presença
de 6 íntrons que, embora possuam
tamanhos diferentes, estão localiza-
dos nas mesmas posições (Johnstone
et al., 1990; Unkles et al., 1992;
Kitamoto et al., 1995; Chang et al.,
1996; Haas et al., 1996; Amaar e
Moore, 1998; Pereira, 2001). Em
Leptosphaeria maculans e carteri possuem 15 e 9 íntrons, res-
Stagonospora nodorum, esse gene é
interrompido por 4 íntrons que cor-
respondem aos íntrons II, III, IV e VI
de Aspergillus e Penicillium (Williams
et al., 1994; Cutler et al., 1998), en-
quanto em Beauveria bassiana (nú-
mero de acesso no Genbank X84950),
Fusarium oxysporum, Gibberella
fujikuroi, Metarhizium anisopliae
(número de acesso no Genbank
AJ001141) e Neurospora crassa, ape-
nas 1 íntron está presente na mesma
posição do íntron VI de Aspergillus e
Penicillium (Okamoto et al. 1991;
Diolez et al., 1993; Tudzynski et al.,
1996). O gene da nitrato redutase de
H. cylindrosporum parece ser o úni-
co que possui íntrons (11 e 12) na
região correspondente ao domínio
FAD (Jargeat et al., 2000). Pode-se
observar na Figura 2 que o tamanho
médio dos íntrons é de, aproximada-
mente, 58 pares de bases (pb), sendo
o menor de 46 pb e o maior de 92 pb.
Na grande maioria das vezes, esses
íntrons não apresentam similaridade
a não ser nas seqüências envolvidas
com o processo de sua retirada
(splicing). Os íntrons encontrados
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
nos genes que codificam a nitrato
redutase em eucariotos não inter-
rompem a seqüência codificadora
em éxons com os respectivos domí-
nios funcionais da enzima, sendo
que a maioria deles parece estar
dentro e não entre os domínios fun-
cionais (Zhou e Kleinhofs, 1996). A
localização dos íntrons é conservada
dentro de fungos, algas e plantas
superiores, em relação a genes para
nitrato redutase, mas, mesmo assim,
difere entre esses grupos. Em algas,
os genes da nitrato redutase de
Chlamydomonas reinhardtii e Volvox
pectivamente, localizados nos domí-
nios molibdênio, heme e FAD. A
posição de 8 dos 10 íntrons em Volvox
é idêntica à de Chlamydomonas. Os
quatro íntrons presentes em Oryzae
sativa, Phaseolus vulgaris, Lypersicon
esculentum e Nicotiana tobacum es-
tão localizados, precisamente, na mes-
ma posição (Zhou e Kleinhofs, 1996).
Com base no número e na posição
dos íntrons presentes nos genes da
nitrato redutase de fungos filamento-
sos, algas e plantas, Zhou e Kleinhofs
(1996) não puderam afirmar se, du-
rante a evolução, os íntrons foram
incorporados (gain hypotheses) ou
perdidos (loss hypotheses). Então, os
íntrons podem ter sido inseridos no
gene da nitrato redutase após a diver-
gência entre fungos e plantas, ou o
ancestral desses grupos possuía to-
dos os íntrons e esses foram perdidos
independentemente após a divergên-
cia. Ainda, segundo esses autores, a
hipótese de embaralhamento de
éxons (exon shuffling), em que as
seqüências que codificam regiões es-
truturais ou funcionais da proteína
estariam delimitadas por íntrons, não
parece se aplicar a esse caso, pois as
seqüências que codificam os domíni-
os funcionais das proteínas nitrato
redutase apenas são separadas por
íntrons em H. cylindrosporum (íntron
9 entre domínios molibdênio e heme).
Além dos íntrons, a organização
dos três genes relacionados com a
assimilação do nitrato em fungos fila-
mentosos pode ser separada em, pelo
menos, quatro grupos diferentes (de
A a D). No grupo A, os três genes
estão ligados, mas os genes da nitrato
e nitrito redutase são transcritos em
direções opostas, sendo o gene do
transportador transcrito na mesma
75
 Figura 2 - Comparação da organização dos genes de assimilação do nitrato em fungos filamentosos. Em alaranjado, a região
promotora intergênica dos genes nos quais foram relatadas ligação entre nitrito e nitrato redutase. As setas representam o sentido
da transcrição nesses genes. As caixas abertas indicam a região estrutural com tamanho e posição dos íntrons em relação às regiões
codificadoras dos domínios molibdênio, heme e FAD. O tamanho da região promotora e dos íntrons é dado em pares de bases.
O número de aminoácidos das respectivas proteínas é dado à direita.

direção da nitrito redutase. Essa orga-
nização é encontrada em A. nidulans,
A. niger, A. parasiticus, A. fumigatus
e P. chrysogenum (Johnstone et al.,
1990; Unkles et al., 1992; Chang et al.,
1996; Amaar e Moore, 1998; Haas e
Marzluf, 1995). O tamanho da região
intergênica é de 1.262 pb em A.
nidulans (Johnstone et al., 1990), 1.668
pb em A. niger (Unkles et al., 1992),
1.670 pb em A. parasiticus (Chang et
al., 1996), 1.229 pb em A. fumigatus
(Amaar e Moore, 1998) e 661 pb em P.
chrysogenum (Haas e Marzluf, 1995).
No grupo B, os três genes também
estão ligados, mas o gene do transpor-
tador está entre os genes da nitrato e
da nitrito redutase, sendo transcritos
na mesma direção descrita no grupo
A. Essa organização é encontrada em
H. cylindrosporum (Jargeat et al.,
2003). No grupo C, os genes da nitrato
e da nitrito redutase estão ligados, são
transcritos na mesma direção, mas o
gene do transportador não está liga-
do, como é observado em L. maculans
e S. nodorum (Williams et al., 1994;
Cutler e Caten, 1999). O tamanho da
região intergênica é de 1.438 pb em L.
maculans (Williams et al., 1994) e 829
pb em S. nodorum (Cutler e Caten
1999). No grupo D, apesar da posição
do transportador ainda não ter sido
determinada, os três genes não pare-
cem estar ligados, como ocorre em
Neurospora crassa (Exley et al., 1993)
e em Gibberella fujikuroi (Tudzynski
et al., 1996).
Regulação do gene da
nitrato redutase
As maiores contribuições para o
conhecimento da regulação do meta-
bolismo do nitrogênio em fungos
filamentosos baseiam-se nos traba-
lhos realizados com os organismos A.
nidulans e Neurospora crassa
(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997),
sendo que, nos últimos anos, estudos
também têm sido relatados para ou-
tras espécies como, por exemplo,
Penicillium chrysogenum (Haas e
Marzluf, 1995; Haas et al., 1996).
A utilização de fontes de nitrogê-
nio secundárias é controlada de ma-
neira positiva e negativa, existindo
um sistema de controle global e um

76 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

específico. A desrepressão de mais de
100 genes estruturais, incluindo, por
exemplo, genes que codificam trans-
portadores de aminoácidos, transpor-
tadores de purinas, proteases
extracelulares e enzimas catabólicas,
é dependente da presença do indutor
e da ausência de fontes preferenciais
de nitrogênio (amônio e glutamina).
Essa desrepressão é realizada tanto
pelo regulador global positivo areA
em A. nidulans e seus corresponden-
tes nit-2 em N. crassa e nre em P.
chrysogenum, quanto por regulado-
res específicos. O gene areA codifica
uma proteína reguladora de 876 resí-
duos de aminoácidos que contém um
único domínio de ligação ao DNA, o
qual reconhece e se liga a seqüências
que contêm o core GATA (Kudla et
al., 1990; Langdon et al., 1995). As
proteínas AREA, NIT-2 e NRE possu-
em somente 30% de homologia, mas,
considerando apenas o domínio de
ligação ao DNA, a identidade é de
98% (Haas e Marzluf, 1995). Em AREA,
o domínio de ligação ao DNA é cons-
tituído por um único dedo de Zn com
quatro cisteínas, seguido de um domí-
nio terminal básico, que apresenta
uma estrutura compacta formada por
dois pares de folhas-β seguidas por
uma α-hélice e uma cauda não
estruturada. As cadeias laterais ao
dedo de Zn fazem contato altamente
hidrofóbico no sulco maior da molé-
cula de DNA e a cauda carboxi-termi-
nal faz contato com o esqueleto de
fosfato (Scazzocchio, 2000). Elemen-
tos com, pelo menos, duas cópias de
seqüências GATA, que podem estar
na mesma direção, ou em direções
opostas, e com espaço de, pelo me-
nos, 30 pb, são considerados fortes
sítios de ligação para NIT-2 (Chiang e
Marzluf, 1994). Para P. chrysogenum,
Haas e Marzluf (1995) descreveram
fortes sítios de ligação de NRE como
regiões com, pelo menos, duas se-
qüências GATA com espaçamento
entre 5 e 27 pb, configuradas na
mesma direção ou em direções opos-
tas. Elementos GATA separados por
74 ou 96 pb não demonstraram ser
fortes sítios de ligação NRE (Haas e
Marzluf, 1995). Para A. parasiticus,
Chang et al. (2000) relataram a ligação
de AREA a segmentos de 42 pb da
região promotora dos genes da nitrato
e da nitrito redutase que continham
um ou dois elementos GATA.
Outro gene importante para o
metabolismo do nitrogênio é o nmr
(do inglês nitrogen metabolism
repressor), que atua de maneira nega-
tiva, reprimindo a síntese de vários
genes. O gene nmr codifica uma
proteína de 54,8 KDa, que não pos-
sui domínio de ligação ao DNA, mas
é capaz de se ligar a uma pequena
região do domínio de ligação ao
DNA e à região carboxi-terminal da
proteína NIT-2 (e possivelmente de
AREA), impedindo a ação dessa pro-
teína, sendo a glutamina o possível
sinal para essa ligação (Xiao et al.,
1995). Pelo menos para AREA, ainda
existem outros dois níveis de
regulação: a transcrição de areA é
auto-regulada e a estabilidade do
mRNA de areA é menor em células
que crescem em fontes de nitrogênio
preferenciais (Platt et al., 1996). Des-
sa forma, na presença de fontes pre-
ferenciais, além de uma menor esta-
bilidade do mRNA do gene areA, o
regulador NMR se liga à proteína
AREA já sintetizada e impede que
essa proteína se ligue aos promoto-
res e induza a transcrição dos genes
relacionados com o metabolismo de
fontes secundárias de nitrogênio. As-
sim, a célula assegura a assimilação
de nitrogênio a partir de compostos
que são prontamente metabolizáveis.
A indução do gene da permease
do nitrato e dos genes da nitrato
redutase (niaD para Aspergillus sp. e
P. chrysogenum ou nit-3 para N.
crassa) e nitrito redutase (niiA para
Aspergillus sp. e P. chrysogenum ou
nit-6 para N. crassa) requer síntese
de novo, sendo necessária a ausência
das fontes preferenciais e a presença
de nitrato como indutor. Nesse caso,
além do fator de regulação global, é
necessária a presença de um fator
específico chamado nirA em A.
nidulans e nit-4 em N. crassa
(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).
A proteína NIRA liga-se ao DNA a
partir de um domínio na sua região
amino-terminal (Burger et al., 1991).
Essa proteína se liga à seqüência 5’-
CTCCGHGG-3’, sendo que foram de-
tectados sítios putativos ou já com-
provados para essa proteína em vári-
as espécies de ascomicetos (Punt et
al., 1995). Para o reconhecimento de
cis-elementos e expressão do gene
nit-3 em N. crassa (Feng e Marzluf,
1998), é requerida uma interação
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
específica entre os fatores de
regulação NIT-2 e NIT-4. Em N. cras-
sa, um acúmulo máximo de mRNA
de nit-3 ocorre apenas 15 minutos
após a indução por nitrato, sendo
que o acúmulo máximo de proteína
ocorre após 60 minutos, e em P.
chrysogenum transcritos de niaD são
detectados com 15 minutos de
indução, e atingem um nível máximo
após 60 minutos (Okamoto et al.,
1991; Haas et al., 1996). Até a presen-
te data, a única exceção é o
basidiomiceto H. cylindrosporum,
onde o gene da nitrato redutase pos-
sui alto nível de transcrição na pre-
sença de nitrato, uréia, serina e glicina,
sendo possível, neste caso, a
inexistência de fatores de regulação
específicos. Entretanto, na presença
de amônio, ocorre uma forte, mas
incompleta, repressão desse gene,
indicando a existência de um sistema
de regulação geral (Jargeat et al.,
2000). Recentemente, foi reportado,
para H. cylindrosporum, que a trans-
crição dos genes da permease do
nitrato e da nitrito redutase também
não é induzida por nitrato, mas é
completamente reprimida por amônio
(Jargeat et al., 2003).
Relações filogenéticas
baseadas na proteína
nitrato redutase
Apesar da proteína nitrato redutase
apresentar regiões comprovadamente
importantes para seu funcionamento,
outras regiões parecem poder sofrer
variação sem acarretar perda de funcio-
nalidade para a proteína. A região N-
terminal e 2 regiões curtas, entre os
domínios molibdênio e heme e heme e
FAD, apresentaram menor identidade
entre 17 outras proteínas nitrato redutase
de plantas, algas e fungos quando fo-
ram comparadas por Zhou e Kleinhofs
(1996). Essa característica de apresentar
regiões conservadas que flanqueiam
regiões que podem sofrer variação é
interessante para estudos de filogenia.
Esses mesmos autores verificaram que
o gene da nitrato redutase pode ser
utilizado como relógio molecular, pois
genes de diferentes espécies evoluem
em uma taxa constante, e, baseados
nesse gene, estimaram o tempo de
divergência entre fungos e plantas, em
torno de 1 bilhão de anos e, entre algas
e plantas superiores, em torno de 750
77
 milhões de anos. Além do uso como
relógio molecular, estudos filogenéticos
com a proteína nitrato redutase de fun-
gos filamentosos têm revelado uma
tendência de agrupar espécies que per-
tençam a categorias taxonômicas co-
muns (Williams et al., 1994; Cutler et al.,
1998). Assim, esse gene possui caracte-
rísticas interessantes para uso em estu-
dos evolucionários. Na Figura 3 é apre-
sentada uma árvore filogenética não
enraizada baseada na seqüência de
aminoácidos da proteína nitrato redutase.
Para a construção dessa árvore, seqüên-
cias da proteína nitrato redutase de 16
fungos filamentosos e 1 planta foram
retiradas do GenBank na página do
National Center for Biotechnology
Information (www.ncbi.nlm.nih.gov)
por meio dos seguintes números:
Aspergillus fumigatus (AF336236), A.
nidulans (M58291), A. niger (M77022),
A. oryzae (D49701), A. parasiticus
(U38948), Arabdopsis thaliana
(P11832), Beauveria bassiana
Figura 3 - Árvore filogenética não enraizada, baseada em análises pelo método de
parsimônia da seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase de vários fungos
filamentosos. Os números indicam porcentagem dos valores de bootstrap em análise
com 1.000 réplicas.
78 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
(X84950), Botryotinia fuckeliana
(U43783), Fusarium oxysporum
(Z22549), Gibberella fujikuroi
(X90699), Hebeloma cylindrosporum
(AJ238664), Leptosphaeria maculans
(U04445), Metarhizium anisopliae
(AJ001141), Neurospora crassa
(X61303), Penicillium chrysogenum
(U20779), P. griseoroseum (AY255803),
Stagonospora nodorum (AJ009827) e
Ustilago maydis (AJ315577). O alinha-
mento de toda a seqüência de amino-
ácidos foi realizado no programa
Clustal X (Thompson et al., 1997),
sendo o alinhamento resultante anali-
sado pelo método de parsimônia no
programa PAUP* versão 3.1 (Swofford,
1993). Foi feita uma busca heurística
e análise de bootstrap com 1.000 répli-
cas para gerar índices de confiabilidade
para cada ramo.
Pode-se observar claramente a
tendência de se agruparem as espé-
cies analisadas pela ordem à qual
essas pertencem de acordo com a
taxonomia clássica. Dessa forma, a
seqüência de aminoácidos da prote-
ína nitrato redutase apresenta uma
aplicação para estudos filogenéticos,
com forte reflexo da história natural
dos fungos filamentosos.
Obtenção de mutantes
deficientes na enzima
nitrato redutase
Uma das grandes vantagens na
aplicação do gene da nitrato redutase
é a fácil obtenção de mutantes es-
pontâneos por seleção positiva via
resistência ao clorato. Essa seleção
positiva, que favorece o crescimento
do mutante em relação ao selvagem,
é baseada na “similaridade” entre a
molécula de nitrato e seu análogo
tóxico, o clorato. Da mesma forma
que o nitrato, o clorato presente no
meio de cultura é transportado para
o meio intracelular pela permease do
nitrato e é reduzido a clorito pela
ação da enzima nitrato redutase. En-
tretanto, diferentemente do nitrito, o
clorito é um composto tóxico que
promove a morte da célula. A teoria
de que o clorato por si só não é
tóxico, mas se torna tóxico pela con-
versão a clorito como resultado da
ação da nitrato redutase, foi primei-
ramente sugerida por Aberg (1947) e
tem sido confirmada por uma série
de trabalhos. Análises do efeito do
clorito de sódio, tanto in vitro como
in vivo, sugerem que o clorito cause
estresse oxidativo em células de fun-
gos e, por causar oxidação de
biomoléculas importantes, torna-se
tóxico (Ingram et al., 2003). Dessa
maneira, a célula que apresenta uma
enzima nitrato redutase funcional
morre e aquela que apresenta uma
forma não-funcional sobrevive, pois
não é capaz de reduzir o clorato a
clorito.
Nesse momento, a colônia
mutante, que cresce no meio de cul-
tura, é resistente ao clorato, mas não
necessariamente é mutante para a
enzima nitrato redutase. Mutações
em, pelo menos, cinco genes podem
levar ao fenótipo de resistência ao
clorato: (i) mutação no gene da
permease do nitrato (crnA), que in-
capacite a célula de absorver o clorato
do meio extracelular; (ii) mutação no
gene do regulador específico da assi-
milação de nitrato (nirA), que impos-
Figura 4 - Obtenção de mutantes nitrato redutase. 1-) Esquema do protocolo para obtenção de mutantes resistentes ao clorato e
testes de crescimento para anotação da mutação; 2-) Vias metabólicas envolvidas com o fenótipo de resistência ao clorato (possíveis
genes mutados são mostrados em laranja); 3-) Fenótipo de crescimento em placas contendo MM + nitrato (A), MM + nitrito (B) e
MM + hipoxantina (C) de mutantes de Penicillium griseoroseum resistentes ao clorato. Colônias que não crescem em A mas crescem
em B e C são mutantes nitrato redutase; S indica o tipo selvagem utilizado como controle positivo.

sibilite a célula de expressar a enzima (cnxA-J), que, não estando presente, obtenção das colônias resistentes ao
nitrato redutase; (iii) mutação no gene torna ineficazes a enzima nitrato clorato, é necessário fazer uma dis-
do regulador geral da assimilação de redutase e outras enzimas depen- criminação do fenótipo mutante por
nitrogênio (areA), que também im- dentes desse cofator; e (v) mutação meio de um fácil teste de crescimen-
possibilite a célula de expressar a no próprio gene da nitrato redutase to em meio mínimo contendo as
enzima nitrato redutase; (iv) muta- (niaD), impossibilitando a célula de seguintes fontes de nitrogênio: nitra-
ção em algum gene envolvido na sintetizar essa enzima (Cove, 1976; to, nitrito, hipoxantina, glutamato e
biosíntese do cofator molibdênio Cove, 1979). Dessa forma, após a amônio . O crescimento ou não nes-
Tabela 1 - Testes de crescimento de mutantes resistentes ao clorato, em diferentes fontes de nitrogênio.
Designação Testes de crescimento
Mutação
do mutante* Clorato Nitrato Nitrito Hipoxantina Glutamato Amônio
Nenhuma Selvagem - + + + + +
Nitrato redutase n iaD + - + + + +
Regulador específico n irA + - - + + +
Cofator molibdênio cn xA-J + - + - + +
Regulador geral areA + - - - - +
Permease crn A + + + + + +
* denominação dos genes para Aspergillus n idulan s; + indica crescimento e - indica ausência de crescimento.

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 79

 sas diferentes fontes (Tabela 1) é,
então, correlacionado com a muta-
ção em um dos cinco possíveis genes
acima relacionados (Figura 4). Como
em todas as espécies de fungos
filamentosos estudadas até o mo-
mento, apenas uma cópia funcional
do gene da nitrato redutase foi en-
contrada, mutantes nitrato redutase
são reportados com alta freqüência.
A razão do teste de crescimento
em hipoxantina é que, além do re-
querimento por NAD(P)H, as
enzimas nitrato redutase são depen-
dentes de uma molécula chamada
cofator molibdênio. A ausência des-
se cofator impossibilita a célula de
utilizar o nitrato como também
purinas como adenina, hipoxantina
e xantina como única fonte de nitro-
gênio. Os mutantes incapazes de
crescer em nitrato e hipoxantina
apresentam uma perda pleiotrópica
da atividade das enzimas nitrato
redutase e xantina desidrogenase,
respectivamente. Como esses
mutantes são defectivos na síntese
de um cofator comum, tanto para a
nitrato redutase como para xantina
desidrogenase, os genes envolvidos
na síntese desse cofator foram deno-
minados cnx (do inglês common
component for nitrate reductase and
xanthine dehydrogenase) (Pateman
et al., 1964; Cove, 1979). Por meio
de testes de complementação entre
diferentes mutantes, Pateman et al.
(1964) reportaram a existência de
vários loci (cnx ABC, E, F, G e H)
relacionados com vários genes res-
ponsáveis pela produção do cofator
molibdênio, e Arst et al. (1982) rela-
taram a existência de outro locus
(cnxJ). Unkles et al. (1997) compro-
varam que o locus cnxABC é parte
de um único gene que codifica uma
proteína com dois domínios catalíti-
cos requeridos para a síntese de um
intermediário do cofator molibdênio.
Um protocolo para obtenção de
mutantes deficientes na enzima ni-
trato redutase é apresentado a seguir
e está esquematizado na Figura 4.
Esse protocolo baseia-se em espéci-
es que apresentam reprodução
assexual e/ou sexual possibilitando
o uso de esporos na análise. Como na
grande maioria das espécies de fun-
gos filamentosos os esporos são
uninucleados e contêm genoma
haplóide, a mutação é expressa sem
80 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
efeito de dominância. Mesmo assim,
algumas espécies de fungos não pro-
duzem esporos in vitro, e esse proto-
colo pode ser modificado para ob-
tenção de mutantes por intermédio
de fragmentos de micélio, onde seto-
res resistentes ao clorato apresentam
crescimento mais vigoroso. Entretan-
to, em algumas espécies de fungos, a
resistência ao clorato parece ser na-
tural, o que impossibilita a obtenção
de mutantes por essa técnica.
Protocolo para obtenção de
mutantes nitrato redutase (segundo
Cove, 1976; Cove, 1979; Unkles et
al., 1989):
• Preparar uma suspensão de
esporos em tween 80 0,05%
contendo cerca de 10 7 .ml -1
esporos;
• Plaquear 0,1 ml dessa solução
em meio mínimo (MM) sólido
(Pontecorvo et al., 1953) sem
nitrato e acrescido de 470 mM
de clorato de potássio e 10 mM
de glutamato de sódio (clorato
de potássio 57,6 g; glutamato
de sódio monobásico 1,87 g;
KH2PO4 1,5 g; KCl 0,5 g; MgSO4
0,5 g; FeSO4 0,01 g; ZnSO4 0,01
g; glicose 10 g; ágar 15 g; água
destilada 1.000 ml; pH 6,8);
• Incubar as placas a 25oC por
cerca de 7 a 10 dias;
• Transferir as colônias resis-
tentes ao clorato para placas
contendo meio completo (MC)
sólido, Pontecorvo et al. (1953)
modificado por Azevedo e Cos-
ta (1973) [meio mínimo adicio-
nado de peptona 2,0 g; caseína
hidrolisada 1,5 g; extrato de
levedura 2,0 g; solução de vita-
minas 1,0 ml; (biotina 0,2 mg;
ácido p-aminobenzóico 10,0 mg;
piridoxina 50,0 mg; tiamina 50,0
mg; ácido nicotínico 100,0 mg;
riboflavina 100,0 mg; água des-
tilada 100 ml); ágar 15 g; água
destilada 1.000 ml; pH 6,8];
• Fazer purificação monospórica
dos mutantes;
• Inocular as colônias resisten-
tes em placas de MM contendo
10 mM das seguintes fontes de
nitrogênio : nitrato de sódio,
nitrito de sódio, cloreto de
amônio, hipoxantina e gluta-
mato de sódio;
• Incubar a 25oC por 3 a 5 dias;
• Verificar o crescimento e ano-
tar os fenótipos mutantes;
• Separar e identificar os
mutantes nitrato redutase.
Assim, o sistema nitrato redutase
apresenta vantagens sobre outros
sistemas, como a fácil obtenção de
mutantes espontâneos por seleção
positiva via resistência ao clorato, e,
como não há emprego de mutagê-
nese, a possibilidade de mutações
secundárias que atinjam genes im-
portantes ou de interesse é reduzi-
da. Também esses mutantes apre-
sentam um único fenótipo desejá-
vel, não utilizar nitrato como única
fonte de nitrogênio, sendo que esse
fenótipo é dispensável sem alterar o
crescimento ou fluxos metabólicos
importantes.
Utilização de mutantes
deficientes na utilização do
nitrato em estudos de
grupos de compatibilidade
vegetativa
Isolados de uma espécie fúngica
podem ser caracterizados pela com-
patibilidade ou incompatibilidade ve-
getativa. A compatibilidade ocorre
quando micélios de diferentes isola-
dos podem sofrer anastomoses e ori-
ginar heterocários (hifas que contêm
núcleos geneticamente diferentes),
enquanto a incompatibilidade ocorre
quando não há formação de hetero-
cários. Nem sempre é possível for-
mar essas anastomoses, principal-
mente quando os cruzamentos são
interespecíficos ou intergenéricos,
pois o fator determinante da intera-
ção entre as células pode estar na
parede celular manifestando-se como
bloqueio da fusão celular (Peberdy,
1991). Os isolados que apresentem
compatibilidade podem ser coloca-
dos dentro de um mesmo grupo,
formando um grupo de compatibili-
dade vegetativa (GCV). Em fungos
de reprodução assexuada, isolados
de um mesmo GCV são mais simila-
res geneticamente que isolados de
diferentes GCV.
A heterocariose também é a pri-
meira etapa para que fungos
assexuados troquem material genéti-
co por meio de um ciclo alternativo
chamado parassexual. Nesse ciclo,
os diferentes núcleos no heterocário
se fundem, originando diplóides he-
terozigotos, e, a seguir, ocorre a pro-
dução de recombinantes por meio de
recombinação mitótica e haploidiza-
ção (Pontecorvo & Roper, 1952).
A detecção de heterocários pode
ser alcançada pelo cruzamento de
indivíduos portadores de diferentes
mutações. Quando são formadas
anastomoses entre as hifas desses
diferentes mutantes, o heterocário
pode ser visualizado já que o núcleo
de um indivíduo contém o gene sel-
vagem que complementa a mutação
do outro. As diferentes mutações
podem estar relacionadas, por exem-
plo, à coloração da colônia, mas a
obtenção de mutantes por técnicas
de mutagênese tradicionais é muito
trabalhosa, o que torna esse procedi-
mento difícil de ser empregado para
estudo com muitos isolados de cam-
po. Assim, vários trabalhos reportam
o estudo de GCVs utilizando muta-
ções auxotróficas que incapacitem a
célula de utilizar nitrato como única
fonte de nitrogênio (Puhala, 1985;
Correl et al., 1986; Brooker et al.,
1991). Nesses estudos, é suficiente
fazer a triagem de populações utili-
zando indivíduos que contenham mu-
tações únicas em diferentes genes da
assimilação do nitrato, que possam
ser testados para a sua habilidade de
complementar as mutações e de for-
mar heterocário em meio contendo
nitrato como única fonte de nitrogê-
nio. Como o isolamento de mutantes
resistentes ao clorato gera mutações
de diferentes tipos, essas mutações
podem ser utilizadas como marcas
de seleção para a formação dos hete-
rocários. Assim, esse sistema torna-
se simples e rápido para ser utilizado
para essa finalidade.
Estudos de compatibilidade ve-
getativa são de particular interesse
em fungos que se reproduzem
assexuadamente, já que os indivídu-
os dentro de um GCV podem trocar
informações genéticas por meio de
heterocariose e de ciclo parasexual.
Em fungos fitopatogênicos, os GCVs
podem ser correlacionados com a
patogenicidade, embora essa corre-
lação não esteja sempre ligada.
Puhalla (1985) utilizou mutantes de-
ficientes na assimilação de nitrato
para testar a compatibilidade vegeta-
tiva entre 21 isolados de F. oxysporum,
reportando que membros do mesmo
GCV pertenciam à mesma formae
speciales. Correl et al. (1986) também
utilizaram mutantes incapazes de
metabolizar nitrato em testes de com-
patibilidade vegetativa para identifi-
car F. oxysporum f. sp. apii raça 2 de
uma população de raças de F.
oxysporum que colonizava raízes de
aipo. Assim, o teste de compatibili-
dade vegetativa é uma ótima ferra-
menta para estudos de diversidade
genética constituindo marcadores ge-
néticos naturais que podem ser utili-
zados para diferenciar isolados. Além
disso, em fungos que se reproduzem
sexuadamente, esses estudos tam-
bém são importantes para determi-
nar genes relacionados com o tipo
sexual (mating type), importantes no
reconhecimento e desenvolvimento
do ciclo sexual.
Transformação genética
baseada no gene da nitrato
redutase
Um dos principais passos no de-
senvolvimento de uma tecnologia para
manipulação e análise molecular de
um organismo é o estabelecimento de
um protocolo que permita introduzir
seqüências de DNA clonadas em uma
linhagem recipiente. A disponibilida-
de de um sistema de transformação
oferece possibilidade de adição e de
deleção de rotas metabólicas em um
organismo de interesse, alterando o
fenótipo selvagem para uma aplica-
ção específica. As seqüências a serem
introduzidas têm interesses distintos,
dependendo do tipo de organismo
estudado. Dessa forma, o principal
objetivo da clonagem de genes que
codificam nitrato redutase é o estabe-
lecimento de protocolos de transfor-
mação baseados na complementação
de mutações no gene da nitrato
redutase. Nesse ponto, além das van-
tagens inerentes a esse sistema, outra
característica importante é ser basea-
do na complementação de uma muta-
ção auxotrófica, o que evita a introdu-
ção de genes de seleção baseados na
resistência a drogas.
A transformação é realizada pela
introdução do gene da nitrato redutase
em um mutante nitrato redutase por
biobalística ou Agrobacterium
tumefaciens, sendo que o método
mais comum é o da transformação de
protoplastos pela técnica do polieti-
lenoglicol (PEG)/CaCl2. Após a trans-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
formação, os protoplastos são
plaqueados por pour-plate em meio
mínimo contendo estabilizador
osmótico e nitrato como única fonte
de nitrogênio. Apenas aquelas célu-
las mutantes onde o gene da nitrato
redutase se integrar, serão capazes
de crescer (Figura 5). Para tanto,
pode-se utilizar um gene da nitrato
redutase já isolado de um organismo
em uma espécie de interesse. Quan-
do o gene é de uma espécie diferente
da espécie receptora, o sistema é dito
heterólogo, e quando o gene foi
isolado do organismo receptor, o
sistema é dito homólogo.
Nos sistemas heterólogos, geral-
mente há baixa similaridade entre o
vetor de transformação e o genoma
do organismo receptor, o que resulta
em baixa freqüência de transforma-
ção, integração aleatória e alto núme-
ro de cópias do vetor. Esse padrão de
integração aleatório pode ser interes-
sante para obtenção de mutantes pela
técnica de REMI (do inglês restriction
enzyme-mediated integration), des-
crita por Schiestl e Petes (1991), que é
uma variação da técnica de transfor-
mação, onde enzima de restrição é
adicionada à mistura de transforma-
ção juntamente com o plasmídeo line-
ar. Queiroz et al. (1998) verificaram
que o gene da nitrato redutase de F.
oxysporum se integrava aleatoriamen-
te no genoma de P. griseoroseum,
sendo essa característica utilizada por
Soares (2002) para obtenção de
mutantes de P. griseoroseum pela téc-
nica de REMI.
Mesmo assim, sistemas de trans-
formação homólogos têm sido de-
senvolvidos para vários fungos fila-
mentosos, incluindo A. oryzae
(Unkles et al., 1989), Cephalosporium
Figura 5 - Seleção de transformantes basea-
da no gene da nitrato redutase. Placas com
meio mínimo contendo nitrato como úni-
ca fonte de nitrogênio. (A) Controle neg-
ativo - protoplastos do mutante nitrato
redutase que não foram transformados;
(B) protoplastos do mesmo mutante que
foram transformados com gene homól-
ogo da nitrato redutase.
81
 acremonium (Whithead et al., 1990),
P. chrysogenum (Gouka et al., 1991),
Fusarium oxysporum (Diolez et al.,
1993), G. fujikuroi (Tudzynski et al.,
1996), B. cinerea (Levis et al., 1997a),
S. nodorum (Cutler et al., 1998) e P.
griseoroseum (Pereira, 2001). Na lite-
ratura, existem relatos para A. oryzae
(Unkles et al., 1989) e S. nodorum
(Cutler et al., 1998) de 100% de
integração do vetor no locus da nitra-
to redutase, sendo que nesses estu-
dos foram analisados 22 transfor-
mantes para A. oryzae e 13 transfor-
mantes para S. nodorum. Para B.
cinerea (Levis et al., 1997a), a análise
de 36 transformantes revelou 34
integrações homólogas, sendo 29
eventos de troca gênica. Mesmo que
a utilização de genes homólogos au-
mente a probabilidade de ocorrência
de integração em sítios homólogos,
para fungos filamentosos e outros
organismos eucariotos, parecem ser
mais comuns eventos de integração
heteróloga. Sistemas de transforma-
ção homólogos, baseados na com-
plementação de mutações nitrato
redutase, desenvolvidos para
Cephalosporium acremonium
(Whitehead et al., 1990) e P.
chrysogenum (Gouka et al., 1991)
resultam, na maioria dos transfor-
mantes, na integração do vetor em
sítios diferentes do locus da nitrato
redutase, enquanto que G. fujikuroi
(Tudzynski et al., 1996) e F.
oxysporum (Diolez et al., 1993) ocor-
reu um número similar de integra-
ções, dentro e fora desse locus.
Um sistema de transformação com
alta incidência de integração homólo-
ga, especialmente troca gênica, pode
ser utilizado para estudos de regiões
importantes, tanto em nível de
regulação como em nível estrutural.
Assim, mutações geradas in vitro,
como alteração dos sítios de ligação
de proteínas reguladoras, podem ser
introduzidas e avaliadas in vivo no
exato local onde reside o gene. Além
disso, essa alta taxa de integração
homóloga é interessante em experi-
mentos de co-transformação, pois di-
minui a probabilidade de integrações
em sítios heterólogos que sejam im-
portantes para o metabolismo celular
e/ou de interesse biotecnológico.
Vários trabalhos relatam a utili-
zação de vetores de transformação
que carregam o gene da nitrato
82 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
redutase como marcadores de sele-
ção em experimentos de co-trans-
formação para introduzir genes de
interesse biotecnológico. Por exem-
plo, Ribeiro (2001) relatou a obten-
ção de transformantes com até 89%
de aumento na produção de poliga-
lacturonase quando co-transformou
um mutante nitrato redutase de P.
expansum com o plasmídeo pPE 15,
que carrega o gene homólogo de
poligalacturonase, e o plasmídeo
pNH24, contendo o gene da nitrato
redutase de F. oxysporum como
marcador de seleção. Linhagens
transformantes de A. oryzae apre-
sentaram a produção de poligalactu-
ronase aumentada em até 3,2 vezes
quando transformadas com um gene
de poligalacturonase de Penicillium
janthinellum, sendo os transforman-
tes selecionados pela complemen-
tação de uma mutação nitrato
redutase (Ishida et al. 1997). Cardo-
so et al. (2003) utilizaram o gene
homólogo da nitrato redutase de P.
griseoroseum para introduzir uma
construção do gene da pectina liase
e obtiveram transformantes com au-
mento expressivo na atividade des-
sa enzima.
Utilização do gene da
nitrato redutase como
vetor de expressão
Uma outra perspectiva na apli-
cação biotecnológica do gene da ni-
trato redutase é sua utilização como
vetor de expressão. Isso é baseado
nas análises de expressão onde são
observadas grandes quantidades de
transcrito do gene da nitrato redutase
apenas poucos minutos após sua
indução por nitrato (Okamoto et al.,
1991; Haas et al., 1996), sendo esse
indutor acessível e de baixo custo.
Essa perspectiva é importante uma
vez que muitos genes de valor bio-
tecnológico somente são expressos
na presença de um indutor específi-
co que, muitas vezes, é oneroso e
acarreta a inviabilidade da aplicação
industrial. Para tanto, a região estru-
tural do gene de interesse pode ser
clonada sob controle do promotor do
gene da nitrato redutase, abrindo a
possibilidade para a indução do gene
por uma fonte mais acessível e ape-
nas no momento em que o indutor
estiver presente.
Uso da nitrato redutase
para detecção e isolamento
de elementos
transponíveis
Elementos transponíveis são se-
qüências de DNA que podem se
mover no genoma integrando-se
em regiões não homólogas, e que
constituem importantes agentes de
mutação e reorganização gênica,
sendo também utilizados em siste-
mas de inativação de genes. Assim,
detectar e isolar esses elementos é
um importante passo para estudos
de biologia básica e aplicada em
um organismo. Diferentes estraté-
gias são empregadas para o isola-
mento de elementos transponíveis
em fungos filamentosos. Entre es-
sas diferentes estratégias, o método
de armadilha para transposons
(“transposons trapping”) é o me-
lhor método para detecção e isola-
mento de elementos transponíveis
ativos. Esse método requer, além
de um sistema de seleção positiva
de mutantes espontâneos, que o
gene alvo esteja clonado e caracte-
rizado. Conforme discutido anteri-
ormente, um dos melhores siste-
mas para seleção positiva de
mutantes espontâneos é o sistema
nitrato redutase. Dessa maneira,
esse sistema vem sendo emprega-
do com muito sucesso para o isola-
mento de vários elementos trans-
poníveis em fungos filamentosos.
Os elementos Fot1, impala, Ant1,
Vader, Flipper e hupfer, são exem-
plos de transposons clonados pela
seleção de mutações espontâneas
no gene da nitrato redutase em
Fusarium oxysporum, Aspergillus
niger, A. fumigatus, Botrytis cinerea
e Beauveria bassiana (Daboussi et
al., 1992; Langin et al., 1995; Glayzer
et al., 1995; Amutan et al., 1996;
Levis et al., 1997b; Maurer et al.,
1997).
Para isolar esses elementos utili-
zando-se o sistema nitrato redutase,
é necessário isolar mutantes nitrato
redutase e caracterizar, por hibridiza-
ção com o gene alvo, o tipo de
mutação que originou o fenótipo
mutante. Nos mutantes isolados po-
dem ocorrer mutações de diferentes
tipos no gene da nitrato redutase,
como, por exemplo, mutações pon-
tuais, deleções ou inversões. Além
 Figura 6 - Esquema da detecção e isolamento de elementos transponíveis utilizando o gene da nitrato redutase como isca.
desses tipos, também pode ocorrer a
inserção de um fragmento de DNA,
como a inserção de um elemento
transponível. Assim, espera-se que o
resultado da hibridização apresente
algum mutante com o fragmento do
gene alvo maior quando comparado
ao tipo selvagem (Figura 6). Após a
obtenção de um mutante com a in-
serção, pode-se fazer um teste de
estabilidade plaqueando-se esporos
do mutante em meio mínimo conten-
do nitrato como única fonte de nitro-
gênio. Se a inserção for oriunda de
um transposon ativo, esse pode sal-
tar e reconstituir o fenótipo selva-
gem, apresentando maior instabili-
dade. O fragmento inserido, ou parte
dele, pode ser recuperado por meio
de bancos genômicos parciais ou de
amplificação com oligonucleotídeos
específicos e, então, seqüenciado e
caracterizado.
Mesmo que o gene da nitrato
redutase não tenha sido clonado para
uma espécie de interesse, há possibi-
lidade de usar um gene heterólogo
conforme realizado com sucesso por
Daboussi et al. (1992). Esses autores
introduziram o gene da nitrato redutase
de A. nidulans em uma linhagem
mutante para nitrato redutase de F.
oxysporum e isolaram o elemento
Fot1 inserido no gene heterólogo.
Assim, a fácil seleção de mutantes
nitrato redutase têm-se mostrado uma
ótima ferramenta no isolamento de
elementos transponíveis ativos em
diferentes espécies de fungos fila-
mentosos.
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Pesquisa
Estrutura e termoestabilização
Carla M. Y. Lemos
Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada
IBILCE - UNESP, Pós Graduação em Microbiologia
Aplicada IB/UNESP - Rio Claro-SP
Erica Fuchs
Department of Food Science and Human Nutrition
Iowa State University, IA-USA
Eleni Gomes
Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada
Departamento de Biologia
IBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP
Roberto Da Silva
Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada,
Departamento de Química e Ciências Ambientais,
IBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP
dasilva@qca.ibilce.unesp.br
Ilustrações cedidas pelos autores
86 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Glucoamilase:
Estrutura e termoestabilização de glucoamilase por técnicas moleculares
Resumo
A glucoamilase (GA) é uma
enzima hidrolítica que catalisa a libe-
ração sucessiva de β-D-glucose a par-
tir do amido e oligossacarídeos relaci-
onados. A GA catalisa eficientemente
a reação de sacarificação do amido
dentro de uma faixa estreita de tem-
peratura. A sua termoestabilidade li-
mitada afeta seu uso no processo
industrial, onde a incubação prolon-
gada em altas temperaturas é necessá-
ria. As estratégias tradicionais para
melhorar a termoestabilidade da GA
de Aspergillus, tais como a imobiliza-
ção e modificação química têm falha-
do no uso industrial. Atualmente, as
técnicas de evolução dirigida utilizan-
do a biologia molecular proporcio-
nam uma importante ferramenta para
melhorar ou mesmo criar novas pro-
priedades nas enzimas existentes, em
um curto espaço de tempo. Esta revi-
são apresenta a importância, estrutura
e função da glucoamilase e as recen-
tes estratégias da biologia molecular
como ferramenta para melhorar a ter-
moestabilidade desta enzima.
1. Glucoamilase de
Aspergillus
A glucoamilase (α-1,4-glucan
glucohidrolase, EC 3.2.1.3), também
conhecida como amiloglucosidase, é
uma enzima hidrolítica que catalisa a
quebra das ligações glicosídicas α-
1,4 a partir de uma extremidade não
redutora das moléculas de amilose
ou amilopectina do grânulo de ami-
do e oligossacarídeos relacionados
liberando β-D-glucose. Em uma ve-
locidade menor, a glucoamilase tam-
bém atua hidrolisando as ligações α-
1,6 (Fleetwood e Weigel, 1962). Su-
gere-se, portanto, que a ação da
glucoamilase ocorra através de um
mecanismo multisseriado no qual a
enzima atua aleatoriamente em toda
a molécula de substrato (James e Lee,
1997).
A glucoamilase (GA) é ampla-
mente usada na indústria alimentícia
para a produção de xaropes com alto
teor de glucose e também é empre-
gada na produção de álcool e xaro-
pes com alto teor de frutose (1989;
Brumm, 1998; Mathewson, 1998).
Vários microrganismos, plantas
e animais produzem glucoamilase.
Estas enzimas disponíveis comercial-
mente são, na sua maior parte, pro-
duzidas por linhagens dos fungos
Aspergillus e Rhizopus. Dentre estas,
a glucoamilase de Aspergillus é a
mais termoestável, apresentando a
máxima atividade em torno do pH
4,5, em temperaturas de 50 a 55°C,
mas ela é rapidamente inativada em
temperaturas próximas a 60°C
(Manjunath et al.,1983; Brumm, 1998).
A glucoamilase catalisa eficien-
temente a reação de sacarificação
dentro de um limite relativamente
estreito de temperatura, porque a
sua conformação cataliticamente ati-
va muda com o aumento da tempe-
ratura. Esta termoestabilidade limi-
tada afeta seu uso no processo in-
dustrial, onde a atuação prolongada
em altas temperaturas é necessária.
Na produção de xaropes com alto
teor de glucose, uma pasta de amido
(30-40% BS) é primeiro liquefeita a
105°C por 5 minutos e em seguida,
 DC
Figura 1. Imagem da estrutura estendida da glucoamilase de Aspergillus niger idêntica a glucoamilase de Aspergillus awamori.
No lado esquerdo o domínio catalítico (DC), ao centro o filamento ligante ou “linker” (L) e à direita o domínio de ligação ao
substrato (amido) (DLS).
http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/nte/heyde/www.public.iastate.edu/_pedro/glase/glase.html (10/10/03)
a 95°C por 2 horas, usando a a-
amilase bacteriana termoestável, em
pH 6.0-6.5. Finalmente, o amido
liquefeito é resfriado a 60°C e
hidrolisado por mais 48 a 72 horas
usando a glucoamilase (James e Lee,
1997, Brumm, 1998). Está claro que
a termoestabilidade da glucoamila-
se determina a velocidade do pro-
cesso como um todo. Trabalhar em
altas temperaturas não apenas pode
acelerar a taxa da reação e conse-
quentemente diminuir o tempo do
processo, como também pode pre-
venir a contaminação microbiológi-
ca, além de reduzir a viscosidade da
mistura de reação. Portanto, o de-
senvolvimento de uma glucoamila-
se mais termoestável poderá contri-
buir para a otimização do processo
de sacarificação do amido. Entretan-
to, o conhecimento da estrutura da
proteína e o processo de termoinati-
vação da enzima são necessários
para elaboração de prognósticos ra-
cionais e planos efetivos de experi-
mentos de estabilização da estrutura
proteica.
A glucoamilase de Aspergillus é
codificada por um único gene, mas
existem duas ou três formas variáveis
da enzima produzidas por proteólise
limitada (Svensson et al., 1986). Pazur
et al (1971) constatou que as formas
da glucoamilases de Aspergillus niger
são glicoproteinas que possuem quan-
tidades diferentes de glicosilações.
Como em outras proteínas, após a
síntese no citoplasma, a GA é trans-
portada em um estado desdobrado
através da membrana do retículo
L DLS
endoplasmático (RE). Durante o sub-
seqüente processo de dobramento,
ocorre a O-glicosilação do “linker”,
filamento que liga o domínio catalítico
(CD) ao domínio de ligação ao subs-
trato (DLS), e pontes dissulfetos são
formadas (Pryer et al, 1992; Gaut e
Hendershot, 1993). Assim, a GA, na
sua conformação nativa estendida,
assume uma forma de alteres, onde
dois domínios volumosos, o domínio
catalítico e o domínio de ligação ao
amido, estão ligados por um filamento
fino como mostra a figura 1. Esta é
uma imagem simplificada ilustrativa,
uma vez que a estrutura real da GA
completa ainda não está disponível.
A organização dos domínios da mo-
lécula tem sido deduzida através das
diferentes técnicas biofísicas e rela-
tos disponíveis (Coutinho, 1997;
Sauer, 2000).
As inúmeras proteínas desdo-
bradas, que entram no lúmem do RE,
devem ser protegidas de quaisquer
agressões e serem mantidas em um
estado de dobramento-competente.
Dobramentos ineficientes ou muta-
ções em proteínas secretadas resul-
tam em enzimas com conformação
incorreta e defeito na atividade
(Bonifacino e Klausner, 1994).
Em Aspergillus awamori, o gene
codifica uma GAI de tamanho com-
pleto contendo de 615 a 616 resíduos
de aminoácidos (figura 2), bem como
o peptídeo sinalizador de secreção
no N-terminal. O peptídeo sinalizador
é cortado após a secreção da proteí-
na pela célula. O outro maior produ-
to de proteólise da GAI (diz-se da GA
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
competente) é a GAII resultante da
perda do sítio de ligação ao substrato
localizado na extremidade C-termi-
nal. A GAII é uma mistura de
polipeptídeos de tamanhos entre 512
e 514 resíduos de aminoácidos, com
atividade catalítica normal mas sem a
habilidade para se ligar ao amido no
estado natural, não gelatinizado
(Svensson et al., 1986).
As proteínas originais de
Aspergillus niger e Aspergillus
awamori, cujas seqüências são idên-
ticas (Svensson et al., 1989; Nunberg
et al., 1984), consistem de três prin-
cipais áreas funcionais (Coutinho e
Reilly, 1994 a-b, Coutinho e Reilly,
1997): (1) o domínio catalítico, cons-
tituído dos resíduos 1 ao 440, (2) o
filamento ligante, formado pelos re-
síduo 441 ao 512, que é altamente O-
glicosilado, e (3) um domínio de
ligação ao amido no estado natural
na extremidade C-terminal, conten-
do os resíduo 513 a 616 (Svensson et
al., 1986; et al., 1989). Além da região
de O-glicosilação do “linker”, dois
outros sítios de N-glicosilação estão
localizados nos resíduos Asn 171 e
Asn 395 (Svensson et al., 1989; Aleshin
et al., 1992). Acredita-se que os resí-
duos de carboidratos desempenham
uma importante função na estabiliza-
ção da glucoamilase (Manjunath et
al.,1983, Svensson et al.,1989;
Williamson et al., 1992a). Em altas
temperaturas, a GA de A. niger, qui-
micamente desglicosilada, (Shenoy
et al., 1984) e a glucoamilase de A.
awamori, geneticamente truncada,
sem parte da região de O-glicosilação
87
 (Evans et al, 1990), deterioraram-se
mais rapidamente do que as suas
formas selvagens. Além disso, a GAII
em que falta apenas do domínio de
ligação ao substrato, tem termoesta-
bilidade similar a da GAI (Svensson
et al., 1986), enquanto que uma
glucoamilase especial (GAI’), na qual
faltam parte da região O-glicosilada e
o domínio de ligação ao amido, é
menos estável do que a sua forma
original (Hayashida et al., 1989). A
região de O-glicosilação também fa-
cilita a secreção de GA (Evans et al.,
1990).
A estrutura da GA nativa é muito
difícil de determinar em função do
alto grau de glicosilação. Aleshin et
al (1992) determinou a estrutura cris-
talina de uma GA muito próxima da
forma nativa denominada A. awamori
var. X100 (GA’) (figura 3), a qual foi
obtida por proteólise limitada com
subtilisina e apresenta os primeiros
470 resíduos de aminoácidos da pro-
teína original. Esta seqüência de ami-
noácidos da GA’ é 99,4% similar a
GAI de A. niger e A. awamori, com
uma deleção no resíduo 102 (Aleshin
et al, 1992, 1994a). Assim, o estudo
desta estrutura cristalina elucidou a
conformação do domínio catalítico
completo e a conformação da primei-
ra metade N-terminal da região O-
glicosilada da glucoamilase de
Aspergillus. A estrutura cristalina da
GA de A. awamori var. X100 mos-
trou que o domínio catalítico consis-
te de treze a-hélices que compreen-
dem cerca de 51% dos resíduos de
aminoácidos do polipeptídeo total, e
regiões menores de β filamentos
antiparalelos. Doze das α-hélices
estão arranjadas dentro de uma estru-
tura denominada barril α/α, consis-
tindo de seis α-hélices externas e seis
internas que envolvem o sítio
catalítico em forma de funil, constitu-
ído por seis segmentos α/α altamen-
te conservados (Sauer, 2000). O sítio
catalítico da GA possui uma barreira
de resíduos hidrofóbicos no centro,
os quais separam o núcleo em duas
regiões de volume morto (void), con-
tendo apenas água. Uma serve como
o sítio ativo propriamente dito e a
outra, tem uma função ainda não
conhecida (Aleshin et al., 1994a). O
sítio ativo contém Glu179 e Glu400
88 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 2. Seqüência de aminoácidos (1 letra) da GA de A. niger. Letras vermelhas: α-
helice; letras azuis: fita-β; C dentro dos retângulos: resíduos de cisteínas envolvidos
em pontes dissulfetos; N dentro dos retângulos: sitios N-glicosilados; T e S dentro dos
retângulos: sítios O-glicosilados; E dentro dos retângulos: resíduos dos aminoácidos
catalíticos glutâmico 179 e 400; seqüências sombreadas: regiões conservadas S1 a S5;
seqüência sublinhada: sitio de ligação ao substrato. Fonte: Flory, 1993.
como os dois resíduos de aminoáci- com 2 unidades de glucoses ligadas
dos catalíticos localizados no fundo N-glicosidicamente nos resíduos Asn
do sítio (Harris et al., 1993; Sauer, 171 e Asn 395, formam um cinto de
2000). A estrutura em barril α/α do glicosilações ao redor do domínio
DC da GA de A. awamori, A. niger e catalítico (Aleshin et al, 1992). Foi
de Saccharomyces fibuligera são si- sugerido que a outra parte altamente
milares, sendo que esta última apre- O-glicosilada (aminoácidos de 472 a
senta 14 α-hélices, 12 das quais estão 512) envolva o domínio catalítico
na conformação barril α/α (Sevcik et como uma continuação do resíduo
al, 1998; Sauer et al, 2000). Esta 471, fazendo com que o domínio de
conformação contrasta com a ligação ao amido fique próximo ao
topologia de organização em barril sítio ativo (Sauer et al, 2000). O
α/β encontrada em outras enzimas segmento C-terminal do “linker” con-
amilolíticas tais como α e β-amilases tém cerca de 30 aminoácidos, princi-
(Buisson et al., 1987; e Mikami et al., palmente serina e treonina, sendo,
1993) e ciclodestrina glucosiltransfe- portanto, muito O-glicosilado. A esta
rases (Klein e Schulz, 1991). Obser- parte particular do linker tem sido
vou-se uma pequena similaridade atribuída papéis na estabilidade, se-
entre a estrutura da GA e proteínas creção e na digestão do amido cru
transportadoras de glucose. Assim, a (Libby et al, 1994; Sauer et al, 2000).
organização das hélices na GA pode Embora algumas características como
ser relevante para a conformação de a compactação da conformação do
proteínas que transportam glucose barril α/α, a proteção dos carboidra-
(Aleshin et al, 1994a). tos e a região O-glicosilada, façam a
O segmento O-glicosilado está GA de Aspergillus mais estável do
numa conformação de cinto estendi- que algumas proteínas, uma maior
do em torno do barril α/α catalítico. estabilidade ainda é requerida para
Isto sugere que este segmento serve os processos industriais, como expli-
como um elo de ligação estrutural cado anteriormente.
entre o domínio catalítico e o domí- O domínio de ligação ao amido
nio de ligação. A primeira parte (ami- possui este nome por causa da sua
noácidos 441 a 471) desta região O- capacidade de se ligar ao grânulo de
glicosilada possui cerca de 10 resídu- amido nativo e permitir sua digestão
os de manoses expostos, que juntos pelo domínio catalítico (Svensson et

Figura 3. Esquema da glucoamilase (GA’) de Aspergillus awamori var. X100 (Aleshin
et al., 1992). α- hélices (H1 a H13) são simbolizadas por cilindros, sítios de O-
glicosilação são representados por hexágonos simples, e sítios de N-glicosilação são
simbolizados por cadeias de três hexágonos.
al., 1983). Este domínio parece ter a
capacidade de ligar a GA à parede da
célula isto porque tem afinidade por
α-1,4 e α-1,6 glucanos que pertencem
à parede celular. Esta afinidade au-
menta a concentração de GA próxima
da micromembrana da célula
(Neustroev et al., 1993). A GAII, na
qual faltam os resíduos 513 a 616, tem
uma habilidade semelhante a GAI
para digerir amido solúvel, mas pos-
sui uma habilidade drasticamente re-
duzida para se ligar e hidrolisar o
amido nativo (Svensson et al., 1989).
Recentemente, foi demonstrado que
o DLS isolado, atuando em grânulos
de amido juntamente com a GAII,
apresentaram um efeito sinergístico
na degradação do substrato insolúvel,
sugerindo que o domínio de ligação
ao substrato se liga ao amido como
uma porção individual e rompe a
compacta estrutura do grânulo de
amido facilitando a hidrólise pelo
domínio catalítico (Southall et al, 1999;
Sauer et al, 2000). O domínio de
ligação ao amido da GA possui uma
significante similaridade de seqüên-
cia de aminoácidos com o domínio de
ligação ao amido da ciclodextrina gli-
cosiltransferase (CGTase) (Svensson
et al., 1989). A estrutura tridimensional
da CGTase é globular, contendo de 6
a 8 fitas β (Klein e Schulz, 1991). A
estrutura do domínio de ligação ao
amido da GA revela uma estrutura
bem definida em fitas β consistindo
de um par paralelo e 6 pares
antiparalelos que formam um barril β
aberto na lateral. Dois sítios de liga-
ção para outros ligantes foram encon-
trados neste domínio, sendo cada um
no final da molécula em faces opostas
(Sorimachi et al., 1996). O mecanismo
proposto de ligação deste domínio
aos grânulos de amido, parece envol-
ver a formação de um complexo de
inclusão entre os resíduos hidrofóbicos
do domínio de ligação e os grânulos
de amido (Goto et al., 1994).
Existem quatro pontes dissulfe-
tos na GA, das quais três estão no
domínio catalítico e uma no domínio
de ligação. No domínio catalítico, as
pontes estão entre os resíduos 210 e
213 (conectando o N-terminal com o
meio da hélice 7), 262 e 270 (conten-
do um filamento β antiparalelo) e 222
e 449 (associando o trigésimo resí-
duo O-glicosilado do “cinto” com o
domínio catalítico) (Aleshin et al.,
1992). Experimentos sugerem que
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
existe uma ligação dissulfeto entre os
resíduos 509 e 604 que conecta o N-
terminal com o C-terminal do domí-
nio de ligação ao substrato (Coutinho
e Reilly, 1994 b).
Existem dois resíduos N-glicosi-
lados (Asn 171 e Asn 395) na GA, nos
arredores do sítio ativo. Em cada
caso, o N da Asn está ligado à posição
C1 do primeiro resíduo de açúcar (N-
acetil-D-glucosamina), que está liga-
do por β (1→4) ao segundo (N-
acetil-D-glucosamina) que por sua
vez se liga ao terceiro resíduo (D-
manose) (Aleshin et al., 1992). O
número total de resíduos de açúcares
para formar a cadeia glicosil ligada a
Asn 171 e Asn 395 é 5 e 8 respectiva-
mente (Aleshin et al., 1994 a). A
mutação Asn 395→ Gln que removeu
o sítio de N- glicosilação no resíduo
395, diminuiu drasticamente tanto a
secreção como a termoestabilidade,
mas não alterou a atividade específi-
ca (Chen et al., 1994 b).
Embora a GA de A. awamori
primariamente catalise a clivagem
hidrolítica de ligações a (1,4) com
liberação de β-glucose a partir de
uma extremidade não redutora da
cadeia de amido e oligossacarídeos,
ela também cliva ligações glicosídicas
a (1,6) com uma eficiência catalítica
(Kcat/ Km) por volta de 500 vezes
menor do que para as ligações a (1,4)
(Fleetwood e Weigel, 1962).
2. Termoestabilização da
Glucoamilase
2.1. Estratégias tradicionais
A modificação química e a imo-
bilização são as duas principais estra-
tégias tradicionais que têm sido ex-
ploradas para melhorar a termoesta-
bilidade da GA.
Modificação química: altera um
grupo funcional específico nas pro-
teínas, tal como um grupo carboxila,
por reação química. Embora esta
técnica tenha aumentado a estabili-
zação da a α-quimotripsina em 1000
vezes (Moshaev et al., 1988), ela
geralmente tem um rendimento ne-
gativo ou relativamente muito pe-
queno na termoestabilização da GA
(Sinitsyn et al.,1978; Munch e Tritsch,
1990).
89
 Imobilização: geralmente resul-
ta em alguma perda da atividade
enzimática (Lee et al., 1976; Svensson
e Ottesen, 1981; Lenders e Crichton,
1988), mas apesar disso, foi usada
em GA porque ela permite o proces-
so contínuo de operação. Embora
muitas GAs imobilizadas tenham
melhor estabilidade do que as formas
solúveis, elas ainda não substituíram
estas últimas no uso industrial, isto
porque as GAs imobilizadas devem
ser usadas em temperaturas operaci-
onais baixas a fim de serem preserva-
das por vários meses, e continuarem
viáveis (Lee et al., 1976). Desde que
a energia de ativação para a atividade
enzimática deva ser menor do que
para a inativação da enzima, uma
temperatura de 38 a 40°C é recomen-
dada para a GA imobilizada. Entre-
tanto, o decréscimo na temperatura
operacional resulta numa baixa taxa
de reação e em contaminação
microbiológica, que é menos facil-
mente controlado em fábricas do que
em laboratório. Lee et al., (1976)
relataram que a GA imobilizada ren-
deu xaropes com teores mais baixo
de glucose, 1,0-1,5%, e de Dextrose
Equivalente (DE), 1,0-1,5 unidades,
do que aqueles produzidos por
enzimas solúveis. Isto é atribuído a
limitação da difusão de partículas de
glucose, que resulta em um gradien-
te de concentração de glucose e,
consequentemente, leva a uma mai-
or incidência de reações reversíveis
do que se o gradiente não estivesse
presente (Lee et al., 1980). Além
disso, numa aplicação real, as altas
concentrações do substrato estabili-
zam tão bem a GA que o aumento da
termoestabilização proporcionado
pela imobilização torna-se relativa-
mente insignificante (Klesov e
Gerasimas, 1979).
2.2. Estratégias
moleculares (Evolução
Dirigida de Enzimas)
O advento da engenharia de
proteínas, empregando técnicas de
biologia molecular, proporcionou
novas estratégias para a termoestabi-
lização de enzimas. O gene da GA de
A. awamori foi clonado e expressado
em Saccharomyces cerevisiae (Innis
90 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
et al., 1985) e em Pichia pastoris
(Fierobe et al. 1997), o que permitiu
o emprego da manipulação genética
como uma maneira de modificar a
enzima para melhorar suas proprie-
dades catalíticas ou físicas.
Estas estratégias para criar novas
ou melhoradas propriedades em
enzimas, atualmente podem ser sepa-
radas em duas estratégias comple-
mentares 1) desenho racional e 2)
evolução dirigida. O desenho racio-
nal de proteínas é baseado no conhe-
cimento detalhado da seqüência pri-
maria, estrutura, função e mecanismo
de catálise. Através destes conheci-
mentos, alterações são introduzidas,
principalmente, por mutação sitio
dirigida, como será discutido abaixo.
A evolução dirigida, (Zhang, 1997)
não exige conhecimento da relação
estrutura-função da enzima. A evolu-
ção dirigida é também chamada de
biotecnologia evolutiva (Arnold e
Volkov, 1999; Reetz e Jaeger, 1999;
Sutherland,2000). O termo evolução
dirigida subtende uma série de expe-
rimentos que reproduzem, de forma
acelerada e em tubos de ensaios, a
evolução da diversidade natural e
adaptação ambiental. Mutações e
recombinações são feitas dando ao
processo uma direção no sentido de
atingir a otimização de uma proprie-
dade específica (Lehman e Wyss,
2001). Muitas pistas de como melho-
rar enzimas vêm dos estudos de como
as enzimas evoluem na natureza. As-
sim, esta poderosa técnica objetiva
otimizar o processo de melhoramento
das enzimas utilizando mecanismos
envolvidos na evolução natural (mu-
tação, recombinação e seleção natu-
ral). Entretanto, a evolução dirigida
difere do processo natural no sentido
em que são os pesquisadores que
definem as propriedades a serem
otimizadas e o processo biotecnológi-
co acontece em um período curto de
tempo (semanas ou meses) (Reetz,
1999).
Num experimento de evolução
dirigida, primeiramente é induzida
uma alteração no DNA visando uma
resposta específica. Isto resulta em
uma biblioteca de populações com
diferentes graus de possíveis respos-
tas, incluindo ou não a resposta espe-
rada. O próximo passo é encontrar
dentre as milhões de possibilidades,
a solução ou as soluções corretas, ou
seja, a enzima que exibe a proprieda-
de desejada (Arnold, 1996).
Em suma, este processo consiste
na combinação de técnicas da biolo-
gia molecular apropriadas para a
mutação e expressão do gene,
acopladas a um eficiente e rápido
sistema de seleção. (Reetz e Jaeger,
2000). A idéia é partir de uma enzima
selvagem, realizar a mutagênese no
gene que codifica a enzima e seleci-
onar os melhores mutantes de acor-
do com a característica fenotípica
desejada (Zhang, 1997). Após a sele-
ção dos mutantes, segue-se novos
ciclos de mutações buscando melho-
res mutantes.
Quando a taxa de mutação, ta-
manho da biblioteca e o processo de
seleção são adequados, o fenótipo
desejado de uma enzima geralmente
aumenta a cada ciclo de mutações
(Zhang, 1997).
Existe um grande número de
diferentes estratégias de mutagênese
para criar diversidade de seqüências,
tais como a mutação pontual ao aca-
so por PCR mutagênico (error-prone
PCR), e o embaralhamento de DNA
(DNA shuffling). Combinações des-
tas técnicas também vêm sendo utili-
zadas. Tais estratégias serão discuti-
das a seguir:
2.2.1 Mutação Sítio Dirigida
(MSD)
É uma poderosa técnica na qual
apenas um ou poucos aminoácidos
específicos são substituídos por ou-
tros aminoácidos, por alteração nos
correspondentes nucleotídeos no
gene codificador da proteína. Quan-
do realizada com sucesso, ela tem a
vantagem de melhorar a característi-
ca desejada da enzima sem afetar
outras propriedades e até mesmo de
criar mutantes carregando várias ca-
racterísticas melhoradas.
Nesta ferramenta, as mudanças
precisas, efetuadas na seqüência dos
aminoácidos, são baseadas no conhe-
cimento detalhado da estrutura da
proteína, função e mecanismo (Chen,
1999). Por exemplo, um resíduo par-
ticular de aminoácido pode ser iden-
tificado como sendo importante para
a atividade catalítica da enzima (Reetz,
1999), sendo assim, uma substituição
individual deste aminoácido poderia
provocar mudanças na estrutura se-
cundária resultando em enzimas com
características desejáveis (Chen, 1999).
Entretanto, seria impossível predizer
qual dos 19 aminoácidos remanes-
centes seria o melhor alvo para a
mutação que resultaria em subsequen-
te melhoria da propriedade procurada
(Reetz, 1999). Muitas tentativas para
alterar especificamente algumas das
propriedades das enzimas através
desta técnica falharam, isto porque a
introdução de aminoácidos substitu-
tos têm efeitos inesperados na estru-
tura e função da enzima. (Kikuchi,
1999). Além disso, tem sido observa-
do que em muitos estudos de muta-
ção sítio dirigida, o aumento da ter-
moestabilidade está vinculada ao de-
créscimo da atividade catalítica (Carrea
e Colombo, 2000). As falhas também
podem ser porque este processo re-
quer conhecimento de detalhes da
estrutura tridimensional da enzima,
de seu mecanismo de catálise, bem
como um certo grau de intuição na
escolha do aminoácido a ser substitu-
ído (Reetz, 1997). Em muitos casos,
estas substituições foram feitas sem
levar em consideração as proprieda-
des estruturais da proteína (Chen, 1999).
2.2.2. PCR mutagênico (Error-
prone PCR):
A introdução de mutações atra-
vés desta técnica envolve uma modi-
ficação no protocolo de PCR (Jaeger
e Reetz, 2000). Uma reação de PCR é
normalmente realizada de modo a
amplificar qualquer dado DNA com
alta fidelidade. A atividade de corre-
ção de erro 3’ → 5’ da DNA polime-
rase assegura que a amplificação do
DNA siga de maneira precisa. Ocasi-
onalmente, nucleotídeos errados são
incorporados durante a amplificação
levando a mutações com uma fre-
qüência de 0,1 a 2x 10 -4 por
nucleotídeo para a DNA polimerase
termoestável do Thermus aquaticus
(Taq polimerase). Esta baixa taxa de
erro pode ser aumentada para 7x 10-3
por nucleotídeo através de um ou
mais dos seguintes procedimentos:
aumento da concentração de MgCl2,
adição de MnCl2, aumento na con-
centração de dCTP e dTTP e aumento
na quantidade taq polimerase. Para o
propósito de evolução dirigida de
enzima, estas condições devem ser
modificadas a fim de se obter uma
taxa média de 1 a 2 nucleotídeos
mutados por gene, levando a uma
mudança média de 1 aminoácido por
enzima mutante (Reetz, 1999). A van-
tagem de tal processo é que pode ser
realizado rapidamente envolvendo
qualquer proteína, mesmo sem o
conhecimento preciso de sua estru-
tura (Zhang et al, 1997 e Jaeger e
Reetz, 2000).
2.2.3. Embaralhamento de DNA
(DNA shuffling)
Este poderoso processo de evo-
lução dirigida, que gera diversidade
por recombinação, é baseado na com-
binação de mutações úteis de genes
individuais. Bibliotecas de genes qui-
méricos podem ser geradas por frag-
mentação aleatória de um gene, se-
guido por recombinação dos frag-
mentos em uma reação de PCR
(Crameri, 1998).
O embaralhamento de DNA
combinado com uma seleção para a
atividade pode acelerar a evolução
dirigida das características deseja-
das. Nesta técnica, a diversidade é
introduzida a partir de uma bibliote-
ca de mutações pontuais aleatórias
(Christians et al, 1999). Os genes
selecionados podem ser submetidos
a mais ciclos de mutações (reemba-
ralhamento) e melhorar ainda mais a
sua mutação benéfica original
(Stemmer, 1994a) simulando de for-
ma acelerada, o processo natural de
recombinação sexual (Christians et
al, 1999).
A técnica consiste basicamente
na fragmentação de um gene com
diferentes mutações pontuais por
DNAse I. A recombinação dos frag-
mentos aleatoriamente resulta em
moldes trocados e recombinados. Um
gene recombinante contendo 4
“crossovers” pode ser selecionado da
biblioteca de recombinantes basea-
do na função melhorada. O conjunto
selecionado promove o ponto de
partida para outro ciclo de mutações
e recombinações. Este processo iso-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
lado causa um baixo número de
mutações pontuais, mas se for dese-
jado, mutações adicionais podem ser
incorporadas por PCR mutagênico
ou mutagênese por UV no “pool” de
genes (Stemmer, 1994a).
A técnica de embaralhamento
pode ser realizada com mutantes do
mesmo gene e também com genes
homólogos de diferentes espécies
(family shuffling) (Reetz e Jaeger,
1999). Esta recente adaptação permi-
te que duas ou mais seqüências que
ocorram naturalmente sejam usadas
como material genético iniciador.
Neste método, genes similares são
misturados, fragmentados aleatoria-
mente e recombinados sob condi-
ções que permitam o anelamento e a
extensão de fitas complementares
não idênticas (Christians et al, 1999).
A recombinação que ocorre nesta
técnica é causada pela incorporação
de um fragmento derivado de uma
seqüência dentro de outra, baseado
na homologia.
Análises evolutivas de famílias
de enzimas sugerem que mudanças
drásticas na função da enzima exi-
gem uma considerável mudança na
seqüência de aminoácidos de um
polipeptídeo. Tais mudanças prova-
velmente não ocorrem durante o pro-
cesso de evolução in vitro, no qual as
enzimas são principalmente melho-
radas por mutações de ponto com
uma tendência a transições e
transversões limitando o acesso a um
amplo espectro de substituições. Em
contraste, a mutação natural, tipica-
mente resultante de recombinação
sexual ou homóloga, gera deleções,
inserções, duplicações ou fusões.
Neste último processo, tais muta-
ções alteram o espaçamento entre
os resíduos de aminoácidos e seg-
mentos de cadeias de polipeptídeos
e pode resultar em mudanças na
especificidade e novas atividades
catalíticas (Chen, 2001).
“Screening” e Seleção: Grandes
bibliotecas de mais de 1010 genes
mutantes podem facilmente ser cri-
adas usando as técnicas acima. Por-
tanto, o desenvolvimento de um
sistema apropriado de seleção é de
importância chave no processo de
evolução dirigida de enzimas (Reetz,
1999). Seleções efetivas, nas quais
91
 apenas aqueles clones carregando a
característica desejada sobrevivam
ou cresçam mais rápido são raras
(Arnold e Volkov, 1999). No caso do
emprego de vetores (plasmídios), o
“screening” é feito para obter os
mutantes que incorporaram o vetor
contendo o gene desejado. O vetor
geralmente carrega um gene para
resistência a algum antibiótico, por
isso utiliza-se o plaqueamento das
linhagens submetidas ao processo
de mutagênese em um meio conten-
do o antibiótico. As colônias que
crescerem neste meio, certamente
incorporaram o vetor e podem ser
escolhidas para a próxima etapa. Em
outros casos, a mutação positiva
resulta em reparo de algum defeito
que poderá ser usado como ferra-
menta para a seleção. Por exemplo,
a recuperação da habilidade de pro-
dução de enzimas formadoras de
halos na placa de seleção. A etapa
seguinte é a escolha de colônias que
tenham a característica desejada, por
exemplo, o aumento na termoesta-
bilidade enzimática. Assim, as
enzimas das colônias positivas no
“screening” serão submetidas a tes-
tes de termoinativação a fim de se
isolar as colônias produtoras de
enzimas termoestáveis.
2.3. Enzimas
termoestabilizadas por
estratégias moleculares
Akanuma et al (1998) introduzi-
ram o gene leuB (que codifica para a
3-isopropilmalato desidrogenase en-
volvida na biossíntese de leucina) no
microrganismo termofílico Thermus
thermophilus usando técnicas de evo-
lução dirigida de enzimas. Após mu-
tação no gene da enzima, eles obtive-
ram uma variante termoestável. A
estabilidade térmica da enzima
mutante foi 10°C acima da observada
na enzima selvagem.
A técnica da evolução dirigida
foi aplicada à kanamicina nucleoti-
diltransferase (KNTase), uma enzima
que confere resistência ao antibióti-
co kanamicina. Variantes desta
enzima apresentaram resistência a
kanamicina a uma temperatura de
63°C e foram produzidas por dois
ciclos seguidos de mutações resul-
92 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
tando em duas substituições de ami-
noácidos (Reetz e Jaeger, 1999).
Kikuchi et al (1999) aplicaram
esta técnica nos genes xylE e nahH
que codificam para a enzima catecol
2,3-dioxigenase. Mais de 2000 clones
híbridos foram criados e posterior-
mente selecionados para estabilida-
de térmica. A melhor enzima quimé-
rica selecionada foi testada a 50°C e
a vida média foi de 70 min, muito
maior do que a enzima codificada
pelos genes selvagens xylE (2,7min)
e nahH (5,4min).
Yang et al (2000) criaram um
mutante para o gene da subtilisina E
através da técnica de PCR mutagênico.
Análises do seqüenciamento revela-
ram apenas uma substituição (A→G).
O tempo de vida médio da atividade
da enzima mutante, quando encubada
a 65°C, foi de aproximadamente 80
min enquanto que uma outra linha-
gem mutante (mutante original usado
no PCR mutagênico) e a linhagem
selvagem apresentaram um tempo de
13 e 15 min respectivamente.
Miyazaki et al (2000) usaram a
técnica de embaralhamento de DNA
em uma subtilisina S41 psicrofílica
com o objetivo de aumentar sua ter-
moestabilidade e atividade. Após a
terceira geração de bibliotecas cria-
das por PCR mutagênico, três varian-
tes termoestáveis foram identifica-
das. Das três, uma enzima mutante
em particular teve a maior atividade
residual após incubação a 70°C. Esta
subtilisina S41 variante contém 7 subs-
tituições de aminoácidos, todas con-
tribuindo para o aumento da sua
termoestabilidade.
A temperatura ótima da lipase
foi aumentada em até 15°C através
da mutagênese aleatórea utilizando a
técnica de PCR com tendência ao
erro (Kohno et al, 2001).
Utilizando-se da técnica de em-
baralhamento de DNA Hayashi et al.
(2001), obtiveram quimeras de β-
glucosidase com a termoestabilidade
aumentada em até 16°C quando com-
paradas com a enzima original.
A evolução dirigida foi também
usada para melhorar a termoestabi-
lidade da galactose oxidase (Sun et
al, 2001). Foi observado que as
enzimas mutantes obtidas, manti-
nham a atividade enzimática e a
especificidade pelo substrato seme-
lhantes às da enzima selvagem, en-
tretanto, a termoestabilidade foi au-
mentada. O T50 (temperatura na qual
as enzimas perdem 50% da sua ativi-
dade) foi aumentado para 67°C para
os dois mutantes mais termoestáveis
enquanto que a selvagem não ultra-
passou 63°C.
Experimentos com a GA usam
na sua grande maioria a MSD como
ferramenta para a obtenção de carac-
terísticas desejadas melhoradas, uma
boa revisão neste assunto foi apre-
sentada por Ford (1999). Várias abor-
dagens preconizadas para estabiliza-
ção podem ser acessadas pela MSD,
como por exemplo, as substituições
dos resíduos flexíveis de glicina em
α-helices, substituições de seqüênci-
as susceptíveis a desamidação e que-
bra Asn-Gly, alterações em ligações
frágeis como Asp-X, introdução de
prolina que reduz o número de con-
formações no estado desdobrado,
acréscimo cisteínas para aumentar o
número de pontes dissulfetos, além
de combinações destas abordagens
em mutantes múltiplos etc. (Ford,
1999; Sauer, 2000).
Libby et al (1994) testaram o
efeito de deleções de aminoácidos
na região O-glicosilada da GA de
Aspergillus awamori. Foram feitas
deleções para remover os resíduos
de 466 a 512 (GAI), de 485 a 512
(GAII) e de 466 a 483 (GAIII). Anali-
sando as frações intracelulares e
extracelulares, observou-se que a
região deletada da GAIII afetou a
secreção enquanto que a deleção da
GAII contribuiu para a produção e
uma estrutura estável da proteína.
Para todos os mutantes foram encon-
tradas atividades catalíticas similares
à selvagem indicando que as deleções
não afetaram o sítio catalítico.
Chen et al. (1994) substituíram
a seqüência susceptível a desamida-
ção, Asn182-Gly, por Ala182-Gly, o
que resultou em decréscimo de 2,5
vezes na taxa de termoinativação a
60 e 65°C.
O efeito da substituição de resí-
duos flexíveis de glicina por alanina
em quatro diferentes α-hélices na GA
de Aspergillus awamori foram estu-
dados (Chen et al, 1996). Substitui-
ções simples de Gly137 e Gly139 e
no mutante múltiplo contendo ambas
as mutações estabilizaram a GA con-
tra a termoinativação irreversível.
Com o objetivo de estudar o
papel das regiões conservadas na GA
de Aspergillus awamori, Sierks et al
(1993) realizaram substituições nos
resíduos de Leu177, Trp178 e Asn182
por His, Arg e Ala, respectivamente.
Quando se substituiu Leu177 por His
houve um grande aumento na ener-
gia de ativação para substratos com
ligação α(1→4) e α(1→6); na substi-
tuição Trp178 por Arg, a energia
aumentou para substratos com liga-
ções α(1→6), mas não para α(1→4).
Estas substituições indicaram que os
resíduos de aminoácidos Leu177 e
Trp178 estão localizados no subsítio
1 e 2 respectivamente. Por outro
lado, a substituição Asn182 por His
não alterou os valores de energia de
ativação para nenhum tipo de liga-
ção do substrato, sugerindo que este
resíduo não é crucial para o mecanis-
mo catalítico da GA.
Fiorobe et al. (1996) substitui-
ram Ala246 por Cys, criando mais
uma ponte dissulfeto entre este resí-
duo e o resíduo Cys320. O mutante
apresentou maior atividade residual
e atividade catalítica por 15 minutos
comparado a linhagem selvagem.
Fiorobe et al. (1998) produziram um
mutante substituindo o Glu 400 por
Cys. A atividade do mutante, após
oxidação da cisteina para acido
cisteinosulfínico, elevou a atividade
do mutante para 160% em relação a
linhagem selvagem. Entretanto, não
houve ganho de termoestabilidade.
Uma ponte dissulfeto foi criada
substituindo Asn20 e Ala27 por Cys
na GA de Aspergillus awamori e
observou-se um aumento na termo-
estabilidade de 1,2 kJ/mol a 65°C (Li
et al, 1998).
Mutantes contendo prolina em
substituição a vários aminoácidos fo-
ram estudados por Allen et al. (1998).
O maior sucesso com mutação sim-
ples foi obtido no mutante Ser30→Pro,
resultando em um aumento da ener-
gia livre de termoinativação de 1,6 kJ/
mol a 65°C. Os autores ainda combi-
naram diferentes mutações termoes-
táveis e obtiveram um triplo mutante
contendo Gly137→Ala, Ser30→Pro e
Asn20→Cys/Ala27→Cys que apresen-
tou aumento cumulativo de termoes-
tabilidade de 4,4 kJ/mol.
Estes experimentos, embora te-
nham como objetivo principal a me-
lhora em propriedades da enzima,
paralelamente desempenham um pa-
pel de extrema importância, o de
elucidar as funções de inúmeros seg-
mentos da cadeia polipeptídica da
proteína.
3. Conclusão e
perspectivas futuras
As técnicas de evolução dirigida
disponíveis, associadas a considera-
ções teóricas e às várias experiências
relatadas de sucesso ou não, disponí-
veis na literatura, têm levado a uma
crescente seleção de mutações bem
sucedidas para termoestabilização da
GA. Todavia, este sucesso ainda não
refletiu significativamente na produ-
ção de enzima industrialmente satis-
fatória, deixando o campo ainda aber-
to para novas experiências.
Os organismos atualmente dis-
poníveis para clonagem e expressão
da GA são mesofílicos, criando difi-
culdades para a seleção de enzimas
mais termoestáveis. Além disso as
linhagens de E. coli utilizadas são
deficientes em glicosilação e forma-
ção de pontes dissulfetos, essenciais
para a GA ativa. Pesquisas com
bacterias termofílicas e/ou bacterias
competentes para a clonagem e ex-
pressão da GA estruturalmente ativa,
podem ser alternativas viáveis para
reduzir tempo e manipulação.
A maior parte das informações
sobre seqüências de GA são dos
fungos mesofílicos, A. niger e A.
awamori. Informações de seqüênci-
as de GAs termoestáveis, seriam im-
portantes para orientação racional de
desenhos de experimentos de evolu-
ção dirigida. Entretanto, poucas GAs
termoestáveis de fungos termofílicos
foram relatadas. Dentre estes estão
Humicola grisea var. thermoidea
(Tosi et al. 1993), Aspergillus
fumigatus (Brandani e Peralta, 1998)
e Thermomyces lanuginosus (Li et al
1998). Informações sobre seqüências
genéticas são ainda mais raras. A
procura por novas fontes de GAs
termoestáveis, bem como informa-
ções sobre a proteína e seu gene
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
codificador são um campo aberto e
com enormes perspectivas futuras.
Bibliografia
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 Marcadores Moleculares
no Melhoramento Genético
Pesquisa
de Araucária
Valdir Marcos Stefenon
Biólogo – Mestre em Biotecnologia
Depto. de Ciências Biológicas e da Saúde – UNIPLAC
gene_mol@hotmail.com
Rubens Onofre Nodari
Eng. Agrônomo – Doutor em Genética
Departamento de Fitotecnia – CCA – UFSC
Ilustrações cedidas pelos autores
Caracterização da diversidade genética em Araucaria angustifolia
Introdução
A exploração florestal foi uma
importante alavanca para o desenvol-
vimento econômico do Sul do Brasil
desde o início do século XX, com
intensidade crescente nas décadas de
1950 a 1970 (Guerra et al., 2002).
A principal espécie explorada nes-
se ciclo foi a Araucaria angustifolia
(Bert.) O. Ktze., única representante
da Família Araucariaceae no Brasil e
principal espécie que compõe a flo-
resta ombrófila mista ou mata de
araucária (Guerra et al., 2002). No
Brasil, a distribuição natural dessa
espécie se dá em amplas áreas nos
estados do Rio Grande do Sul, Santa
Catarina e Paraná, e em alguns pontos
mais elevados de São Paulo, Rio de
Janeiro e Minas Gerais (Reitz e Klein,
1966).
Todavia, a alta qualidade de sua
madeira para os mais diversos fins,
desde a construção civil até a produ-
ção de celulose e de papel, fez com
que essa espécie fosse exaustivamente
explorada, tendo como conseqüência
uma drástica redução das grandes re-
servas de A. angustifolia no sul do país.
Além dessa exploração desor-
dena-da, o avanço das fronteiras agrí-
colas foi outro fator responsável pela
redução das populações naturais des-
sa importante espécie florestal.
Em função desses acontecimen-
tos, a araucária encontra-se hoje na
Lista Oficial de Flora Ameaçada de
Extinção (IBAMA, 2002) e os rema-
nescentes de floresta ombrófila mista
estão reduzidos a fragmentos isolados
de diversos tamanhos.
Em alguns desses fragmentos, es-
tima-se que grande parte da diversida-
de genética tenha sido perdida (Schögl,
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
2000; Auler et al., 2002), fato que
inviabiliza a regeneração natural da
espécie, devido à endogamia acentu-
ada e à redução do fluxo gênico entre
suas populações.
Nos últimos anos, diversas dis-
cussões a respeito desse tema vêm
apontando para a necessidade de se
desenvolver o melhoramento genéti-
co dessa conífera, com vista a regene-
rar a Floresta de Araucária e discipli-
nar os plantios com finalidade lucra-
tiva, seja pela exploração da madeira,
seja pela venda das sementes comes-
tíveis ou de outros subprodutos.
Entretanto, antes de os progra-
mas de melhoramento genético serem
implementados, é necessário que se
conheça a diversidade genética exis-
tente entre as populações remanes-
centes e dentro delas. Esses estudos
são importantes para que se interprete
o efeito da fragmentação dos rema-
nescentes sobre a estrutura genética
das populações: informação essencial
para o planejamento de programas de
melhoramento.
Esse conhecimento, além de re-
duzido, tem sido produzido basica-
mente a partir de marcadores morfo-
lógicos (Shimizu e Higas, 1980;
Monteiro e Spelz, 1980; Kageyama e
Jacob, 1980) e isoenzimas (Shimizu et
al., 2000; Auler et al., 2002; Mantovani
et al., 2002).
Considerando a utilização de mar-
cadores RAPD (Williams et al., 1990;
Welsh e McClelland, 1990) e AFLP
(Vos et al., 1995) para estudos genéti-
cos em diversas espécies florestais, o
objetivo deste estudo foi determinar a
capacidade informativa desses marca-
dores para a caracterização da diver-
sidade genética de populações natu-
rais de A. angustifolia.
95
 Material e Métodos:
Material vegetal e
Extração de DNA
O material vegetal utilizado neste
estudo foi composto por amostras foliares
de trinta indivíduos adultos de uma
população natural do Parque Ecológico
Municipal de Lages, Estado de Santa
Catarina, coletados e acondicionados
em sacos plásticos que continham sílica
gel. Inicialmente, foram testados sete
protocolos para extração de DNA vege-
tal com base na utilização do detergente
CTAB. Com esses testes, chegou-se à
conclusão de que era necessário otimizar
um protocolo específico para a espécie,
a fim de eliminar os compostos contami-
nantes do DNA presentes nas folhas de
araucária (principalmente proteínas e
polifenóis) e a fim de evitar a liofilização
do material vegetal.
Aproximadamente 150 mg de fo-
lhas foram congeladas em nitrogênio
líquido e maceradas completamente em
gral de porcelana. Ao pó resultante,
acrescentou-se 1,5 mL de tampão de
extração [CTAB 2%; NaCl 1,5 M; EDTA 20
mM; Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM; PVP 2%;
2-mercaptoetanol 1%]. O material foi
transferido para tubos eppendorf de 2 mL
e mantido em banho-maria (60°C) por 40
min. A cada 15 minutos, o material foi
homogeneizado por inversão. Após essa
etapa, o material foi deixado sobre a
bancada até alcançar a temperatura am-
biente, quando lhe foram acrescidos, em
cada tubo, 600 µL de CIA [clorofórmio:
álcool isoamílico 24:1]. O material foi
homogeneizado durante três minutos,
por inversão, e centrifugado a 13.000
RPM, por 5 min. A porção aquosa que
continha o DNA foi transferida para dois
novos tubos e foram acrescidos a ela 5 µL
de RNAse A (10 µg/mL). Após 40 min, a
34°C, realizou-se uma segunda extração
orgânica com CIA. Após a centrifugação
(13.000 RPM, por 5 min), a porção
aquosa foi transferida para novos tubos,
aos quais adicionaram-se 50 µL de solu-
ção de CTAB 10% [CTAB 10%; NaCl 1,4
M], a 60°C. Após a homogeneização,
realizou-se uma terceira extração orgâni-
ca com CIA. A porção aquosa foi
transferida para novos tubos e o DNA foi
precipitado pela adição de 2/3 do volu-
me de álcool isopropílico gelado(-20°C).
O material foi mantido por 30 min a -
20°C e, posteriormente, centrifugado a
7.000 RPM, por 5 min . O álcool
isopropílico foi descartado e o DNA
96 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 1: Polimorfismo revelado em marcadores RAPD em A. angustifolia, entre os trinta
indivíduos da população do Parque Ecológico Municipal de Lages, utilizando o iniciador
OPA04. Linhas 1 a 30: indivíduos da população. M= marcador de peso molecular 1kb.
desidratado novamente com 1 mL de
álcool etílico 95%. O material permane-
ceu por 10min a -20°C e centrifugado a
8.000 RPM, por 5 min. O álcool etílico foi
descartado e deixou-se o precipitado
secar a temperatura ambiente. O DNA foi
diluído em 100 µL de TE, a temperatura
ambiente, por um período de 12 a 16
horas, e armazenado a -20°C.
A concentração de DNA foi de-
terminada pela comparação com quan-
tidades conhecidas de DNA de fago
lambda (20, 50, 100 e 200 ng/µL), após
eletroforese em gel de 0,8% de agarose,
corado com solução de 0,02% de
brometo de etídio. A leitura espectro-
fotométrica da razão OD260/OD280
foi utilizada para determinar a pureza
das amostras frente à contaminação
por proteínas.
Reações RAPD
Para reações RAPD, foram utiliza-
dos seis iniciadores comercializados
pela Operon Technologies ® (OPA04,
OPA09, OPA17, OPC06, OPF16,
OPAN15). O coquetel da reação cons-
tou de tampão de PCR 1X, 3,8 mM de
MgCl2, 0,4 mM de dNTPs, 0,4 µM de
iniciadores, 1 U de Taq DNA polimerase
e 1,5 ng/ µL de DNA. As reações de PCR
foram desenvolvidas em termociclador
PTC-100 (MJ Research Inc.) em um
volume de 13 µL. O programa utilizado
foi composto de uma etapa inicial de
desnaturação (4 min. a 92°C), seguida
de 35 ciclos de amplificação (45 s. a
92°C; 45 s. a 35°C; 1 min e 15 s. a 72°C),
e terminada com uma etapa final de
elongação das cadeias de DNA (3 min a
72°C). Os produtos amplificados foram
separados por eletroforese horizontal
submersa em tampão TBE 1X, em gel de
1,5% de agarose, corado com solução
de 0,02% de brometo de etídio. As
bandas foram visualizadas sob luz ultra-
violeta e os géis fotografados com filme
Polaroid preto e branco.
Reações AFLP
Sete combinações de iniciadores
para reações AFLP foram selecionadas
aleatoriamente no kit AFLP ® Analysis
System I / Life Technologies ® (E-
ACG+M-CAC, E-ACT+M-CAA, E-
ACA+M-CTT, E-ACG+M-CAG, E-
AAG+M-CTG, E-ACC+M-CAT e E-
ACC+M-CAC) e as reações foram desen-
volvidas de acordo com o protocolo de
Vos et al. (1995), com pequenas modi-
ficações. Inicialmente, realizou-se a res-
trição do DNA com as enzimas EcoRI e
MseI, durante duas horas, a 36°C. A
ligação dos oligonucleotídeos adapta-
dores foi realizada por 2 horas, a 20°C,
em um volume de 25 µL. Na etapa
seguinte (pré-amplificação), o DNA foi
amplificado com a utilização de inicia-
dores com uma base seletiva (EcoRI-A e
MseI-C). O DNA pré-amplificado foi
diluído em uma razão de 1:25 e ampli-
ficado novamente, utilizando-se inicia-
dores com três bases seletivas (EcoRI-
ANN e MseI-CNN). As etapas de restri-
ção enzimática, de ligação dos adapta-
dores e de amplificações foram realiza-
das em termociclador PTC-100 (MJ
Research Inc.). Os produtos amplifica-
dos foram separados por eletroforese
vertical em tampão TBE 1X, em gel de
6% de poliacrilamida. As bandas foram
visualizadas após coloração com nitrato
de prata.
Para a coloração, os géis foram
fixados com solução de 0,5% de ácido
acético + 5% de etanol, por 10 min., e
com solução de 1% de ácido nítrico,
por três minutos. Posteriormente, fo-
ram impregnados com solução de ni-
trato de prata 0,2%, durante trinta mi-
nutos. Após esse tempo, uma solução
de 3% de carbonato de sódio + 0,2% de
formaldeído foi utilizada para a revela-
ção das bandas, durante o tempo ne-
cessário. As revelações foram finaliza-
das com a utilização de uma solução
de 5% de ácido acético. Após cada
etapa, os géis foram lavados durante 20
segundos com água destilada. Todos
os tratamentos foram realizados sob
leve agitação. Após a secagem dos géis
em temperatura ambiente, as bandas
foram visualizadas sob luz branca e os
géis fotografados com máquina digital.

Caracterização da
Diversidade Genética e
Capacidade Informativa
Os índices de diversidade esti-
mados foram: a similaridade genética,
o número médio de bandas, a porcen-
tagem de bandas polimórficas e a
diversidade genética. Os padrões de
bandas obtidos com os marcadores
RAPD e AFLP foram analisados e para
eles construiu-se uma matriz binária,
que identificava sua presença ou sua
ausência, codificadas por 1 ou 0, res-
pectivamente. A partir dessa matriz
de dados, com o auxílio do software
NTSYS-pc 2.02 (Rohlf, 1990), foi de-
terminado o índice de similaridade
genética de Jaccard entre os indivídu-
os e pelo método de agrupamento
UPGMA (método das médias das dis-
tâncias), foram gerados, separadamen-
te e de maneira agrupada, os
dendrogramas para marcadores RAPD
e AFLP. Para determinação da diversi-
dade genética, foi utilizado o índice
de Shannon, dado pela fórmula H= -
Σ pi ln(pi), onde pi corresponde à
freqüência de cada alelo (Lewontin,
Figura 2: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo
índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal
de Lages, gerado a partir de 18 marcadores RAPD (r=0,83).
1970). Como ambos os marcadores Resultados e Discussão:
apresentam característica dominante,
considerou-se cada banda amplificada A partir dos seis iniciadores utili-
como sendo um loco com dois alelos, zados para as reações RAPD, foram
presente ou ausente no gel. obtidos dezoito marcadores polimórfi-
Para determinar a capacidade in- cos, de um total de 62 bandas
formativa dos marcadores RAPD e amplificadas, com uma média de 11,16
AFLP, foram utilizados para a compa- bandas amplificadas por iniciador. A
ração dados gerados a partir de mar- média de bandas polimórficas foi de
cadores isoenzimáticos (Auler et al., 3,0 por iniciador, com uma porcenta-
2002) e PCR-RFLP (Schögl, 2000) pro- gem média de 26,9%. O índice de
venientes da mesma população. Devi- diversidade de Shannon foi igual a 0,53
do à diferente natureza dos marcado- (Tabela 1). A figura 1 apresenta o
res, o índice de diversidade de padrão de bandas obtido com o inici-
Shannon foi determinado para todos ador OPA04, para reações RAPD.
os dados e usado como parâmetro de As sete combinações emprega-
comparação. das para as reações AFLP revelaram 62

Tab ela 1: In iciad o res u tilizad o s n as reaçõ es R A P D e respectivo s ín d ices d e d iversid ad e gen ética para a
po pu lação d e A . an gu stifo lia d o P arq u e E co ló gico Mu n icipal d e Lages.
Nú mero to tal Ban d as po lifó rmicas Ín d ice d e
In iciad o res
d e b an d as Qu an tid ad e % d iversid ad e (H)
OPA4 12 03 25,0% 0,58
OPA9 13 02 15,4% 0,59
OPA17 06 01 16,7% 0,58
OPC6 09 03 33,3% 0,52
OPF16 13 05 38,5% 0,56
OPAN15 09 04 44,4% 0,43
Méd ias para marcad o res R A P D 11,16 3,0 26,9 % 0,53
Tab ela 2: C o mb in açõ es d e in iciad o res u tilizad o s n as reaçõ es A FLP e respectivo s ín d ices d e d iversid ad e
gen ética para a po pu lação d e A . an gu stifo lia d o P arq u e E co ló gico Mu n icipal d e Lages.
Nú mero to tal Ban d as po limó rficas Ín d ice d e
In iciad o res d e b an d as d iversid ad e (H)
Qu an tid ad e %
E-AGC + M-CAC 90 4 4,4% 0,65
E-ACT + M-CAA 100 10 10,0% 0,45
E-ACA + M-CTT 60 3 5,0% 0,68
E-ACG + M-CAG 100 21 21,0% 0,55
E-AAG + M-CTG 80 6 7,5% 0,56
E-ACC + M-CAT 105 7 6,6% 0,55
E-ACC + M-CAC 90 11 12,2% 0,50
Méd ias para marcad o res A FLP 89,3 8,8 9,8% 0,54

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 97

 marcadores polimórficos, em um total
de 625 bandas amplificadas. A média
de bandas totais amplificadas foi de
89,3 e de bandas polimórficas foi de
8,8 por combinação de iniciadores. A
porcentagem média de bandas
polimórficas foi de 9,8%. Para marca-
dores AFLP, o índice de diversidade
de Shannon foi de 0,54 (Tabela 2).
Quando os dois tipos de marca-
dores foram analisados conjuntamen-
te, o total de bandas amplificadas foi
de 687, com 80 bandas polimórficas,
que correspondiam a 11,6%. As médi-
as de bandas totais e polimórficas
amplificadas foram de 52,8 e 6,15 por Figura 3: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo
iniciador, respectivamente. A diversi- índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal
dade genética determinada pelo índi- de Lages, gerado a partir de 64 marcadores AFLP (r=0,83).
ce de Shannon foi de 0,54 (Tabela 3).
Marcadores isoenzimáticos (Auler
et al., 2002) empregados na mesma
população acessaram uma diversida-
de genética de Shannon de H=0,29, ao
passo que marcadores PCR-RFLP de
DNA de cloroplastos (Schögl, 2000)
detectaram um único haplótipo na
população, correspondendo a uma
diversidade virtualmente inexistente.
Nesse caso, marcadores RAPD e AFLP
mostraram-se altamente eficientes, de-
tectando uma diversidade genética
quase duas vezes maior (1,8 x) que
aquela determinada por isoenzimas.
Apesar de caracterizar-se pela aná-
lise da molécula de DNA da mesma
forma que as técnicas RAPD e AFLP, a Figura 4: Dendograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo índice
técnica PCR-RFLP aplicada a genomas de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal de Lages,
de cloroplastos não possibilitou a gerado a partir de 18 marcadores RAPD e 62 marcadores AFLP agrupados (r=0,80).
detecção de diversidade nesta popu-
lação. Já as técnicas RAPD e AFLP não tras populações de A. angustifolia ana- ra 4). A maior similaridade genética
demonstraram limitações para acessar lisadas antes. entre indivíduos foi de 86% (indivídu-
a diversidade genética em populações Por outro lado, uma criteriosa os L11 e L13), com marcadores RAPD;
altamente exploradas, como a utiliza- seleção de combinações de iniciado- 81 % (indivíduos L5 e L26), com
da nesta pesquisa. res permite que a técnica AFLP apre- marcadores AFLP e 71% (indivíduos
Quando os valores obtidos no sente um polimorfismo muito maior L6 e L7), com o agrupamento dos dois
presente trabalho são comparados a (Stefenon, 2003). tipos de marcadores. Nesse ponto,
outros estudos que utilizaram as técni- A similaridade genética foi anali- percebe-se que o maior número de
cas RAPD e AFLP, estes podem ser sada em função dos três dendrogramas marcadores permite uma maior discri-
considerados baixos. Contudo, há de gerados: um, a partir dos 18 marcado- minação entre os indivíduos analisa-
se considerar que os estudos com res RAPD polimórficos (Figura 2), o dos.
isoenzimas e PCR-RFLP utilizados como segundo, a partir dos 62 marcadores A comparação entre os três
parâmetro para a comparação também AFLP polimórficos (Figura 3) e o ter- dendrogramas permite ainda perce-
apresentaram valores baixos para essa ceiro, a partir dos 80 marcadores RAPD ber que, no agrupamento dos marca-
população, quando comparados a ou- e AFLP polimórficos agrupados (Figu- dores, o maior número de bandas

Tab ela 3: Méd ias para o s ín d ices d e d iversid ad e gen ética estimad o s para a po pu lação d e A . an gu stifo lia
d o P arq u e E co ló gico Mu n icipal d e Lages, a partir d e marcad o res R A P D e A FLP.
Nú mero to tal Ban d as po limó rficas Ín d ice d e
Marcad o res
d e b an d as Qu an tid ad e % d iversid ad e (H)
Médias para marcadores RAPD 11,16 3,0 26,9% 0,53
Médias para marcadores AFLP 89,3 8,8 9,8% 0,54
Méd ias R A P D + A FLP 52,8 6,15 11,6% 0,54

98 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

AFLP fez com que o dendrograma
ficasse muito semelhante ao gerado
unicamente dos marcadores AFLP.
Utilizando-se um valor máximo
de 50% para a similaridade genética
entre os indivíduos, o dendrograma
gerado a partir de marcadores RAPD
(Figura 2) dividiu-se em doze grupos.
A maior similaridade genética foi ob-
servada entre os indivíduos L11 e L13,
com 86% de similaridade e o ponto de
união de todos os grupos apresenta
30,5% de similaridade.
O dendrograma gerado de mar-
cadores AFLP (Figura 3) dividiu-se em
quinze grupos, utilizando-se 50%
como similaridade máxima; o ponto
de união de todos os grupos apresen-
ta 24% de similaridade. Com esses
marcadores, a similaridade genética
entre pares de indivíduos variou de
24% a 81%.
Deve-se considerar que existe uma
relação entre o número dado a cada
planta e sua proximidade geográfica,
sendo mais próximos geograficamente
os indivíduos cujos números são mais
próximos. Dessa forma, pode-se ob-
servar que os argumentos de plantas
são aleatórios, formados por indivídu-
os dispersos pelo Parque, em uma área
de 2,34 km2. Esse dado sugere que
indivíduos geograficamente, os quais
podem ser aparentados, não apresen-
tam grande similaridade genética.
Considerações Finais
Um aspecto importante a ser con-
siderado é que a A. angustifolia prova-
velmente possuía uma grande diversi-
dade genética antes da exploração ocor-
rida durante o ciclo da madeira no sul
do Brasil (Auler et al., 2002).
Dessa forma, antes de qualquer
previsão de melhoramento genético é
essencial conhecer a diversidade ge-
nética existente nas populações rema-
nescentes, para possibilitar a seleção
de plantas e sementes a serem utiliza-
das, tanto para a produção de mudas,
quanto para cruzamentos controlados.
A exemplo do ocorrido no Par-
que Ecológico Municipal de Lages,
durante o ciclo da madeira, a seleção
promovida pelo homem até o mo-
mento, foi a retirada dos melhores
fenótipos, em detrimento dos demais.
Devido ao acesso aleatório a am-
plas regiões genômicas praticamente
livres da ação da seleção natural, as
técnicas RAPD e AFLP geram um gran-
de número de marcadores virtual-
mente neutros. Neste caso, dos resul-
tados obtidos no presente trabalho,
pode-se concluir que essas técnicas
apresentam-se como poderosas ferra-
mentas para a caracterização da diver-
sidade genética dos remanescentes de
A. angustifolia, com vistas ao melho-
ramento genético da espécie.
Agradecimentos
Ao CNPq, UNIPLAC e FUNCITEC
pelo apoio financeiro e à Prefeitura
do Município de Lages, pelo apoio na
obtenção do material vegetal.
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6535, 1990.
99

Pesquisa
Monita Fiori de Abreu
Acadêmica do curso de Agronomia,
Bolsista PIBIC/BIP/CNPq - Laboratório de
Morfogênese e Bioquímica Vegetal - CCA/UFSC.
monitaf@yahoo.com
Enio Luiz Pedrotti
Ph.D., Prof. Adjunto IV , Departamento de
Fitotecnia - Laboratório de Morfogênese e
Bioquímica Vegetal -CCA/UFSC.
pedrotti@cca.ufsc.br
Ilustrações cedidas pelos autores
100 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Micropropagação
de Macieira
Avanços nos protocolos de micropropagação
Introdução
A cultura da macieira possui pa-
pel de destaque no cenário frutícola
brasileiro. Atualmente, a área cultiva-
da no Brasil está estimada em 30 mil
hectares, com uma produção aproxi-
mada de 967 mil toneladas (ABPM,
2003). Visando atender às demandas
de mudas da pomicultura nacional,
faz-se necessária a aplicação de méto-
dos eficientes para garantir grande
quantidade de material vegetal de alta
qualidade genética e fitossanitária.
A produção de mudas da maciei-
ra tradicionalmente é efetuada atra-
vés de técnicas de propagação vege-
tativa, como a enxertia de cultivares
copa sobre um porta-enxerto. Tradi-
cionalmente a muda é obtida através
de mergulhia de cepa (Driessen &
Souza Filho, 1986). Porém, esse mé-
todo restringe o número de mudas
obtidas, requer muito tempo, além
de poder resultar em mudas de baixa
qualidade fitossanitária.
Diante da problemática relacio-
nada às técnicas convencionais de
propagação, a biotecnologia através
do aperfeiçoamento das técnicas de
cultivo in vitro, tem sido uma exce-
lente opção para a multiplicação des-
ta frutífera (Figura 1). Possibilita a
produção de mudas de alta qualida-
de sanitária oriundas da cultura de
meristemas livres de vírus, evitando,
desta forma, os problemas de disse-
minação de vírus e outros patógenos
durante a fase de propagação.
Diversos trabalhos vêm sendo
conduzidos no Laboratório de
Morfogênese e Bioquímica Vegetal
(CCA/UFSC) a partir de projetos fi-
nanciados pelo CNPq e FINEP. As
principais linhas de pesquisa foram
no sentido de desenvolver metodo-
logias que abrangem desde o isola-
mento e inoculação in vitro de
meristemas, até a aclimatização das
plantas micropropagadas.
Metodologia
1 - Isolamento e Inoculação
in vitro
A introdução e o estabeleci-
mento de meristemas in vitro é uma
das fases mais delicadas da micro-
propagação. O isolamento de
meristemas é um processo oneroso
(Nunes et al., 1999) mas é primordi-
al, pois é uma condição que garante
a produção de brotações livres de
patógenos. A oxidação e a contami-
nação provocam grandes perdas do
material. Os meristemas extraídos
das gemas apicais apresentam taxas
de oxidação acima de 40%. A per-
centagem de contaminação é cons-
tatada em cerca de 35% dos
explantes. Num trabalho conduzido
com o porta-enxerto M.9, todos os
tubos de ensaio com meio de cultura
contaminado apresentaram oxida-
ção (Tabela 1). Os agentes contami-
nantes como fungos e bactérias libe-
ram compostos que causam a oxida-
ção. O estabelecimento in vitro é
executado segundo metodologias
consideradas clássicas para esta fase
(Pedrotti, 1993; Nunes et al. 1999).
As gemas são extraídas com o auxí-
lio de um bisturi e estas, são subme-
tidas à lavagem com água destilada/
autoclavada e detergente Tween
 Tabela 1. Contaminação, oxidação, números de gemas e brotos e balhos conduzidos no laboratório,
percentual de calos no porta-enxerto de macieira 'M-9' (Malus após a transferência dos meristemas
pumilla M.), a partir da cultura de meristemas e gemas axilares. provenientes de gemas apicais e seg-
Tratamentos mentos nodais com gemas axilares,
Parâmetros Analisados não ocorrem mais problemas de con-
Meristemas Gemas CV (%)
Contaminação (%) 38,6 a 32,2 a 14,1 taminação nem oxidação.
Oxidação (%) 42,3 b 58,4 a 12,5 O crescimento e desenvolvimen-
Nº médio de gemas por broto 3,0 b 5,0a 12,6 to dos meristemas e gemas axilares
Nº médio de brotos formados 3,0 a 4,0 a 9,6 são normalmente lentos até 30 dias
Calos (%) 62,3 a 12,4 b 14,1 após a inoculação, não sendo obser-
vado o crescimento de brotações.
Aos 60 dias, é possível observar o
desenvolvimento de brotações. Para
o porta-enxerto M.9, os meristemas e
gemas axilares introduzidos in vitro,
formam um número médio de 3 e 5
gemas por broto, respectivamente
(Tabela 1).
As diferenças observadas na in-
trodução in vitro e multiplicação po-
dem ser consequência do estado fisi-
ológico das plantas matrizes, onde
foram coletados os explantes como
salientaram Grattapaglia & Machado
(1990). Quando material vegetal co-
letado é retirado das matrizes no final
do verão, possivelmente, as gemas já
iniciam o processo de entrada em
dormência, o que diminui a sobrevi-
Figura 1: Frascos do cultivo in vitro de macieira vência dos meristemas e gemas intro-
duzidos in vitro. Desta forma, a épo-
20®por 20 minutos. Em seguida, as suplementação de fitorreguladores ca mais interessante para a introdu-
gemas são imersas em solução de (Souza et al.,2003). ção in vitro é aquela que correspon-
Anfotericina B®(25 mg.L-1) por 10 As gemas axilares introduzidas de a um intenso crescimento
minutos. Em câmara de fluxo laminar, in vitro têm apresentado oxidação vegetativo nas condições naturais.
as gemas são imersas em etanol 70% acima de 50%, enquanto que os mei-
por 1 minuto, seguida de solução de os de cultura contaminados com fun- 2 - Multiplicação do
hipoclorito de sódio 4%, por 10 mi- gos e bactérias são normalmente aci- material vegetal
nutos. Durante este processo os fras- ma de 30% (Tabela 1). Da mesma
cos são mantidos sob agitação con- forma, todos os tubos contendo meio A composição salina mais utili-
tínua. Posteriormente, faz-se uma de cultura contaminados apresenta- zada nos meios de cultura é a MS
tríplice lavagem com água destila- ram oxidação. Quando os explantes (Murashige & Skoog, 1962), geral-
da/autoclavada e as gemas perma- não apresentam oxidação nem con- mente suplementada com regula-
necem em uma solução de ácido taminação, são transferidos de tubos dores de crescimento que permi-
ascórbico 15% por 10 minutos até de ensaio com novos meios de cultu- tem direcionar as respostas morfo-
serem inoculadas em sais e vitami- ra para eliminar resíduos fenólicos genéticas (George, 1996). Para a
nas de MS (Murashige e Skoog, 1962), liberados pelas plantas no meio de fase de multiplicação in vitro da
sacarose (30 g.L-1), ágar (6 g.L-1) sem cultura inicial (Zanol, 1996). Nos tra- macieira, Ribas & Zanette (1992)
Tabela 2. Efeito de diferentes concentrações de BAP em meio de cultura MS sobre a resposta de na fase
de multiplicação in vitro de macieira (Malus platycarpa) após 45 dias de cultura.
Concentração de Nº de brotações Altura das Comprimento dos
Vitrificação (%)
BAP por explante brotações (cm) entrenós (cm)
0,00 µM 1,0 c 2,3 a 0,59 b 42,0 a
1,11 µM 2,0 b 2,6 a 0,59 b 18,0 c
2,22 µM 3,0 a 2,6 a 0,54 c 18,0 c
4,44 µM 2,0 b 2,9 a 0,65 a 24,0 b
CV (%) 14,2 15,3 13,3 18,9
Médias seguidas de mesma letra na vertical não diferem significativamente entre si, ao nível de 5% de
probabilidade, pelo teste de Duncan.

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 101

 utilizaram o meio MS suplementa-
do com 1,0 mg.L-1 de BAP e 1,0
mg.L-1 de tiamina, e Modgil et al.
(1999) obtiveram a maior taxa de
multiplicação de brotações da culti-
var Tydeman´s Early Worcester adi-
cionando ao meio de cultura 4,4 µM
de BAP e 5,0 µM de KIN. Para o
porta-enxerto Marubakaido Nunes
et al. (1999) utilizaram concentra-
ções de BAP entre 1,11 e 4,44 µM.
Quando se pretende estudar o
comportamento de um novo genótipo,
os explantes são repicados para tubos
de ensaio (2,5 x 15,0 cm) contendo 15
mL de sais e vitaminas de MS, suple-
mentado com diferentes concentra-
ções de benzilaminopurina (BAP) (0;
0,25; 0,50 e 1.0 mg.L-1), 30,0g.L-1 de
sacarose, 6,0 g.L-1 de ágar. Para um
genótipo usado com planta indicadora
de viroses, é possível verificar que as
concentrações de BAP influenciam sua
resposta in vitro (Tabela 2). O material
é mantido no escuro por 48 horas, após
este período, é transferido para a sala
de crescimento sob fotoperíodo de 16
horas e temperatura de 25 ± 2°C e 40
µmol.m-2.s-1 de radiação luminosa,
fornecidas por lâmpadas fluorescentes
Phillips® Super 84.
3 - Microenxertia
Tendo em vista as características
da cultura, a associação das técnicas
de micropropagação e microenxertia
permite combinar as vantagens da
rápida multiplicação in vitro, com a
união de dois genótipos diferentes:
um clone copa, selecionado para
produzir frutos de alta qualidade, e
um clone de porta-enxerto, que con-
fere à cultivar copa características
relevantes, como: vigor, produtivida-
de, qualidade de frutos, resistência a
fatores adversos como a patógenos
do solo, além de realizar funções
básicas de suporte da planta, forneci-
mento de água e nutrientes e a adap-
tação às condições de solo, clima e
doenças.
A micronexertia foi inicialmen-
te desenvolvida por Murashige et al.
(1972) e posteriormente melhorada
por Navarro et al.(1975), buscando a
produção de citrus livres de viroses.
Esta técnica permite a obtenção de
plantas livres de patógenos, aplica-
102 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Figura 2: Fenda do microenxerto de macie-
ira., início de brotação na copa, 30 dias após
a microenxertia.
ção de quarentena em espécies ve-
getais cuja disponibilidade seja de
apenas algumas gemas vegetativas,
separação entre viroses e outras do-
enças, além de estudos fisiológicos,
histológicos e histoquímicos nas
enxertias. Porem ainda é um desafio
promover com sucesso a enxertia de
um material tão pequeno e frágil
como aquele proveniente de plantas
produzidas in vitro. (Obeidy & Smith,
1991). Para garantir a viabilidade do
microenxerto é necessário que as
células da base do microenxerto da
cultivar copa, entrem novamente em
divisão, pois são diferenciadas, ou
seja, já deixaram o ciclo celular e
não sofrem mais desdiferenciação.
Na retomada do ciclo celular é pos-
sível induzir novas competências e
diferenciar para estabelecer os teci-
dos estruturais e condutores (Taiz &
Zeiger, 1991). O estabelecimento de
novos tecidos condutores é o resul-
tado do sucesso do método.
Nos trabalhos desenvolvidos no
Laboratório de Morfogênese e Bio-
química Vegetal, como modelo, fo-
ram utilizados dois porta-enxertos
(M9 e Marubakaido) e uma cultivar
copa (Gala) de macieira. O porta-
enxerto M9 (Malus pumila Mill.) é o
mais utilizado no sul do Brasil, tendo
como característica principal dimi-
nuir o vigor da planta. Além de redu-
Figura 3: Detalhes dos pontos de conexão
observados no corte histológico do microenx-
erto de macieira, 90 dias após a microenxertia.
zir o porte da planta, o M9 aumenta
a precocidade e é um dos poucos
porta-enxertos que apresenta boa
resistência à podridão do colo
(Phytophthora cactorum) (Barrit,
1999). O porta-enxerto Marubakaido
(Malus prunifolia Borkh.) é de ori-
gem japonesa, sendo bastante utili-
zado como porta-enxerto comercial
no Japão, Europa bem como no Bra-
sil (Bessho et al., 1993). É vigoroso,
apresenta resistência à podridão-do-
colo, relativa resistência a Rosellinia
sp. e é muito sensível a viroses
(Denardi, 1986). A culitvar copa Gala
(Malus domestica Borkh.) é a primei-
ra em volume de produção no Brasil,
apresenta frutificação precoce, alta
produtividade e boa adaptação a al-
titudes superiores a 1000m (Denardi,
1986).
4 - Estudos histológicos
A microenxertia é realizada em
fenda simples conforme a metodo-
logia proposta por Hartmann et al.
(1990). Em câmara de fluxo laminar,
a parte apical das plântulas dos
porta-enxertos é retirada e a altura
das plantas uniformizada em 5 cm
de altura. Para a variedade copa
Gala sãopreparados microgarfos
com uma única gema lateral. Atra-
vés de um corte em fenda simples
 Tabela 3. Número e comprimento de raízes em plantas micropropagadas dos porta-enxertos de
macieira M.7, M.9 e Marubakaido, submetidos a diferentes concentrações e formas de aplicação de
Ácido I ndolbutírico (AI B) e ao crescimento das raízes em diferentes substratos.
Número de raízes Comprimento das raízes (cm)
Tratamentos "M.7" "M.9" "Marubakaido" "M.7" "M.9" "Marubakaido"
1 4,0 ± 1,0 c 5,0 ± 1,0 a 10,0 ± 2,0 a 1,7 ± 0,1 b 2,7 ± 0,5 a 1,8 ± 0,4 b
2 6,0 ± 0,5 b 3,0 ± 1,0 b 3,0 ± 1,0 b 1,9 ± 0,1 ab 0,5 ± 0,2 c 0,5 ± 0,3 c
3 8,0 ± 1,0 a 0,0 ± 0,0 c 2,0 ± 0,5 c 2,2 ± 0,2 a 0,0 ± 0,0 d 0,4 ± 0,3 c
4 9,0 ± 1,0 a 5,0 ± 1,0 a 13,0 ± 2,0 a 2,2 ± 0.2 a 1,6 ± 0,2 b 3,4 ± 0,5 a
Médias na coluna seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si, ao nível de 5 % de
probabilidade, pelo teste de Tukey.
Tratamentos:
1 - Indução in vitro em 1.5 µM de AIB em ágar e crescimento das raízes in vitro em ágar;
2 - Indução in vitro em 1.5 µM de AIB em ágar e crescimento das raízes in vitro em substrato mineral;
3 - Indução in vitro com 0,49 M de AIB e crescimento in vitro em substrato mineral;
4 - Indução ex vitro com 0,49 M de AIB e crescimento das raízes em substrato mineral concomitante com a fase
de aclimatização.
Tabela 4.Enraizamento, número e comprimento de raízes de microestacas do porta-enxerto de
macieira M.9 (Malus pumila), tratadas com AIB e submetidas ao enraizamento ex vitro, em substrato
de casca de arroz carbonizada e vermiculita 1:1 (v/v), por um período de 30 dias.
AIB(mg/L) Enraizamento(%) Número deraízes Comprimento das raízes (cm)
0 64 b 3,5 b 3,5 a
500 82 a 6,0 a 4,1 a
1000 84 a 6,0 a 4,5 a
1500 30 c 7,5 a 4,7 a
* Médias seguidas de mesmas letras nas colunas não diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5%.
ns - não significativo.

realizado nas plântulas dos porta- conexão dos microenxertos é 5 - Enraizamento de

enxertos, e um corte em bisel no
minigarfo da cultivar copa, é reali-
zada a enxertia com o auxílio de
duas pinças. Os microenxertos são
então inoculados em frascos com
meio de cultura MS (Murashige &
Skoog, 1962) e transferidos para a
sala de crescimento, com tempera-
tura de 25±2ºC, fotoperíodo de 16
horas e luminosidade de 40 µmol.m -
.s , onde permanecem até as cole-
2 -1
tas dos segmentos. Para os estudos
histológicos, de ambas as combina-
ções enxerto-porta-enxerto, Gala so-
bre Marubakaido e Gala sobre M9,
são realizadas 120 microenxertias,
o que diminuem os erros experi-
mentais. O material vegetal coleta-
do é fixado em glutaraldeído 2,5%
em tampão fosfato de sódio 0,1M –
pH7,2, desidratado em série etílica
e emblocado em parafina (Johansen,
1940). Os cortes são corados com
azul de toluidina e montados, entre
lâmina e lamínula, com bálsamo do
Canadá. A análise dos cortes
histológicos é feita em microscopia
óptica e em lupa, 30 e 90 dias após
a microenxertia (Figuras 2 e 3). A
vizualizada a partir de duas etapas.
O primeiro momento se dá em pou-
cos dias e é caracterizado pela mor-
te de camadas celulares da interface
do enxerto e pela formação de cé-
lulas parenquimáticas que preen-
chem o ponto de enxertia, resultan-
do no desenvolvimento de uma
camada necrótica na fenda. Na se-
gunda etapa, ocorre a proliferação
de um calo em associação com a
região vascular da copa e do porta-
enxerto, formando uma ponte na
interface do enxerto. Posteriormen-
te, há a diferenciação de algumas
células do calo em novas células
cambiais. Ocorre, então, a união
entre os tecidos afins da copa e do
porta-enxerto resultando no esta-
belecimento de uma conexão cam-
bial contínua. Na última fase, a
continuidade da epiderme no pon-
to de enxertia é restaurada. O pos-
terior desenvolvimento da copa pelo
alongamento e desenvolvimento de
brotações caracteriza o sucesso da
microenxertia, observado em até
30 dias em macieira (Abreu et al.,
2003).
plantas micropropagadas
O enraizamento de microesta-
cas é considerado por vários autores
um dos estágios mais críticos do
processo de propagação massal de
plantas perenes (Wang, 1991), pois
depende do genótipo e de sua condi-
ção fisiológica no momento da
indução ao enraizamento (Martins &
Pedrotti, 2001). A emissão de raízes
por uma microestaca pode ser dividi-
da em três fases, que compreendem
a desdiferenciação celular, a indução
e a organização dos primórdios
radiculares (Hartmann et al., 1997;
Blakesley et al., 1991). Na maioria
dos protocolos estabelecidos para a
micropropagação de plantas, o enrai-
zamento é induzido in vitro, utilizan-
do meios de cultura contendo uma
auxina (Harbage & Stimart, 1996;
Deklerk et al., 1997; Ferri et al., 1998).
Para a maioria das espécies, a auxina
é necessária na fase de indução das
raízes enquanto que, na fase de dife-
renciação dos primórdios e no cresci-
mento das raízes, a presença de
auxinas no meio de cultura pode

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 103

 inibir o processo (Deklerk et al.,1995).
A concentração de auxina a ser adici-
onada ao meio de cultura para o
estágio de indução, depende da con-
centração endógena deste hormônio
em cada genótipo utilizado (Blakesley
et al., 1991), sendo que altas concen-
trações, por períodos de exposição
prolongados, podem determinar a
formação de calos na base das micro-
estacas. Para Pasqual & Ishida (1992),
o melhor enraizamento in vitro foi
obtido em meio MS, geleificado, con-
tendo 1 mg/L de AIB.
As condições de temperatura, a
luminosidade da câmara de cresci-
mento e a disponibilidade de oxigê-
nio junto à base das microestacas,
além de fatores anatômicos inerentes
ao genótipo, podem inibir a evolu-
ção do processo morfogenético in-
duzido pelas auxinas. Apesar de
Harbage & Stimart (1996), Deklerk et
al. (1997) e outros autores utilizarem
o processo de indução e crescimento
das raízes in vitro, McClelland et al.
(1990) ressaltam que as raízes produ-
zidas in vitro não são funcionais quan-
do transferidas para a fase de aclima-
tização. Para garantir a sobrevivência
nesse estágio, é necessário que a
planta produza novas raízes, o que
demanda um grande consumo de
reservas que deveriam ser utilizadas
para o crescimento da parte aérea.
Além disto, Debergh & Maene (1981)
salientam a necessidade de desen-
volver sistemas de indução que per-
mitam a produção de raízes funcio-
nais para o processo de aclimatiza-
ção e para o aumento da qualidade
das plântulas.
5.1 - Enraizamento in vitro
Os resultados obtidos com a
indução in vitro de raízes em porta-
enxertos de macieira, mostraram di-
ferenças em relação aos parâmetros
avaliados, em função do genótipo e
da concentração e forma de aplica-
ção da auxina (Martins & Pedrotti,
2001). (Tabela 3). Resultados seme-
lhantes foram obtidos com macieira
por Harbage et al. (1998), os quais
concluíram que a capacidade de emitir
raízes e de estabelecer um sistema
radicular, é uma condição intrínseca
de cada genótipo
104 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
No caso do porta-enxerto M.7, o
enraizamento realizado in vitro em
ágar apresentou resultados inferiores
quanto ao número de raízes. Provavel-
mente as concentrações de AIB utiliza-
das não possibilitaram a indução do
mesmo número de raízes que foi ob-
servado para o ‘Marubakaido’, já que as
respostas são dependentes do genótipo
(Blakesley et al., 1991). É possível que,
para este porta-enxerto, o pH do meio
de cultura não tenha favorecido a ab-
sorção de auxinas pelas células da
base da microestaca, tendo em vista
que a penetração de auxinas nas célu-
las depende do equilíbrio entre ácidos
livres e formas aniônicas, que são
dependentes do pH (Harbage et al.,
1998). O maior número de raízes obti-
do para as microestacas do ‘M.9’ e do
‘Marubakaido (Tabela 4), induzidas ex
vitro com o AIB dissolvido em água e
transferidas diretamente para o subs-
trato mineral para a aclimatização, re-
força as conclusões emitidas por Rogers
& Smith, (1992). Estes autores aumen-
taram a eficiência no enraizamento de
roseiras quando utilizaram substratos
minerais para o crescimento das raízes,
comparados com meios de cultura
geleificados. Estes resultados abrem
perspectivas concretas para o uso de
substratos porosos para o enraizamen-
to in vitro, o que diminui os custos de
produção de plantas micropropaga-
das. Com esta metodologia é possível
substituir os meios de cultura conten-
do ágar por substratos minerais, o que
diminui custos e produz raízes de
melhor qualidade do que as produzi-
das in vitro.
Figura 4 : Crescimento de raízes em
porta-enxertos de macieira, após indução
ao enraizamento
5.2 - Enraizamento ex vitro
Em função dos custos da fase de
enraizamento e aclimatização das
plantas micropropagadas, uma série
de trabalhos foram conduzidos no
Laboratório de Morfogênese e Bio-
química Vegetal (Pedrotti & Voltolini,
2001). Os principais objetivos foram
de induzir o enraizamento ex vitro
em substratos porosos que servem
apenas de suporte para as plântulas
como acontece na estaquia tradicio-
nalmente usada para a propagação
de várias espéceis. Para isto, são
utilizadas miniestacas do porta-en-
xerto M.9, de 2 a 2,5 cm de compri-
mento, com dois pares de folhas,
preparadas a partir de brotações mi-
cropropagadas. A indução ao enrai-
zamento é efetuada submergindo
10mm da base das miniestacas du-
rante 10 segundos em diferentes con-
centrações de ácido indolbutírico (0,
500, 1000, ou 1500 mg/L ). Em segui-
da, as miniestacas são transferidas
para bandejas alveoladas contendo o
substrato terra roxa e casca de arroz
carbonizada 1:1 (v/v.). As bandejas
são então colocadas dentro de caixas
plásticas com uma lâmina de água de
5 mm para manter a umidade relativa
elevada. As caixas são cobertas com
uma lâmina de vidro, conforme me-
todologia descrita por Pedrotti (1993).
Durante 30 dias essas caixas são
mantidas em câmara de aclimatiza-
ção com temperatura de 27±2 °C,
fotoperíodo de 16 horas com intensi-
dade luminosa de 30 µmol.m-2.s-1.
Após esse período, as plantas são
avaliadas quanto ao percentual de
enraizamento, número e comprimen-
to das raízes emitidas.
As maiores percentagens de en-
raizamento com 82 e 84 % são obser-
vadas nas miniestacas tratadas com
500 e 1000 mg/L de AIB, respectiva-
mente O menor percentual de enrai-
zamento (29,6%) é obtido com 1500
mg/L de AIB. As microestacas-con-
trole produzem em média 3,4 raízes.
Estes valores são inferiores
àqueles observados nos tratamentos
com AIB. Para os níveis de AIB de
500, 1000 e 1500 mg/L, o resultado é
a produção de 5,6 a 7,6 raízes respec-
tivamente, não diferindo estatistica-
mente entre si.
 Considerando que o porta-en-
xerto M.9 é de difícil enraizamento
é possível sugerir que o mesmo
necessite de níveis maiores de
auxinas ou outros coofatores para
aumentar o enraizamento, já que
James & Thurnbon (1981) só obti-
veram 45% de enraizamento com
este porta-enxerto quando adicio-
naram fluoroglucinol no meio de
cultura. Possivelmente as condições
de indução in vitro, utilizadas por
estes autores dificultaram a absor-
ção da auxina, como constatado
por Harbage et al. (1998). Além
disto, a intensidade luminosa da
câmara de crescimento pode ter
contribuído para inativar parte da
auxina aplicada. Khosh-khui & Sink
(1982) obtiveram aumento no en-
raizamento de roseira com o
sombreamento da base das estacas.
Valores mais elevados no enraiza-
mento de pereira (Wang, 1991) e
em macieira (Fortes & Leite,1993)
foram obtidos com a manutenção
das plantas no escuro. A maior po-
rosidade e aeração dos substratos
utilizados também podem favore-
cer a indução e o crescimento de
raízes, como foi observado por Jay-
Allemand et al. (1992).
Figura 5.: Desenho esquemático da metodologia de aclimatização de plantas micropropagadas (Pedrotti, 1993).
A e B: Indução ao enraizamento in vitro.
C: Indução ao enraizamento ex vitro.
D: Início do processo de aclimatização.
E: Plantas sendo mantidas em sala com nebulização.
F: Fotoperíodo sendo mantido em 16 horas de luz para evitar a entrada em dormência.
G e H: Plantas transferidas à campo para completar o crescimento.
Os níveis de AIB superiores a
500 mg/L não aumentam a percenta-
gem de enraizamento do porta-en-
xerto M.9. Estes resultados podem
estar relacionados com os teores
endógenos de auxinas produzidas
por gemas e folhas jovens, como
sugerem Hartmann et al. (1997), pois
mesmo sem aplicação de AIB, as
percentagens de enraizamento do
porta-enxerto M.9 foram de 63,5 %.
A exposição das miniestacas ao AIB
por 10 segundos é suficiente para a
indução de primórdios radiculares e
o desenvolvimento e crescimento
posteriores das raízes (Figura 4).
Jarvis et al. (1983) observaram um
aumento na síntese de RNA 20 horas
após a aplicação de auxina o que
corresponde às primeiras divisões
celulares.
6 - Aclimatização
Durante a fase de aclimatização,
as plantas micropropagadas devem
se adaptar a um ambiente completa-
mente diferente das condições em
que ela foi produzida in vitro. Duran-
te este período a planta deve compor
uma estrutura anatômica e fisiológi-
ca capaz de suportar as condições de
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
alta demanda evaporativa da atmos-
fera e de alta radiação luminosa.
Quando transferidas para condições
ex vitro, as mudas normalmente apre-
sentam altas taxas de transpiração,
em função da alta condutividade hi-
dráulica de suas folhas e a funciona-
lidade dos estômatos (Brainerd &
Fuchigami, 1981; Schakel et al., 1990),
o que, na maioria das situações, pro-
voca elevado déficit hídrico, poden-
do provocar a morte das mudas (Díaz-
Pérez et al., 1995).
Apesar dos avanços nos protoco-
los de multiplicação in vitro, poucos
trabalhos foram realizados no sentido
de elucidar problemas ligados à acli-
matização das plantas (Avanzato &
Cherubini, 1993). Para Ziv (1995), a
aclimatização pode comprometer o
processo de micropropagação por en-
volver a neoformação de um sistema
radicular e a passagem para condi-
ções de cultivo ex vitro.
Durante a fase de multiplicação
das brotações in vitro, os estômatos
apresentam-se com formas e estru-
turas anormais (Blanke & Belcher,
1989) e a densidade pode ser dife-
rente das folhas de plantas cultiva-
das ex vitro (Cappelades et al., 1990;
Sciutti & Morini, 1993). Para diver-
105

Figura 6: Crescimento e desenvolvimento de mudas de macieira após aclimatização.
sos autores, (Pospisilova et al., 1997),
os estômatos in vitro não são funci-
onais, permanecem contentemente
abertos ou fechados e são insensí-
veis aos estímulos habituais de es-
curo, alta concentração de CO2, ABA
e potencial hídrico. Desta forma, a
grande transpiração pode causar di-
ficuldades durante o processo de
aclimatização.
A metodologia recomendada
por Pedrotti (1993) (Figura 5) e
utilizada no LMBV por Pedrotti &
Voltolini (2001), possibilitou bons
resultados para vários genótipos de
macieira. Neste processo, as plan-
tas são induzidas ao enraizamento
ex vitro e transferidas para bande-
jas alveoladas.
As bandejas são colocadas em
caixas plásticas cobertas com uma
placa de vidro transparente. Esta
condição, permite a manutenção da
umidade relativa em 100%. Com
esta metodologia, a sobrevivência
das plantas situa-se entre 70 e 95%
(Tabela 5). No que concerne à ma-
téria seca produzida pelas raízes e
parte aérea das plantas, os maiores
valores são obtidos quando as plan-
tas receberam 1000 mg/L de AIB na
fase de indução ao enraizamento. A
aclimatização pode ser efetuada em
câmaras de nebulização que man-
tém alta umidade relativa, o que
diminuem as possibilidades de de-
sidratação e morte das plantas. Neste
sentido, Maciel et al. (2002)
demostraram que é possível obter
altos índices de sobrevivência de
plantas do porta-enxerto M.7. Nes-
te processo, as bandejas são trans-
feridas para diretamente para a câ-
mara de nebulização. Aos 30 dias
após a transferência ex vitro, a per-
centagem de enraizamento é maior
nas mudas que foram aclimatizadas
no substrato composto por casca de
arroz carbonizada, já que esta au-
menta o espaço poroso como foi
observado por Lê & Collet (1991) e
por Avanzato & Cherubini (1993).
As altas percentagens de enrai-
zamento coincidem com as de so-
brevivência, pois todas as plantas
que enraizaram sobreviveram, e co-
incidem com os de crescimento das
mudas (Figura 6). Maciel et al. (2002)
sugerem que a umidade relativa no
ambiente utilizado garantiu as con-
dições adequadas para a aclimatiza-
ção das mudas. Esta hipótese é cor-
roborada por Campostrini & Otoni
(1996), pois plântulas produzidas in
vitro não estão adaptadas ao novo
ambiente, pois não possuem meca-
nismos de proteção contra a desi-
dratação, já que seus estômatos ge-
ralmente se encontram abertos
(Schackel et al., 1990). No entanto,
segundo Pospíslová et al.(1997) e
Bolar et al. (1998), durante a aclima-
tização as mudas ativam os mecanis-
mos que permitem sua sobrevivên-
cia após a transferência para a casa
de vegetação. Possivelmente as con-
dições de aclimatização utilizadas
neste trabalho possibilitaram a so-
brevivência da planta até a entrada
em funcionamento dos estômatos, o
que permitiu um maior controle so-
bre as perdas de água, o que está de
acordo com Sutter (1988).
Considerações Finais
Os resultados obtidos nesse la-
boratório corroboram com aqueles
que foram publicados por vários
grupos de pesquisa nacionais e es-
trangeiros. As metodologias desen-
volvidas permitem a produção co-
mercial de mudas de porta-enxertos
e copa de macieira micropropagados.
Em que pese as peculiaridades de
cada genótipo a grande maioria dos
clones utilizados atualmente podem
ser produzidos seguindo protocolos
semelhantes. A perspectiva do uso
da indução ao enraizamento realiza-
do simultaneamente à aclimatização
das plantas ex vitro pode diminuir em
até 50% o custo de produção de uma

Tabela 5. Sobrevivência, número e comprimento de raízes altura e número de folhas de miniestacas do

porta-enxerto de macieira M.9 (Malus pumila), submetidas ao enraizamento ex vitro, em diferentes
concentrações de AIB, 45 dias após a repicagem para substrato mineral.
AIB Sobrevivênciadas Número de Comprimento das Comprimento das Número de
(mg/L) plantas (%) raízes raízes (cm) brotações (cm) folhas
0 85 b 10,1 ns 12,0 ns 5,3 ns 7,5 ns
500 95 a 11,5 12,5 6,3 8,0
1000 70 c 1 6, 0 11 ,6 6,9 7,5
1500 73 c 20 ,0 11 ,3 6,9 7,8
* Médias seguidas de mesmas letras nas colunas não diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5%.
ns - não significativo

106 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

muda micropropagada, o que torna
viável o uso comercial da micropro-
pagação.
A produção de mudas de alta
qualidade genética e sanitária é um
fator de extrema importância para a
garantia da competitividade da
pomicultura nacional. Neste sentido,
a aplicação das técnicas aqui aborda-
das abrem perspectivas para a insta-
lação de laboratórios comerciais para
atender à demanda de mudas para a
renovação de pomares pouco produ-
tivos e a implantação de novos po-
mares com alta densidade.
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Pesquisa
Adriano Luiz Tonetti
Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP
atonetti@fec.unicamp.br
Bruno Coraucci Filho, Dr
Professor Associado da Faculdade de Engenharia
Civil - UNICAMP
Alexandre Patto Kanegae
Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP
Ronaldo Stefanutti, Dr
Doutor pelo CENA-USP
Ilustrações cedidas pelos autores
Método Alternativo de
Tratamento de Esgotos
Reator anaeróbio com recheio de bambu associado com filtros biológicos de areia
Resumo
ste artigo apresenta os re-
sultados encontrados para
o estudo de um sistema
alternativo de tratamento
de esgotos constituído por
reator anaeróbio com re-
cheio de bambu associado a um filtro
biológico de areia. Tal combinaçaão
possui baixo custo e busca minimizar
o sério problema de saneamento pelo
qual o Brasil passa.
O reator anaeróbio foi alimenta-
do com uma vazão de 2 l/min e seu
efluente era aplicado em cinco cargas
hidráulicas (20, 40, 60, 80 e 100 l/m2)
sobre a superfície de quatro filtros de
areia com diferentes profundidades
de leitos (25, 50, 75 e 100 cm).
Devido à ação dos microrganis-
mos anaeróbios e aeróbios, que ade-
rem à superfície do bambu e da areia,
obteve-se uma excelente remoção
de matéria orgânica do esgoto que,
caso fosse lançada em um corpo de
água antes do processo de tratamen-
to, levaria ao consumo de oxigênio e
a uma mortandade da fauna e flora
aquáticas. Quanto ao nitrogênio, ocor-
reu uma grande transformação da
sua parte orgânica em nitrato, de-
monstrando a grande adaptação das
bactérias responsáveis por esta rea-
ção bioquímica ao meio formado
pela areia. Os organismos patogêni-
cos foram em grande medida removi-
dos, adequando o efluente a alguma
prática de reuso.
Palavras-chave: filtro de areia,
pós-tratamento, efluente anaeróbio,
baixo custo.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Introdução
O Brasil é um dos países que
possuem o maior fluxo interno de
água. Porém, há uma enorme
disparidade na distribuição deste re-
curso entre suas diferentes regiões.
Enquanto que no norte existe uma
abundância hídrica, no sul e sudeste,
industrializados e populosos, ocorre
a escassez causada pelo elevado con-
sumo e grande poluição dos rios,
resultante da precária situação do
saneamento básico.
Este quadro alarmante acarreta
sérios problemas à saúde pública e
ao meio ambiente levando a mortan-
dade de um grande número de espé-
cies. Portanto, um dos desafios atuais
para a melhoria desta situação é o
desenvolvimento de sistemas de tra-
tamento simples, eficientes e adaptá-
veis às condições econômicas e es-
truturais do nosso país.
O Tratamento Anaeróbio
O tratamento anaeróbio depen-
de dos microrganismos que agem na
ausência de oxigênio, transforman-
do os dejetos gerados pela ação
humana em produtos mais simples
como metano, gás carbônico e água
(METCALF e EDDY, 1991). Estes
compostos mais simples podem
retornar ao meio ambiente sem com-
prometer o planeta e seu ecossiste-
ma. Apesar da boa eficiência deste
sistema, entre 10 e 30% da matéria
orgânica não é degradada, o que
impede que seu efluente atenda à
109

Figura 1: Filtro anaeróbio de fluxo ascen-
dente.
legislação brasileira quanto a este
parâmetro, havendo necessidade de
um pós-tratamento.
O reator anaeróbio é caracteriza-
do pela presença de um material de
recheio estacionário e inerte no inte-
rior de um tanque fechado. O esgoto
penetra pela parte inferior e flui até a
sua saída na área superior. No decor-
rer do escoamento, o esgoto entra em
contato com este material. Sobre a
superfície deste recheio ocorre a for-
mação natural de um biofilme que
degrada o substrato contido no fluxo
de esgoto (Figura 1).
O material de recheio no qual
os microrganismos aderem deve
ter as seguintes características: es-
trutura resistente, ser biológica e
quimicamente inerte, leveza, po-
rosidade elevada e preço reduzi-
do. Tal sistema possui a vantagem
de consumir pouca energia e pro-
duzir uma quantidade mínima de
lodo, além de não depender da
utilização de complexos equipa-
mentos mecânicos.
Pesquisadores da UNICAMP di-
agnosticaram que o uso de anéis de
bambu poderia satisfazer a tais pré-
requisitos (CAMARGO, 2000). Este
material apresenta a vantagem de
possuir um baixo custo e ser facil-
mente encontrado no Brasil. Desta
forma, construíram e operaram qua-
tro reatores que possuíam o bambu
como recheio e obtiveram uma re-
moção média de matéria orgânica
(DBO) superior a 75%. Quanto ao
nitrogênio orgânico, somente uma
parcela de sua concentração foi trans-
formada em amônia.
Pode-se concluir ao final deste
110 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
trabalho inicial que, apesar dos bons
resultados, havia a necessidade de se
realizar um pós-tratamento do
efluente anaeróbio gerado pelo rea-
tor de bambu, pois ele não se ade-
quava à legislação brasileira. Assim,
buscando manter as características
de um tratamento alternativo e bara-
to decidiu-se aplicar o efluente gera-
do sobre a superfície de filtros bioló-
gicos de areia.
A associação do reator anaeró-
bio com filtros biológicos de areia
seria uma alternativa que preserva-
ria o baixo custo total. Outro item
importante seria a possibilidade de
dispor o efluente gerado diretamen-
te sobre os cursos d’água, ou
reutilizá-lo na irrigação, ou no con-
sumo não-humano, seguindo a ori-
entação da Organização Mundial de
Saúde (OMS, 1989).
No Brasil, esta combinação seria
aplicável nas pequenas cidades, em
bairros isolados e condomínios fe-
chados das metrópoles, onde a insta-
lação de uma rede coletora de esgo-
tos apresentaria custo elevado.
Filtros Biológicos de Areia
O filtro biológico de areia é um
método de tratamento bastante anti-
go, inicialmente adotado na remoção
de turbidez da água potável. A partir
do século XIX, na Europa e nos
Estados Unidos, passou a ser apro-
veitado na depuração de esgotos
(MICHELS, 1996).
Figura 2: Vistas externa (esquerda) e interna (direita) dos reatores anaeróbios.
O funcionamento deste sistema
baseia-se na aplicação de afluente
intermitentemente sobre a superfície
de um leito de areia. Durante a infil-
tração do líquido ocorre a purificação
por mecanismos físicos, químicos e
biológicos.
O tratamento físico é resultan-
te do peneiramento e o químico
ocorre pela adsorsão de determina-
dos compostos. A purificação de-
pende principalmente da oxidação
bioquímica que ocorre no contato
do afluente com a cultura biológi-
ca. Devido a esta característica,
Jordão e Pessoa (1995) afirmam
que este tipo de sistema é incorre-
tamente chamado de filtro, pois seu
funcionamento não possui como
explicação primordial o peneira-
mento ou a filtragem. Neste mesmo
sentido, KRISTIANSEN (1981) sus-
tenta que o leito de areia, em con-
junto com os microrganismos, for-
ma um filtro vivo.
Material e Métodos
Este projeto de pesquisa está
instalado em uma área experimental
situada na Estação de Tratamento de
Efluentes Graminha, na cidade de
Limeira, Estado de São Paulo. O es-
goto bruto é originário de um bairro
residencial denominado Graminha.
Inicialmente esta água residuária pas-
sa por um tratamento preliminar com-
posto por grades de retenção e caixa
de areia e em seguida, uma pequena
 Tab ela 1: Den o min ação d o s filtro s b io ló gico s e pro fu n d id ad es d o Para a distribuição uniforme
leito d e areia. do afluente sobre o leito dos filtros,
P ro fu n d id ad e d o Leito empregou-se uma placa quadrada
Filtro de 20 cm de comprimento, feita de
(cen tímetro s)
F025 25 madeira e posicionada no centro da
F050 50 camada superficial (Figura 4). Após
F075 75 o lançamento do afluente pela tu-
F100 100 bulação de distribuição, existe o
porção do seu fluxo é direcionada até suía 20 cm de profundidade. Logo choque do líquido com esta placa,
quatro reatores anaeróbios com re- acima estava a camada formada por distribuindo as gotículas sobre a
cheio de bambu. pedregulho, com 10 cm de profundi- superfície.
Cada reator possui volume de dade, que objetivava sustentar a areia, Buscando-se determinar a ca-
500 l e foi construído em aço inox impedindo que suas partículas fos- pacidade de tratamento dos filtros
tendo formato cilíndrico e fundo sem arrastadas para fora da estrutura biológicos de areia, foram aplica-
cônico, que funcionou como um do sistema. Quanto à camada de das as cargas hidráulicas de 20, 40,
compartimento para a distribuição areia, buscando-se determinar qual 60, 80 e 100 l/m2 de efluente prove-
do esgoto (Figura 2). O meio supor- era a espessura ideal para a realiza- niente dos reatores anaeróbios so-
te foi constituído de anéis de bam- ção do tratamento, empregou-se qua- bre as superfícies. Cada carga hi-
bu da espécie Bambusa tuldoides. tro filtros com diferentes profundida- dráulica foi empregada pelo perío-
O caule do bambu foi cortado em des de leito, conforme apresentado do de um mês entre as segundas e
pedaços de aproximadamente 5 cm na Tabela 1. sextas-feiras.
(CAMARGO, 2000). A areia empregada foi a popu- Na Figura 5 está apresentado de
Estes reatores anaeróbios foram larmente denominada de grossa co- forma esquemática o fluxograma de
operados com fluxo ascendente, ten- mercial, possuindo um diâmetro efe- funcionamento deste sistema de tra-
do uma vazão de 2 l/min e tempo de tivo (D10) de 0,093 mm. Salienta-se tamento em estudo.
detenção hidráulica de 3 horas, con- que estes materiais foram os mais As seguintes amostras foram ob-
trolados diariamente. comumente encontrados na região tidas semanalmente: esgoto bruto,
de desenvolvimento do projeto. efluente dos reatores anaeróbios com
Filtros de Areia Na construção dos filtros, foi recheio de bambu e efluentes dos
utilizada uma caixa cilíndrica com filtros de areia. Todas as análises
Na construção do leito dos fil- estrutura de fibra de vidro e diâmetro foram baseadas no Standard Methods
tros foram empregadas três camadas de 100 cm. Na Figura 3 há um esque- for the Examination of Water and
posicionadas a partir da base. A pri- ma da disposição das diferentes ca- Wastewater (AWWA/ANHA/WEF,
meira foi constituída por brita e pos- madas que compõem os filtros. 1999).
Os parâmetros físicos, quími-
cos e biológicos analisados foram os
seguintes: pH, demanda bioquímica
de oxigênio (DBO), série do nitro-
gênio (nitrogênio orgânico e
amoniacal, nitrito e nitrato) e
coliformes totais.

Resultados

pH

O estudo deste parâmetro é de

extrema importância em um sistema
biológico. Isto porque os microrga-
nismos responsáveis pelo tratamen-
to dos esgotos necessitam de um pH
que varie entre 4 e 8. Caso contrário
existe o impedimento da formação
do biofilme responsável pela depu-
ração do efluente.
De acordo com a Figura 6 pode-
se fazer uma divisão dos valores de
Figura 3: Esquema dos filtros de areia.

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 111


Figura 4: Vista externa (esquerda) e superior
(direita) de um filtro de areia, tendo ao centro
a placa de distribuição de afluente.
pH encontrados para os filtros bioló- resultados esperados. De acordo com
gicos de areia em dois grupos bási- a análise dos compostos nitrogena-
cos. O primeiro engloba os pHs en- dos, esperava-se que a transforma-
contrados nas cargas hidráulicas de ção dos nitrogênios orgânico e
20, 40 e 60 l/m2 onde houve tendên- amoniacal em nitrato causasse a re-
cia para valores superiores a 7. No dução do pH. Tal fato ocorreria devi-
segundo grupo, constituído pelas do à redução de alcalinidade
cargas de 80 e 100 l/m2 nota-se valo- provocada pelas bactérias aeróbias
res inferiores ao pH neutro. no processo metabólico da degrada-
A característica encontrada para ção da matéria orgânica. Uma possí-
o primeiro grupo não se adequa aos vel explicação para esta característi-
Figura 5: Fluxograma do sistema de tratamento em estudo.
ca pode ser a formação de um siste-
ma tampão químico pela areia. As-
sim, apesar do consumo de compos-
tos alcalinos, haveria o impedimento
da queda do pH do efluente dos
filtros de areia.
A formação do sistema tam-
pão pelo leito de areia pode ser
comprovada pelo fato do filtro
F025, que possui o menor volume
de areia, possuir tendência aos
menores pHs e também por ter
sido o primeiro a apresentar os
valores mais baixos. O filtro de 100
cm manteve valores altos de pH
ate o final da aplicação da carga de
100 l/m 2.
Vê-se também que o sistema,
mesmo sob condições temporárias
de aplicações de pHs bastante anor-
mais, conforme encontrado na sex-
ta semana, mostrou-se capaz de
amortecê-los. Isso também pode
ser notado nas duas últimas sema-
nas de aplicação da carga de 100 l/
m2, quando houve a geração de um
efluente ácido pelos reatores anae-
róbios de bambu. Observa-se que
nesta situação os efluentes dos qua-
tro filtros não tiveram uma tendên-
cia a acompanhá-lo nesta queda
brusca.
Quando se comparam os valo-
res encontrados para o pH com aque-
les exigidos pela legislação brasileira
(CONAMA 20/86), que permite a
emissão de um efluente cujo pH
varie entre 4 e 9, nota-se que o
sistema propiciou valores bastante
satisfatórios.

Demanda Bioquímica de
Oxigênio - DBO

Caso seja lançado em um cor-

po de água uma grande quantidade
de matéria orgânica, haverá o con-
sumo parcial dela pelos microrga-
nismos presentes no meio. Como
conseqüência desta degradação,
esta colônia formada consome gran-
de quantidade de oxigênio, levan-
do à morte diversas espécies da
fauna e da flora.
No que se refere a DBO, parâ-
metro que determina a quantidade
Figura 6: Variação do pH durante as semanas de coleta. de matéria orgânica, os reatores

112 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

 anaeróbios propiciaram uma remo-
Tab ela 2: R emo ção méd ia d e DBO n o sistema d e tratamen to n as ção média de aproximadamente
cargas h id ráu licas aplicad as. 48%. Este resultado está de acordo
P o n to d e R emo ção méd ia d e DBO (%) com as possibilidades dos micror-
C o leta 20 l/m2 40 l/m2 60 l/m2 80 l/m2 100 l/m2 ganismos anaeróbios e com os da-
F025 95,3 97,3 93,7 95,8 91,3 dos encontrados para materiais de
F050 98,0 98,9 98,7 96,5 94,9 recheio normalmente empregados
F075 97,5 98,9 98,8 98,3 97,0 em estações de tratamento de gran-
F100 97,6 98,8 99,4 99,3 98,7 de porte.
Quanto aos filtros de areia, vê-
se pela Figura 7 a excelente remoção
de DBO. O maior valor encontrado
foi de somente 29 mg/l, obtido no
efluente do filtro com 25 cm de
profundidade, durante a aplicação
da maior carga hidráulica. Este resul-
tado está muito abaixo do máximo
permitido pela legislação brasileira,
que é de 90 mg/l.
Outra característica observada
é que quanto mais profundo o leito
de areia, melhores foram os resulta-
Figura 7: DBO média para cada uma das cargas hidráulicas aplicadas. dos. Isto pode ser explicado pelo
fato de que quanto maior a profun-
didade, maior a quantidade de areia
revestida com biofilme. Assim exis-
te uma ampla possibilidade de con-
tato do material orgânico com os
microrganismos.
Quando se observa a Tabela 2,
que apresenta os percentuais de
remoção da DBO em todo o siste-
ma, observa-se o valor mínimo de
91,3%. O filtro com 100 cm de
profundidade nunca removeu me-
nos que 97,6%, independente da
carga de aplicação.

Nitrogênio

A remoção dos compostos nitro-

genados presentes no esgoto é de
extrema importância. Caso isto não
ocorra tem-se o lançamento de um
efluente tóxico que pode levar à
morte de micro e macrorganismos.
Tal fato ocorre devido ao nitrogênio
amoniacal ou devido à eutrofização,
que acaba por criar um meio propício
à floração de algas.
Pela Figura 8 percebe-se que
tanto o esgoto bruto como o
efluente dos reatores de bambu
eram constituídos de compostos
nitrogenados pouco degradados
Figura 8: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no esgoto bru- (nitrogênio orgânico e amoniacal).
to e efluente dos reatores de bambu em cada carga hidráulica. Assim, desde a produção dos

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 113


Figura 9: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no filtro F025 e
F050 em cada carga hidráulica.
dejetos pelo ser humano até a che-
gada à estação de tratamento ocor-
reram poucas transformações em
sua composição. Isto ocorre prin-
cipalmente devido ao fato de os
organismos responsáveis pela de-
composição dos compostos nitro-
genados agirem somente em pre-
sença de oxigênio.
Ao comparar-se o esgoto bruto
com o efluente dos reatores de bam-
bu, nota-se que apesar da sua carac-
terística anaeróbia, a amônia na mai-
oria das situações superava o valor
de nitrogênio orgânico. Quanto às
concentrações de nitrato e nitrito,
observa-se que foram muito peque-
nas para estes dois pontos de coleta.
Pelas Figuras 9 e 10, nota-se
que o efluente dos reatores anaeró-
bios de recheio de bambu ao
infiltrar-se através do leito de areia
dos filtros biológicos sofreu gran-
des alterações no que se refere aos
compostos nitrogenados. Ou seja,
114 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
existiu uma grande transformação
do nitrogênio orgânico e do
amoniacal para nitrato, indepen-
dente da carga que era empregada.
Tal modificação é resultante das
nitrobactérias, que em ambientes
aerados levam tais compostos à sua
forma mais oxidada.
Para os filtros F025 e F050, a
partir da carga de 60 l/m2 passa a
haver um aumento da concentração
de nitrogênio amoniacal, que foi
ampliada na de 80 l/m2. Este au-
mento pode ser explicado pelo
acréscimo de carga, que acarretou
na diminuição do tempo de contato
entre o líquido que se infiltrava e a
cultura biológica aderida à areia.
Quanto maior era a profundida-
de do leito, maior era o processo de
nitrificação, ou seja, de transforma-
ção do nitrogênio orgânico em nitra-
to. Assim, de acordo com a Figura 10,
nota-se que o filtro com 100 cm de
profundidade de leito propiciava uma
completa nitrificação. Assim, a
somatória das concentrações de to-
dos os compostos nitrogenados era
muito semelhante à de nitrato.
Coliformes Totais
Os coliformes totais são uma
classe de organismos adotada pela
engenharia sanitária como um indi-
cador da presença de organismos
patogênicos. Assim, caso esteja em
pequenas quantidades, pode-se su-
por que a água também não conterá
seres vivos que possam causar algum
dano a saúde.
Ao analisar-se as concentrações
de coliformes totais pela Figuras 11,
vê-se que o afluente sempre possuía
valores superiores a 106 NMP/100 ml,
chegando em alguns casos a superar
109 NMP/100 ml. Desta forma, pode-
se constatar que os reatores anaeró-
bios com recheio de bambu realmen-
te não removem estes organismos,
conforme afirma a literatura.
Quanto aos filtros de areia, nas
baixas cargas o F025 já apresentava
valores mais altos que os outros três,
e no decorrer do desenvolvimento do
projeto, sempre possuía as maiores
concentrações. Por outro lado, o filtro
com 100 cm de profundidade chegava
a gerar um efluente capaz de atender
à legislação brasileira para a água
potável quanto a coliformes totais.
Ao observar-se a comparação
entre o afluente e o efluente do filtro
de areia apresentada na Tabela 3,
percebe-se a grande remoção de
coliformes totais que este sistema
propiciou. O filtro com menor pro-
fundidade de leito, o F025, apresen-
tou altos percentuais, sendo no míni-
mo igual a 84%. Os dois filtros mais
profundos tiveram valores superio-
res a 99% em praticamente todas as
situações em estudo.
Conclusões
A análise destes resultados de-
monstra a grande viabilidade deste
sistema biológico para o tratamento
de efluente de pequenas comunida-
des, utilizando materiais presentes
nas próprias comunidades.
 O efluente gerado estava em con-
formidade com o exigido pela legisla-
ção brasileira para a emissão em um
corpo receptor, sendo compatível com
aqueles produzidos nas grandes esta-
ções de tratamento existentes nas gran-
des cidades brasileiras. Outro ponto é
a possibilidade do reuso deste líquido
em alguma atividade humana, resguar-
dando os mananciais naturais para
usos mais nobres.

Agradecimentos

A FAPESP, CNPq, FINEP, Caixa

Econômica Federal e PROSAB pelo
apoio e financiamento na construção
do projeto e em sua manutenção.

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n o s filtro s b io ló gico s d e areia em cad a carga h id ráu lica.
DIAL DE SAÚDE. Directrices sa-
P o n to d e R emo ção d o s C o lifo rmes To tais (%)
nitárias sobre el uso de águas
C o leta 20 l/m2 40 l/m2 60 l/m2 80 l/m2 100 l/m2
F025 97,5 89,8 84,8 84,9 87,0 residuales en agricultura e
F050 99,9 99,2 98,0 87,4 96,3 aquicultura. Séries de reporta-
F075 100,0 99,9 99,4 99,5 97,0 gens técnicas. N 778. OMS, Gene-
F100 100,0 100,0 99,9 99,9 99,9 bra, 1989.

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 115

 Amendoim Selvagem
Pesquisa
Soraya Cristina Leal-Bertioli - PhD
Pesquisadora EMBRAPA Recursos
Genéticos e Biotecnologia,
soraya@cenargen.embrapa.br
Patrícia Messenberg Guimarães - PhD
Pesquisadora EMBRAPA Recursos
Genéticos e Biotecnologia,
messenbe@cenargen.embrapa.br
Alessandra Pereira Fávero - MsC
Pesquisadora EMBRAPA Recursos
Genéticos e Biotecnologia,
favero@cenargen.embrapa.br
Márcio de Carvalho Moretzsohn - MsC
Pesquisador EMBRAPA Recursos
Genéticos e Biotecnologia,
marciocm@cenargen.embrapa.br
Karina Proite - MsC
Estudante de doutorado da UnB,
proite@cenargen.embrapa.br
David John Bertioli - PhD
Pesquisador Universidade Católica de Brasília
david@pos.ucb.br
Ilustrações cedidas pelos autores
116 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Uma fonte de resistência a pragas
amendoim cultivado,
Arachis hypogaea, é
uma das leguminosas
produtoras de grãos
mais plantada em todo
o mundo, devido ao seu alto conteú-
do de proteína e óleos insaturados. É
cultivado extensivamente na China,
Índia e Estados Unidos, além de di-
versos países da América Latina e
África (Conab, 2002). Os principais
problemas da cultura estão relacio-
nados ao ataque de fungos da parte
aérea e nematóides, necessitando pe-
riodicamente da utilização de defen-
sivos agrícolas (Hagan, 1998 ;
Subrahmanyam et al., 1983; Bailey,
2002). Espécies silvestres de Arachis
têm-se mostrado altamente promis-
soras como fonte de resistência a
diversas pragas que atingem o amen- foto ilustrativa
doim e outras culturas, sendo que já
foram identificadas algumas espéci- namarca) e Sainsbury’s Laboratories (In-
es com resistência a três fungos glaterra) na busca de genes de resistên-
foliares (Cercospora arachidicola, cia a fungos e nematóides patogênicos
Cercosporidium personatum e ao amendoim, e no desenvolvimento
Puccinia arachidis) e ao nematóide de um mapa genético para Arachis que
das galhas (Meloidogyne spp.). Bus- possibilite a utilização destes genes.
ca-se, agora, desenvolver ferramen-
tas para a utilização destas espécies Produção de um mapa
silvestres em programas de melhora- genético para facilitar a
mento genético, visando à obtenção seleção assistida
de cultivares de amendoim com re-
sistência mais duradoura (Fig.1). Espécies silvestres de Arachis pos-
O projeto “Identificação de resis- suem alta diversidade genética e cons-
tências a stress biótico em Arachis sel- tituem uma rica fonte de genes de
vagem e desenvolvimento de ferra- resistência. Diversos trabalhos têm mos-
mentas para o melhoramento genético trado que as espécies silvestres são
através de mapeamento e genômica muito mais resistentes a doenças do
comparativa” combina esforços e habi- que a espécie cultivada (Arachis
lidades de pesquisadores da Embrapa hypogaea) (Holbrook et al., 2000). O
Recursos Genéticos e Biotecnologia, amendoim cultivado é tetraplóide (tem
Universidade Católica de Brasília, IBONE quatro conjuntos de cromossomos, dois
(Instituto Botanico del Nordeste, Ar- conjuntos do chamado genoma A e
gentina), Universidade de Aarhus (Di- dois conjuntos do genoma B), enquan-
 Fig.1 - Sementes de diferentes espécies de Arachis
to que a maioria das espécies silvestres
é diplóide (apenas dois conjuntos de
cromossomos). Esta diferença de
ploidia dificulta a introgressão de genes
dos parentes silvestres, uma vez que os
híbridos obtidos de maneira tradicio-
nal são triplóides estéreis. Por isso,
para obter híbridos férteis, necessita-se
fazer cruzamentos entre espécies sil-
vestres com genomas AA e BB. Os
híbridos obtidos (AB) são então sub-
metidos a tratamento com colchicina
para duplicar o número de cromosso-
mos, obtendo-se, assim, anfidiplóides
sintéticos (AABB), que, em princípio,
são compatíveis com o amendoim cul-
tivado. Estes híbridos são então cruza-
dos com A. hypogaea dando continui-
dade ao programa de pré-melhora-
mento de Arachis.
Tradicionalmente, nos programas
de melhoramento de plantas que en-
volvem hibridações seguidas de retro-
cruzamentos, grande parte do genoma
da parental doadora é incorporada ao
genoma da planta receptora e, por
isso, são necessárias várias gerações
para a eliminação gradual dos genes
indesejáveis, enquanto o genótipo do
parental recorrente é mantido para os
demais locos. Em cada geração são
selecionadas as plantas que apresen-
tam a característica de interesse a ser
introgredida, e as demais característi-
cas do parental recorrente. Este pro-
cesso de seleção, após a introgressão,
pode ser otimizado através da cons-
trução de mapas genéticos e da iden-
tificação de marcadores moleculares
fortemente associados aos genes de
interesse. Desta forma, é possível, em
cada fase de seleção, a escolha dos
indivíduos que contenham o máximo
de características do parental recor-
rente, diminuindo assim o tempo do
processo de melhoramento. Isso é
particularmente importante em pro-
gramas que visam à introgressão de
genes de resistência a pragas. Neste
caso, a seleção indireta através de
marcadores moleculares possibilita,
além da redução de tempo, a identifi-
cação e seleção de genótipos resisten-
tes na ausência do patógeno e a
transferência e manutenção de mais
de um gene de resistência principal
durante a seleção (piramidização de
genes de resistência).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Para a implementação de um
esquema efetivo de seleção assistida
por marcadores em programas de
melhoramento genético, três reque-
rimentos são essenciais: (1) alguns
marcadores devem estar fortemente
ligados aos genes que controlam as
características de interesse; (2) os
marcadores devem estar facilmente
disponíveis para a análise de grandes
populações e (3) as técnicas utiliza-
das devem ser reproduzíveis entre
laboratórios e com baixo custo.
Mapeamento comparativo:
Um atalho para um mapa
genético
Espécies de Arachis têm geno-
mas muito grandes. O genoma
haplóide de Arachis hypogaea tem
aproximadamente 1,74 x 109 pares de
bases. Isto dificulta a identificação e o
mapeamento direto de genes de inte-
resse. Uma outra espécie da família
das leguminosas, Lotus japonicus, tem
um genoma bem menor, tem um
mapa genético de alta resolução já
disponível e os projetos de seqüenci-
117

Fig.2 - Exemplo de estudo de sintenia: Marcadores moleculares (M1 a M4) em posições
colineares nos genomas de Lotus e Arachis.
amento de ESTs (expressed sequenced
tags) e do genoma estrutural estão
quase completos (Asamizu et al., 2000;
Sato et al., 2001). Por isso, L. japonicus
tem sido considerada uma planta-
modelo para todas as leguminosas,
auxiliando no entendimento de ou-
tras espécies de genomas mais com-
plexos. A comparação entre estes dois
gêneros e a análise da ordem dos
genes nos cromossomos possibilita a
identificação de regiões correlatas
entre os dois genomas (chamada
sintenia), ou seja, o mapeamento com-
parativo. Neste processo, são identifi-
cados marcadores moleculares comuns
aos diversos genomas, chamados mar-
cadores-âncoras. Como exemplo de
transferência de informação da planta
modelo para leguminosas cultivadas
pode-se citar o caso dos fenótipos
mutantes: uma vez que o gene res-
ponsável por um fenótipo mutante
seja clonado em Lotus, a análise
fenotípica comparativa e a informa-
ção do mapa podem ser utilizadas
como base para identificar genes can-
didatos para o gene correspondente
em outras leguminosas.
No caso específico de Arachis, a
análise genômica comparativa pode-
rá auxiliar no desenvolvimento de
marcadores para o melhoramento ge-
nético da cultura, o que certamente
facilitará a clonagem de genes de
interesse. A exploração da colineari-
dade entre genes de Arachis e Lotus
buscando a identificação entre as duas
espécies e a identificação de regiões
118 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
cromossômicas ortólogas (genes ho-
mólogos localizados em genomas de
diferentes organismos) tem sido reali-
zada através do desenvolvimento de
um banco de ESTs de Arachis (Gui-
marães et al., 2003 ). Este banco de
dados deverá acelerar o mapeamento
do genoma de Arachis, a identificação
de resistências e o desenvolvimento
de marcadores a serem utilizados nos
programas de melhoramento. Um be-
nefício adicional do projeto é o desen-
volvimento de um sistema genético
unificado para a família das legumino-
sas, pois trabalhando com Lotus que é
considerado um dos gêneros mais
adaptados desta família e Arachis que
é considerado um dos mais primiti-
vos, qualquer região de similaridade
encontrada provavelmente existirá em
todas as leguminosas. Até o momen-
to, já foram encontradas homologias
entre Lotus e Arachis em vários genes
que codificam para enzimas envolvi-
das em importantes cadeias metabóli-
cas, além da homologia entre genes
envolvidos na simbiose destas plantas
com bactérias fixadoras de nitrogênio
estarem sendo estudadas (Sandal, et
al., 2003) (Fig. 2). A identificação de
tais regiões pode facilitar o isolamen-
to de genes envolvidos neste proces-
so, possibilitando o desenvolvimento
de variedades de Arachis com maior
capacidade de fixação de nitrogênio,
o que resultaria na redução da utiliza-
ção de fertilizantes nitrogenados, con-
tribuindo para uma produção de ali-
mentos mais sustentável.
Estudos de expressão gênica
O estudo da expressão gênica tem
demonstrado ser uma importante ferra-
menta no entendimento dos processos
biológicos em nível molecular. Por exem-
plo, estes estudos podem ser utilizados
na identificação de uma rede de genes
expressos de fundamental importância
no desenvolvimento de uma determina-
da estrutura, ou na resposta de um
organismo a um estímulo externo. O
estudo da expressão gênica diferencial
pode contribuir para a caracterização de
resistências, pois possibilita a identifica-
ção de genes–chave desta rede através
da comparação da expressão gênica
durante o desenvolvimento de uma es-
trutura sob condições normais e em
organismos carregando uma mutação
ou submetidos a algum tipo de stress.
Através do acúmulo de dados da expres-
são diferencial de vários genes sob dife-
rentes condições, pode-se reconstruir as
vias reguladas por estes genes, predizer
onde eles atuam e identificar novos
genes associados ao processo.
Para o entendimento da função de
um gene, é fundamental o estudo de
onde e quando ele é expresso. Recente-
mente, várias estratégias foram desen-
volvidas para permitir o estudo da fun-
ção de vários genes simultaneamente,
entre elas: a genética reversa (geração de
mutações específicas em genes de inte-
resse), screens mutagênicos (geração de
mutações randômicas e screening de um
pool de mutantes para se identificar
fenótipos de interesse) e bioinformática
(a análise dos dados gerados por todas as
estratégias acima). As estratégias acima,
associadas aos projetos genoma, que
têm como objetivo o sequenciamento do
genoma inteiro de vários organismos,
têm possibilitado o estudo sistemático da
expressão diferencial de genes em nível
de genoma como um todo. A análise da
expressão diferencial de genes em res-
posta ao ataque de um patógeno consti-
tui, portanto, uma ferramenta importan-
te no isolamento de genes de resistência
ou de fatores envolvidos com a interação
patógeno-hospedeiro.
Neste projeto, a identificação de
genes expressos diferencialmente em
germoplasma resistente de Arachis está
sendo realizada através da análise de ESTs
e de microarranjos. Para tal, várias biblio-
tecas de cDNA foram construídas a partir
de Arachis stenosperma submetido a
diferentes situações de stress (inoculado
com nematóides e fungos) as quais estão
sendo seqüenciadas de forma massal
visando à construção de um banco de
dados de ESTs e dos chips de DNA.
Uma vez isolados e confirmada
sua função, estes genes podem ser
introgredidos para o amendoim cultiva-
do ou transferidos a outras plantas de
interesse econômico, que sejam atingi-
das pelas mesmas pragas, como a soja
e feijão, para as quais já existem dispo-
níveis métodos de transformação.
O impacto da utilização
destas novas técnicas no
cultivo do amendoim
O Brasil produz atualmente apro-
ximadamente 170 mil toneladas de
amendoim, sendo o maior produtor o
estado de São Paulo, com aproximada-
mente 60 mil ha plantados e 80-90% da
produção do país (Conab, 2002). Um
dos principais problemas dos produto-
res de amendoim deste estado é o
ataque de doenças fúngicas de parte
aérea, como a mancha barrenta
(Didymella arachidicola), mancha cas-
tanha (Cercospora arachidicola), man-
cha preta (Cercosporidium personatum),
ferrugem (Puccinia arachidis) e
verrugose (Sphaceloma arachidis). A
principal cultivar plantada no país é a
cv. Tatu, com aproximadamente 80%
da área plantada e é altamente suscep-
tível às doenças acima citadas. A última
cultivar de A. hypogaea lançada pelo
Instituto Agronômico de Campinas
(IAC), a IAC-Caiapó, é de ciclo longo
(com 130 dias) e possui resistência
moderada às cercosporioses, à mancha
barrenta e a ferrugem (Conab, 2002).
As espécies silvestres da secção
Arachis têm sido utilizadas no melhora-
mento do amendoim na Índia, Argentina,
Estados Unidos e Brasil. Várias das espé-
cies, que, na maioria, são brasileiras,
possuem níveis de resistência a pragas e
doenças superiores aos encontrados em
acessos de A. hypogaea (Stalker & Moss,
1987; Fávero et al., 2000 e 2001). A falta de
informações sobre o potencial destas
espécies para o melhoramento de cultiva-
res é a principal barreira para seu uso. As
69 espécies silvestres de Arachis descritas
e existentes são restritas ao Brasil, Bolívia,
Paraguai, Argentina e Uruguai, sendo 57
endêmicas ao Brasil. As expedições de
coleta realizadas desde 1959 têm permiti-
do a preservação de mais de 1600 acessos
no banco de germoplasma, localizado na
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecno-
logia, através de seu curador e principal
coletor, Dr. José Francisco M. Valls. Neste
banco de germoplasma, há acessos que
representam todas as espécies de Arachis,
exceto uma, Arachis martii, considerada
extinta.
A identificação de espécies resis-
tentes a doenças e pragas e a localização
de marcadores associados aos genes de
interesse auxiliarão sobremaneira a sele-
ção de plantas com resistência, desde as
primeiras fases do programa de melho-
ramento, até a obtenção de novas culti-
vares. Acredita-se que a possibilidade da
piramidização de genes tornará as novas
cultivares com resistências mais dura-
douras do que se fosse utilizada apenas
a seleção baseada em avaliação agronô-
mica e fitopatológica das plantas, pois
será possível a identificação de marcado-
res moleculares ligados a genes de resis-
tência localizados nos genomas A e B
oriundos de espécies silvestres e incor-
porados ao amendoim cultivado.
O projeto irá propiciar o diálogo
mais intenso entre os parceiros na coope-
ração científica e tecnológica entre a
União Européia e América Latina. Isto
também beneficiará o treinamento de
jovens pesquisadores em tecnologias de
ponta em genômica e citogenética. Os
mapas genéticos gerados e o mapeamen-
to comparativo entre os genomas de
Arachis e Lotus poderão facilitar o melho-
ramento de amendoim e, possivelmente,
os programas de melhoramento de outras
leguminosas. O desenvolvimento de va-
riedades melhoradas de amendoim adap-
tadas à América Latina auxiliará na redu-
ção do uso de defensivos agrícolas e
poluição associada, sem perdas na produ-
tividade, contribuindo para o desenvolvi-
mento sustentável da agricultura.
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119
 Pesquisa
Ana Paula Pacheco Clemente
Bióloga, Especialista em Bioética, Direito e
aplicações, coordenadora e professora dos cursos de
pós-graduação lato sensu e extensão em Bioética da
PUCMinas e UFLA, e do curso de extensão em
Tanatologia e Bioética do IEC-PUC Minas, membro
da diretoria do Capítulo de Bioética da SBCM,
consultora da Comissão de Bioética e Biodireito da
OAB-MG, membro fundador e da Diretoria
Executiva da Sociedade Brasileira de Bioética
Regional Minas Gerais.
paulaclemente@bioconsulte.bio.br;
paulaclemente@bol.com.br
120 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
Bioética
A área das ciências biológicas é
a que mais privilegia o conceito de
Bioética da forma como foi concebi-
do inicialmente. Ela possui um cam-
po muito vasto de atuação para o
profissional que transita entre a área
da saúde e a do meio ambiente.
Segundo Potter, criador do termo,
que era biólogo e oncologista, a atu-
ação da Bioética seria buscar a boa
qualidade de vida, pela interação do
ser humano com o meio ambiente.
Esse conceito foi adaptado pelo Ins-
tituto Rose e Kennedy de Reprodu-
ção Humana e Bioética, que tornou
assim a Bioética voltada para a
biomedicina e a biotecnologia. A
Bioética tradicional, dos EUA, é ba-
seada em quatro princípios funda-
mentais, que são:
Autonomia: direito do paciente
de participar ativamente de seu trata-
mento, refutando, concordando, dis-
cutindo e decidindo junto com o
médico a melhor conduta a ser toma-
da. Esse conceito vem da filosofia,
uma vez que o termo supramencio-
nado significa autogoverno. Entre-
tanto, para que tal aconteça, o sujeito
(paciente) deve receber informações
claras e precisas sobre seu quadro
clínico, diagnóstico, tratamento e
prognóstico.
Beneficência e não-maleficência,
as quais possuem origem hipocrática.
A primeira pugna por sempre buscar
o bem do paciente; já a segunda
determina que, existindo dúvida
quanto ao bem a ser ofertado ao
paciente e sobre os seus efeitos
Pluralidade e transdisciplinaridade
colaterais, ou seja, se estes forem
maiores que aqueles, o médico não
deve atuar, uma vez que a atuação
médica deve sempre buscar o bem
do paciente.
O princípio da justiça prega o
livre acesso de todos a um tratamen-
to médico de qualidade, e a livre
distribuição dos progressos da medi-
cina para todos os seres humanos.
Deve-se ressaltar a existência,
antes de Potter, dos movimentos
pré-bioéticos, tais como o Código
de Nuremberg, o qual estabeleceu
regras mínimas para pesquisas clíni-
cas em seres humanos, e a Declara-
ção Universal dos Direitos Huma-
nos, que estipula direitos e garantias
mínimos de respeito à vida humana.
Ambos buscaram impedir reincidên-
cias das atrocidades cometidas pela
humanidade nas duas grandes guer-
ras mundiais.
Hodiernamente, bioética é a
parte da ética que cuida das questões
referentes à vida humana, à saúde,
aos avanços da biotecnologia e aos
efeitos destes sobre o homem. Busca
sempre o bom e o melhor para o ser
humano, possuindo, desta forma, um
caráter antropocentrista bastante
acentuado, que busca privilegiar a
interação homem/meio ambiente.
A atuação do biólogo no meio
ambiente busca a proteção da biodi-
versidade, a manutenção de espécies
em vias de extinção, a preservação
do meio ambiente e da qualidade de
vida. O licenciamento ambiental e o
relatório de impacto ambiental de
responsabilidade técnica do biólogo
é de extrema importância para evitar
acidentes ecológicos. O Brasil possui
uma legislação ambiental que regu-
lamenta as atividades dos profissio-
nais que atuam na área. A Bioética
influencia nas decisões à medida
que analisa a interação do ser huma-
no com o ambiente e os reflexos
causados pelas ações propostas pelo
homem.
Mais recentemente temos tido
discussões sobre transgênicos e
OGMs, não só na área de meio
ambiente, mas também na área mé-
dica, com a produção de animais
transgênicos para transplante de
órgãos, vacinas e medicamentos
manipulados geneticamente. Temos
também biotecnologia na formação
de biomateriais, reprodução huma-
na assistida, que gera grandes polê-
micas por causa da doação de sê-
men, óvulo, útero de substituição,
que muda os pilares de filiação,
trazendo gêmeos em idades diferen-
tes, crianças com até cinco pais,
crianças com material genético de
três pais em resultado de exame de
DNA com técnica de rejuvenesci-
mento de óvulo; gestação após a
morte dos pais biológicos, mudança
de paradigma quanto à filiação, pri-
vilegiando a paternidade e materni-
dade sócio-afetivas.
O Projeto Genoma Humana com
a descoberta de todos os genes hu-
manos , trará benefícios e proporcio-
nará, daqui a alguns anos, a cura para
várias doenças. Nesse âmbito haverá
um avanço na medicina preditiva
que, através da avaliação genética,
pode fazer o diagnóstico de várias
doenças que poderiam se manifestar
ou não no futuro. Hoje já é possível
fazer o diagnóstico de algumas doen-
ças, porém não é possível curá-las, os
benefícios são apresentados na
melhoria da qualidade de vida e da
adaptação do paciente.
Já há algumas décadas, a medi-
cina fetal proporciona, através do
diagnóstico pré-natal, a possibilida-
de de diagnóstico de doenças cro-
mossômicas, como a síndrome de
Down. Hoje, contamos com a biotec-
nologia por meio do diagnóstico ge-
nético pré-implantação; podemos
fazer a análise genética retirando um
blastômero do embrião, ou seja, uma
célula totipotente, que poderá virar
outro ser humano idêntico ao da
célula de onde foi retirado. Dessa
forma, o diagnóstico é realizado no
embrião, não havendo necessidade
de retirar nenhum material biológico
após a implantação, para não correr
o risco de um aborto.
Com a descoberta de doenças
genéticas pela micromanipulação de
embriões, é possível descartar esses
embriões “anormais” pondo em prá-
tica a chamada Eugenia doce, que
seria o descarte de embriões e fetos
com defeitos congênitos. Aí surge a
discussão sobre o que é normal e o
que é anormal. Caso do casal surdo-
mudo que recorreu ao banco de sê-
men para buscar um doador de sê-
men surdo para ter seu bebê.
A terapia gênica vai proporcio-
nar através da utilização de vetores,
como vírus e bactérias, a cura das
doenças das quais forem localizados
os genes que as causam, removendo
ou acrescentando o gene saudável à
pessoa.
Outra questão discutida pela
Bioética é o direito à identidade ge-
nética nos casos em que a criança foi
adotada ou tenha nascido por inter-
médio de material genético doado, o
que não desfaz o vínculo de paterni-
dade; direito não para fins de heran-
ça nem tampouco para negatória de
paternidade, mas, simplesmente, pelo
direito de conhecer suas origens. O
advento do exame de DNA trouxe a
certeza biológica, mas muitos têm
utilizado tal exame de forma errônea.
Deve-se ter sempre o exame de DNA
como mais uma prova judicial a ser
juntada aos autos do processo, a fim
de preservar a dignidade e a privaci-
dade humanas. Ninguém é obrigado
a fornecer prova contra si mesmo.
A banalização do exame de DNA
tem trazido conseqüências indesejá-
veis não só para o Direito de Família
e de Sucessões, mas também para a
Criminalística, porque ainda existem
peritos despreparados para coletar o
material biológico na cena do crime.
É preciso seriedade e responsabilida-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003
de para utilizar tal prova; deve-se
evitar contaminação do material,
armazená-lo de forma adequada, ter
uma cadeia de custódia, solicitar au-
torização por escrito nos casos de
investigação de paternidade ou de
maternidade.
Assim, as questões da bioética
podem ser classificadas como emer-
gentes, aquelas advindas do avanço
da biotecnologia e da biociência, e
persistentes as que possuem suas
origens na má distribuição de recur-
sos e em um sistema econômico
excludente. Por esse motivo, a
bioética deve recortar seu sujeito de
trabalho por etnia, raça, sexo e con-
dição econômica, uma vez que a
busca do que é bom e melhor varia
de acordo com essas características.
Devido à complexidade dos va-
lores envolvidos em sua atuação,
esse campo de discussão revela-se
como a ciência da composição, ou
seja, todos os assuntos dentro do
âmbito de atuação da bioética atin-
gem toda a sociedade, logo, as deci-
sões sobre eles devem ser tomadas
com a participação de todas as par-
tes envolvidas.
A Bioética busca uma reflexão
da biotecnologia apresentada pelas
ciências biomédicas para que elas
possam ser utilizadas em benefício
da sociedade. Busca o melhor para a
coletividade, fazendo interagir o ho-
mem com o meio ambiente, com
vistas a propiciar a ele uma melhor
qualidade de vida. O trabalho
transdisciplinar faz-se necessário a
fim de proporcionar um atendimen-
to mais humanizado e justo na área
das ciências da vida. Dessa forma,
buscam-se soluções novas para con-
flitos novos.
Destarte, a bioética representa a
ciência do diálogo transdisciplinar, ou
melhor, propõe a composição possí-
vel com os vários estranhos morais,
pois um médico para atuar bioetica-
mente deve respeitar a individualida-
de de seu paciente e o advogado que
abraçar causa tão apaixonante deve
conhecer biomedicina e os avanços
biotecnológicos. Assim como cada
profissional, na sua área de atuação,
deve buscar essa composição.
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