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ADILSON MACHADO ENES

ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DE TECIDOS VIVOS E TECIDOS MORTOS

EM SEMENTES DE FEIJÃO (Phaseolus Vulgaris l.) PELA ÓPTICA DO BIOSPECKLE LASER

Monografia de projeto orientado apresentada ao

Departamento de Engenharia da Universidade
Federal de Lavras como parte das exigências do
curso de Engenharia Agrícola, para a obtenção do
título de Engenheiro Agrícola.

Orientador
Prof. Roberto Alves Braga Júnior

LAVRAS-MG
2005
 2

ADILSON MACHADO ENES

ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DE TECIDOS VIVOS E TECIDOS MORTOS

EM SEMENTES DE FEIJÃO (Phaseolus Vulgaris l.) PELA ÓPTICA DO BIOSPECKLE LASER

Monografia de projeto orientado apresentada ao

Departamento de Engenharia da Universidade
Federal de Lavras como parte das exigências do
curso de Engenharia Agrícola, para a obtenção do
título de Engenheiro Agrícola.

APROVADA em ___ de _________ de _____.

Prof. ________________________

Prof. ________________________

Prof. _____________________
(Orientador)

LAVRAS-MG
2005
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OFEREÇO

A Deus.

DEDICO
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Aos meus familiares, em especial aos meus pais, Olavio Machado enes e Maria Leida Meri
Enes.
AGRADECIMENTOS

À Deus, por sempre ter iluminado o meu caminho.

Àos meus familiares, em especial aos meus pais Olávio Machado Enes e Maria Leida Meri
Enes, pelo apoio, incentivo e dedicação, sem os quais teria sido impossível a realização deste
curso.
À Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de Engenharia pela realização do curso
de Engenharia Agrícola.
Ao PIBIC/CNPq pela concessão da bolsa de pesquisa permitindo a realização de parte desse
trabalho.
Aos professores Roberto Alves Braga Júnior e Giovanni Francisco Rabelo, pela orientação,
dedicação e amizade demonstrada durante esses anos e por ter me permitido fazer parte de sua
equipe de pesquisa, acreditando em meu potencial.
Aos professores Flávio Meira Borém e Maria Laene Moreira de Carvalho, por toda a
orientação dada na parte de sementes.
Ao professor Daniel furtado Ferreira e aos Monitores de estatística da Pós-graduação, pela
orientação nas análises estatísticas.
Aos colegas e ex-colegas do laboratório de laser e óptica, em especial a Silvestre Rodrigues,
Álvaro Leonardo do Nascimento, Túlio Seabra e a toda a equipe de computação pela
orientação e auxílio dado nessa área.
À laboratorista Dalva e a todo o pessoal do laboratório de sementes e do laboratório de
processamento de produtos agrícolas da UFLA.
Aos amigos do 308, Nicolau Macedo Santos, Marciel José Ferreira, Paulo Ademar Avelar
Ferreira, Carlos Henrique, Esdras Henrique e a todos os outros com quem tive a felicidade de
compartilhar o mesmo teto.
A todos os professores que contribuíram para a minha formação.
Às secretárias Juliana e Sandra (graduação), Iara (colegiado), Patricía (pesquisa).
A todos os amigos que estiveram comigo durante esses cinco anos.
 5

RESUMO

Este trabalho tem como objetivo contribuir para o desenvolvimento da metodologia do

biospeckle laser aplicado à analise de sementes. Uma das etapas do controle de qualidade de
sementes é a da inspeção da viabilidade e do vigor, o que atualmente tem sido feito com
análises subjetivas e lentas. O biospeckle é um fenômeno óptico de interferência que ocorre
quando a luz laser incide sobre uma superfície onde se desenvolve um processo dinâmico
biológico ou não biológico. Atividades vitais de materiais biológicos alteram os padrões de
interferência da luz laser, alterando, por conseqüência, o padrão temporal do speckle. O padrão
temporal do speckle deve ser analisado com técnicas de processamento de imagens e
tratamento estatístico, uma vez que a observação visual permite apenas a identificação da
existência do fenômeno, mas não permite quantificá-lo. Para quantificar variações temporais
foi utilizado um método denominado Módulo de Dispersão de Intensidade do padrão temporal
de speckle. Esse parâmetro de quantificação é obtido através do estudo de séries temporais
aplicado ao tratamento de imagens que registram a ocorrência do fenômeno biospeckle. Os
trabalhos permitiram a extração de informações importantes para uma melhor compreensão da
interação do laser com materiais biológicos e dos diversos fatores que interferem no processo,
tais como teor de água do material analisado e a própria interferência ambiental. Através de
um estudo contínuo e prolongado da variação temporal dos padrões do speckle conseguiu-se
verificar como os diversos teores de água das amostras influenciam o fenômeno, tanto nos
tecidos vivos quanto nos tecidos mortos.
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SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 7
2 - REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 9
3 - METODOLOGIA ............................................................................................................ 11
3.1 - Descrição Geral......................................................................................................... 11
3.2 - Configuração Experimental ....................................................................................... 11
3.4 - Aplicativos Computacionais Utilizados ..................................................................... 12
3.5 - Experimentos ............................................................................................................ 13
3.5.1 - Experimento 1: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E
Tecidos De Sementes Submetidas Ao Processo De Envelhecimento Artificial................13
3.5.2 - Experimento 2: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E
Tecidos De Sementes Submetidas Ao Processo De Congelamento..................................15
3.5.3 - Experimento 3: Estudo Da Interação Dinâmica De Interferência Da Água Em
Tecido Vivo E Tecido Morto De Sementes.......................................................................16
4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 19
4.1 - Experimento 1: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E Tecidos
De Sementes Submetidas Ao Processo De Envelhecimento Artificial. ............................... 19
4.2 - Experimento 2: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E Tecidos
De Sementes Submetidas Ao Processo De Congelamento. ................................................ 21
4.3 - Experimento 3: Estudo Da Interação Dinâmica De Interferência Da Água Em Tecido
Vivo E Tecido Morto De Sementes. .................................................................................. 24
5 - CONCLUSÃO ................................................................................................................. 32
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 33
7
 7

1 - INTRODUÇÃO

As propriedades físicas e mecânicas de frutos e vegetais vem sendo pesquisadas

visando desenvolver equipamentos de medição e seleção correlacionando parâmetros
objetivos com variações fisiológicas. Embora alguns métodos de analises de sementes sejam
largamente utilizados ainda não existe uma técnica padronizada internacionalmente. Alguns
novos métodos estão sendo pesquisados e utilizam técnicas de medição de ressonância, raios
X, e análise de resposta a estímulos luminosos para avaliar a viabilidade de sementes.
Atualmente alguns métodos ópticos de análise de materiais biológicos estão se
baseando na técnica da visão artificial (“machine vision”) e técnicas de processamento de
imagens. Uma outra linha de métodos ópticos está relacionada ao fenômeno “biospeckle”
laser. A observação da incidência da luz laser em um objeto nos leva a perceber a figura de
interferência conhecida por “speckle” (granulado), que é proveniente da alta coerência da luz
laser. Em uma superfície ou objeto que apresente algum tipo de atividade, podendo ser
proveniente de processos biológicos ou não, o fenômeno do “speckle” se transforma no
“speckle ” dinâmico ou “biospeckle”.
A simples detecção da ocorrência do fenômeno não pode ser utilizada para avaliar a
atividade biológica dos materiais sob estudo, por outro lado, quando se aplica técnicas de
tratamento de imagens para se extrair informações mais objetivas do fenômeno óptico, torna-
se possível estudar pequenos movimentos aleatórios das partículas constituintes dos materiais.
Alguns resultados satisfatórios foram obtidos em estudos de processos de secagem de pintura,
oxidação de superfícies, coagulação de sangue e também em exames parasitológicos de
sangue, dentre outros.
As propriedades estatísticas do “biospeckle” e um modelo matemático de sua descrição
ainda merecem estudos mais profundos, pois envolvem uma complexidade constitutiva dos
materiais, e na movimentação ou atividade dos mesmos. O tecido vegetal é heterogêneo,
sendo constituído por diferentes materiais de forma e tamanhos distintos, o que dificulta ainda
mais o desenvolvimento de um modelo que explique o fenômeno. Independente disso é
possível quantificar a variação temporal do “biospeckle”e, permitindo-se obter informações
capazes de estimar a atividade do meio sob estudo.
 8

Uma das etapas do controle de qualidade de sementes é a da inspeção da viabilidade e

do vigor com análises subjetivas, lentas e não automáticas.
Até o momento não foi possível estabelecer uma metodologia que consiga a
identificação conclusiva de danos em semente. Assim, faz-se necessário a continuidade da
pesquisa que possa conduzir a uma aplicação prática do fenômeno na avaliação de viabilidade
e vigor de sementes.
Este trabalho tem como objetivo contribuir para o desenvolvimento de metodologias,
utilizando “biospeckle”, que permitam extrair informações referentes ao nível de atividade
biológica da semente, buscando estudar os fatores que interferem nesse processo. O primeiro e
o segundo experimento têm como objetivo especifico, diferenciar utilizando o laser, tecido de
sementes viáveis de tecido de sementes mortas, sendo que no primeiro experimento as
sementes mortas foram obtidas por um processo de envelhecimento artificial, já no segundo
experimento as sementes mortas foram obtidas por um processo de congelamento. O terceiro
experimento tem como objetivo específico isolar a variável umidade, através de um estudo
contínuo e prolongado das variações temporais do padrão do “Speckle”.
 9

2 - REVISÃO DE LITERATURA

O “biospeckle” pode ser definido como sendo um fenômeno óptico de interferência que
ocorre quando a luz laser incide sobre uma superfície onde se desenvolve um processo
dinâmico (RABELO, 2000). Esse fenômeno é bem conhecido em estudos de óptica, e ocorre
quando a luz laser se dispersa sobre uma superfície incidente, a qual exibe algum tipo de
atividade (DAINTY,1975). Pode ser notado quando se ilumina, com luz laser, material
biológico, como por exemplo, sementes, ou em fenômenos não biólogos como a corrosão e a
evaporação. Se o objeto difusor se move, os grãos individuais do padrão de “speckle” também
se movem alterando assim, a sua forma. Isso permite supor que os padrões de “speckle”
dinâmico contêm informações sobre o movimento do objeto. Esse fenômeno é muitas vezes
denominado de “boiling speckle” devido ao fato de sua aparência visual ser similar a um
líquido em ebulição, podendo também ser descrito como um fervilhamento luminoso. Por ser
dinâmico, o “biospeckle” deve ser analisado com técnicas de processamento de imagens e
tratamento estatístico, uma vez que a observação visual permite apenas a identificação da
existência do fenômeno, mas não permite quantificá-lo (RABAL et al, 1998).
A água é um constituinte básico de materiais biológicos e segundo (BERGKVIST
,1997), não absorve a luz do laser de HeNe de comprimento de onda 632 nm. Por outro lado,
em uma semente, a quantidade de água está relacionada com a intensidade do processo
metabólico. A utilização do “speckle” na área biológica tem sido uma linha de grande
potencial, pouco explorada e as aplicações existentes foram desenvolvidas de forma
superficial (RABAL et al, 1998). (BRAGA JR, 2000) observou a influencia de outros fatores
no fenômeno biospeckle, como o teor de água e a atividade de fungos. (RIBEIRO et al, 2004),
propõe a utilização do biospeckle no monitoramento da atividade observada em biscoitos de
polvilho com diferentes teores de água, comparando com a cinética de sorção da água.
(BRAGA JR, 2000) realizou estudos do biospeckle em sementes, visando correlacionar
o biospeckle com a viabilidade e o vigor. O autor evidencia a possibilidade de utilização da
técnica para medir atividade biológica em sementes, destacando a necessidade de realização
de novos estudos investigando o comportamento de tecidos vivos e mortos em sementes.
(RODRIGUES, 2003) utilizou o biospeckle para separar tecidos vivos de tecidos mortos em
sementes de feijão e evidenciou que a técnica poderá ser usada como indicador de viabilidade
de sementes. (NASCIMENTO et. al, 2004) apresentou um modelo baseado na óptica de
 10

Fourier. Ao ser comparado com os resultados obtidos da iluminação de feijão (Phaseolus

vulgaris L.), mostrou-se capaz de reproduzir as principais características responsáveis pela
formação do speckle dinâmico. A ferramenta estatística utilizada como comparação foi a
autocorrelação.
Para a análise de nível de atividade de material biológico, o que se tem proposto com o
uso do laser é a utilização do método denominado Modulo De Dispersão De Intensidade do
padrão temporal do speckle conforme descrito por (RABELO, 2000).
 11

3 - METODOLOGIA

3.1 - Descrição Geral

Os trabalhos foram realizados nos laboratórios de Laser e Óptica e de Processamento

de Produtos Agrícolas do Departamento de Engenharia e no laboratório de Sementes do
Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras.
Nos experimentos foram utilizados, um microcomputador, aplicativos computacionais
para processamento de imagens, uma fonte de luz laser e uma câmera CCD (“Charge Coupled
Detector”).
A fonte de luz utilizada é um laser de HeNe (Hélio,Neônio) vermelho, de
comprimento de onda de 632.8 nm, fabricante coherent.
Para tratamento das imagens foram utilizados aplicativos computacionais
desenvolvidos em linguagem C, e na captura foi utilizada a placa de aquisição PXC200 color
frame Grabber da Imagenation.
A câmera de vídeo consiste basicamente em um arranjo de cerca de 780x480 detectores
de semicondutor denominados dispositivos de carga acoplada (CCD’s). O conjunto é formado
por elementos detectores feitos de silício e é sensível aos comprimentos de onda que abrangem
a faixa de aproximadamente 400 nm (azul) a aproximadamente 1,1 m (infravermelho
próximo).
Foi utilizado um expansor de feixes para que se conseguisse incidir o laser em uma
maior área da semente. A altura da câmera até a placa onde se encontravam as sementes foi de
15,2 cm.
Para garantir a estabilidade do laser, o emissor era ligado uma hora antes do inicio da
iluminação.

3.2 - Configuração Experimental

O laser passa por uma lente (expansor de feixe) e atinge um espelho, cuja função é
direcionar o feixe para a semente. Parte do laser que atinge a semente é refletida e atinge a
câmera CCD. O foco da câmera é ajustado para pegar a imagem de apenas uma semente por
 12

vez. Em cada iluminação são capturadas 512 imagens para a formação da matriz STS. As
imagens são enviadas para um microcomputador PC para processamento digital. Na figura 4
está representada a configuração experimental.

Câmera CCD

Computador
Espelho

Laser HeNe Expansor de feixe

Sementes
Figura 4 – Configuração Experimental

3.4 - Aplicativos Computacionais Utilizados

Na captura das imagens e geração da matriz STS foi utilizado o aplicativo

computacional “aquisição.c”. Na quantificação da matriz STS foi utilizado o aplicativo
“MI.c.” Os aplicativos Sisvar e Excel da Microsoft foram utilizados na análise estatística e
geração dos gráficos.
 13

3.5 - Experimentos
A pesquisa foi dividida em três fases, a saber:

 Diferenciação entre tecidos de sementes recém colhidas e tecidos de sementes

submetidas ao processo de envelhecimento artificial. Na qual foi investigada a
sensibilidade do método a níveis intermediários de atividades.

 Diferenciação entre tecidos de sementes recém colhidas e tecidos de sementes

submetidas ao processo de congelamento. Na qual foi investigada a capacidade do
método de diferenciar níveis extremos de atividade.

 Estudo da interação dinâmica de interferência da água em tecido vivo e tecido

morto de sementes de feijão (Phaseolus Vulgaris L.). Na qual foi investigada a
capacidade do método de diferenciar níveis extremos de atividade em uma ampla
faixa de teor de água.

3.5.1 - Experimento 1: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E

Tecidos De Sementes Submetidas Ao Processo De Envelhecimento Artificial.

3.5.1.1 - Preparação Das Amostras

Foram utilizados dois lotes de sementes de feijão (Phaseolus Vulgaris L.), sendo um
de sementes novas e outro de sementes que apresentavam um alto grau de envelhecimento
natural. As sementes foram armazenadas em caixas do tipo gerbox, e levadas a uma B.O.D, a
42º C, para promover um envelhecimento artificial. Parte desse lote foi retirado após 96 horas
e parte retirado após 140 horas. Em seguida as sementes foram submetidas ao teste do
tetrazólio, a fim de se certificar se o nível de vigor nulo havia sido atingido.

3.5.1.2 - Análise De Viabilidade

O Teste de Tetrazólio foi conduzido com quatro repetições de 50 sementes por

subamostras. As sementes foram embaladas em papel toalha umedecido e colocadas em
 14

germinador, à temperatura de 25ºC, por um período de 16 horas. Após o pré-condicionamento

as sementes foram colocadas em frascos béquer, sendo totalmente submersas na solução de
tretazólio (0,1%), e submetidas à uma temperatura de 35ºC durante quatro horas. Alcançada a
coloração, as sementes foram lavadas com água e mantidas submersas até o momento da
avaliação.

3.5.1.3 - Determinação Do Teor De Água Nas Sementes

Os experimentos foram realizados com umidade uniforme das sementes, e o método

utilizado para a determinação da umidade foi o método da estufa, por amostragem, conforme
descrito por Brasil (1992). Decidiu-se então utilizar o nível de 30% b.u. para os três
tratamentos de forma que as sementes foram umedecidas artificialmente até atingir
aproximadamente 30 % b.u.

3.5.1.4 - Delineamento Experimental

Foram utilizadas 327 sementes, sendo 109 para cada tratamento, totalizando assim três
tratamentos, sendo eles: N – sementes novas, E96 – sementes envelhecidas a 96 horas , E140 –
sementes envelhecidas a 140 horas.
O delineamento experimental foi planejado em D.I.C (Delineamento Inteiramente
Casualisado).As sementes foram colocadas em embalagens de polietileno, para evitar a troca
de umidade com o meio, sendo retiradas uma - a - uma e cortadas longitudinalmente. O teste
proposto foi aplicado em um dos cotilédones sendo o outro cotilédone descartado. As imagens
capturadas foram analisadas para se determinar e quantificar a variação temporal do speckle.
Como indicador dessa variação foi utilizado o Momento de Inércia (M.I) Verificou-se a
ausência de normalidade nos dados observados, sendo necessária assim uma transformação
log (x + 1) para se proceder as análises estatísticas, onde se utilizou o teste de F e o teste t de
Student.
 15

3.5.2 - Experimento 2: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E

Tecidos De Sementes Submetidas Ao Processo De Congelamento.

3.5.2.1 - Preparação Das Amostras

As amostras foram divididas em duas subamostras, sendo uma de sementes de feijão

(phaseolus vulgaris l.) recém colhidas e a outra de sementes submetidas à baixa temperatura.
O procedimento consistiu em deixar a semente embeber em água durante 16 horas em caixas
do tipo gerbox e submetê-las, após esse período, ao congelamento a 18ºC negativos por 24
horas.

3.5.2.2 - Análise De Viabilidade

Para verificar a viabilidade e o vigor dos lotes, foram conduzidos o teste de Tetrazólio,
conforme descrito para o experimento 1, e o teste de germinação. O teste de germinação foi
realizado com quatro repetições de 50 sementes por subamostra. Visando o adequado
umedecimento das sementes, o papel toalha, utilizado como substrato, foi embebido em água
destilada na quantidade de 2,5 vezes o seu peso seco. O germinador onde as sementes ficaram
acondicionadas foi regulado à temperatura de 250C. As contagens foram realizadas no 50 e 9º
dia após a semeadura.

3.5.2.3 - Avaliação Da Sanidade Das Sementes

O teste de sanidade foi aplicado para verificar a presença de fungos. A metodologia

utilizada foi a de incubar as sementes em papel de filtro com restrição hídrica. As sementes
foram distribuídas em Placas de Petri de 15 cm de diâmetro, sendo 4 repetições (25 sementes
por Placa) contendo três folhas de papel de filtro previamente esterilizadas e umedecidas com
soluções osmóticas de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl) e manitol, com
potencial de –1 Mpa. As sementes foram incubadas em câmara com temperatura de 20C 
2C e fotoperíodo de 12 horas de luz negra durante 7 dias para a primeira contagem e por mais
7 para verificar a presença de Colletotrichum lindemunthianum.
 16

3.5.2.4 - Determinação Do Teor De Água Nas Sementes

Os experimentos foram realizados com umidade uniforme das sementes, e o método

utilizado para a determinação da umidade foi o método da estufa, por amostragem, conforme
descrito por Brasil (1992). Decidiu-se então utilizar o nível de 18% b.u. para os dois
tratamentos de forma que as sementes foram umedecidas artificialmente até atingir
aproximadamente 18 % b.u.

3.5.2.5 - Delineamento Experimental

Foram utilizadas 220 sementes, sendo 110 para cada tratamento, totalizando assim dois
tratamentos, sendo eles: sementes novas e sementes submetidas ao congelamento.
O delineamento experimental foi planejado em D.I.C (Delineamento Inteiramente
Casualisado).As sementes foram colocadas em embalagens de polietileno, sendo retiradas uma
- a - uma e cortadas longitudinalmente. O teste proposto foi aplicado em um dos cotilédones
sendo o outro cotilédone descartado. As imagens capturadas foram analisadas para se
determinar e quantificar a variação temporal do speckle. Como indicador dessa variação foi
utilizado o Momento de Inércia (M.I) Verificou-se a ausência de normalidade nos dados
observados, sendo necessária assim uma transformação log.n para se proceder as análises
estatísticas, onde se utilizou o teste de F e o teste de Tukey.

3.5.3 - Experimento 3: Estudo Da Interação Dinâmica De Interferência Da Água Em

Tecido Vivo E Tecido Morto De Sementes.

3.5.3.1 - Preparação das Amostras

Para a realização dos experimentos, a semente escolhida foi a de feijão (Phaseollus

Vulgaris L.).
Parte do lote de sementes foi colocada num frízer durante 48 horas, a 80º C negativos,
com o objetivo de inviabilização. Após esta etapa, as sementes ficaram submersas em solução
contendo cada 90ml de água destilada 10ml de hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) até
atingirem o estado de turgescência, o que ocorreu 16 horas depois.
 17

3.5.3.2 - Delineamento Experimental

Após a embebição as sementes tiveram seus tegumentos retirados e foram afixadas

isoladamente, em quatro placas retangulares (figura 3), duas placa contendo cada uma 15
sementes vivas e as outras duas contendo 15 sementes mortas. Apenas duas placas, uma com
sementes vivas e outra com sementes mortas, foram iluminadas sendo que as outras duas
destinaram-se ao monitoramento do teor de água (placas testemunhas). As sementes foram
iluminadas individualmente. Objetivando conseguir uma maior casualidade, a ordem das
placas era invertida a cada nova iluminação. O intervalo entre iluminações foi de quatro horas,
com exceção do último intervalo que foi de oito horas.

Placa de plástico Fundo de

fita adesiva

Sementes

Figura 3 – Esquema de fixação das sementes na placa

3.5.3.3 - Monitoramento do Teor de Água nas Sementes

O monitoramento da umidade das sementes foi feito por pesagem. Cada placa foi
pesada, em balança de precisão, antes e após fixação das sementes. Antes de cada iluminação
as placas eram pesadas novamente. No final do experimento as sementes das placas
testemunhas foram colocadas em estufa a 105 ºC durante 24 horas. O teor de água no final do
experimento foi determinado comparando-se o peso das sementes antes e após a secagem, de
acordo com a seguinte fórmula:
 18

U  (( PI  Pf ) / PI ) x100

onde: U= umidade em base úmida (b.u)

PI = peso inicial

Pf = peso final

Com base no teor de água encontrado no final do experimento, foi possível determinar
o teor de água em cada iluminação através da fórmula abaixo:

Uf  (100 x(Ui  PP) /(100  PP))

onde:Uf= umidade final (b.u)

Ui= umidade inicial (b.u)

PP= variação percentual do peso

3.5.3.4 - Teste Comparativo

Após a iluminação as sementes foram submetidas ao teste de tetrazólio conforme

descrito para o experimento 1, sendo posteriormente avaliadas quanto a sua coloração e
fotografadas.
 19

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 - Experimento 1: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E

Tecidos De Sementes Submetidas Ao Processo De Envelhecimento Artificial.

4.1.1 - Teste de Tetrazólio

A tabela 1 apresenta os resultados do teste de tetrazólio para os três tratamentos, onde

se observa que as sementes envelhecidas atingiram o nível zero de vigor e viabilidade.

TABELA 1: Percentual de Vigor e Viabilidade de Sementes Recém Colhidas e de Sementes

Envelhecidas Artificialmente a 42º C Após 96h e 140h. UFLA, Lavras, MG, 2005.

Sementes Vigor(%) Viabilidade(%)

Recém colhidas 88 98
Envelhecidas a 96h 0 0
Envelhecidas a 140h 0 0

4.1.2 - Teor de Água

A umidade final das sementes em percentual de base úmida é apresentada na tabela 2

para os três tratamentos.

TABELA 2: Percentuais de Umidade em Base Úmida Sementes Recém Colhidas e de

Sementes Envelhecidas Artificialmente a 42º C Após 96h e 140h. UFLA, Lavras, MG, 2005.

Sementes Umidade
% b.u.

Recém colhidas 30,37

Envelhecidas a 96h 29,60
Envelhecidas a 140h 30,19
 20

4.1.3 - Análise Estatística

Fixado o valor nominal a 5% o teste F mostrou-se significativo, indicando que havia

pelo menos uma diferença significativa entre as médias dos três tratamentos, conforme
mostrado na análise de variância dos dados transformados apresentado na (Tabela 3).

TABELA 3 – Analise de variância dos Dados transformados. UFLA, Lavras, MG, 2005.

FV GL SQ FC FT>FC
TRAT. 2 4,4112844 25,599 0,000
ERRO 324 0,172386
T. COR. 326
CV%=14.84; Média geral: 2.7981651; Número de observações: 327

O teste t foi usado, assumindo variâncias homogêneas, para identificar quais tratamentos
apresentaram diferenças significativas entre si. Os resultados obtidos são apresentados na
tabela 4, onde se observa que existe diferença significativa entre os dois extremos, ou seja
entre o primeiro tratamento e o terceiro tratamento ao nível de 5% de probabilidade, entretanto
as diferenças entre os dois primeiros tratamentos não foram detectadas.

TABELA 4: Teste Student (SNK) para os três tratamentos. UFLA, Lavras, MG, 2005.

Tratamento Médias Resultado do teste

Recém Colhidas 2,944954 a

Envelhecidas a 96h 2,880734 a
Envelhecidas a 140h 2,568807 b

DMS: 0,1663118; NMS: 0,01; Média harmônica do número de repetições ( r ): 109; Erro:
0,039768.

Conforme se observou o método consegue diferenciar as sementes envelhecidas a 140

horas de sementes recém colhidas (Novas), o que foi evidenciado pelo teste de Student. É de
se esperar que o metabolismo de uma semente envelhecida seja menor do que daquela jovem.
 21

O teste “biospeckle” laser trás informações de atividade metabólica. Considerando-se que os

espécimes estavam com o mesmo nível de umidade, pode-se considerar o momento de inércia
como um indicador de viabilidade.
Para o lote de sementes envelhecidas a 96 horas (E96) não foi percebida diferença
significativa pelo laser, o que pode indicar que embora submetida a esse tratamento existia
ainda algum nível de atividade metabólica.

4.2 - Experimento 2: Diferenciação Entre Tecidos De Sementes Recém Colhidas E

Tecidos De Sementes Submetidas Ao Processo De Congelamento.

4.2.1 - Testes de viabilidade

A tabela 5 apresenta os resultados dos testes de tetrazólio e germinação para os dois

tratamentos, onde se observa que as sementes submetidas ao congelamento atingiram nível
zero de viabilidade e germinação.

TABELA 5: Valores médios de viabilidade e germinação das sementes avaliadas de acordo

com os testes de germinação e tetrazólio. UFLA, Lavras, MG, 2005.

Sementes Germinação (%) Tetrazólio (%)

Recém colhidas 92 96
Submetidas ao congelamento 0 0

4.2.2 - Teste de Sanidade

A tabela 6 mostra os fungos encontrados no teste de sanidade.

 22

Tabela 6 – Principais fungos encontrados na avaliação da sanidade de sementes de feijão

(Phaseolus vulgaris L), pelo método do Blotter Test. UFLA, Lavras – MG, 2002.

Sementes Fungos Fungos (%)

Tecido vivo Fusarium spp 1,5

Clodosporum spp 1,5
Aspergillus spp 1,0
Alternaria spp 1,0.
Penicillium ssp. 0,5
Coletotrichum lindemunthianum 0,0

Tecido morto Fusarium spp 3,0

Coletotrichum lindemunthianum 0,0

4.2.3 - Teor de Água

A umidade final das sementes em percentual de base úmida é apresentada na tabela 7

para os dois tratamentos.

TABELA 7: Percentuais de Umidade em Base Úmida De Sementes Recém Colhidas e de

Sementes Submetidas Ao Congelamento. UFLA, Lavras, MG, 2005.

Sementes Umidade
% b.u.

Recém colhidas 18,25

Sementes submetidas ao congelamento 18,82
 23

4.2.4 - Análise Estatística

A tabela 8 apresenta a análise de variância, onde se observa que ocorreram diferenças

significativas nos Momentos de Inércia para os tratamentos. Os valores não apresentaram
uma normalidade, sendo necessário proceder à transformação log. n para a análise.

Tabela 8 - Quadro de Análise de Variância dos valores ln Momento de Inércia obtidos da

média de cada tratamento. UFLA, Lavras – MG, 2002.
FV GL SQ QM Fc Pr>Fc
Sementes 1 16,770908 16,770908 23,391 0,0000
Erro 196 140,530148 0,716991
T corrigido 197 157,3010
CV% = 18,87; Média geral: 4,51; Número de observações: 198.

Conforme evidenciado pelo teste f é possível diferenciar tecidos vivos de tecidos

mortos em sementes pelo método do “biospeckle”. O teste “biospeckle” laser trás
informações de atividade metabólica. Como as sementes estavam com o teor de água muito
próximo umas das outras, pode-se concluir que a água nas sementes não influenciou nos
resultados. Assim, pode-se considerar o Momento de Inércia como capaz de diferenciar
tecidos vivos de tecidos mortos em sementes.
O blotter test mostrou que a presença de fungos nas sementes foi pequena a ponto de
não interferir nos resultados. Mas foi observada a presença de bactérias saprófitas nas
sementes submetidas ao congelamento. As bactérias saprófitas atacam tecidos mortos. Ainda
não é conhecido o quanto a atividade de bactérias e fungos interferem nos resultados do
biospeckle. Como as bactérias possuem atividade, podem ter contribuído para que os valores
do Momento de Inércia das sementes inviabilizadas pelo congelamento atingissem médias
maiores.
 24

4.3 - Experimento 3: Estudo Da Interação Dinâmica De Interferência Da Água Em

Tecido Vivo E Tecido Morto De Sementes.

4.3.1 - Comportamento Dos Níveis De Atividade Ao Longo Do Tempo

Durante toda a iluminação os níveis médios de atividade das sementes vivas se

mantiveram acima dos níveis médios de atividade das sementes mortas. O gráfico 1 permite
visualizar o comportamento médio desses níveis ao longo do tempo.

MI x Tempo

60

50

40
Vivas
MI

30
mortas
20

10

0
0 10 20 30 40 50 60
Tempo

Gráfico 1 – comportamento médio dos níveis de atividade das sementes vivas e mortas ao
longo do tempo

O gráfico 1 mostra uma redução exponencial nos valores de MI, nas primeiras 10 horas
de iluminação, o que pode ser explicado pelo alto teor de água inicial das sementes. No
período de 10 a 24 horas, tanto as sementes vivas quanto às mortas mantiveram uma redução
linear nos valores de MI, indicando que as sementes já se aproximavam da umidade de
equilíbrio higroscópico com o ar ambiente. Nos períodos subseqüentes os valores de MI
oscilaram em função das variações ambientais. É importante observar que mesmo sofrendo
influencias ambientais os valores de MI das sementes vivas e mortas mantiveram
comportamentos semelhantes.
 25

4.3.2 - Comportamento Da Umidade Ao Longo Do Tempo

O gráfico 2 permite visualizar as variações no teor de água das sementes ocorridas ao

longo do tempo. Nesse gráfico pode-se observar que o comportamento do teor de água ao
longo do tempo é semelhante ao comportamento dos níveis médios de atividades mostrados no
gráfico 1, mostrando claramente a relação, já descrita por outros autores, entre teor de água
das sementes e MI. Outro fator a ser analisado no gráfico é o fato de as sementes vivas
apresentarem teor de água inferior ao das sementes mortas em todas as iluminações. Sabendo
que o teor de água contribui diretamente para o aumento nos valores de MI, era de se esperar
que as sementes mortas apresentassem valores de MI maiores do que as sementes vivas, no
entanto o que se verificou foi exatamente o contrário. Tal fato só pode ser explicado se
levarmos em conta que a atividade biológica das sementes vivas era maior do que a das
sementes mortas a ponto de compensar o acréscimo devido à umidade.

Umidade x tempo

70
60
Umidade (b.u)

50
40 Vivas
30 mortas
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60
Tempo (Horas)

Gráfico 2 – Comportamento do teor de água das sementes ao longo do tempo

Nas iluminações finais podemos observar que o comportamento das curvas de umidade
por tempo (gráfico 2) difere do comportamento das curvas de MI por tempo (gráfico 1), o que
nos leva a acreditar que as oscilações de MI ocorridas no final do experimento são devidas a
fatores externos às sementes, tal como umidade relativa do ar ambiente.
 26

4.3.3 - Relação Entre Teor De Água e MI Para as Sementes Vivas

Devido às variações ambientais observadas, somente as 6 primeiras iluminações foram

consideradas no estudo de correlação entre umidade e MI. O teste de Tukey ( tabela 9) mostra
as diferenças significativas existentes entre os diferentes níveis de umidade ao nível de 5% de
confiança. As médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si. O teste de
Tukey mostra que há diferenças significativas entre os dois teores de água iniciais (duas
primeiras iluminações), no entanto não foi possível diferenciar as quatro iluminações
subseqüentes quanto ao teor de água.

Tabela 9 - Teste Tukey para a FV BLOCOS. UFLA, Lavras, MG, 2005.

----------------------------------------------------------------------------------------------
Umidades Médias Resultados do teste
12,49 9.910667 a1
16,47 10.964667 a1
23,06 11.418667 a1
31,51 14.169333 a1
43,48 25.440667 a2
52,60 55.853333 a3

DMS: 4,9808386900254 NMS: 0,05; Média harmonica do número de repetições (r): 15; Erro
padrão: 1,20731597894498

O gráfico 3 mostra como os valores de MI variaram em função do teor de água das

sementes. Nesse gráfico também é possível observar as equações que melhor se ajustaram à
curva de tendência.
 27
Umidade x MI (sementes vivas)

80,00

60,00 y = 0,0466x 2 - 2,0192x + 30,387

R2 = 0,8984
MI
40,00
20,00

0,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00

Umidade

Gráfico 3 – Umidade x MI para as seis primeiras iluminações – sementes vivas.

A equação que melhor se ajustou aos dados corresponde a uma equação polinomial de
segundo grau conforme podemos observar no gráfico, com um coeficiente de correlação
bastante elevado (0,89).

4.3.4 - Relação Entre Teor De Água E MI Para As Sementes Mortas

No caso das sementes mortas foi possível observar diferenças significativas, quanto ao
teor de água, apenas entre a primeira iluminação e as demais, conforme podemos observar na
tabela 10.
 28

Tabela 10 - Teste Tukey para diferentes valores de teor de água. UFLA, Lavras, MG, 2005.

Umidade Médias Resultados do teste

18,30 5.105333 a1
20,96 5.760667 a1
26,93 5.892000 a1
36,31 8.480000 a1
49,63 9.805333 a1
59,21 26.505000 a2

DMS: 6,54788730689094 NMS: 0,05; Média harmônica do número de repetições (r):

14,8235294117647; Erro padrão: 1,58671098362419

No gráfico 4 os valores de MI estão representados em função do teor de água das

sementes. Também neste caso o modelo polinomial quadrático se mostrou satisfatório para
explicar a curva de tendência.

Umidade x MI (sementes mortas)

50,00

40,00

30,00 y = 0,0218x 2 - 1,2285x + 21,779

MI

20,00 R2 = 0,7265
10,00

0,00
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00

Umidade

Gráfico 4 – Umidade x MI para as seis primeiras iluminações – sementes mortas

 29

4.3.5 - Resultado Do Teste Comparativo

O teste de tetrazólio confirmou a eficiência do congelamento no sentido de matar o

tecido das sementes, conforme pode ser observado nas fotos 1 e 2.

Foto 1 – Sementes que sofreram congelamento submetidas ao Tetrazólio.

Foto 2 – Sementes recém colhidas submetidas ao Tetrazólio.

 30

Pode-se observar na foto 1 que as sementes submetidas ao congelamento não

apresentaram coloração avermelhada, indicando ausência de processos respiratórios nessas
sementes. Tal fato é um indicativo de que os tecidos das sementes submetidas ao
congelamento estavam mortos.
As sementes recém colhidas apresentaram coloração avermelhada, conforme pode ser
observado na foto 2, mostrando que nessas sementes o processo respiratório estava presente, o
que caracteriza a presença de tecidos vivos.

4.3.6 - Analise De Variância Dos Dados Experimentais

Como o teor de água das sementes vivas e mortas foi bastante próximo em cada
iluminação, e conforme já foi comentada, a diferença existente vai no sentido de contribuir
para reduzir as diferenças observadas através dos valores de MI, considerou-se, para efeito de
análise, cada iluminação sendo um bloco, totalizando 14 blocos. A análise de variância foi
feita então, objetivando verificar a existência de pelo menos uma diferença significativa entre
os tratamentos.Para a análise foram considerados dois tratamentos, sementes vivas e sementes
mortas, cada tratamento contendo 15 repetições.

TABELA 11 - Análise De Variância. UFLA, Lavras, MG, 2005.

FV GL SQ QM Fc Pr>Fc

TRAT 1 6200.142772 6200.142772 252.133 0.0000

BLOCOS 13 32516.560783 2501.273906 101.716 0.0000
ERRO 405 9959.260345 24.590766

Total corrigido 419 48675.963900

CV (%) = 43.80; Média geral: 11.3209762; Número de observações: 420

 31

Podemos observar no quadro de análise de variância, ao nível nominal de 99,999% de

confiança, que existem diferenças significativas entre os tratamentos (sementes vivas e
sementes mortas). Também ao nível de 99,999% de confiança podemos afirmar que existe
pelo menos uma diferença significativa entre os blocos (iluminações).
 32

5 - CONCLUSÃO

Conclui-se que a técnica do “biospeckle”, consegue separar tecidos vivos de tecidos

mortos por congelamento (Níveis extremos de atividade) em sementes de feijão (Phaseolus
vulgaris L).
A metodologia também se mostrou eficiente na separação de sementes com nível de
atividades semelhantes e diferentes teores de água.
Os objetivos do presente trabalho foram alcançados. O trabalho contribuiu para o
entendimento da variável umidade, o que permitirá no futuro, conhecendo-se o teor de água
das sementes, fazer inferências mais precisas com o uso do laser na análise de vigor e
viabilidade de sementes.
O estudo permitiu também verificar a interferência de fatores ambientais na variação
temporal dos padrões do “speckle”, mostrando que resultados mais precisos podem ser
alcançados se os experimentos futuros forem conduzidos em ambiente controlado.
 33

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRAGA Jr., R. A. Utilização do biospeckle laser em sementes – Uma contribuição para o

desenvolvimento de uma tecnologia, Tese de Doutorado, UNICAMP, Campinas, SP, set., 2000.

BERGKVIST, A. “biospckle” – based study of the line profile of the light scattered in
strawberries. Dissertacao de mestrado faculty of technology at Lund University, 1997

DAINTY, J. C. laser speckler and relat phenomena. Topics in Applied Physics, v. 9, 1975.

NASCIMENTO, Á. L.; COSTA Jr., A. T.; BRAGA Jr. R. A.; RABELO, G. F.; MOREIRA, M. F. B.
Estudo da interação luz coerente-tecido biológico: construção de um modelo para o biospeckle.
XXXIII Congresso Brasileiro de Engenharia Agrícola, São Pedro, 1 CD, 2004.

RABAL, H. J.; BRAGA Jr., R. A.; TRIVI, M. R.; DAL FABBRO, I. M. O Uso do Laser na
Agricultura. In: CONBEA, 27, 1998, Poços de Caldas, cap. 5, 1998.

RABELO, G. F. Avaliação do Fenômeno “Biospeckle” no Monitoramento de Qualidade de

Laranjas (Citrus Sinensis), Tese de Doutorado, UNICAMP, Campinas, SP, fev., 2000.

RODRIGUES, S. Análise do Biospeckle Laser na Diferenciação de Tecidos vivos e Mortos em

Sementes, Dissertação de Mestrado, UFLA, Lavras, MG, 2003.