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CONTAGEM DE MICROORGANISMOS VIÁVEIS EM PRODUTOS QUE

NÃO NECESSITAM CUMPRIR COM O TESTE DE ESTERILIDADE
- Métodos para determinação total de bactérias e fungos para matéria-prima e
produtos acabados.- Consiste na contagem de Microorganismos que apresentam
crescimento visíveis, em 4 dias, em ágar Caseína-soja a 30-35ºC e em 7 dias em agar
Sabouraud-dextrose a 20-25ºC.
Biocarga (Bioburden): Número de microrganismos presentes no produto.
Necessário: Inativar os conservantes antes dos testes. Ex: Conservante/Inativante
Cloro/Tiossulfato de Sódio (0,5%p/v); Formaldeído/Histidina (0,1%p/v no diluente )
Fenóis e derivados/Polissorbato 80 (1,0%p/v no diluente).
Métodos para a contagem de microrganismos
1. Método de filtração por membrana (+ recomendado)
2. Método de contagem em placa – Semeadura da amostra em superfície
- Semeadura em profundidade (Pour Plate).
3. Método de tubos múltiplos
Cuidados – Empregar técnicas assépticas de preferência em capela de fluxo laminar.
Amostragem: de produtos em processo:3 amostras no início
4 amostras no meio
3 amostras no fim
1. Método de filtração por membrana
2 membranas 0,45µm : Filtrar
incubar
caseína soja 30-35ºC 4 dias
Filtrar
incubar
sabouraud 20-25ºC 7 dias
Exemplo: Foram filtrados 100,0 mL de água potável em membrana filtrante com poros de 0,45
µm, após a inativação do cloro, em seguida a membrana foi transferida para o meio de cultura
apropriado e após incubação foram contadas 100 UFC. Podemos afirmar que o na amostra o
número de UFC é de: 1 UFC/mL.
2. Método de contagem em placas:
Utilizar placas de Petri 100 x 20 mm. Semeadura:
2.1. Semeadura em Superfície:
Dispersar 1,0 mL da amostra (diluída ou não) na superfície do meio sólido (movimentos em S
ou 8). A diluição é necessária quando o número de UFC/placa for > 100.
Exemplo: Foram semeados, em 3 placas contendo meio de sólido, 1,0 mL da amostra diluída
10-2 (1g da amostra/100 mL) em cada placa, Após incubado, foram contadas 40 UFC, 60 UFC
e 80 UFC. Considerando a média, podemos afirmar que na amostra original (não diluída) o
número de UFC/100mL é de: 6.000UFC/ mL.
2.2. Semeadura em Profundidade (Pour Plate):
Misturar 1,0 mL da amostra (diluída ou não) com 20,0 mL do meio líquido (45 - 48ºC)
Exemplo: Foram semeados, em 3 placas contendo meio de sólido, 1,0 mL da amostra diluída
10-2 (1g da amostra/100 mL) em cada placa, Após incubado, foram contadas 40 UFC, 60 UFC
e 80 UFC. Considerando a média, podemos afirmar que na amostra original (não diluída) o
número de UFC/mL é de: 600.000UFC/ 100 mL.
Contagem de microorganismos viáveis em produtos que não necessitam cumprir com o teste de esterilidade
. Prof. Dr. Luiz Maçao Sakamoto
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Após semear: incubar e contar
Incubação: As placas devem ser incubadas em posição invertida
Quando a contagem for superior a 100 UFC, realizar diluições. Nesse caso os resultados serão:
Amostra não diluída: ≥ 300 UFC/mL p/ bactérias ou 100 UFC/mL p/ fungos
(Diluir1/10: Fator de diluição: F = 10).
Amostra diluída 1/10: condição acima (Diluir novamente 1/10: diluição final 1/100)
Amostra dil. 1/100: Nº UFC x F = UFC/mL de bactérias na amostra não diluída.
Ex: 60 UFC/mL x 100 = 6.000 UFC/mL
Meios de cultura:
Caseína-Soja (15- 20 mL): Incubar a 30-35ºC 4 dias
Sabouraud-Dextrose (15 – 20 mL) : Incubar a 20-25ºC 7 dias
3. Método dos tubos múltiplos: Número Mais Provável (NMP) FB 5ª Edição
- Preparar a amostra conforme procedimentos de adequação do produto.
- Preparar diluições 1:10; 1:100; 1:1000.
- Transferir 1 mL de cada uma das diluições, para 3 tubos,contendo cada um, 9 mL de caldo
caseína-soja. Incubar todos os tubos a 32,5 ºC ± 2,5 °C durante 3 - 5 dias.
- Anotar o número de tubos positivos e o número de tubos negativos.
- Se a natureza da amostra tornar a leitura difícil, como, por exemplo, uma suspensão, efetuar
subcultura para o mesmo caldo ou para ágar caseína-soja por 2 dias na mesma temperatura.
- Determinar o número mais provável de micro-organismos viáveis por grama ou mililitro do
produto, de acordo com a tabela.
Recomendado quando se espera uma baixa densidade bactérias
Valor do Número Mais Provável de Micro-organismos - NMP. FB 5ª Edição
Número de tubos positivos NMP por g, ou mL do Limite de confiança
produto
Número de g, ou mL do produto por tubo a 95%
10-1 (0,1) 10-2(0,01) 10-3 (0,001)
0 0 0 <3 0,0 – 9,4
0 0 1 3 0,1 – 9,5
0 1 0 3 0,1 – 10
0 1 1 6,1 1,2 – 17
0 2 0 6,2 1,2 – 17
0 3 0 9,4 3,5 – 35
1 0 0 3,6 0,2 – 17
1 0 1 7,2 1,2 – 17
Para realizar a contagem pelo NMP: Transferir 1 g ou 1 mL do produto e completar para 10
mL com o diluente (Tubo A = 10-1), Transferir 1 mL do tubo A para o Tubo B = 10-2 e
completar com o diluente para 10 mL, Transferir 1 mL do tubo B para o tubo C = 10-3 e
completar com o diluente para 10 mL.
Contagem de microorganismos viáveis em produtos que não necessitam cumprir com o teste de esterilidade
. Prof. Dr. Luiz Maçao Sakamoto