Espectroscopia de Massas – QO 423

Matéria da 2ª prova dissertativa

Aula I – Introdução à Espectroscopia de Massas

Tem um monte de coisa que existe sobre a massa das moléculas e dos átomos que
vocês não conhecem. O conceito de massa que vocês conhecem não será o mesmo no
final da aula. O primeiro conceito por mais estranho que possa parecer é o seguinte: Se
eu pedir pra você calcular a massa do seleto de gálio, vocês iram olhar pra tabela
periódica, certo?. Se isso aqui é um curso de massas aquilo ali é importante certo?

Errado. Nós não iremos utilizar a tabela periódica. Do nosso ponto de vista aquilo ali
está errado. Vamos começar pela primeira coisa que é definição de MS: Estudo da
matéria através da formação de íons em sua fase gasosa, caracterizados pela sua
razão massa carga. Observem a representação de um espectrômetro de massas:

O primeiro ponto que deve ser observado é a presença de uma fonte de ionização.
Ela pega e transforma as coisas em íons e leva pra sua fase gasosa. MS não enxerga
coisas que sejam neutras. Uma vez que eu tenho um íon na fase gasosa, o analisador de
M/Z vai medir M/Z. O espectrômetro não mede massas, mas sim M/Z. Então antes de a
gente ver a fonte de ionização, veremos o conceito de massa. Como a gente
normalmente faz a massa de um átomo qualquer? A gente conta o número de prótons e
neutros. Primeira aproximação: A massa de prótons e neutros é igual. E segunda
aproximação: A massa do elétron é desprezível.

Vamos pegar a massa de alguns elementos iniciais:

Mas repara o seguinte: O hélio é o dobro da composição do deutério, mas:

Como pode? O que acontece? A massa de um átomo não é a soma das partículas que
o compõe? Ou não é só isso? Vamos olhar pra estrutura de um átomo genérico:
 Você aprendeu que os elétrons não “vão embora” por causa da atração eletrostática
com os prótons, correto? E por que o núcleo não explode? Porque os prótons não se
afastam um dos outros por esta mesma atração eletrostática?

Veja, temos os seguintes tipos de força no universo:

A força gravitacional responde a massa. Mas ela só responde a grandes quantidades

de massa (como por exemplo, um planeta ou uma lua). Depois temos a força
eletromagnética, que é muito mais forte que a gravitacional, que responde à carga
elétrica, não importando a massa. E ela pode ser atrativa e repulsiva. Agora falta
conhecer a força forte, que é sempre atrativa. Ela também é a mais forte, como diz o
nome. A eletromagnética, assim como a gravitacional, ela é infinita. O alcance dela é
infinito. A força forte ela é mais forte, mas tem o alcance extremamente curto. Da
ordem do tamanho do núcleo de um átomo. Então, se eu pegar dois prótons e colocar no
espaço, pela força eletrostática eles vão se afastar. Mas se eu começar a aproximar eles,
mesmo com a repulsão eletrostática, eu vou começar a comprimir essas partículas. Veja,
quando eles chegaram a certa distância, a força forte (que é mais forte que a
eletromagnética) atua, e irão fundir as duas partículas no núcleo. Toda vez que eu
formar o núcleo, teremos isso. E teremos uma liberação de energia, por que a força forte
é muito mais forte que a eletromagnética. Com ela, o núcleo passa a ser estável, e sua
formação é muito exotérmica. Só que massa e energia são apenas duas manifestações da
mesma coisa. Gelo, água e vapor são apenas manifestações da mesma coisa. Se eu estou
liberando energia, eu estou consumindo massa. Toda vez que eu formo o núcleo, eu
libero uma quantidade enorme de energia e sua massa diminui. Então a massa de um
átomo é a massa das partículas que o compõe menos a energia liberada na sua formação.
E a exatidão que o espectrômetro mede é muito maior que essa diferença de energia.
Mas ainda assim, olhando um átomo, você não consegue me dizer a massa dele, por que
não sabe a energia que foi gasta pra que ele ser formado.
Isso dá origem ao que chamamos de defeito de massa:

Esse defeito de massa vai ser extremamente importante. Tem várias informações
obtidas nisso. Quando você aprendeu sobre massa atômica, tudo estava em função do
átomo 12 de carbono. Sua massa é 12,000.

Então veja: Você não tem como saber a massa de um átomo. Os elementos não
simplesmente existem? Alias, pergunta: Da onde vêm os elementos químicos?
A formação dos elementos químicos se da em três processos únicos: A 13,7 bilhões de
anos atrás temos o inicio do universo com o Big Bang. Todo o hidrogênio que temos foi
formado 1seg depois do Big Bang. E um pouco de hélio também. Então, temos que
desse evento, só existia esses dois elementos. Com o tempo, essas nuvens de elementos
vão se juntando, aumentando o volume, pressão e temperatura. Com o aumento disso,
os prótons vão começando a se juntar. Acontece a fissão nuclear. O nosso sol: Toda luz
que a gente vê é ele fundindo hidrogênio e hélio. Nosso sol não consegue fazer mais
nada a não ser fundir esses dois elementos. Mas existem estrelas maiores que
conseguem fundir outros elementos.

Qual o elemento mais abundante do planeta? Ferro. Ferro é abundante. Por que? Pois
ele é o elemento com o núcleo mais estável que existe. Depois do ferro, você vê que a
estabilidade começa a cair, ou seja, a reação é endotérmica, ou seja, não da mais pra
prosseguir. Não tem mais energia para sustentar a atração gravitacional. E a estrela
explode. Então é o seguinte: Big Bang; estrelas. Mas da onde vem o ouro? O cobre?
Zinco? Bromo? Quando a estrela explode, ela joga esses elementos, e uma porrada de
nêutrons. Esses elementos vão “inchando” e ganhando nêutrons que podem se
transformar em prótons. Essa mistura ira formar os próximos elementos da tabela
periódica.

Então olhem esse gráfico:

 Toda vez que é formado um elemento, a fissão nuclear faz com que libere energia e
ele fique proporcionalmente mais leve. É isso que podemos ver nesse gráfico aqui, e
isso que é o defeito de massa. O carbono 12 tem defeito de massa zero, todo mundo
antes dele tem massa proporcionalmente maior, e quase todo mundo depois dele, tem
massa menor que ele, quase que linear. Quem tem grande defeito de massa positivo? O
hidrogênio, principalmente. Depois do carbono, com exceção do oxigênio, todo mundo
não tem massa X, mas sim X menos alguma coisa. Mas e aí, como definimos o que é
massa? Existem 3 categorias de massa:

A massa nominal é aquela que usamos para fazer uma conta aproximada. A média é
aquela que leva em conta todos os isótopos naturais. Por exemplo, o carbono tem massa
média de 12,0107. Essa 0,01 se dá pelo um por cento de carbono 13 que existe. Mas ela
não é muito útil para a MS. Por isso usamos o conceito de massa monoisotópica. Essa
definição tem uma propriedade importante: Nenhuma massa monoisotópica é
múltipla de outra. O que significa que a massa monoisotópica é única para cada
fórmula. Como a gente usa isso ao nosso favor? Se eu pegar e determinar a massa com
exatidão suficiente, eu não só tenho a massa, mas também a fórmula da molécula. Essa
é a vantagem de a gente usar essa definição. Então veja, existe dados cujo aumento de
exatidão não faz o menor sentido. Por exemplo: A fortuna do Silvio Santos. Ou o PIB
do Brasil. Não é o caso de massa de molécula. Eu falar 180 ou 180,0126 são duas
informações. Então é o seguinte: Se vocês fazem uma síntese, você tira um espectro.

Por que você faz espectro? Se você tá falando que o composto é aquele, você tem
que checar sua hipótese fazendo seus espectros, vendo se a massa bate com a fórmula
molecular do que você está propondo.

Agora vamos falar de isótopos naturais:

Então, vamos lá: hidrogênio e deutério. Toda vez que você bebe água, ela tem 0,01%
de deutério. Carbono: 1% é carbono 13. Então a abundância isotópica pode ser alta ou
baixa. Em termos de número de átomos, qual o elemento mais abundante em compostos
orgânicos? Hidrogênio. Segundo elemento mais abundante? Carbono. Terceiro?
Oxigênio. Depois o nitrogênio. Em média é essa a abundância. Vamos olhar pra isso aí:
O átomo mais comum é o hidrogênio e do seu isótopo temos 0,01%. Agora, carbono é
abundante e seu isótopo é abundante também. Então, se eu for considerar todos os
isótopos naturais, o único elemento que é abundante e seu isótopo também, é o carbono.
De cada 100 carbonos, 1 é carbono 13. É isso que temos que ter na cabeça. Os outros a
gente pode desprezar. Por que o espectrômetro de massa vai medir todos os isótopos.
Então vamos ver essas frases que agora não vão fazer sentido, mas depois vai:

Olhando um espectro:
 Então o seguinte: Os sinais serão normalizados pelo mais intenso (100%) e eu vou
chamar de bico base. Todos os outros terão suas intensidades relativas à ele.

Qual é a massa do metano? 16. Se eu pegar o metano e tirar um espectro, vai tá lá no

16. Mas se eu olhar com cuidado vai ter um pico em 17. O que é esse sinalzinho? O que
é isso? Esse é o carbono 13. Então se 100 átomos, 99 são carbono 12 e 1 é carbono 13.
 O sinal com o carbono 13 no metano é quase desprezível. Mas olhando o C10H22, a
probabilidade de termos carbono 13 é maior, e o pico é mais visível. Para o C 20H42 a
qual tem massa 282, eu tenho agora 20% de chance de uma dessas moléculas ter
carbono 13, e massa 283. E agora essa molécula tem tantos carbonos, que agora temos
chance de ter 2 carbonos 13, e massa 284 e podemos ver também esse pico.
A massa monoisotópica, eu vou dar sempre o nome de M. e os outros sinais serão: M+1,
M+2... e o conjunto de sinais serão chamados de padrão isotópicos. Espectrômetro de
massa irá detectar todos eles. Nesse ponto, aquelas três frases fazem sentido agora.
Uma molécula realmente grande, de massa 3000, na prática não há nenhuma com seja
apenas com carbono 12. Então se você pegar a massa nominal e fizer a conta, você não
vai ver nem aquele sinal. Você pode olhar e ver que 1% tem carbono 13 e achar que não
é nada, mas em uma aglomeração de átomos, faz muita diferença. Mas tem alguma
vantagem nisso? Tem uma vantagem enorme. Veja:

Então só de olhar pro padrão isotópico da minha molécula, é possível saber quantos
carbonos ela tem. Por que o M+1 está relacionado com o carbono? Veja, o oxigênio 16
tem isótopo 18, ou seja, ele vai influenciar a intensidade do M+2, e não do M+1. E o
nitrogênio tem nitrogênio 14, e nitrogênio 15. Mas é raro, pois é raro moléculas com
bastante número de nitrogênio (mais que três é normalmente explosivo). Se eu tiver Cl
ou Br na minha molécula, aí a coisa fica interessante. Veja:
 A intensidade do M+2 do cloro é aproximadamente um terço da intensidade do M.
Para o bromo, esse valor é aproximadamente 100%. Ou seja, caso o sinal em M+2 tenha
intensidade praticamente a mesma quando comparado ao pico molecular, pode-se notar
a presença de bromo na estrutura. O mesmo ocorre com o cloro, unicamente alterando o
valor de intensidade relativa de 100% para 33% do pico molecular.

Aula II – Regra do Nitrogênio e Clivagens Simples

Para começar, temos mais uma regra:

 Se eu pegar todos os elementos que compõe moléculas orgânicas, se ele tem valência
par, ele tem massa par. Mas se tem valência ímpar, ele tem valência ímpar. O nitrogênio
quebra essa regra ele tem massa par e valência impar. Isso origina a regra do nitrogênio.
Espectro para achar a fórmula:

De cara

sabemos que ele tem Br, por que temos um M+2 de mesma intensidade que o M. Essa
molécula também tem nitrogênio (em número ímpar), devido ao pico molecular ser
impar. Massa do Br: 79, do nitrogênio: 14. Isso somado dá 96. 151-96 dá 58 unidades
de massa, o que é possível chegar em 4 carbonos e 10 hidrogênios.

Com isso encerramos a parte de fundamentos de massa.

Agora iremos ver a parte de técnicas de ionização.

Essa é a forma mais antiga e tradicional de se colocar carga em uma molécula. Eu

vou pegar um gás e passa-lo em uma fonte de ionização. Isso aqui é um filamento como
naquelas quase finadas lâmpadas de filamento. Então eu vou passar uma corrente por
aqui, e isso aqui vai aquecer. Um filamento como esse também emite elétrons para
todos os lados. Então eu vou colocar uma placa aqui com potencial positiva, e os
elétrons que forem sair daqui, irão vir todos pra cá. Então eu formo um fluxo que sai do
meu filamento aquecido e são atraídos pela plaquinha. Então eu vou pegar a substância
que eu quero analisar, que aqui é um gás. Uma hora ou outra, ela vai cruzar esse feixe
de elétrons, que então irão colidir com a molécula e arrancar um elétron dela, deixando-
a positiva. Assim, foi gerada meu íon. Essas placas tem um potencial positivo que atrai
os íons e assim que eles cruzam e são ionizados, eles são arrastados pra fora de câmara
de ionização pra um lugar que será analisado a razão massa/carga. Qualquer coisa que
entre aqui será ionizado. Então a molécula mais o elétron incidente, formarão a minha
molécula positiva, que também vai ficar radicalar (numero ímpar de elétrons), quando
eu arranco um elétron, ficará um desemparelhado. E aí vai sair dois elétrons: o incidente
e o da molécula. Também será depositada energia na molécula, ou seja, o processo de
ionização não é só o processo de arrancar o elétron, mas também de depositar energia.
Toda vez que você tem uma coisa quente, ela esfria. Como você esfria uma coisa
quente? Em termos técnicos, você esfria por contato (colocando na agua, por exemplo).
Se essa coisa estiver no vácuo, ela vai esfriar por irradiação. Qual a terceira forma que
eu tenho de se livrar de energia interna é rompendo ligações. Agora pensa, a partir do
momento que eu liberar esses íons, ele só poderá de livrar da energia interna se
fragmentando (não tem contato com nada, todos os íons são positivos, e não dá tempo
de emitir radiação). E aí isso gera uma coisa muito interessante, se eu to sozinho eu não
tenho efeito de pressão, temperatura nem nada. Isso faz com o que o espectro obtido
seja completamente reprodutível. Eu não tenho outro fator que influencia no espectro a
não ser a energia dos elétrons. Se eu pegar uma molécula, jogo lá dentro, ela é ionizada
e fica com uma energia interna. Quanto? Quase uma distribuição de Boltzman.

Vamos brincar com esse espectro:

 O benzeno faltando uma valência vale 77, com mais 28 da carbonila, temos 120.
Esse pico pequeno do lado é o do carbono 13. Sua intensidade em relação a ela é igual a
8+10% = 8,8. Então o pico menor é 9% do maior. A molécula intacta que eu só
arranquei o elétron eu vou dar o nome de íon molecular. Uma parte da molécula
ionizada ganhou certa energia interna que é maior que a energia de ligação, então ela
quebrou uma ligação e formou o 105. 105-120 = 15, que é uma metila, então ela perdeu
uma metila. Uma parte das moléculas ficou intacta com 120, outra parte, se fragmentou
e ficou com 105. Mas ela ainda pode se fragmentar e ficar com massa 77, e assim por
diante. Então um espectro de massas é um íon se clivando pra se esfriar. Veja, eu
sempre vou tender a quebrar as ligações mais fracas. Então o caminho e o quanto eu irei
formar de cada fragmento são o mesmo. Por isso os espectros são tão reprodutíveis.

Olha os isômeros agora:

 Todos eles têm um sinal de 43, mas olha a intensidade relativa dos outros sinais.
Então, os sinais são extremamente sensíveis á estrutura do meu composto. Então agora
vamos olhar com um pouco mais de detalhes a fragmentação.

Vou começar com clivagem alfa. Veja, clivagem alfa vai ser a primeira fragmentação
para praticamente todos os compostos com heteroátomos. Por que clivagem alfa só vai
acontecer para espécies radicalares. Por exemplo, jogando a acetona na fonte de
ionização, iremos tirar o elétron do oxigênio. Sabemos da química orgânica que a meia
seta representa a movimentação de um par só de elétrons.

Aqui, como temos um radical, e a clivagem alfa é um mecanismo de clivagem

radicalar, vamos usar bastante a meia seta. A clivagem alfa envolve o rompimento
homolítico da ligação alfa a minha carga. Então tá aqui meu carbono alfa e eu vou
romper uma ligação dele. No caso da propanona, ela é simétrica, então tanto faz.
A clivagem radicalar de uma ligação alfa ao meu radical (centro de carga) eu chamo de
clivagem alfa.

Regra de Stvenson: Se eu tiver que olhar entre a estabilidade de um cátion e um

radical e elas forem em direções opostas, o cátion manda. Estabilizar um cátion é
melhor que estabilizar um radical.
 A clivagem alfa é induzida pelo radical. Então toda vez que eu tiver um radical na
minha molécula, vou pela clivagem alfa. Se na minha fragmentação eu obtive alguma
coisa com carga positiva, meu fragmento neutro é um radical. Então a clivagem alfa
parte de alguma coisa é positiva radicalar e vai formar um fragmento positivo e outro
radicalar. O meu espectrômetro de massas não vai ler o radical (não tem carga).

Mas eu comentei com vocês que se os íons formados forem quentes o suficiente, eles
podem sofrer uma fragmentação adicional, então eu vou consumir eles e formar outro
fragmento. A fragmentação dessa espécie não pode ser via clivagem alfa, uma vez que
esta não é radicalar. Daqui pra frente a gente vai usar mecanismos, que são os mesmo
que a gente usa em química orgânica, ou seja, vamos ter a movimentação de um par de
elétrons. Esse mecanismo agora, a gente da um nome especial pra ele que chama
clivagem indutiva e se a clivagem alfa sempre gera como parte neutra um radical, a
clivagem indutiva sempre vai gerar como parte neutra uma molécula neutra. As duas
clivagens vão formar uma parte neutra e uma parte catiônica. Na clivagem alfa eu parto
de uma espécie radicalar e vou formar cátion mais radical. Uma vez que eu formei um
cátion que não é radicalar, eu não vou poder usar mais clivagem alfa, obrigatoriamente
eu vou pra clivagem indutiva. Clivagem indutiva é induzida pela carga, eu vou tentar
neutralizar a minha carga aqui. Eu jogo meu par de elétrons, então eu uso uma seta
cheia, e formo outra espécie.

Aqui vai uma dica: Cantem comigo ‘’15, 29, 43, 57, 71, 85, 99...’’ ou seja, um carbono,
dois carbonos, três carbonos... Veja, do ponto de vista prático, existem moléculas com
energia interna muito grande, ou seja, essas moléculas tem tanta energia interna que se
fragmenta por mecanismos que a gente não esperaria em primeiro principio.

Ou seja, toda vez que a gente pega um espectro de massas, a gente vai ignorar essa
‘’graminha’’ aqui, são processos muito energéticos, eles passam um pouco do que seria
razoável a gente tentar justificar. Então, vamos olhar só os íons mais abundantes.

Esses pequenos veem de uma serie de rearranjos... A estabilidade de cátions aqui

funciona igualzinho pra química orgânica, é só que aqui, temos uma condição muito
mais energética, por isso temos um cátion metila, por exemplo.
 Vamos fazer um resumo então: Se eu tiver um íon radicalar, a fragmentação que vou
fazer é uma clivagem alfa. Ela produz um cátion e um radical. Uma vez que eu formei
um cátion, a possibilidade é que ele se fragmente por clivagem indutiva, formando outro
cátion e aqui, como perda, eu vou ter uma molécula neutra.
Mais uma dica: CO vale dois carbonos (29).

Em uma mesma molécula podem ocorrer ao mesmo tempo inúmeros processos de

clivagem alfa e indutiva ao mesmo tempo. Observe os exemplos:
Aula III – Rearranjos de McLaferty e Aromáticos

Como tarefa da aula passada, eu pedi pra vocês fazerem esse aqui em casa:

Ela é assimétrica, posso ter duas clivagens alfa. Fazendo as fragmentações geradas pela
clivagem alfa e indutiva, não conseguimos explicar o segundo sinal mais intenso, o 58.
Todos os outros sinais mais intensos tem em comum o fato de que são números
ímpares, com exceção do 58. E faz sentido ser ímpar. Se minha molécula tem massa par
é por que ela não tem nitrogênio, e eu vou tirar um grupo, quebrar uma ligação, eu vou
ter que formar duas coisas de massa ímpar. O sinal é sempre uma molécula faltando
uma ligação. Então faz sentido os fragmentos terem massa ímpar. Todo mundo funciona
assim, com exceção do 58. Veja, de 100 pra 85 é a perda de uma metila, certo? De 100
pra 58, você não precisa nem fazer a conta, saindo de uma massa par e indo para outra
massa par, você não precisa nem fazer a conta, você perdeu uma coisa de massa par.

E o que tem massa par? Uma molécula neutra. A única forma de perder uma
molécula neutra aqui é através de um rearranjo. Dito de outra forma, esse 58 tá gritando
pra gente: eu vim de um rearranjo. Na ausência de solvente, espécie em que a carga e o
radical estão separados são mais estáveis, ou seja, rearranjo desse tipo são
extremamente favorável. E é tão clássico e comum que recebe um nome: Rearranjo de
McLafferty. Toda vez que eu conseguir fechar um anel de 6, que eu conseguir colocar
um hidrogênio próximo do meu sitio radicalar, a transferência do hidrogênio para o sitio
radicalar é favorecida. Então toda vez que eu estiver olhando um espectro que não seja
de uma molécula com nitrogênio e ver um sinal par, o fragmento que deu origem a ele
tem que ter vindo de um rearranjo. Observe:

Agora da uma olhadinha nesse:

A massa par dele é 72. Por que é ele o 72. Veja, do lado direito eu não consigo fazer
o rearranjo, eu preciso de ao menos 3 carbonos, para poder fazer o ‘’anel de 6’’.
Se tivermos cadeias grandes o suficiente dos dois lados pra fazer rearranjo, iremos ter
então dois rearranjos possíveis.

Os exemplos não fogem da intenção de ‘’matar’’ a carga no heteroátomo.

Então agora vamos para outra grande classe de fragmentos, que é: aromáticos. Veja,
agora eu vou ensinar outra regra.
 A regra será - 77, 65, 51, 39. Toda vez que eu tiver um aromático eu terei esses
sinais e seus sinais adjacentes. Toda vez que eu tiver isso, está estampado e gritando que
eu terei um anel aromático. Por que? Observe os fragmentos:
 Vamos pegar o exemplo do tolueno:

O conjunto de valores 77, 65, 51 e 39 está gritando que temos um aromático. Agora,
se você olhar, eles são pouco intensos. Mas temos um extremamente intenso, o 91, que
vem da perda de um hidrogênio. Veja, se eu ionizar uma das duplas do benzeno, qual a
primeira fragmentação que ocorre com um cátion radicalar? Clivagem alfa. Formamos
um íon tropílio, que é aromático, extremamente estável, como podemos ver pelo
espectro de massas (sinal intenso).

Então veja 77, 65, 51 e 39, grita pra você que é aromático. Se eu tiver um sinal de
91, ele grita pra você que eu tenho um fenil -CH2. Por que eu vou ionizar e formar o íon
tropílio. Então se eu olhar pro espectro e ver o 91, ele tem o fenil -CH2.
Agora vamos olhar o etil-benzeno:
 Temos o 77, 65, 51 e 39. Também temos o 91 gritando pra mim aqui, ótimo, eu
tenho um -CH2. O 106 é ele, que é meu íon molecular. Agora vamos ver o propil
benzeno. Temos os valores pra aromático e o 91, então temos o fenil -CH2. E temos um
92. Veja, você pode virar e falar que é o M+1 do 91. O meu 91 é C7H7, e sua
intensidade é aproximadamente 8%, o que não é o caso do espectro. A massa 92 me diz
que isso veio de um rearranjo, que não existe só pra composto carbonilado, mas sim pra
qualquer chance de fechar um anel de 6.

Então vamos lá, se eu tiver 77, 65, 51, 39 eu tenho um aromático. Se eu tiver 91, eu
tenho o fenil CH2 e se eu tiver 92 eu tenho pelo menos um fenil e três carbonos.
Então agora vamos resolver esse espectro aqui agora:
 Qual a massa desse composto? 154. E sabemos que ele tem cloro, por que temos um
M+2 de intensidade um terço de m. E sabemos que temos um aromático. Eu tenho um
cloro cuja massa é 35. Grupo fenila tem massa 77, o que nos da 112. 154 – 112 = 42.
Então você só precisa achar 42 unidades de massa que está sobrando, que significa que
temos 3 carbonos, que dá 36, para 42 faltam 8 unidades de massa. Sabemos que temos
um fenil CH2, devido ao sinal 91. Eu tenho um C3, não tenho? Por que tenho um íon de
M/Z 92, que nos diz que temos um fenil C3. Agora veja, eu tenho duas possibilidades,
C3 e um Cl na ponta da cadeia, ou o Cl ligado diretamente ao anel. Mas o segundo não
pode, pois o 91 não seria o 91, mas sim o 91 clorado. Se eu tiver alguma coisa ligada ao
meu anel, eu vou formar os correspondentes 91 e 92, pro mesmo grupo. Quanto vai dar
o 91 clorado? Veja, você pode olhar e falar que é só pegar o 91 e adicionar 35. Mas
você tirou um hidrogênio e pegou um cloro, então tem que somar 34. 91 + 34 dá 125.

A massa do meu composto é 154. Quem é meu pico base? 125. O meu íon de M/Z
tem um cloro. E o sinal 127 tem um terço da intensidade do 125. Então o 125 está
dizendo que o cloro está no anel. Então veja, o 91 e o 92 são íons que mostra que eu
tenho fenil -CH2 ou fenil propil desde que eu não tenha substituição no meu anel. Se
esse for o caso, eu vou formar os correspondentes.

Vamos recapitular um pouquinho do que já passamos pra vocês. Primeiro, a gente

falou de fundamentos de massa: O que é massa, massa média, massa monoisotópica,
isótopo, massa exata, defeito de massa, padrão isotópico, no qual a gente explorou
vários casos: tem bromo, tem cloro... Aí a gente entrou com EI, que é o primeiro
método que a gente tem para ionizar uma molécula, ou seja, a gente pega o analito e
temos que transforma-lo em um íon em fase gasosa. E vemos que nesse processo a
gente deposita energia interna e a molécula se fragmenta, o que é ótimo por que a gente
tem o íon molecular. E analisando o íon molecular do qual a gente tem o padrão
isotópico, eu tirei um monte de informações. Se eu analisar o íon molecular eu tenho um
monte de informações sobre a composição da minha molécula.

Mas isso não me dá informações sobre a estrutura. A informação de estrutura nós

temos dos fragmentos. Então veja EI é um método extremamente simples, eficiente, eu
ionizo uma a cada 10 000 moléculas. Porém, nós também temos algumas desvantagens:
Só funciona para moléculas voláteis e termoestáveis. Outra desvantagem é que nem
sempre a gente tem um íon molecular. E por fim, eu tenho outro problema, o espectro só
é útil para substância pura. Então veja, do ponto de vista de análise estrutural isso só é
válido para substâncias puras.

E agora vamos ver como resolvemos os três problemas. A substância pura é o que
vamos falar agora: O acoplamento de cromatografia gasosa com espectroscopia de
massas é uma combinação muito poderosa, por que o GC separa as substancias e o
espectrômetro de massas é capaz de identificar cada composto do GC.
Aula IV – Método ESI e suas Particularidades

Anteriormente eu comentei as 3 desvantagens de usar a ionização por EI. Substâncias

que não contemplarem essas características, não podem ser ionizadas por EI:

Até 20 anos atrás, massas era uma técnica exclusiva para moléculas pequenas e
voláteis. Portanto, não poderíamos tirar espectro de polímeros, organometálicos,
aminoácidos, e etc. Isso a gente vai resolver com o segundo método de ionização, o ESI.
Ela promove a ionização de moléculas sem a necessidade de volatilizar termicamente o
meu composto. Então mesmo que a molécula não seja termo estável, eu vou conseguir
ionizar. E tem outra grande diferença, a amostra agora é introduzida via solução. Eu
tenho que dissolver a amostra antes de injetar ela.
 Então ESI funciona assim: eu vou pegar uma solução e colocar nela um sal. Então eu
vou ter cátion-mais e meu ânion-menos. E eu vou passar essa solução salina em um
tubo capilar de metal. A única diferença é que nesse capilar de metal eu vou aplicar uma
tensão. Então, eu vou aplicar, por exemplo, um potencial positivo. Minha solução é
neutra, numero de cátion igual ao de ânions. Mas quando meu ânion passar pelo capilar
com carga positiva, ele irá ser atraído, e vai perder o elétron que vai virar corrente. E
assim eu anulo parte dos meus ânions da solução, como se fosse uma eletrólise, o único
detalhe é que a minha outra ponta da minha fonte de tensão não tá na solução, então eu
só tenho a parte positiva. Suponha que eu tenha 100 cátions e 100 ânions. Quando ele
passa por esse capilar, alguns dos ânions vão ser eliminados por causa do potencial
positivo. Ele encosta e oxida. Então a solução dali pra frente vai ter um excesso de
cargas positivas e um tubo positivo, o que vai gerar uma repulsão. Naturalmente isso
aqui vai formar um spray, um cone, e vai formar gotículas com excesso de cargas
positivas. Então o processo de ESI começa assim: Aplica o potencial positivo, parte dos
ânions é eliminada da solução, eu gero um excesso de cargas positivas que é repelida e
forma um spray no qual é formado gotículas com o solvente (água) e excesso de cargas
positivas. Então eu tenho uma gota e tenho lá 30 cátions em excesso, que vão tentar se
repelir. Eles irão ficar na superfície, o máximo afastado possível. Na gotícula, eu irei
passar gás quente, que vai evaporar o solvente, e a gota vai diminuir. Conforme a gota
diminui os cátions da superfície vão se aproximando e a repulsão vai aumentando, até
que chega uma hora que a repulsão é tão grande, que um cátion é injetado para fora para
diminuir a repulsão. Então eu criei um cátion na fase gasosa. Que é exatamente o que o
EI faz. Porém lá, ele coloca na fase gasosa e depois ioniza. Aqui eu tenho um íon e
depois vou levar ele pra fase gasosa. O processo de ESI não é nada mais nada menos do
que isso.

O processo de ESI não é o processo de ionização. Ionização significa transformar

em um íon, mas aqui eles já são. Então, como é que a gente faz. Acima temos a foto real
do meu capilar onde é aplicado o potencial, onde já começa a formar gotículas
carregadas, que vão se repelir e formar essa nuvem. E na frente disso, eu terei um
biquinho, por que ao contrário da EI que está no vácuo, aqui estamos em pressão
atmosférica e atrás disso está em vácuo. Então temos que ter uma interface entre as duas
regiões. O que eu vou ter é uma coisa em formato de um cone. E aí, normalmente, o
meu spray eu coloco ele não de frente, mas de lado. Então quem for carregado, vai fazer
a curva e entrar, quem for neutro, vai reto e não entra no meu equipamento. Então eu
coloco essa abertura. Dela pra trás vai ter uma diferença de pressão. Daqui já temos
várias diferenças entre o ESI e o EI: A ionização é feita em pressão atmosfera, a
amostra é inserida em solução. E podemos tirar o espectro de sais. Como eu faço pra
transformar a minha molécula em sal? Assim:

A minha molécula pode ter sítios ácidos ou básicos. Se ela é básica, eu posso pegar
minha solução, adicionar um ácido volátil. Se for uma amina, por exemplo, num meio
ácido, eu vou protonar ela. Se o ácido é o ácido fórmico, por exemplo, eu tenho o par
amina protonada e íon formiato. Quando eu passo isso no capilar positivo, o meu
formiato vai ser atraído pelo tubo, ele vai ser oxidado e arrancado da solução, e eu vou
formar a gotícula que tem como excesso a minha molécula protonada. Eu vou enxugar a
minha gota, e isso em algum momento vai ser expulso da gota por repulsão
eletrostática. Então ESI é uma técnica que funciona pra sal. Se eu jogar só a minha
molécula lá, não vai funcionar, eu tenho que transformar em um sal. Por exemplo, se ela
tiver um sítio básico, eu tenho que jogar um ácido e fazer um sal.

Hidrocarbonetos é uma classe que eu nunca vou conseguir ionizar por ESI, por que
não tem sítio pra protonar. Mas é uma das classes mais apropriadas para EI. Na prática,
hidrocarbonetos e haletos de alquila são as únicas classes que não consigo protonar.
Se eu tiver um sítio ácido na minha molécula, eu posso fazer o oposto. Ao contrário de
EI onde a ionização só acontece ionização no modo positivo, em ESI também temos no
modo positivo. No modo positivo, as minhas opções são mais restritas, visto que
hidróxido de sódio não é uma base muito forte. São ionizados em ESI negativo: ácido
carboxílico, fenóis ativados (de preferencia com grupo retirador), ácido sulfônico ou
DNA (ÁCIDO desoxirribonucleico).

Então agora vamos dar uma olhada em coisas reais, vamos ver como é um espectro
de ESI:

A chance de isso ser ionizável por EI é quase zero. Percebe-se também que tem
vários nitrogênios que são sítios básicos e podem ser protonados. Se o íon é 487, a
massa da molécula é de 486, já que ela tem um próton a mais.
Ao olharmos um espectro de ESI precisamos saber qual o método de ionização foi
utilizado. Se for ESI positivo, temos um hidrogênio a mais, e se for ESI negativo, temos
um hidrogênio a menos. Num espectro de ESI eu não observo nenhum fragmento, uma
vez que o íon é formado por repulsão eletrostática e não por alta energia interna.

Isso é ruim por que não temos nenhuma informação estrutural. Então aqui eu sempre
vou saber a massa da molécula, mas gerei um problema que eu não tenho fragmentos e
não posso fazer uma análise de estrutura aqui. Então se por um lado não ter o fragmento
me impede de fazer uma análise estrutural, ela tem uma vantagem. O que acontece se,
por exemplo, eu tiver uma mistura de dois lipídios? Eu teria dois sinais. No EI eu nunca
conseguiria fazer isso, pois o espectro estaria cheio de sinal de fragmentos.
Até onde eu consigo ir a termos de massa de moléculas? Eu consigo ir longe. Olha isso:

A massa é 1568 e eu consigo ionizar. Mas olhando o sinal vemos uma coisa de 785,
mas a massa do meu composto é 1568... O que aconteceu? Degradou? Eis aqui outra
fantástica característica do ESI. Esse espectro vai fazer com que a gente olhe pra isso e
saiba exatamente o que é. Esse íon tem massa 785, correto? Errado. Esse íon tem uma
relação M/Z de 785. Essa minha molécula é tão grande, que eu consigo colocar dois
prótons nela. Então temos 1568,9 + 2 prótons dividido por dois, que dá 785,46.
Mas, ao tirar o espectro de uma substância, eu não sei qual a massa dela. Então como eu
sei que isso é 1569 com duas cargas e não 784 com uma carga? Então a gente vai ter
que ter algum jeito de achar a carga do íon para termos a massa...
Se ampliarmos o sinal, vemos o que a diferença entre um sinal e outro é meio. Veja, a
diferença entre um sinal e o outro é um carbono 13, que dá uma unidade de massa. Mas
ao dividirmos por dois, então na escala de massa carga, essa diferença da meio.
Suponha que eu tenha uma molécula de massa 998. Se eu colocar dois prótons, o meu
íon vai ter massa 1000. Então o padrão isotópico do meu íon com dois prótons deveria
ter sinais de 1000, 1001, 1002 e 1003. Com carbono 12, um carbono 13, dois carbonos
13 e 3 carbonos 13, certo? Isso, se isso for na escala de massa. Agora eu pegaria esse
espectro e transformo na relação M/Z. Se eu colocar dois prótons, os sinais se
transformam em: 500; 500,5; 501; 5001,5. Então veja, se o espaçamento entre os sinais
do meu padrão isotópico for 1, significa que a carga do meu íon é um, que é o caso em
EI. Se meu íon tiver uma carga dois, significa que a diferença de massa de um Dalton
vai ter que ser dividia por 2. Então um Dalton dividido por dois nos dá ½ M/Z. Imagina
que eu tenho uma molécula de massa 997 e consiga colocar 3 prótons nela. Na escala de
massa eu teria sinais de 1000, 1001 e 1002. Mas na escala de M/Z eu tenho: 333,33;
333,66; 334. Se o espaçamento entre os sinais é um, é por que eu peguei uma carga. Se
for meio, é por que eu peguei a diferença de um Dalton e dividi por dois, e se a
diferença for 0,33 é por que eu peguei um Dalton e dividi por 3. Então temos:

Perceba a diferença entre uma molécula com carbono 12 e com carbono 13 é um

Dalton, mas como estamos falando da relação M/Z, dividimos por 1 se for uma carga,
por dois se for duas, e etc.

Quando eu vou ter múltiplas cargas no meu ESI? Toda vez que eu tiver vários sítios
de protonação. Mas veja, não temos solvente para solvatar as cargas. Então eu não
consigo colocar duas cargas em sítios de protonação muito próximos devido a repulsão.
 Via de regra a cada 500 unidades de massa, eu consigo colocar uma carga.
Os requisitos pra eu colocar múltiplas cargas é que a molécula tenha tamanho suficiente
e vários sítios básicos (se a carga for positiva).

Aqui temos um espectro de uma proteína que foi quebrada em várias partes:

E os sinais mais intensos ampliados, e vendo o espaçamento de cada sinais

conjugados, sabemos quantas cargas temos em cada fragmento.
Se eu pegasse esse espectro, tirasse tudo e deixasse só a escala, você seria capaz de me
dizer quem é maior que quem (tem mais massa), pela intensidade do M+1, que está
diretamente relacionada com o número de carbonos.
Aula V – Calculo de Massa em Proteínas

Com ESI a gente consegue ionizar coisas com massa muito grande. Mas até onde a
gente consegue ionizar?

Eu consigo ionizar macromoléculas de massa de quase 17000. Agora minha

molécula é tão grande que eu tenho tantos sítios de protonação, que algumas dessas
moléculas vão ionizar com 10 cargas, algumas com 11, 12, 13... Então o número de
prótons que essa molécula vai ter é variável. Então o que são esses vários sinais? É a
mesma massa com diferentes quantidades de cargas.

Então toda vez que eu pegar macromoléculas, eu consigo ver ela com mais
quantidades de cargas, e consequentemente, a relação M/Z (eixo x).
Se eu tenho o íon monocarregado, a diferença entre eles é 1, se ele tem duas cargas, a
diferença é ½, 3 cargas, 1/3... Ou seja, conforme o número de cargas for aumentando, a
diferença entre os sinais é menor. Chega uma hora que eu não consigo separar os sinais.
Então eu não consigo olhar o padrão isotópico e saber quantas cargas tem. Veja, todos
esses sinais tem a mesma massa, mas cargas diferentes. Então veja, temos o sinal de
804,9 e sabemos que isso é igual a 804,9 = (m+x)/x e o sinal do lado vai ser
768,3 = (m+x+1)/(x+1) por que a distribuição é contínua. Como eu divido por um
número de cargas maior, a relação M/Z é menor.

E agora temos duas equações e duas variáveis para descobrir a massa da minha
molécula. (Se for achado o valor de x, foi achado o número de cargas).
Se a separação entre os sinais for muito pequena a ponto de eu não conseguir separar
pra saber a carga, é só montar esse sistema de equação. Se esse espectro tivesse sido
tirado no modo negativo, teríamos: 804,9 = (m-x)/x e 768,3 = M-(x+1)/(x+1)

Quando tínhamos EI, a forma de colocar a amostra no analisador era em forma de

gás, e eu falei que isso era fantástico para acoplar com um cromatógrafo. Se eu pegar o
ESI eu introduzo a amostra em forma de solução. Isso me permite acoplar o meu ESI a
um HPLC. Eu injeto a amostra na coluna, eles vão se separando, e na hora que saem é
possível fazer a análise pois já temos a solução da amostra e os analitos estão separados.

De todas as cromatografias líquidas, a forma mais comum é a de fase reversa (C18).

O que é tipicamente o solvente de um cromatógrafo liquida? Água e acetonitrila ou água
e metanol, que é exatamente o tipo se solvente que eu preciso para fazer ESI. Então o
acoplamento é perfeito.
 Eu comentei que no caso do EI, o GC era imprescindível por que separava os
compostos. Mas no ESI, caso dê algum problema e o cromatógrafo não separe os
componentes da minha amostra e eles coeluírem, não tem problema, visto que cada
composto dará um sinal independente.

Isso aqui é uma forma de resumir mais ou menos tudo que a gente viu até agora: