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Massas Resumo (Gozzo)
Massas Resumo (Gozzo)
UNICAMP – CAMPINAS/SP
2º Semestre de 2015
2
“Tomei a decisão de fingir que todas as coisas
que até então haviam entrado em minha mente não
eram mais verdadeiras do que as ilusões dos meus
sonhos”
3
4
SUMÁRIO
SUMÁRIO ......................................................................................................................... 5
INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 9
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 13
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 25
5
2. IONIZAÇÃO POR IMPACTO ELETRÔNICO (EI) ..................................... 25
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 37
2.3.REARRANJOS DE McLAFFERTY...................................................................... 45
6
CAPÍTULO V – ANALISADORES MASSA/CARGA ............................................. 55
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 55
7
CAPÍTULO VI - ANÁLISES SEQUENCIAIS E APLICAÇÕES MS/MS .............. 77
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 77
8
INTRODUÇÃO
Seus primórdios datam em 1886, quando E. Goldstein descobre a existência dos raios
catódicos. Assim, o progresso da técnica sempre acompanhou o desenvolvimento e
modificações vistas para o modelo atômico: a presença de isótopos, a massa molecular, a
diferenciação de núcleo e eletrosfera, a ionização e elucidação de mecanismos radicalares
e iônicos, entre outros avanços científicos.
i. Formação de íons: desta forma, qualquer composto neutro ou radicalar que não
esteja na forma de íon não poderá ser analisado;
ii. Íons em fase gasosa: os íons gerados devem estar em fase gasosa antes de serem
analisados. Assim, caso forme-se o íons, mas este esteja em fase líquida ou sólida (menos
provável), este não conseguirá ser detectado;
9
10
CAPÍTULO I – O CONCEITO MODERNO DE MASSA E ÁTOMO
1. INTRODUÇÃO
Pode-se iniciar este capítulo com uma observação perturbadora: para um curso que se
trata de massas como o próprio nome já diz, em nenhum momento deve-se utilizar a
tabela periódica. Isto se deve ao fato de que a tabela periódica contém diversas
aproximações que afastam esta da realidade encontrada. Por exemplo:
Os exemplos a seguir apenas são uma prévia das anormalidades que podem ser vistas:
11
Exemplo 2: considerando o modelo atômico até o momento
conhecido, sendo o núcleo formado por prótons e nêutrons, com
elétrons presentes na eletrosfera. Pode-se inclusive considerar o
modelo atômico mais antigo, o que apenas facilitaria a compreensão
do problema proposto. Figura 1: Modelo atômico
mais antigo
Admitindo que a interação eletrostática seja a que mantém prótons e elétrons em
conjunto, por que o núcleo não entra em colapso pelo excesso de cargas positivas? Por
que os elétrons não escapam do átomo? Se os nêutrons não tem carga, como se sabe, qual
a sua contribuição para estabilidade do núcleo?
ii. Nuclear Fraca: relacionada com o decaimento nuclear e o spin dos núcleos, com
alcance de 10-18 metros, mas com intensidade baixa (escala relativa de intensidade de
10-6), podendo ser desconsiderada, igualmente a força gravitacional;
iii. Eletrostática: possui uma interação que pode ser repulsiva ou atrativa dependendo
da carga dos íons, elétron ou outra entidade. Possui alcance infinito, porém com uma
intensidade relativa de 1/137;
12
Assim, o que ocorre para um Repulsão
Eletromagnética
átomo? Inicialmente como se observa
a interação eletrostática é a
governante, fazendo com que ocorra a Atração
repulsão eletromagnética. Esta força Nuclear Forte
Como a força nuclear forte é 137 vezes maior que a eletrostática, a atração pode
ocorrer, diminuindo em enorme extensão a energia do sistema. Este processo altamente
exotérmico, fonte de uma quantidade absurda de energia é conhecido popularmente por
fusão nuclear ou fusão atômica. Um exemplo da quantidade de energia liberada nestes
processos pode ser visto nas bombas atômicas de hidrogênio.
Conhecido pela sua célebre equação E = mc², Albert Einstein introduz o conceito de
transformação de matéria em energia. Esta promove a resposta para o primeiro exemplo
mostrado anteriormente. Como o hélio é um elemento que veio da fusão de dois átomos
de hidrogênio, sua massa não é igual a massa original uma vez que, para o processo de
fusão ocorre a diminuição da massa total pela liberação de energia no processo.
Quanto mais pesado o átomo, maior a energia necessária para a fusão atômica e assim,
consequentemente maior energia liberada. Desta forma, quanto mais pesado o átomo,
maior o desvio entre a massa original e a final para o átomo.
13
3. DEFEITO DE MASSA
14
4. OS TIPOS DE MASSAS
iii. Massa Monoisotópica: é a massa do isótopo mais abundante para cada elemento.
Possui a particularidade de ser única para cada elemento químico;
Nenhuma massa isotópica é igual a outra, nem mesmo múltipla de outra. Assim, a
determinação da massa com um número suficientemente de exatidão consegue prever
com grande confiabilidade a fórmula molecular para uma estrutura.
Exemplo: para uma massa encontrada de114 Da, observa-se que esta pode representar ao
mesmo tempo diversos compostos, como: C6H10O2, C6H14N2, C7H14O ou C8H18.
C7H14O 114,104457 5
15
Desta forma pode-se encontrar com grande precisão a formula molecular para tal
composto. Os espectrômetros atuais conseguem determinar com mais de cinco casas
decimais o valor da massa molecular, permitindo que o erro seja praticamente mínimo
quando comparado com o valor calculado da massa molecular.
A espectrometria de massas (que a partir de agora poderá ser abreviada para MS) é
uma técnica que mede as massas moleculares levando em consideração os isótopos
constituintes, considerando suas devidas proporções. Assim, dependendo dos isótopos e
suas proporções relativas, uma mesma molécula poderá ter mais que uma massa.
16
CAPÍTULO II – SOBRE O ESPECTRÔMETRO E ESPECTRO DE MASSAS
Cada uma das partes que compõe o espectrômetro de massas será individualmente
estudada, comentando sobre suas importâncias, características principais e utilizações.
iii. Analisador de m/z: sua função é a de separar e analsiador os íons de acordo com
suas razões massa/carga. Os analisadores mais comuns são: Bipole (B),
Quadrupole (Q), Time of Flying (TOF), Orbitrap, Ion Trap (IT), entre outros;
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1. SOBRE UM ESPECTRO DE MASSAS
Pico mais intenso: Pico Base
Como se sabe, o Carbono-12 é o isótopo mais abundante para este elemento. Assim,
realizando-se um espectro de massas para o metano, se vê um pico (chamado de pico
molecular por representar a massa molecular do composto) em 16. Isto corresponde à
massa molecular desta molécula; entretanto, também se vê um pico inferior para 17. Isto
18
corresponde a pequena parcela de moléculas de metano onde o átomo de carbono consiste
nos isótopos de Carbono-13. Este pico possui a intensidade relativa de praticamente 1%,
o que corresponde a proporção isotópica para este elemento. Poder-se-ia pensar também
que este pico corresponde aos hidrogênios presentes na forma de Deutério, mas isto não
seria necessário, uma vez que a proporção isotópica deste elemento é inferior a 0,01% de
abundância relativa com o
Hidrogênio-1.
Aumentado a cadeia
molecular para o decano,
observa-se que houve um
aumento do sinal corresponde à
M+1, uma vez que agora a
probabilidade de existir um Figura 8: Diferentes espectros de massa obtidos para o metano
(esquerda) e decano (direita)
átomo de Carbono-13 em dez
átomos de carbono é próximo à 11%. Nestes casos deve-se lembrar de que a
probabilidade é aditiva (ou seja, soma-se a probabilidade de tal átomo ser Carbono-13).
Isto continua de maneira linear para cada átomo de carbono somado a molécula. Assim,
para uma cadeia de cinquenta carbonos, além da probabilidade de se existir um Carbono-
13, existe a probabilidade de existirem dois Carbono-13, mostrando assim um pico M,
M+1 e M+2. Em casos com cadeias superiores a cem carbonos, a probabilidade de se
existir um Carbono-13 em cem carbonos é maior do que existir uma cadeia com cem
Carbonos-12, fazendo com que o pico M+1 supere o pico corresponde à M.
Com uma cadeia com cento e cinquenta carbonos os picos correspondentes à M+1e
M+2 são superiores aos de M. Isto se deve unicamente a probabilidade. Quanto maior a
cadeia, maior a probabilidade de se existirem um átomos diferente do outro,
acompanhando logicamente a proporção isotópica deste elemento.
19
–Assim, nem sempre o pico molecular corresponde ao pico mais intenso do espectro. Isto
somente ocorrerá em cadeias onde se encontram um número inferior à noventa carbonos.
Esta proporcionalidade e picos demonstrados são denominados de padrão isotópico do
carbono. Este padrão revela uma informação muito importante: uma vez que se sabe que
o pico M+1 varia unicamente com o número de carbonos na molécula, sua intensidade
relativa para o pico molecular revela o número de carbonos do analito.
O número de carbonos ser obtido a partir do pico M+1 é uma informação muito útil.
Observe na Figura 10 que há três estruturas com distintas fórmulas moleculares.
Entretanto a intensidade de M+1 para todas é exatamente igual, uma vez que o número de
carbonos para todas são iguais. A intensidade de M+1 não depende dos outros átomos
formadores da molécula, como pode ser visto.
Figura 10: Diferentes espectros de massa para compostos com diferentes fórmulas moleculares, mas com
mesmo número de carbono (observar mesma intensidade para M+1)
- 120 Carbonos: M + 1 = 100 – (120 x 1,1%). Assim, M+1 = 122 % de M; (M+1 > M)
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1.2. OUTROS PADRÕES ISOTÓPICOS
16 18 14 15
Exemplo: O (99,80 %) x O (0,20 %); N (99,93 %) x N (0,63 %); são dois casos
onde se esperaria um padrão isotópico em M+2 e M+1, respectivamente. Entretanto,
devido suas abundâncias relativas, além de serem raros os casos onde existam moléculas
muito ricas em nitrogênio ou oxigênio, raramente seus espectros serão influenciados pelos
padrões isotópicos destes elementos.
Entretanto para o cloro e bromo suas abundâncias relativas são próximas o suficiente
para influenciar o espectro de massas. Como já visto a proporção de Cloro-35 e
Cloro-37 é de aproximadamente 3:1, enquanto para o Bromo-79 e Bromo-81 a proporção
é de 1:1. Isto significa que seus padrões serão observados para M e M+2.
Figura 11: Padrões isotópicos para molécula com um átomo de cloro e um átomo de bromo
Como observado na Figura 11, uma molécula contendo um átomo de cloro apresenta
um pico em M+2 na proporção relativa de 33% de M. Enquanto isto, uma molécula com
átomo de bromo apresenta M+2 com proporção relativa de 50% de M. Isto segue
exatamente como imaginado para o carbono, seguindo as devidas proporções em termos
21
de abundância isotópica para cada elemento. Nestes casos onde as moléculas não são
grandes, os picos de M+2 não correspondem para casos com dois Carbono-13.
Para moléculas mais complexas como as da Figura 12 pode haver casos onde um pico
corresponde à soma de duas probabilidades de massa:
Figura 12: Diversos espectros de massas para moléculas com padrões isotópicos observáveis
12
i. Para C15H31Cl: sabe-se que M: 246 corresponde à C151H3135Cl; sabe-se que
M+1: 247, corresponde à 13C112C141H3135Cl e que este tem intensidade relativa de 16% de
M, o que resulta em um número de carbonos de 15, como é esperado. Já em M+2
12
observa-se os sinais de C151H3137Cl junto à 13
C212C131H3135Cl, porém este último
contribui em proporção quase insignificante devido ao número de carbonos, sua
intensidade relativa é de 33% de M, uma vez que esta intensidade é a probabilidade de
que o átomo de Cloro seja 37 e não 35. Por fim, o sinal referente à M+3 corresponde à
22
13
C212C131H3137Cl, tendo este intensidade relativa de 16% de 33% de M, devido à
probabilidade multiplicativa (deve-se ter um Carbono-13 ao mesmo tempo em que um
Cloro-37 (ou seja, isto representa ou 16% de 33% vistos no espectro);
Para os espectros inferiores o que ocorre é a presença de dois átomos de cloro ou dois
átomos de bromo. Para compreender os picos, usa-se a probabilidade. A existência de
dois átomos de Cloro-37 (ou Cloro-37) em dois átomos de cloro é multiplicativa. Já a
presença de apenas um átomo é aditiva. Lembre-se, para o primeiro caso deve-se ter um
átomo de Cloro-35 E outro átomo de Cloro-35. Já para a segunda probabilidade deve-se
ter um átomo de Cloro-35 OU o outro átomo com este isótopo. Assim:
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iv. Para o C20H40Br2: M: 438 – 12C201H4079Br2;
12
M+1: 439 - C1913C11H4079Br2;
M+2: 282 - 12C201H4079Br181Br1;
M+3: 283 - 12C1913C11H4079Br181Br1;
M+4: 284 - 12C201H4081Br2, raramente 12C1813C21H4079Br81Br;
Esta dica é unicamente válida para este elemento, pois ele é o único que se apresenta
em uma proporção isotópica tão próxima à 1:1. O cloro, por apresentar proporção
isotópica de 3:1 não desfruta de tal propriedade.
Uma propriedade interessante para as moléculas neutras que possuem número ímpar
de nitrogênio é que estas moléculas serão as únicas as quais apresentam massa molecular
ímpar. Isto se deve unicamente ao fato do nitrogênio ser o único elemento com valência
ímpar enquanto possui uma massa par.
NOTA IMPORTANTE: a massa de uma molécula NEUTRA só será ímpar caso esta
tenha um número ÍMPAR de nitrogênios. Caso a molécula não atenda ao mesmo tempo
estas duas restrições, nada se pode dizer a respeito da presença de nitrogênio.
24
CAPÍTULO III – TÉCNICAS DE IONIZAÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Como já visto anteriormente, apenas moléculas que podem formar íons é que serão
analisadas e gerarão de fato um sinal no espectrômetro de massas. Assim, o método para
formação dos íons é essencial para o sinal gerado. As duas principais técnicas que serão
abordadas são a Electron Ionization (EI) e ElectronSpray Ionization (ESI).
A utilização desta energia para o impacto eletrônico é a que promove maior eficiência
na formação dos radicais, sendo um parâmetro determinado experimentalmente. A partir
da reação acima nota-se a transferência ou depósito de energia no íon radical formado.
Esta energia acrescida deve, e será dissipada da molécula. Uma das formas seria a
irradiação, entretanto o processo é particularmente rápido, o que não promove tal
fenômeno. A outra possibilidade é a quebra e/ou formação de novas ligações químicas. O
método EI é altamente eficiente no que se diz respeito à formação de fragmentos
moleculares, que já serão abordados futuramente.
25
A EI é realizada em uma câmera a vácuo,
extraindo rapidamente os íons que são
formados. Devido à baixa pressão, não há
colisão ou contato entre as moléculas, o que
evita acoplamentos ou dissipação de energia
por estes processos.
A EI é uma técnica muito utilizada no que Figura 14: Representação de uma fonte de
ionização por impacto eletrônico
se diz respeito à sua alta reprodutibilidade.
Devido às condições as quais a EI é realizada, o único fator que poderia interferir e diferir
entre dois espectros de um mesmo composto seria a energia utilizada para o impacto
eletrônico. Sendo esta variável fixa em 70 eV, a EI consegue em dois equipamentos
diferentes produzir dois espectros com alta proximidade e semelhança;
i. Unicamente útil para soluções puras: uma vez que ocorre a fragmentação do
composto, uma mistura de dois compostos iria um espectro aditivo de toda a
fragmentação para cada um dos analitos, o que gera erro na análise;
iii. Em alguns casos o íon molecular pode não aparecer: uma vez que ocorrem
diversas fragmentações o íon molecular pode ser convertido totalmente para fragmentos,
o que faz com que a informação da massa molecular seja perdida;
26
3. IONIZAÇÃO POR ELETRONSPRAY (ESI)
Para solucionar justamente os obstáculos impostos pela técnica de EI, em 1989 John
Fenn inventou uma nova maneira de ionizar e levar estes íons a modo gasoso.
Denominada de Ionização por Eletronspray, esta promove a ionização das moléculas sem
a necessidade de volatilizar as espécies. Esta técnica atualmente ocupa mais de 90% dos
casos para MS, uma vez que a amostra é inserida ainda em solução. Desta forma, em
2002 John Fenn foi laureado com o Nobel de Química.
Uma vez que esta concentração é alta, esta repulsão é capaz de ejetar estes íons
solvatados para fora do capilar. No espaço entre a saída do capilar até o inicio do
analisador de massa carga, estas gotas formadas e ejetadas são submetidas a aquecimento
a fim de secagem desta. Este é o momento mais importante do ESI; uma vez que se inicia
a secagem, os íons acumulados na etapa anterior iniciam um movimento repulsivo ao
mesmo tempo em que a gota seca. No limite da conciliação entre secagem da gota –
repulsão eletrostática ocorre o colapso da mesma, se fragmentando em gotas menores. É
através deste processo que, no fim deste têm-se um íon em fase gasosa.
Note que, em termos gerais o ESI não promove a ionização, apenas a secagem dos íons.
O composto já entra no ESI em forma iônica.
27
Figura 15: Processo simplificado de ionização utilizando eletronspray
Os espectros obtidos por ESI são altamente superiores aos de EI tratando-se dos
requistos de pico molecular. A técnica de ESI possui fragmentações muito mais brandas e
menos energéticas que a EI, permitindo que o pico molecular seja preservado.
28
Assim:
- Utilizando ESI (+): ocorre a protonação do analito. Assim o pico molecular é M+1;
- Utilizando ESI (-): ocorre a desprotonação do analito. Assim o pico molecular é M-1;
29
Como raramente se analisa uma substância pura, o acoplamento entre MS-EI com GC,
gerando GC-MS torna-se uma ótima solução para este problema. Uma vez que a
cromatografia gasosa separa cada substância com alta resolução, fazendo com que o
espectrômetro identifique e analise apenas um composto da mistura de cada vez.
Pelos mesmos motivos já citados também se chega a conclusão que a melhor técnica a
ser acoplada a ESI é a HPLC. Uma vez que nesta técnica de ionização os íons são
inseridos em meio aquoso, acoplar o espectrômetro com um HPLC garante boa resolução
e identificação dos compostos da mistura. Como no modo ESI ocorre menor chance de
fragmentação, raramente têm-se picos moleculares concomitantes, com exceção de
moléculas com massas isobáricas (casos mais raros).
30
5. ESPECTROS ESI- MULTIPROTONAÇÕES/MULTIDESPROTONAÇÕES
Uma das maiores vantagens do método ESI é a possibilidade de levar compostos com
massas moleculares elevadas e não voláteis para a fase gasosa. É importante lembrar de
que este método não forma íons, uma vez que a solução que entra no capilar já se
encontra em forma iônica. Análise utilizando este método, quando voltada a estruturas e
moléculas muito grandes (atualmente a maioria dos estudos na área de espectrometria de
massas baseia-se em estudos de moléculas macrobiológicas, como proteínas, lipídeos,
hormônios, entre outros) pode gerar espectros com diversas propriedades únicas.
Como já se sabe também, o modo de ESI utilizado afetará o valor referente ao o pico
molecular de forma que:
- Utilizando ESI (+): ocorre a protonação do analito. Assim o pico molecular é M+1;
- Utilizando ESI (-): ocorre a desprotonação do analito. Assim o pico molecular é M-1;
Figura 19: Espectro de massas para um peptídeo com massa molecular próxima a 1500 Dalton
31
Aproximando o pico observado é possível enxergar o padrão isotópico para este
composto, que como já anteriormente explicado, refere-se às probabilidades encontradas
para a presença de átomos de carbono na estrutura. Entretanto, notando-se bem o padrão
isotópico desdobrado é possível ver que a diferença entre um sinal e outro e de
aproximadamente 0,5 e não de 1,0 como esperado para qualquer composto. A resposta para
isto encontra-se no eixo x do espectro. O espectrômetro de massas mede de fato a relação
massa/carga do analito. Desta forma, o padrão isotópico que possui a diferença de uma
unidade de massa entre os picos somente seria possível caso o composto estive na forma
monoprotonada (ou monodesprotonada). Para um espaçamento de 0,5 seguindo ao
esperado, sabe-se que este composto apresenta-se na forma com duas protonações ou duas
desprotonações. Assim, seu pico molecular refere-se a M+2 ou M-2.
Diversos exercícios necessitam deste tipo de tratamento inicial. Caso adotasse este pico
como sendo o molecular, o erro em torno da massa molecular do composto seria de 200%
comparado ao valor real (caso a molécula se apresentasse com duas protonações ou
desprotonações). Para determinar a massa molecular nestes casos deve-se avaliar o
espaçamento entre dois picos adjacentes. Sendo dois picos M e M’:
Se: - Δm/z (M-M’) = 0,5, tem-se uma dupla protonação ou dupla desprotonação;
32
Estas fórmulas vão de encontro com o que já se sabe, uma vez que se determina
primeiramente um pico onde se conhece o número de protonações ou desprotonações
ocorridas. Este valor é dividido pelo número de protonações ou desprotonações ocorridas.
Para o valor de m/z pico deve-se adotar o pico molecular. A diferença entre as fórmulas é
que para a ESI (+) ocorreram protonações, então se deve descontar o número de prótons
adicionado. Por motivo análogo, na ESI (-) deve-se adicionar o número de prótons
removidos no processo de formação dos íons em fase aquosa.
Exemplo:
A partir do espectro de massas acima, vê-se que a diferença entre os picos é de 0,50.
Aliando isto ao fato de que o modo é ESI (+) sabe-se que este composto esta
di-protonado. Utilizando a fórmula mostrada na página anterior:
Exemplo 2:
33
A partir do espectro de massas acima, vê-se que a diferença entre os picos é de 0,33.
Aliando isto ao fato de que o modo é ESI (+) sabe-se que este composto esta
tri-protonado. Utilizando a fórmula mostrada na página anterior:
Deve-se atentar na escolha de qual pico será utilizado na fórmula – pico molecular.
Exemplo 3:
A partir do espectro de massas acima, vê-se que a diferença entre os picos é de 0,25.
Aliando isto ao fato de que o modo é ESI (+) sabe-se que este composto esta
tetra-protonado. Utilizando a fórmula mostrada na página anterior:
Para os exemplos acima se verifica que a escolha do pico molecular é essencial para
garantir que a massa molecular seja corretamente calculada. Entretanto em compostos
com massas moleculares acima de 5000 Dalton espera-se protonações ou desprotonações
em quantidades acima de 10-15 unidades. Isto resulta em uma diferença dos sinais
massa/carga inferior à Δm/z de 0,10. Nestes casos torna-se impossível calcular através do
padrão isotópico o número de protonações e/ou desprotonações presentes. Desta forma,
outros meios são necessários para determinação de massa molecular em proteínas ou
macromoléculas orgânicas.
34
A demonstração da fórmula empregada para a determinação da massa molecular nestes
casos é demonstrada junto ao exemplo a seguir:
Exemplo:
Considerando o pico de m/z 845,1. Sabe-se que este pico possui, devido ao método
empregado ser ESI (+), um número de protonações iguais à x. Tomando agora o pico à
sua esquerda com m/z 804,9, sabe-se que este pico possui x+1 protonações. Assim, pode-
se formar um sistema linear a fim de determinar a massa molecular.
Duas regras muito importantes devem ser seguidas para as equações mostradas:
ii. Além da mudança da fórmula para os picos adjacentes à esquerda e direita, para
os diferentes métodos de ESI tem-se diferentes fórmulas;
35
O resultado encontrado para a massa molecular da mioglobina seria idêntico caso fosse
utilizado na fórmula o pico à direita do m/z 845,1. Entretanto, deve-se lembrar de que o
pico a direita corresponde à massa molecular com x-1 protonações. Desta forma o sistema
de equações seria diferente para a segunda expressão.
Para dois picos adjacentes têm-se as seguintes fórmulas para calcular massa molecular.
Lembrar sempre de observar o método de ionização utilizado, além das posições relativas
entre os picos escolhidos.
36
CAPÍTULO IV – MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E REARRANJOS
1. INTRODUÇÃO
Deve-se neste momento introduzir uma importante regra que diz respeito aos
processos de fragmentação em uma molécula. Conhecida como Regra de Stevenson, ela
pode ser simplificadamente transcrita como “entre optar pela estabilidade relativa de um
cátion e um radical, o cátion é quem governará. Estabilizar um cátion é mais favorável
energicamente do que estabilizar um radical”.
A compreensão dos processos envolvendo os íons radicalares são os mais difíceis, pois
envolvem mecanismos radicalares, pouco exploradas até o momento. Pode-se, entretanto,
compreender facilmente os produtos gerados das fragmentações através da regra dos
números de elétrons:
Iniciando com uma molécula de massa par (ou seja, sem número ímpar de nitrogênios):
São ocasionadas por íons, não radicais. É observada após fragmentações alfa em íons
inicialmente radicalares ou através de fragmentações em sistemas de ionizações por ESI.
Neste caso a clivagem é induzida pelos íons, normalmente gerado em sítios consistidos
por heteroátomos. Como produtos normalmente gerados encontram-se novos íons e
moléculas neutras, sendo estas não detectadas.
38
A melhor forma de compreender estes processos é através de exemplos. Os próximos
formam um crescendo de complexidade em termos de estruturas. Observe que para uma
mesma molécula há uma grande quantidade de possibilidades de fragmentações, além de
que, uma pequena mudança na estrutura do composto pode gerar, de dois isômeros, uma
quantidade diferente de fragmentos.
De primeiro momento nota-se se demonstra que a ESI pode gerar um pequeno número
de fragmentos, uma vez que é mais branda (radicais são espécies mais reativas). Além
disto, o método ESI não pode realizar clivagens-alfa, uma vez que não haverá a formação
de íons. No caso acima a propanona não pode ser analisada por ESI-(-) uma vez que
cetonas não possuem hidrogênios-ácido disponíveis.
39
Exemplo 3: 3-Heptanona utilizando EI
i
i
40
Exemplo 5: Ácido butanoico utilizando ESI-(-)
i i
41
Exemplo 8: 3-Hexanol utilizando ESI-(+)
i i
i
i
42
Figura 21: Exemplos de espectros obtidos para diferentes isômeros de heptano, junto a seus fragmentos
43
Exemplo 10: N-benzil-fenilamida utilizando EI
i
i
α
i
De primeiro momento o íon R-NH+ pode causar estranhamento, uma vez que nos
mecanismos conhecidos, R-NH3 possui uma carga positiva, enquanto R-NH possui uma
carga negativa. Entretanto, observe que neste caso, o composto R-NH possui apenas um
par de elétrons livre e não dois como comumente ocorrem. Utilizando a fórmula para
carga formal efetiva, chega-se na carga de +1, concordando com o valor colocado.
44
Até o momento se estudou duas possibilidades de fragmentações, supondo um
composto com massa inicial par (seguindo assim as regras do nitrogênio).
Clivagem Alfa
Clivagem Indutiva
45
Para cetonas (ou aldeídos) que apresentam para um dos seus substituintes uma cadeia
igual ou maior do que quatro carbonos dispostos linearmente pode-se realizar um
rearranjo de McLafferty, como mostrado a seguir.
46
Da mesma forma esquematizada anteriormente, tem-se que:
Rearranjo de McLafferty
Sendo neste caso aromáticos compostos que apresentam pelo menos um benzeno em
sua estrutura, há diversos íons que são típicos para qualquer aromático e que sempre irão
ser registrados em um espectrômetro de massa, independentemente dos seus substituintes.
São eles, em m/z: 39, 51, 65 e 77. De forma estrutural:
47
Os mecanismos para obtenção destes fragmentos são demasiadamente complexos para
o momento, sendo assim, deve-se apenas lembrar-se das suas relações massa/carga e
estruturas. O espectro de massas para o benzeno é mostrado a seguir:
Figura 26: Espectro de massas para o benzeno, evidenciando os fragmentos anteriormente citados
48
Exemplo 1: Rearranjo do íon tropílio para o p-metil fenol
Nota-se que para o derivado do íon tropílio gerado sua massa deve-se justamente à
massa do íon tropílio (m/z 91) subtraído de um hidrogênio e adicionado 17 unidades
devido ao grupo hidroxila adicionado. O íon tropílio possui uma estabilidade apreciável
devido a atender as regras de Hückel para aromaticidade dos compostos.
49
Figura 28: Mecanismo genérico para a derivação do rearranjo de McLafferty em aromáticos
50
4. PREDIÇÃO DE FRAGMENTOS E ESPECTROS DE MASSA
Por fim podem-se juntar todas as informações obtidas desde o Capítulo II para, a partir
de uma molécula dada, predizer fragmentos esperados. O caminho inverso, de determinar
a estrutura a partir do espectro é um pouco mais complexo e não será objetivo neste
momento. Neste processo serão empregados conceitos como padrões isotópicos,
rearranjos, clivagens e métodos de ionização.
Para os exemplos a seguir é importante notar que, a intensidade relativa dos sinais não
é levada em consideração, pois são dados empíricos. Os fragmentos mostrados são
gerados a partir de todas as classes estudadas anteriormente, ocorrendo simultaneamente
na molécula. O que será feito então não foge da analise empírica de todas as
possibilidades de fragmentação para uma molécula dada levando sempre em consideração
o método de ionização empregado para a mesma.
- Seta Laranja: indica um rearranjo (podendo este ser de McLafferty ou do íon tropílio);
Setas pretas indicam a remoção de algum fragmento ou íon, como já estava sendo
realizado anteriormente. Atente as relações massa carga de todos os fragmentos; como
dito, as intensidades dos sinais não podem ser dadas, entretanto as intensidades relativas
de padrões isotópicos podem como nos casos já estudados.
51
Moléculas complexas podem gerar uma infinidade de fragmentos, como visto:
Figura 29: Rota sintética para um biocomposto utilizando na detecção de metabólitos em camundongos
52
Exemplo 2: n-butil-isopentil-Cetona utilizando ESI-(+)
53
Exemplo 3: Fragmentos para diferentes tipos de ionização de um aromático substituído
54
CAPÍTULO V – ANALISADORES MASSA/CARGA
1. INTRODUÇÃO
Até o momento já se compreende como uma amostra pode ser ionizada e levada à fase
gasosa através de diferentes métodos, além de como se podem realizar suas
fragmentações, gerando frações da estrutura que podem indicar a presença de
determinados grupos funcionais ou de átomos com padrões isotópicos conhecidos.
55
Exemplo: calculando a resolução para o seguinte pico dentro de um espectro
= 1627
Exemplo: calcular a largura do pico para compostos de massa: 10, 300 e 15000 Dalton
supondo uma resolução fixa em 5000 (resolução não possui unidade).
Observa-se assim que com o aumento da massa analisada o pico torna-se mais largo,
podendo chegar a um ponto extremo onde dois picos próximos começam a formar uma
banda (algo próximo a uma co-eluição cromatográfica). Desta forma, para equipamentos
mais modernos deve-se ou modificar a resolução conforme a massa cresce ou possuir
uma grande resolução, porém fixa. Equipamentos modernos contam com resoluções
superiores à um milhão, podendo separar massas de até 120 mil Dalton.
56
Mais importante que compreender o conceito de resolução é verificar se a resolução
para tal equipamento é a mínima necessária para separar dois picos. Os dois picos mais
utilizados em espectros de massa são justamente o de um padrão isotópico. A fórmula
utilizada para cálculo da resolução mínima do analisador é mostarda a seguir:
Figura 31: Diferentes espectros para analisadores com resolução de 1000 (em preto), de 3000 (em roxo)
e 10000 (em verde) para um composto de massa 1088 Dalton
57
Figura 32: Diferentes espectros para compostos de diferentes massas utilizando uma resolução fixa de 5000
Outro ponto importante onde a resolução pode ser empregada é na separação e análise
de compostos com massa muito próxima. Como já dito, em aparelhos unitários isto não é
possível de ver visto, mas sabe-se que a massa de uma molécula é única para esta,
levando em consideração os átomos e isótopos presentes.
Exemplo: qual a resolução necessária para separar o gás nitrogênio (m/z 28,0061) do
monóxido de carbono (m/z 27,9949) ?
58
ii. Exatidão de Massa (Erro): é uma estimativa da precisão da análise, vista pela
diferença de massa experimental e a esperada. Equipamentos nominais não apresentam
erro uma vez que o erro mínimo seria de uma unidade, coincidindo com a possível massa
de outro íon. Espectrômetros modernos alcançam um erro na casa de ppm - partes por
milhão, o que significaria um erro de um grama à cada tonelada.
Diferente da resolução, o erro de massa é dado pela análise, dependendo da
calibração e do operador, devendo ser realizados anteriormente à análise. A fórmula para
o erro, em ppm, é mostrada a seguir:
OBS.: a exatidão, ou erro, não pode ser maior do que a distância entre dois picos, pois
deste modo os dois picos iriam concomitar. Assim, nota-se que a resolução de nada
importa caso a exatidão contida na análise seja baixa.
Exemplo: qual o erro máximo permitido para diferenciar uma massa de 10 e 11 Dalton?
Além destas duas características principais serão avaliadas para cada um dos
analisadores estudados suas possibilidades de acoplamento, o tipo de feixe utilizado
(contínuo ou pulsado), sua discriminação (vinculada à analise simultânea de íon), a
sensibilidade para cada método, entre outras características.
59
2. ANALISADOR POR SETOR MAGNÉTICO (S.M.)
60
Assim, regulando-se o campo magnético pode-se fazer uma chamada “varredura de
íons”; ou seja, a análise de uma massa/carga por vez é chamada de análise
discriminatória de íons, sendo esta uma característica típica para o setor magnético.
Isto implica que para um íon de dada razão massa/carga “M” haverá íons com uma
massa/carga inferior, mas com velocidade superior ao dos íons “M”, atendendo assim o
campo “B” aplicado. Também haverá íons com uma razão massa/carga inferior à “M”
que possuirão menor velocidade, também atendendo a equação citada. Isto significa que
não somente os íons com razão “M” serão detectados, ocasionando erros à análise.
Devido a Lei de Distribuição de Velocidades não há capacidade de completa separação
dos íons utilizando unicamente um campo magnético.
61
Atualmente os equipamentos que utilizam estes dois setores são conhecidos como
dupla focalização, uma vez que inicialmente é aplicada a focalização magnética e logo em
seguida a focalização elétrica. O esquema para representar estes equipamentos é muito
semelhante ao visto na Figura 33, sendo mostrada logo a seguir:
- Setor elétrico: separa os íons devido à sua energia cinética ou velocidade de saída;
- Analise discriminatória (menos para razão isotópico, que será vista posteriormente);
62
2.1. APLICAÇÕES DO SETOR MAGNÉTICO
63
2.1.2. A Exploração Espacial e o Setor Magnético
64
deveriam chamar o superior, que
apertaria dois botões e o processo se
repetiria por longas jornadas de trabalho.
Estas instalações de segurança máxima
escondiam atrás do painel grandes
espectrômetros de massa que faziam a
separação quantitativa dos isótopos de
urânio através de um setor magnético. A
utilização de mulheres pode ser Figura 38: Esquema de um calutron construído no
Reino Unido na década de 40
explicada pela época em que se vivia:
uma tentativa do governo de delegar “funções importantes às mulheres do país” além da
crença de que mulheres iriam manter o sigilo de seus serviços, dada importância e
confidência do projeto envolvido.
65
Figura 39: Esquema de um espectrômetro a à base de setor magnético para análises de padrão isotópico
- H2O/ HDO: como há diferentes massas entre estes dois compostos, pode-se rastrear a
origem e histórico de dada amostra de água, uma vez que a quantidade de HDO presente
em rios é lagos é diferente da presente em nuvens (uma vez que a evaporação do HDO é
mais lenta devido a maior massa do composto). Neste caso se utiliza os detectores de
razão massa/carga 2 e 3, necessitando antes uma conversão química da amostra.
- 14C/ 13C/ 12C: de maneira semelhante pode-se determinar a presença de carbono em suas
três formas isotópicas possíveis utilizando para isto os detectores de 44, 45 e 46
(respectivo aos isótopos 12, 13 e 14 do carbono). Como o decaimento do carbono
presente em seres vivos tem meia vida de 10 mil anos, pode-se realizar datações através
da determinação de abundância relativa deste isótopo. Em questões de dopping o
processo é o mesmo, uma vez que a quantidade de dado hormônio nada pode informar,
entretanto a porcentagem relativa de Carbono-14 presente em esteroides sintéticos é
diferente do produzido pelo metabolismo, podendo ser fonte de análise.
66
3. ANALISADOR POR QUADRUPOLO (Q)
Figura 40: (À Esquerda) - Esquema de diâmetros e distância entre polos. Deve-se atender que D/d = 1,148
67
dois polos (um positivo e negativo) conforme já se sabe. Devido a ser uma corrente direta
as voltagens destes dois polos não se alteram, gerando uma voltagem constante.
Entretanto, acima desta DC aplica-se uma RF. A grande ideia por trás do quadrupolo
encontra-se aqui: ao aplicar um campo de RF acima de um campo DC cria-se assim um
campo oscilante. Os íons que acabaram de sair do ionizador entram neste campo,
começando assim a oscilar de maneira a procurar um equilíbrio.
68
Assim, nota-se que para uma das
barras esta sempre permanecerá com a
voltagem positiva. Já para a outra barra
ocorre o contrário.
O processo praticamente oposto ocorre para a outra barra. Como esta tem uma
polaridade negativa, ocorre a atração dos íons. Os únicos íons que não se chocam seriam
os que conseguem ser levados ao centro do campo no curto espaço de tempo ao qual a
barra permanece com polaridade positiva, configurando justamente aos íons com baixa
razão massa/carga. Para íons com maior razão massa/carga o tempo ao qual a barra
permanece positiva não é suficiente, fazendo com que o processo de atração culmine no
choque do íon contra a barra metálica, filtrando assim o íon desejado.
- Barra carregada com DC positiva: separa os íons com m/z inferior ao desejado;
chocando as massas mais altas por não conseguirem voltar ao centro do campo;
- Barra carregada com DC negativa: separa os íons com m/z superior ao desejado;
chocando as massas mais baixas pela rápida atração pela voltagem negativa;
69
O espectro é obtido justamente discriminando qual razão massa/carga deseja-se
detectar, excluindo todas as outras possibilidades através das ressonâncias instáveis de
quaisquer outros íons que cheguem ao analisador.
Exemplo: para a análise de um íon com m/z 200. As imagens abaixo mostram secções do
quadrupolo, mostrando diferentes íons e suas ressonâncias instáveis, ocasionando seus
respectivos choques, filtrando-se apenas o íon desejado.
Sendo neste caso o plano YZ formado pelas barras negativas e o plano XZ formado
pelas barras positivas (choque da massa mais alta que desejada).
Assim, a análise pode ser realizada primeiramente analisando uma determinada razão
massa/carga e posteriormente modificando as condições de RF e DC para novos íons
desejados, caracterizando assim uma análise discriminatória de íons.
O quadrupolo possui diversas características únicas:
- Simples e Barato;
- Análise discriminatória;
70
3.2. APROVEITAMENTO DO QUADRUPOLO (Q aprov.)
O que significa que a intensidade relativa de um pico nesta análise será dez vezes
menor do que o esperado caso se monitorasse unicamente este íon. Assim, o
aproveitamento de um quadrupolo quase sempre é baixo para análises envolvendo a
varredura de uma determinada de faixa de íons. Normalmente, analises envolvem
varreduras com mais de 200 unidades, resultando em um aproveitamento de 0,05%. Para
o momento tenha em mente que em análises de varredura o quadrupolo apresenta baixo
aproveitamento, podendo variar com outras classes de análises.
71
4. ANALISADOR POR TEMPO DE VOÔ (TOF)
Assim, os íons que acabam de sair do ionizador são projetados através da área de
aceleração (que contem eletrodos que impulsionam o íon). Assim, caso os íons sejam
positivos deve-se polarizar os eletrodos de modo positivo a fim de garantir a ejeção dos
íons chegados. O próximo passo é fazer com que estes íons de fato voem através de uma
câmera de vácuo, chegando ao detector. O tempo de voo para cada íon é diretamente
relacionado à sua razão massa/carga dada pela seguinte equação:
72
4.1. TOF LINEAR E TOF CONTÍNUO
São duas classes diferentes para o analisador TOF, sendo que entre estes o princípio de
funcionamento é o mesmo. Começando com o TOF linear, mais clássico e simples de ser
compreendido, observam-se as seguintes características:
Por analisador pulsado e contínuo compreende-se quanto ao meio à qual os íons são
introduzidos no analisador. Um analisador contínuo tem como o próprio nome já informa
uma injeção contínua e interrupta de íons. Já um analisador pulsado não disponibiliza
uma nova rodada de íons até que o último (sendo neste caso o íon mais pesado) chegue
ao detector. Assim, como o método ionizante teoricamente não interrompe a formação
dos íons de alguma forma ocorre a supressão do feixe de íons, sendo mandados por um
sistema de drenagem, até o momento aonde o último íon chega ao detector, onde os íons
formados podem novamente ser introduzidos no sistema.
Entretanto todas as vantagens do TOF são postas em balanço devido a sua baixa
resolução. Isto se deve ao problema cinético causado gerado pela utilização de íons em
fase gasosa (problema semelhante já foi anteriormente discutido para o analisador por
setor magnético). Desta forma, devido a lei de distribuição de velocidades de Maxwell, há
uma determinada janela de velocidade possíveis para os íons de uma mesma razão
massa/carga, vinculando um erro na análise.
73
4.1.2. A Utilidade do Refletor
Uma maneira simples de compreender isto é imaginar uma pista de atletismo: sem a
correção nas marcações, um corredor na raia mais “central” iria percorrer uma distância
menor do que um corredor na raia mais “afastada”. Agora, supondo que todos comecem
do mesmo ponto, mas adotando o corredor mais lento na raia mais “central” e o corredor
mais rápido na raia mais “afastada”, todos chegariam ao mesmo tempo, uma vez que o
corredor mais lento seria beneficiado por correr menor distância. Já o corredor mais
rápido seria prejudicado por ter que percorrer uma distância maior.
Neste momento o aumento da distância de tempo de voo é essencial, uma vez que
como já visto no setor magnético, íons com uma maior razão massa/carga mas com uma
74
menor velocidade, ou íons com menor massa/carga e velocidade maior também poderiam
entrar na faixa de íons analisados. Mas como o tubo é muito comprido, diferentes razões
massa/carga podem ser separados de acordo com suas energias cinéticas sem a
necessidade de se utilizar um setor elétrico.
Para compreender todas as vantagens do refletor a Figura 45 pode ser uma boa ajuda
ilustrativa de tudo o que foi comentado até o momento.
Figura 45: Princípio de funcionamento para um refletor idealizando a chegada simultânea dos íons
De fato a utilização do refletor em um TOF faz com que sua resolução salte de
300-400 para mais de 10 mil à 60 mil. Vinculando isto com sua alta exatidão (erro de
massa menores do que 3 ppm) isto torna este analisador excelente para análises
estruturais uma vez que, diferente do quadrupolo, uma análise de varredura não diminuirá
a eficiência do analisador já que todos os íons formados são detectados (como já
informado antes pela sua característica não discriminatória).
75
Figura 46: Esquema de utilização de um GC-TOF de pulso contínuo
5. ANALISADORES – REVISÃO
76
CAPÍTULO VI - ANÁLISES SEQUENCIAIS E APLICAÇÕES MS/MS
1. INTRODUÇÃO
Atualmente com o avanço das tecnológicas podem-se realizar análises cada vez mais
complexas, com compostos nunca antes imaginados e que serão estudados neste
momento. Entretanto para possibilitar tais analises os analisadores estudados não são
capazes de chegar aos resultados esperados.
Adota-se como uma análise MS/MS ou MS² os experimentos sequenciais que utilizam
dois analisadores massa/carga. Neste curso unicamente serão estudados estes casos (como
será visto adiante, se utilizará de fato três câmeras analisadoras, porém apenas duas é que
de fato serão empregadas como analisadoras). De modo análogo, experimentos
MS/MS/MS ou MS³ utilizam três analisadores.
- Varredura: analise onde ocorre a determinação dos íons para determinada faixa
selecionada, importante para análises estruturais, onde se coleta informações dos
fragmentos gerados. O melhor analisador para isto é o TOF;
77
Os motivos para a escolha destes analisadores para cada experimento já foi
anteriormente citado, lembrando-se das propriedades de aproveitamento em um
quadrupolo e capacidade não discriminatória do TOF.
2. EXPERIMENTOS MS/MS
Utilizando dois analisadores, sendo que cada um pode operar em dois modos, chega-se
a um valor de quatro possibilidades de experimentos MS/MS. Neste curso serão
estudados três destas quatro técnicas, sendo que a última possui uma maior complexidade,
não sendo abordada. As quatro possibilidades lógicas são:
78
Cada um destes experimentos possui nome próprio, visto na Figura 47.
Figura 47: Tipos de experimentos MS/MS e respectivas configurações dos analisadores massa/carga
79
3. DISSOCIAÇÃO INDUZIDA POR COLISÃO – CID
A primeira consideração à ser feita é que este método não é normalmente empregado
para a primeira ionização realizada, diferente da EI ou ESI. Pela Figura 47 nota-se que a
CID é uma técnica utilizada apenas na cela de colisão, podendo ser considerada uma
técnica de preparo para o segundo analisador massa/carga.
Note que, caso não se utilize a técnica CID, o segundo analisador fará a mesma
analise do primeiro, ou seja, desligando a cela de colisão tem um experimento MS. É
desta forma que compensa a utilização de um aparelho com três analisadores, pois se
podem realizar desde experimentos MS (dois analisadores desligados) à MS³.
80
Figura 48: Representação de uma cela de colisão e fragmentação via CID
Por exemplo, a utilização de metano como gás de colisão promove as seguintes reações:
As duas primeiras etapas são necessárias para formação de uma espécie iônica de alta
energia potencial, que pode gerar o íon molecular e assim levar à sua fragmentação.
Semelhante à EI a CID promove não apenas ionização, mas transferência de energia
potencial, sendo esta liberada na forma de fragmentação.
Entretanto, diferentemente da EI, a CID não é uma técnica reprodutível uma vez que
há diversas variáveis que podem ser alteradas, como por exemplo, a energia de colisão,
o gás inerte utilizado, a pressão do mesmo, entre outras.
81
Figura 49: Espectros de massa com diferentes energias de colisão para o gás de arraste em um mesmo
analito
A partir da Figura 49 nota-se que com o aumento da energia de colisão ocorre cada vez
mais à fragmentação do composto, aproximando-se de uma analise utilizando EI. Já para
energias mais baixas o pico molecular é mais intenso, evidenciando uma menor taxa de
fragmentação, aproximando-se assim de uma análise via ESI.
Figura 50: Representação genérica de um equipamento utilizado para experimento de varredura de íons
produtos junto aos modos operantes em cada analisador
82
Assim, tomando um exemplo comum: Inicialmente tem-se uma amostra com íons em
razões massa/carga de 200, 300 e 400 e apenas o estudo do íon de m/z 200 é o desejado.
O que se faz é programar o primeiro quadrupolo (Q1) (lembrando-se que regular o
quadrupolo envolve diretamente em sua RF e DC) a fim de se passar unicamente o íon
com desejada – no caso, m/z 200. Assim, no primeiro quadrupolo todos os outros íons são
rejeitados, passando unicamente o íon de razão massa/carga desejada.
Fazendo com que o segundo quadrupolo esteja desligado (q2) ocorre sua conversão a
uma cela de colisão. O importante é entender que apenas dos íons originários, apenas o
com m/z 200 é que será fragmentado. O terceiro quadrupolo (Q3) atua em modo
varredura, gerando um espectro de massas dos fragmentos obtidos. A técnica recebe este
nome justamente por ser uma varredura dos fragmentos gerados a partir de um íon
original escolhido por sua razão massa/carga.
Como pode ser pensado, não necessariamente têm-se equipamentos que operam
unicamente com quadrupolos, como o utilizado para demonstração da técnica. Além do
Quadrupolo já se foi apresentado o TOF, podendo ser empregado neste experimento.
83
O aparelho mostrado na Figura 50 recebe popularmente o nome de QqQ, por empregar
três quadrupolos. Já o QqTOF é um equipamento híbrido, contando com dois quadrupolos
seguidos de um TOF.
Neste ponto é importante notar-se que, para a técnica de varredura de íons produtos
em hipótese alguma se pode utilizar um TOFqQ, uma vez que primeiramente é necessário
um analisador que filtre apenas um íon. Apenas o segundo analisador é que estará
operando no modo varredura. Como o TOF é empregado apenas para varreduras, utiliza-
lo em primeiro momento resulta em um erro total ao experimento.
Um erro comum é adotar que a faixa de íons para calcular-se o aproveitamento é dada
por toda a janela de razão massa/carga dos íons que chegam ao analisador. O erro é
justamente este: a fórmula se diz para os íons que serão de fato analisados; como o
quadrupolo está “travado” em uma única razão massa/carga, seu aproveitamento é de
100%. Como já dito anteriormente, o quadrupolo em modo SIM é altamente sensível.
84
Exemplo: neste caso tem-se um lipídeo de massa 1002 Dalton analisado inicialmente por
ESI-(-) gerando o pico molecular de m/z igual a 1001. Neste primeiro espectro nenhum
fragmento foi notado devido à natureza da técnica utilizada.
85
Exemplo 2: abaixo se tem espectros para um polipeptídeo de baixa massa molecular.
OBS: no segundo espectro existem picos com maios massa/carga que o molecular uma
vez que o composto apresenta-se inicialmente com duas protonações (comprovado
através de seu padrão isotópico de Δm/z 0,5).
86
5. VARREDURA DE ÍONS PRECURSORES
Figura 51: Representação genérica de um equipamento utilizado para experimento de varredura de íons
precursores
Para uma amostra inicial com diversas fragmentações possíveis, gera-se um espectro
com diversos sinais, para diferentes razões massa/carga. Assim, admite-se um íon dentre
todos os possíveis fragmentos gerados, escolhido para ser analisado. Este fragmento
passa por uma nova fragmentação via CID. No segundo analisador escolhe-se um destes
fragmentos para ser analisado utilizando o método SIM.
87
6. MONITORAMENTO SELETIVO DE REAÇÕES (SRM)
88
Sendo a matriz ao qual o composto se encontra o sangue, a maior dificuldade será os
interferentes presentes. O sangue, mais precisamente o plasma, é uma das matrizes mais
complexas possíveis, constituída por mais de mil proteínas diferentes, além de
carboidratos, lipídeos, sais minerais e outros compostos biológicos. Dentre as matrizes
orgânicas o plasma só perde em termos de quantidade de constituintes do petróleo.
89
mesmo comprimento de onda (note que o detector utilizado para tal análise é UV-VIS
fixo em 276 nanômetros) é enorme. Imagine que qualquer composto orgânico pode
absorver radiação na região do ultravioleta. Assim, o método HPLC além de não
minimizar os interferentes (entenda que há sim uma diminuição, mas o número final de
interentes ainda é muito grandioso) é um método lento e pouco confiável.
Antes de entrar na análise via SEM, pode-se pensar em utilizar apenas um analisador
em modo SIM, como já visto e utilizado em exemplos anteriores. Avaliando:
As três primeiras etapas são necessarias para as protéinas que estão presentes no
plasma precipitem. Posteriormente centrifuga-se a mistura, pipetando-se unicamente o
sobrenadante. Esta fase é constituída basicamente do analito e outros componentes do
plasma que não precipitaram nas primeiras etapas.
90
Assim, unicamente os compostos que possuem a razão massa/carga selecionada é que
sairão do espectrômetro de massas e serão introduzidos no cromatógrafo. O resultado
obtido é mostrado a seguir, para duas concentrações diferentes de amostra.
- via SEM: neste método o primeiro analisador encontra-se regulado da mesma forma que
no método SIM: fixo para a razão massa/carga de 821,5. A maior modificação é
justamente no segundo analisador. Relembrando do método de Varredura dos Íons
Produto, a razão massa/carga selecionada no primeiro quadrupolo é a única que será
enviada à câmera de colisão. Esta fragmentará o íon de razão massa/carga selecionada,
gerando, através do segundo analisador em modo varredura, um espectro dos
fragmentos gerados deste íon selecionado no primeiro analisador.
91
Ou seja, resumidamente e simplificadamente, o método SRM é um método SIM onde,
em vez de apenas o primeiro analisador estar fixo para dada razão massa/carga, o
segundo também está fixo para outra razão massa/carga (que deverá corresponder à um
dos picos observados para os fragmentos deste composto).
92
Antes de compreender como este método pode quantificar um analito, deve-se fazer
uma revisão de como o mesmo funciona.
Sendo os dois quadrupolos fixos para determinada razão massa/carga tem-se que o
aproveitamento dos quadrupolos para a técnica de SEM ser extremamente alto. Cria-se
assim um método universal, mas extremamente seletivo, confiável e rápido. Ao mesmo
tempo em que qualquer composto pode ser analisado, somente ele será analisado.
Há raras técnicas que conseguem unir estas duas características.
A técnica de SEM ainda aguarda duas surpresas pra possíveis interferentes na amostra.
O primeiro é simples: caso se saiba que, por azar, exista um componente com mesma
razão massa/carga, forme o mesmo fragmento e possua o mesmo tempo de eluição, pode-
se simplesmente escolher outro fragmento dos formados na fase de CID. Logicamente
prefere-se escolher o fragmento mais intenso, mas não podendo este ser o escolhido, nada
prejudicará a análise em escolher outro fragmento.
É neste ponto que a técnica de Varredura de Íons Precursores (Seção 6) entra: são
necessários antes de partir-se da técnica de SRM realizar uma Varredura dos Íons
Produtos a fim de se saber quais os íons gerados na primeira etapa. A Varredura de Íons
Produtos auxilia na escolha das razões massa/carga apropriadas para a SRM. Conforme
disto anteriormente, neste curso a maior aplicação da técnica de Varredura de Íons
Precursores será no preparo experimental para posterior análise via SRM.
93
6.1. TRANSIÇÃO DE CONFIRMAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
Agora, para o segundo analisador tem-se a escolha de outro pico, normalmente sendo
feito para o pico mais intenso. Sendo assim, chama-se este par de razões massa/carga
(primeira massa/carga + sinal mais intenso) de Transição de Quantificação. Esta possui
seu respectivo tempo de eluição e área cromatográfica.
94
6.2. SOBRE GENÉRICOS, DOPPING E SRM
Exemplo: atualmente existem mais de 200 compostos que caracterizam dopping para
diferentes esportes oficiais. Monitorar todos estes se tornou cada vez complexo visto as
técnicas utilizadas por atletas. Um dos maiores exemplos disto é a utilização de diuréticos
na alimentação. Tecnicamente um diurético não caracteriza dopping, mas caso o atleta
ingira algo que caracteriza dopping, o diurético dilui o composto na urina, fazendo com
que os níveis analisados estejam dentro do esperado.
Analisar todos estes compostos de uma única vez, de modo rápido e confiável, para
todos os atletas competidores em um evento é praticamente impossível utilizando os
métodos cromatográficos convencionais. Assim, utiliza-se da SRM.
95
O método oficial é simples: primeiramente recolhe-se urina do atleta e realiza-se um
teste de DNA para verificar se de fato a amostra é do competidor. Após isto, adiciona-se
padrão interno (em concentração conhecida) e tampão apropriado. Para o primeiro
composto escolhem-se duas transições desejadas. Verificam-se os tempos de eluição e
porcentagens relativas dos picos no espectro e no cromatograma. Comparando com os
valores obtidos para o padrão interno, pode-se determinar, em menos de 5 minutos, a
concentração de tal analito presente na urina do atleta.
Exemplo 2: para testar se determinado fármaco pode ser considerado genérico, um estudo
minucioso deve ser executado a fim de inicialmente verificar os efeitos do fármaco no
organismo do paciente.
Entretanto, para ser tratado como genérico, o candidato à genérico deve seguir com
muita semelhança a conhecida curva de bioequivalência. Ou seja: deve-se garantir que a
concentração do fármaco no organismo do ser seja a mesma do remédio oficial para, no
mínimo, 48 horas de após a dose. No início da dose a concentração cresce muito rápido,
necessitando que a amostra (sangue do paciente) seja recolhida de 15 em 15 minutos,
sendo este tempo modificado conforme se passa o tempo de aplicação.
Agora, supondo que se retire 10 mL de sangue por análise, sendo que estas análises
devem ser duplicata, isto resulta em mais de um litro de sangue do paciente. Lembrando
que o mesmo deve estar em jejum, o método utilizado deve ser extremamente sensível
(devido a pouca concentração do analito), seletivo (uma vez que se está trabalhando com
plasma sanguíneo) e rápido. Um método cromatográfico, além de ser pouco confiável e
demorado demandaria uma quantidade de amostra superior à que o paciente poderia
oferecer, ocasionando na sua possível morte.
96
Considerando o fármaco Minociclina, abaixo consta seu espectro de massas junto à de
um padrão interno escolhido para esta análise.
97
Desta forma pode-se obter a concentração deste composto no plasma sanguíneo,
monitorando-o para cada intervalo de tempo. Por fim pode-se plotar uma curva de
bioequivalência entre a concentração do fármaco ao decorrer do tempo.
Outros exemplos mais modernos, como as pílulas anticoncepcionais, são ainda mais
drásticos. Suas concentrações mínimas no sangue não permitem que nenhum método
cromatográfico possa determinar sua presença (mesmo utilizando mais de um litro de
sangue por análise). Assim, unicamente com a implementação da espectrometria de
massas é que os ensaios laboratoriais puderam ser executados, possibilitando o início da
pesquisa nesta área de medicamentos. Hoje, os anticoncepcionais são os medicamentos
que mais geram lucros as indústrias, quitando as despesas com equipamentos e análises
em tempo recorde. Um exemplo disto é: na hora seguinte ao fim da patente do primeiro
anticoncepcional, mais de 10 empresas lançaram suas marcas de genérico no mercado.
98
CAPÍTULO VII – PLANEJAMENTO DE UM EXPERIMENTO SRM
99
A segunda etapa é justamente escolher os íons que serão utilizados para as transições
de quantificação e confirmação no experimento de SRM. Isto só se torna possível através
da avaliação dos íons gerados da fragmentação do analito. Alguns fragmentos gerados são
mostrados a seguir, iniciando pelos arranjos possíveis no aromático.
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Já para a carbonila à esquerda na molécula e o grupo amino as possibilidades são:
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E por fim as possibilidades para a carbonila da direita incluem as cisões alfa já
conhecidas e aplicadas para a carbonila à esquerda mas também um rearranjo de
Lembrando que para todas as rotas mostradas as colorações das setas seguem os
padrões adotados no Capítulo IV – Seção 4.
- Seta Laranja: indica um rearranjo (podendo este ser de McLafferty ou do íon tropílio);
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Como visto há uma infinidade de fragmentos possíveis para a molécula em questão.
Lembrando sempre de que, caso haja bromo em sua estrutura, o padrão isotópico será terá
um pico de M+2 com intensidade praticamente a mesma.
Assim, a segunda etapa, a determinação dos íons gerados para o analito em questão,
está completa. O único passo restante é a escolha de quais razões massa/carga serão
utilizadas. Recordando o que foi feito até o momento:
1º - Escolheu-se como aparelho um QqQ por ser possível realizar neste equipamento
uma Varredura de Íons Precursores, mas também um experimento SRM;
Assim, para o primeiro quadrupolo, deve-se coloca-lo em modo SIM adotando como
razão massa/carga a massa molecular do analito, ou seja, 367 (ou 369 neste caso, onde a
intensidade do padrão isotópico do bromo é praticamente a mesma). Neste primeiro
quadrupolo a maioria dos interferentes com outras razões massa/carga são eliminados.
- Possui massa molecular de 367 e fragmentar-se para um íon de massa/carga 246 e 282;
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