UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

Instituto de Ciência e Tecnologia

Ana Maria Costa Nogueira

ESTUDOS ESTRUTURAIS POR DINÂMICA MOLECULAR DO PEPTÍDEO

ANTIMICROBIANO PISCIDINA-4 (ecPis-4s)

Diamantina
2021
 Ana Maria Costa Nogueira

ESTUDOS ESTRUTURAIS POR DINÂMICA MOLECULAR DO PEPTÍDEO

ANTIMICROBIANO PISCIDINA-4 (ecPis-4s)

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao

Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade
Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como
parte dos requisitos para obtenção do título bacharela
em Ciência e Tecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Victor Hugo de Oliveira

Munhoz
Coorientadora: Angélica Alcione Sousa

Diamantina
2021
 ANA MARIA COSTA NOGUEIRA
Estudos Estruturais por Dinâmica Molecular do Peptídeo Antimicrobiano Piscidina-4
(ecPis-4s)

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como parte

dos requisitos exigidos para a obtenção título de Bacharel
em Ciência e Tecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Victor Hugo de Oliveira Munhoz

Coorientadora: M.a. Angélica Alcione Sousa

Data de aprovação 17/05/2021

Prof. Dr. Victor Hugo de Oliveira Munhoz

Instituto de Ciência e Tecnologia – UFVJM

Profa. Dra. Vivian Machado Benassi

Instituto de Ciência e Tecnologia - UFVJM

Dr. Lúcio Otávio Nunes

LPP-Jequi-PRPPG – UFVJM

Diamantina

Documento assinado eletronicamente por Vivian Machado Benassi, Servidor, em

17/05/2021, às 16:45, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º,
§ 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.

Documento assinado eletronicamente por Victor Hugo de Oliveira Munhoz,

Servidor, em 17/05/2021, às 16:45, conforme horário oficial de Brasília, com
fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.

Documento assinado eletronicamente por Lúcio Otávio Nunes, Servidor, em

17/05/2021, às 16:53, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º,
§ 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.

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Referência: Processo nº 23086.005498/2021-32 SEI nº 0355401

 RESUMO

Superbactérias são um problema recorrente na atualidade, pois são capazes de resistir à

fármacos comuns presentes no mercado. Os peptídeos antimicrobianos (PAM) normalmente
são uma alternativa de tratamentos contra esses patógenos, pois sua molécula interage com a
bicamada fosfolipídica do microrganismo e a rompem. Estudos feitos sobre o isolamento e
caracterização do modo de ação dos PAMs são cada vez mais recorrentes na academia. É
comum que os peptídeos se estruturem ao entrarem em contato com a membrana celular
bacteriana, contudo, em meio aquoso, o PAM não apresenta estrutura secundária bem definida,
devido a sua interação intermolecular com a água. Oposto a isso, foi caracterizado que o ecPis-
4s mantém a conformação α-hélice em meio a esse solvente. Este trabalho tem o intuito analisar,
através de simulação por dinâmica molecular, os motivos referentes ao não desenovelamento
do ecPis-4s em meio aquoso, visto que, ao manter sua estrutura helicoidal, pode-se ter um
aumento da cinética de ação, diferentemente da maior parte dos PAMs, que geralmente
precisam adotar uma conformação ativa a partir de uma forma desenovelada, ao interagir com
o patógeno. Dessa forma, o mecanismo de ação do ecPis-4s mostrar-se-ia mais espontâneo, ao
poupar uma etapa exotérmica. Na simulação realizada neste trabalho, posicionou-se uma
molécula de ecPis-4s com conformação majoritariamente α-helicoidal em uma caixa cúbica
com água, a fim de analisar as interações interresiduais e interatômicas.

Palavras-chave: Simulação por Dinâmica Molecular. Peptídeo antimicrobiano. ecPis-4s.

α-hélice. Estabilidade. Interação interresidual.
 ABSTRACT

Superbugs are an universal problem nowadays, because they are capable to resist common
drugs present at market. The antimicrobial peptides are a kind of treatment agains these
patogens, because their structures interact with the microorganism phospholipid bilayer and
break it. Studies on isolation and caracterization of AMP means of action are each more
recurrent in academy. It’s usual its get structured when entering in contact with the bacterial
cell membrane, but in aqueous environment the AMP doesn’t show a well defined secondary
structure, because of it intermolecular interaction with water. Opposite to that, the ecPis-4s
maintain the α-hélice conformation amid that solvent. The purpose of this study is to analyze,
through molecular dynamic simulation, the veracity and the reasons refferent to the non-
unwinding of the ecPis-4s in aqueous environment. Whereas, maintaining it helical structure,
the kinetic in it mechanism of action is increased and, differently of the common AMP, that
usually need to create hydrogen bonds for folding when interacting with the patogen, the ecPis-
4s mechanism looks more spontaneous when sparing an exotermic stage. In the simulation
performed a ecPis-4s was placed in a cubic box with water inside, in order to analyze the
interresidual and interatomic interactions.

Keywords: Molecular Dynamics Simulation. Antimicrobial peptide. ecPis-4s. α-helix.

Stability. Interresidual interaction.
2
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 11

2 OBJETIVO .......................................................................................................................... 12

2.1 Objetivo Geral .............................................................................................................. 12

2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................... 12

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................................... 13

3.1 Estruturas de Peptídeos ............................................................................................... 13

3.2 Interações Interresiduais ............................................................................................. 18

3.2.1 Interação Cátion-π ......................................................................................................... 19

3.2.2 Interação π-π .................................................................................................................. 19
2.2.3 Ponte Salina ................................................................................................................... 20
3.2.4 Ligação de Hidrogênio ................................................................................................... 20
3.3 Peptídeos Antimicrobianos .......................................................................................... 21

3.4 Simulação de Dinâmica Molecular ............................................................................. 22

4 METODOLOGIA ............................................................................................................... 27

4.1 Campo de Força............................................................................................................ 27

4.2 Condições Periódicas de Contorno ............................................................................. 28

4.3 Minimização de Energia .............................................................................................. 29

4.4 Ensembles ...................................................................................................................... 31

4.4.1 Condições de temperatura e pressão ............................................................................. 31

4.5 Outros Detalhes Sobre a Simulação de Dinâmica Molecular do PAM ecPis-4s em
Água ..................................................................................................................................... 33

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 35

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 41

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 43
 11

1 INTRODUÇÃO

Superbactérias são microrganismos capazes de resistir ao efeito dos antibióticos e

fármacos comuns no mercado. A resistência bacteriana, conhecida como ação antimicrobiana
(RAM), é a capacidade das bactérias de sobreviverem a medicação anteriormente usada para
tratá-las. A RAM é vista como um problema de saúde pública que apresenta consequências
clínicas e econômicas (OMS, 2018; LOUREIRO et al., 2016). Esses microrganismos são
consequência do uso negligente de antibióticos.
Uma alternativa para esse problema que afeta a população global é o estudo e
desenvolvimento dos peptídeos antimicrobianos (PAM). Através da sua estrutura molecular, o
PAM consegue combater bactérias. Essa classe de biomoléculas possuem um elevado potencial
contra patógenos resistentes, visto que, diferente dos fármacos tradicionais, o principal alvo dos
PAM é a membrana celular (KUMAR et al., 2018; CONLON et al., 2014). Estudos elaborados
por Pane e colaboradores (2017) apontam relação da ação antimicrobiana dos PAM à presença
de carga líquida positiva em sua estrutura e caráter anfipático (moléculas que possuem
características hidrofílicas e hidrofóbicas). A justificativa para a afirmação anterior dá-se pela
capacidade do PAM em interagir com a bicamada fosfolipídica das bactérias e a conformação
que ele adquire no ambiente celular, respectivamente.
Para entender as propriedades e uma proteína em solução aquosa, é necessária uma
descrição sobre as interações entre ela e a água (KUMAR et al., 2012). O presente estudo visa
a realizar a análise conformacional de um PAM em meio aquoso, através de simulação por
Dinâmica Molecular, a fim de analisar uma possível estruturação em água, prevista
experimentalmente. Elucidar o mecanismo de ação do PAM ajuda a compreender a sua ação
fisiológica e assegurar a sua eficácia contra microrganismos patogênicos.
12

2 OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

O presente estudo visa analisar o comportamento do PAM ecPis-4s em meio

aquoso, através de simulação computacional, afim de prever a sua conduta estrutural ao
decorrer do tempo para apresentar possíveis causas para a sua estabilidade estrutural.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar os parâmetros empregados para a realização da Simulação de Dinâmica

Molecular;
• Avaliar o comportamento do peptídeo mediante Simulação de Dinâmica Molecular em
meio aquoso.
 13

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Estruturas de Peptídeos

Os peptídeos são biopolímeros, pois são cadeias constituídas por resíduos de

aminoácidos conectados entre si através de ligações peptídicas. Essas ligações são formadas
entre os grupos α-carboxila e α-amino por uma reação de desidratação (NELSON & COX,
2018). Uma ligação é formada entre esses grupos adjacentes através de uma reação de
condensação (FIG. 1).

Figura 1 - Equilíbrio químico de formação da ligação peptídica (rosa), por condensação, entre um
aminoácido contendo o grupo R¹ e outro contendo o radical R²

Fonte: Autora

A formação da ligação peptídica por condensação acontece de maneira que o grupo

α-amino de um aminoácido (com grupo R²) age como nucleófilo, formando uma ligação
(sombreada). Entre os aminoácidos existentes, 20 são considerados os mais comuns, os
proteinogênicos (FIG. 2). Todos esses compostos possuem um grupo carboxila e um grupo
amino ligados a um mesmo carbono (o carbono α, C𝛼 ). As características físico-químicas de
um peptídeo podem variar de acordo com os resíduos de aminoácidos presentes na cadeia. Os
aminoácidos diferem-se em suas cadeias laterais (R), que variam na estrutura, tamanho e carga
elétrica. Isso, por sua vez, influencia em sua solubilidade (NELSON & COX, 2018).
Cada ligação peptídica tem caráter parcial de ligação dupla. Isso acontece graças à
ressonância e impõe uma alta barreira rotacional à ligação carbono-nitrogênio. O átomo N, na
ligação peptídica, possui com carga parcial positiva, mas possui carga líquida neutra ou
levemente negativa, devido aos orbitais de ligação e os mecanismos quânticos (NELSON &
COX, 2018).
14

Figura 2 - Estrutura dos aminoácidos proteinogênicos. As fórmulas estruturais mostram o estado de

ionização que predomina em pH 7,0. As partes não sombreadas são as comuns a todos e aquelas
sombreadas são o grupo R.

Fonte: NELSON & COX, 2018

A Figura 2 mostra os 20 aminoácidos mais comuns em aminoácidos. Foram

divididos conforme o caráter polar de seus grupos da cadeia lateral (R), que estão sombreados.
Os Grupos R alifáticos, apolares, são aqueles que apresentam apenas hidrocarbonetos e ligações
simples, e são considerados hidrofóbicos; os grupos R aromáticos apresentam anéis aromáticos;
os carregados negativamente e os carregados positivamente apresentam caráter hidrofílico; os
Grupos polares, não carregados são mais hidrofílicos do que os apolares, pois são capazes de
formar ligações de hidrogênio com a água (NELSON & COX, 2018). Os aminoácidos
normalmente são referenciados através de símbolos (com 1 ou 3 letras), como representado na
Quadro 1.
Quadro 1 - Classificação dos aminoácidos (configuração relativa L) quanto a nome e símbolos.
Aminoácido Símbolo (3 letras) Símbolo (1 letra)
Alanina Ala A
Fenilalanina Phe F
Glicina Gli G
Histidina His H
Leucina Leu L
Valina Val V
Prolina Pro P
Treonina The T
Cisteina Cis C
Tirosina Tir Y
Asparagina Asn N
Asparto Asp D
Continua
 15

Quadro 1 - Classificação dos aminoácidos (configuração relativa L) quanto a nome e símbolos.

Aminoácido Símbolo (3 letras) Símbolo (1 letra)

Glutamato Glu E
Metionina Met M
Isoleucina Ile I
Lisina Lys K
Glutamina Gln Q
Arginina Arg R
Serina Ser S
Triptofano Trp W
Fonte: Autora
Em um peptídeo, o resíduo de aminoácido na extremidade de um grupo α-amino
livre é denominado N-terminal; aquele ligado a outra extremidade, grupo carboxila livre, é
conhecido como C-terminal (NELSON & COX, 2018). Quando comparados às proteínas, os
peptídeos são considerados quimicamente mais versáteis, pois podem ser amidados ou
esterificados em suas carboxilas terminais, acetilados em seus grupos amino terminais,
fosforilados ou sulfatados em um ou mais resíduos, além de poderem ser lineares, semicíclicos
ou cíclicos (MACHADO, 2004).
Os peptídeos ou proteínas podem ser comumente classificados a partir de seus
elementos estruturais, que se dividem, de maneira geral, em estruturas primária, secundária ou
terciária (FIG. 3). A estrutura primária pode ser definida pelas ligações de aminoácidos em uma
cadeia polipeptídica. Assim, a sequência desses aminoácidos define a diferença entre os
peptídeos (NELSON & COX, 2018).

Figura 3 – Níveis de estrutura nas proteínas. A estrutura primária é uma sequência de aminoácidos
unidos por ligações peptídicas; o polipeptídio resultante dá origem a estrutura secundária,
representada pela α-hélice; a hélice compõe a estrutura terciária do polipeptídio dobrado; o
agrupamento da estrutura terciária é conhecido, por alguns autores, como estrutura quaternária.

Fonte: NELSON & COX, 2018

16

Existem três ligações que separam os átomos de carbono α consecutivos em uma

cadeia polipeptídica. Elas estão indicadas no canto inferior esquerdo da Figura 4. As ligações
N-Cα e Cα-C podem girar, sendo descritas pelos ângulos diedro φ e ψ, respectivamente. Devido
ao seu caráter de ligação dupla, a ligação C-N (ligação peptídica) não possui rotação livre.
Quando o peptídeo se encontra estendido, os ângulos diedros são 180°, à medida que o peptídeo
sofre rotação, no sentido horário, os ângulos aumentam, com o limite de 180° (NELSON &
COX, 2018).

Figura 4 - Estrutura planar de um peptídeo, na qual é mostrado a extremidade N-terminal e C-terminal;

são ressaltados os ângulos diedros e as ligações que interagem com o carbono α.

Fonte: NELSON & COX, 2018

A estrutura secundária é aquela que obedece a um segmento de resíduos de

aminoácidos unidos por ligações peptídicas, descrevendo um arranjo espacial dos átomos na
cadeia principal. O primeiro passo desse enovelamento, muitas vezes, tem relação com as
interações iônicas, envolvendo grupos carregados, interações de natureza dipolar, hidrofóbicas,
aromáticas ou ligação de hidrogênio entre grupos não carregados. O termo “estrutura
secundária” refere-se a um segmento de uma cadeia polipeptídica e descreve o arranjo espacial
dos átomos da cadeia principal, sem considerar a posição das cadeias laterais. Uma estrutura
secundária regular quando cada ângulo diedro, φ e ψ, permanece o mesmo por todo o segmento.
(NELSON & COX, 2018).
 17

Figura 5 - Estrutura secundária do tipo α-hélice; as ligações pontilhadas representam as interações do tipo
Ligação de Hidrogênio, entre os oxigênios e hidrogênios da cadeia principal polipeptídica.

Fonte: BROWN, 2008.

A conformação secundária, por sua vez é um padrão recorrente assumido pelo

polipeptídio. Normalmente, são reconhecidas duas divisões, as mais comuns, de possíveis
estruturas, a α-hélice e a β-folha. A α-hélice (FIG. 5) foi descoberta por Linus Pauling, Robert
Corey e Herman Branson, no final da década de 1940, por cristalografia de raios-X, que sugeriu
uma estruturação helicoidal (NELSON & COX, 2018; PAULING et al., 1956). Em uma α-
hélice ocorre formação de ligações de hidrogênios entre o oxigênio carbonílico e o hidrogênio
amídico das ligações peptídicas distantes de cerca de três resíduos de aminoácido. Dessa forma,
a α-hélice tem 3,6 aminoácidos por volta, cujas cadeias laterais projetam-se para fora da
estrutura principal (BROWN, 2018).
Na estrutura α-hélice, o esqueleto polipeptídico é enrolado em torno de um eixo
imaginário longitudinal no centro da hélice. Os grupos R dos resíduos de aminoácido projetam-
se de forma que eles ficam para fora do esqueleto helicoidal. À medida que as voltas de hélice
se repetem, formam uma distância de cerca de 5,4 Å ao longo do eixo (o ângstrom, Å, em
homenagem ao físico Anders J. Ångström, é igual a 0,1 nm. Não é uma unidade do SI, mas ela
é comumente usada pelos biólogos estruturais para descrever as distâncias atômicas; é
aproximadamente o tamanho de uma ligação de C-H) (NELSON & COX, 2018).
18

Uma reação química ocorre com a temperatura constante e variação da energia livre
de Gibbs (ΔG), determinada pela variação da entalpia ΔH, que reflete o tipo e número de
ligações químicas, a formação e quebra de interações; e da entropia ΔS, que representa a
variação de desordem no sistema. Tem-se que ΔG = ΔH – TΔS, em que, por definição, ΔH é
negativo para reações exotérmicas (que liberam calor) e ΔS é positivo para reações que
aumentam a desordem. O ΔG negativo implica em um sistema espontâneo (FREDERIK et al.,
2016). A estabilidade da proteína ou peptídeo pode ser definida como a tendencia de manter
sua conformação nativa. O ΔG para o estado enovelado é em torno de 20kJ/mol, já no estado
desenovelado, 65kJ/mol. Como consequência, o segundo estado é caracterizado por um alto
grau de entropia conformacional. Essa entropia, somada as interações das ligações de
hidrogênio e dos outros grupos da cadeia e do solvente, tendem a manter o estado não enovelado
(NELSON & COX, 2018). A tabela 1 mostra a diferença entre variação da energia livre de
Gibbs, em relação ao ΔG da Ala (referência, pois apresenta maior facilidade em manter a
conformação α-hélice em analises experimentais), necessária para que os resíduos de
aminoácidos assumam uma conformação α-hélice.

Tabela 1 – Tendência dos resíduos de aminoácidos em assumir conformação α-hélice. ΔΔG° é a diferença
de variação de energia livre de Gibbs, relativa à alanina, necessária para que os resíduos de aminoácido
assumam uma conformação α-hélice.
Aminoácido ΔΔG° Aminoácido ΔΔG°
Ala 0 Asn 3,0
Phe 2,0 Asp 2,5
Gli 1,3 Glu 1,4
His 2,6 Met 0,88
Leu 0,76 Ile 1,4
Val 2,1 Lys 0,63
Pro >4 Gln 1,3
The 2,4 Arg 0,3
Cis 3,0 Ser 2,2
Tir 2,0 Trp 2,0
Fonte: J W Bryson et al., 1995, retirado do NELSON & COX, 2019

3.2 Interações Interresiduais

Uma interação química ou intramolecular, significa que as moléculas se atraem ou

se repelem entre si, sem que haja quebra ou formação de novas ligações químicas. As interações
intramoleculares estão relacionadas com as propriedades termodinâmicas dos estados de fases
de uma substância. O conhecimento sobre essas interações é importante para entender um
 19

sistema químico em termos atômicos (ROCHA, 2001). Existem diversos tipos de interações
químicas, entre elas estão as ligações de hidrogênio, interações cátion-π, interações π-π e pontes
salinas.
3.2.1 Interação Cátion-π

As conformações α-hélice e β-folha foram usadas para um estudo sobre interações

catiônicas. Em uma primeira aproximação, a interação cátion-π pode ser considerada quando
há interação de um grupo positivamente carregado, como o amônio, e a núvem rica em elétrons
de um anel aromático (FIG. 6). Interações dos aminoácidos Phe e Tpr com Lys, Arg e His foram
estudados por Kallenbach e colaboradores, em uma α-hélice. As interações entre os resíduos
Trp-Lys, Phe-Arg não adcionaram estabilidade à estrutura, contudo par Trp-Arg forneceu -0,4
kcal/mol, indicando o aumento de estabilidade. Doig e cloaboradores investigaram a interação
de Phe com Lys e Arg, descobriram que cada um está se estabilizando fracamente (-0,1 a -0,2
kcal/mol), independente da orientação na hélice. Foram feitas diversas análises como essas e
concluíram a eficâcia da estabilização cátion-π. A interação catiônica ajuda a estabilizar o
peptídeo na região exposta ao solvente (WATERS, 2004).

Figura 6 – Interação cation-π de um grupo positivamente carregado, o amônio, e a núvem rica em elétrons
de um anel aromático, a uma distância molecular d.

Fonte: GALLIVAN et al., 2000

3.2.2 Interação π-π

A interação entre dois anéis atomáticos foi proposta com base em uma componente
de força de dispersão e uma hidrofóbica, bem como uma componente eletrostática. Há
observação de uma preferência orientacional adotada pelos anéis aromáticos ao interagirem
entre si, provocado pela componente de força eletrostática. A interação aromática-aromática foi
estudada em uma estrututa α-hélice, observando a interação da posição i de um aminoácido com
a posição i + 4 (ou múltiplos de 4, devido a quantidade de resíduo de aminoácido por volta de
hélice). Analisado o resíduo Phe na primeira posição e outro resíduo Phe na i + 4, notou-se que
houve estabilização de -0,1 a -0,8 kcal/mol. Foi observado inclinação da face de aresta e
20

deslocamento dos resíduos a partir da interação (FIG 7). A distância média observada para essa
interação interresidual é de 0,528 nm a 0,552 nm para interações face borda na conformação α-
hélice(WATERS, 2004).
Figura 7 – Preferência de orientação adotada pelos resíduos de aminoácido Phe302 e Phe310 ao fazerem
uma interação intramolecular do tipo aromática-aromática, em uma estrutura α-hélice na posição i e i+8.
(1HPM, 299-312).

Fonte: BHATTACHAYYA et al.,2002

2.2.3 Ponte Salina

A ponte salina é a interação entre dois resíduos de aminoácidos que possuem cargas
opostas entre si, em suas cadeias laterais. A associação entre resíduos carregados, formando a
ponte salina, estabiliza a molécula se a interação entre os resídos é forte o suficiente para superar
a dessolvatação, visto que, em meio aquoso, íons são solvatados pela água. Estudos mostram
que ainda que um resíduo carregado tenha grande penalidade energética pela dessolvatação, ao
associar-se a própria estrutura da molécula, sua interação com outro resíduo carregado ou com
os átomos carregados do esqueleto do peptídeo, compensa o ganho energético. Isso ocorre
porque existe menor seletividade do solvente, devido a diferença das constantes dielétricas da
água e o núcleo do peptídeo (KUMAR, 2012).

3.2.4 Ligação de Hidrogênio

Uma ligação de hidrogênio requer que um hidrogênio esteja ligado a um átomo

eletronegativo, com o raio atômico pequeno (F, N, O, por exemplo), visto que, isso implica em
uma atribuição de carga parcial positiva a ele, sem que haja alto impedimento estrutural para
interação intermolecular. A combinação da alta polaridade da ligação entre o H com esse átomo
e o contato muito próximo a um grupo com as mesmas características, resulta em uma interação
forte. Esse tipo de interação intermolecular é linear, correspondendo a um ângulo de 180°
(ROCHA, 2001). As ligações de hidrogênio entre a água e solutos polares causam um
 21

ordenamento das moléculas de água, contudo o efeito energético desse fenômeno é menos
significativo ao tratar-se de solutos apolares (NELSON & COX). As ligações de hidrogênio
têm uma componente dipolar, mas uma sobreposição parcial entre orbitais, confere a essa
interação um caráter parcial de ligação covalente.

3.3 Peptídeos Antimicrobianos

Muitos microrganismos apresentam resistência a antibióticos convencionais. A

partir disso há como alternativa para o tratamento de infecções causadas por esses
microrganismos resistentes o uso de peptídeos que apresentam atividade biológica
antimicrobiana, denominados peptídeos antimicrobianos (PAM). Mais de cinquenta PAM de
anfíbios já foram isolados, tendo como principal característica a natureza catiônica e a
capacidade de permeabilizar membranas de microrganismos (PRATES, 2000).
Em 2018 havia cerca de meio milhão de pessoas nos 22 países analisados sofrendo
de infecções causadas por bactérias resistentes a antibióticos, também conhecidas como
superbactérias (OMS, 2018; LOUREIRO et al., 2016).
Os PAM apresentam ampla atividade contra bactérias Gram-positivas, Gram-
negativas, vírus e fungos. Somado a isso, os PAM já disponíveis no mercado, possuem menos
problemas toxicológicos do que os demais fármacos, por seus mecanismos de ação serem
altamente específicos à membrana celular que se deseja perturbar (BOMAN, 2003). Logo, há
um grande potencial do seu uso para tratamento às bactérias super-resistentes.
O mecanismo dos PAM mais descrito na literatura é aquele ao qual há o
rompimento da bicamada fosfolipídica, seja por micelização ou formação de poros
(KOHANSKI; DWYER & COLLINS, 2010). A característica catiônica é comum em peptídeos
antimicrobianos, devido a presença de resíduos de aminoácidos protonados nas estruturas dos
PAM (PANE, 2017), como é o caso da lisina ou arginina, por exemplo. Quando tais peptídeos
interagem com a bicamada fosfolipídica dos parasitas, eles assumem uma conformação ativa
que contribui para seu acoplamento na membrana e posterior rompimento dela.
A membrana celular das bactérias possui carga líquida negativa; assim, o ataque
dos PAM é efetivado inicialmente pela atração iônica. Os peptídeos que apresentam esse tipo
de ação provocam perturbação e/ou desestruturação na membrana dos parasitas; podendo
causar de poros metaestáveis (são poros que existem por apenas um breve intervalo de tempo,
e são bem menos organizados que os poros toroidais, podem assemelhar-se a canais celulares)
ao rompimento total das células (MANSOUR et al., 2014). Diferentemente de antibióticos
22

convencionais, que atuam por inibição de proteínas específicas dos microrganismos, os PAM,
ao atacarem os patógenos, rompem suas membranas celulares, causando vazamento do material
intracelular. Visto isso, há a proposição que associa o efeito lítico de PAM a sua habilidade de
induzir poros na membrana (ZASLOFF, 2019).

Figura 8 - Ataque do PAM a membrana celular das bactérias. É mostrado a associação anfipática do
PAM a bicamada fosfolipídica da bactéria, seguida pelo rompimento ou invasão do seu núcleo pelo
peptídeo.

Fonte: ZASLOFF, 2002.

Na Figura 8 segue o modelo “Shai-Matsuzaki-Huang” (SMH), no qual representa

uma forma cuja grande parte dos PAM interagem com a membrana. Há nele uma translocação
de lipídeos por peptídeos, alterando a estrutura da bicamada, podendo haver a entrada do PAM
no interior da célula alvo e/ou o rompimento da membrana (ZASLOFF, 2019).

3.4 Simulação de Dinâmica Molecular

A Simulação de Dinâmica Molecular (DM) é uma ferramenta que pode ser usada
como alternativa para otimização de custo, análise e tempo de uma pesquisa em relação à
modelos tradicionais de experimentos laboratoriais. A DM possibilita a determinação das
posições de átomos de uma molécula em uma escala pequena, em tempo estabelecido por meio
de uma simulação computacional, o que é difícil através de técnicas experimentais (SCHLICK,
2010).
A DM leva em consideração para os cálculos as equações de Newton para
movimento dos átomos, em curtos intervalos de tempo. Há uma definição da trajetória e energia
 23

das partículas analisadas que determinam o comportamento que a molécula assumirá de acordo
com as condições de contorno propostas na simulação. Entre elas estão o campo de força e
condições periódicas de contorno, que fornecem ao sistema fronteiras, possibilitando a análise
um ambiente atômico infinito (SOARES, 2009; TAVARES, 2016; HORA 2016).
As equações de Newton são resolvidas simultaneamente em todos os passos da
dinâmica e a temperatura e pressão da simulação são controlados, mantendo-se constantes. Ao
decorrer do processo o sistema tende a um estado de equilíbrio; isso nem sempre representa o
seu mínimo global de energia. Através da análise da trajetória de equilíbrio, é possível visualizar
o sistema como um todo e prever fenômenos em nível molecular (VAN DER SPOEL, 2006).
A DM permite o avanço, retrocesso, pausa temporal para análises e fornece, também, a
quantidade de interações intermoleculares, distância média entre os átomos, energias potenciais
e de interações, dentre vários outros recursos. (JENSEN, 2008; TRSIC & PINTO, 2009).

3.5 EcPis-4s (piscidina)

O peptídeo antimicrobiano ecPis-4s pertence à família das piscidinas. Ele foi

isolado da espécie de peixes Epinephelus coioides, também conhecido como garoupa de pintas
alaranjadas (FIG. 9), encontrado no litoral brasileiro. Esse PAM possui em sua estrutura
molecular 22 resíduos de aminoácidos. Estudos indicam que ele apresenta atividade biológica
contra bactérias e fungos e baixa atividade hemolítica (ZHUANG, 2017).

Figura 9 - Epinephelus coioides (Garoupa de pintas alaranjadas).

Fonte: GUIA PESCA, 2007.

Ele possui a seguinte sequência de aminoácidos:

FFRHIKSFWKGAKAIFRGARQG-NH2, cuja região NH2 refere-se à amidação da extremidade
C-terminal. A partir dela é possível identificar grupos polares e apolares que contribuem
diretamente para ação desse PAM na membrana celular dos microrganismos patógenos.
24

Segundo o estudo realizado por Souza, 2019, o ecPis-4s possui estruturação α-

hélice em meio aquoso, o que é incomum para a maioria dos peptídeos microbianos.
Normalmente os PAM estruturam-se apenas quando entram em contato com a membrana
celular. Tal característica estrutural pode estar associada a uma maior cinética de ação
antimicrobiana, uma vez que o peptídeo já se encontraria parcialmente estruturado antes de
interagir com a membrana do patógeno.
25
 27

4 METODOLOGIA

Os peptídeos agregam-se de modo a proteger suas regiões hidrofóbicas do contato do

solvente, expondo ao meio apenas as cadeias laterais polares, assim, estabilizando a hélice em
um meio aquoso. O presente estudo consiste na simulação contendo apenas um peptídeo,
visando verificar se o peptídeo sozinho consegue manter uma estruturação α-hélice e, também,
avaliar a presença de interações que possam explicar esse “comportamento” do peptídeo.
As informações estruturais iniciais do ecPis-4s foram determinadas pelo estudo
desenvolvido por Kelton Rodrigues de Souza. O peptídeo ecPis-4s foi obtido quimicamente
através da síntese de peptídeos em fase sólida via estratégia Fmoc, e a sua estrutura foi
determinada por meio da técnica de RMN na presença de micelas SDS-d25 (FIG. 10) (SOUZA,
2019).

Figura 10 – Estrutura de menor energia determinada por meio de RMN na presença de micelas SDS-d25.
Em azul estão representados os átomos de nitrogênio e em vermelho os átomos de oxigênio.

Fonte: SOUZA, 2019

Realizou-se a análise do peptídeo ecPis-4s em simulações por dinâmica molecular

(DM), utilizando a estrutura de menor energia determinada por Souza (2019). Para isso, o PAM
foi posto individualmente em uma caixa cúbica contendo água a fim de analisar as suas
variações conformacionais. Foram levados em consideração, como parâmetros, campo de força,
condições periódicas de contorno, temperatura, pressão e energia da simulação.

4.1 Campo de Força

Na DM, os átomos presentes não estão isolados, mas interagindo uns com os outros.
Esses podem ter interações entre si e, assim, são sujeitos a forças interatômicas e
intermoleculares. Para o cálculo dessas forças usa-se uma função matemática chamada de
campo de força. Ela atua através de um conjunto de equações que reproduzem aspectos reais
28

do comportamento molecular, como o estiramento de ligações químicas e deformação angular

entre as ligações (VERLI, 2014).
Para o presente estudo, foi escolhido o CHARMM36 (Chemistry at Harvard
Macromolecular Mechanics) (KLAUDA, 2010) como o campo de força a ser utilizado na
simulação. A ferramenta CHARMM é um programa desenvolvido pela Universidade de
Harvard para simulações computacionais em nível atómico (HUANG et al, 2013). O motivo da
preferência pelo modelo escolhido, CHARMM36, foi considerar todos os átomos das moléculas
presentes no sistema separadamente. Isso implica em uma capacidade analítica mais ampla em
relação aos demais campos disponíveis, devido ao poder de análise fornecido e, assim, resulta,
a princípio, em uma maior aproximação da realidade.
O modelo usado para simular a molécula de água no campo de força CHARMM36
foi o TIP3 desenvolvida por Jorgensen e colaboradores em 1983. Ele foi escolhido como
solvente, visto que, ele é o modelo mais consistente com o campo de força escolhido para a
simulação dentre os disponíveis. Assim os cálculos são feitos em um menor tempo, pois exige
menor número de equações para seu processamento.

4.2 Condições Periódicas de Contorno

Para haver um controle do número de moléculas de solvente no sistema e as coordenadas

dos átomos que se deseja analisar, são utilizadas as condições periódicas de contorno. Essas
especificam as posições iniciais das partículas que constituem o sistema, em uma rede cristalina,
que impede de haver sobreposição indesejada dos átomos, através de uma caixa de simulação
(FIG. 11) (que pode adorar diferentes geometrias), nas quais as moléculas de solventes estarão
contidas. As condições periódicas emulam um meio maior que a caixa de simulação, para haja
estabilidade do sistema, devido à alta energia causada pelo vácuo que as cercam. A otimização
do número de moléculas do solvente possibilita em um menor tempo de simulação
computacional, pois são necessárias menos equações para o processo (VERLI, 2014). Na
simulação utilizou-se uma caixa cúbica contendo moléculas de água, TIP3, cuja aresta foi de
5,75375 nm (FIG 12).
 29

Figura 11 – Condições periódicas de contorno para caixa cúbica contendo o peptídeo (esferas verdes) e as
moléculas de solvente (esferas azuis).

Fonte: VERLI, 2014

Figura 12 – Imagem da simulação por DM mostrando a caixa cúbica contendo o peptídeo e as moléculas
de água (azul).

Fonte: Autora

4.3 Minimização de Energia

Para que as moléculas de solventes se adaptem às do soluto, é necessária uma

adequação antes que a dinâmica se inicie. O motivo é que ao serem inseridas diferentes
moléculas no sistema, pode haver repulsões eletrostática entre os átomos que possuírem cargas
semelhantes, sobreposição entre os átomos ou geometria/conformação inadequada. Assim, a
30

alta energia pode gerar mudanças conformacionais nas moléculas e, em alguns casos, resultar
em uma fragmentação das moléculas na simulação. Para reduzir a energia global do sistema e
evitar tais problemas, é utilizada uma ferramenta de minimização de energia, usando o
algoritmo Steepest descente minimization. Essa, por sua vez, leva a DM a um estado global
mais estável (VERLI, 2014).
Para primeira minimização, contendo apenas uma molécula do PAM, utilizou-se
um tempo de 4477 ps para minimização de energia. A Gráfico 1 mostra a redução de energia
(kJ/mol) da simulação até o ponto em que o sistema se estabiliza, próximo a 5000 ps,
aproximando-se da tangente da curva. Isso faz com que a elevada energia presente pelas forças
de interação intermolecular do próprio sistema, não interfiram nas interações do solvente com
o ecPis-4s. Foram usados 7 íons Cl- para neutralizar o peptídeo.

Gráfico 1 - Variação da energia (kJ/mol) do sistema da DM com o tempo (ps).

Fonte: Autora
 31

4.4 Ensembles

Ensemble é uma palavra de origem francesa que significa “conjunto”. Esse é o nome
de uma condição de simulação usada na DM, definida como o conjunto de elementos que se
mantem constantes durante a simulação. Entre as opções do ensemble pode se controlar o
número de partículas, volume, energia total. Além disso, é possível manipular separadamente
a temperatura (T), pressão (P) ao invés da energia total (E). É exequível também, graças a essa
ferramenta, realizar cálculos a NVT (número de partículas, volume e temperatura constantes);
NPT (número de partículas, pressão e temperatura constantes) (HUANG, 1990).

4.4.1 Condições de temperatura e pressão

As temperaturas das simulações foram feitas na condição NVT, ao tempo de 100 ps

para simulação. O intuito foi manter a temperatura constante na faixa de 300 K, que é
aproximadamente a temperatura ambiente (298,15K). Segue o Gráfico 2 da temperatura (K)
versus tempo (ps). É possível observar que há uma variação média em torno de 300 K,
implicando que a temperatura não vai influenciar na desnaturação ou mudança conformacional
do peptídeo durante a simulação.
32

Gráfico 2 - Variação da temperatura (K) do sistema com o tempo (ps).

Fonte: Autora

As pressões das simulações foram feitas na condição NPT, ao tempo de 100 ps para
simulação. O intuito foi manter a pressão constante na faixa de 1 bar, para não haver
interferência da conformação do ecPis-4s em relação a variação de pressão. Segue o gráfico da
pressão (bar) versus tempo (ps) da simulação. É possível observar que a curva varia, com média
em 1 bar (Gráfico 3), implicando que a pressão não influenciará a conformação do peptídeo
durante a simulação.
 33

Gráfico 3 - Variação da pressão (bar) do sistema com o tempo (ps).

Fonte: Autora

4.5 Outros Detalhes Sobre a Simulação de Dinâmica Molecular do PAM ecPis-4s em Água

Na simulação de dinâmica molecular o peptídeo ecPis-4s foi posicionado de forma

centralizada e distante no mínimo 1,0 nm em relação à borda da caixa, em uma célula cúbica.
A temperatura do sistema foi mantida constante em 300 K pelo Termostato de Berendsen
(BERENDSEN, 1984) modificado com constante de tempo de 0,1 ps (este intervalo de tempo
é empregado para fazer o controle da temperatura). A pressão isotrópica foi mantida constante
em 1 bar com constante de tempo de 2,0 ps pelo Barostato de Parrinello-Rahman
(PARRINELLO, 1981; PARRINELLO, 1980) e compressibilidade isotérmica da água de
4,5x10-5 bar-1. As interações eletrostáticas foram contabilizadas pelo método Partícula Mesh
Ewald (PME) (DARDEN, 1993; ESSMANN, 1995). Interações não ligadas foram truncadas a
34

1,0 nm. O algoritmo LINCS (HESS, 1997) foi utilizado para restringir o comprimento das
ligações. O método de integração Leap-Frog (HOCKNEY, 1974) foi usado com um intervalo
de tempo de 2 fs. Condições periódicas de contorno em xyz foram empregadas para a eliminação
dos efeitos de bordas da caixa de simulação. A simulação foi realizada com o pacote
computacional GROMACS (ABRAHAM, 2015) versão 5.0.4. Os softwares VMD (Visual
Molecular Dynamics) (HUMPHREY, 1996) e Grace (GRACE, 2020) foram utilizados para as
observações visuais da dinâmica do sistema e as plotagens gráficas, respectivamente.
 35

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foi feita a simulação por dinâmica molecular do peptídeo ecPis-4s em meio

aquoso. O PAM foi posto individualmente em uma condição periódica de contorno de caixa
cúbica a fim de analisar as suas variações conformacionais e compara-las ao estudo realizado
por Souza (2019), que verificou a estabilidade conformacional de α-hélice no ecPis-4s em meio
aquoso.
Segundo a Tabela 2 e analisando a sequência de resíduos de aminoácido do ecPis-
4s, temos que os grupos que apresentam maior tendencia a se desnovelarem são Phe, His, Ser,
Trp, com ΔG° de 2,0; 2,6; 2,2 e 2,0 respectivamente. É previsto, então, inicialmente que a região
N-terminal do peptídeo não mantenha a estrutura helicoidal.
No contexto da DM, o RMSD (do inglês root-mean-square deviation ou desvio
quadrático médio) é parâmetro utilizado para análise da variabilidade conformacional de uma
molécula de peptídeo ao longo do tempo de simulação. Ele mostra o quanto o esqueleto da
molécula modifica-se em relação à sua conformação inicial. Essa análise oferece uma medida
média da posição dos átomos de um conjunto selecionados (VERLI, 2014). Através da Gráfico
4 é possível analisar o RMSD da simulação. Observa-se que há uma constância em cerca de 0,4
nm, no intervalo de tempo [50,100] ns, implicando na estabilidade da α-hélice em água nesse
tempo. Contudo, antes desse intervalo nota-se variação estrutural do peptídeo, observada pelo
desvio quadrático médio.

Gráfico 4 - Variação do RMSD pelo tempo de simulação de 100 ns do PAM ecPis-4s. A linha
vermelha indica a curva média de variação do RMSD.

Fonte: Autora
36

Observa-se que, para a simulação, o peptídeo teve sua cadeia desenovelada. O

ecPis-4s, que possui a sequência de aminoácido FFRHIKSFWKGAKAIFRGARQG, manteve
sua conformação na região F1-K10, como possível observar na Figura 13, e desenovelou-se na
região C-terminal, não correspondendo às expectativas iniciais.

Figura 13 – ecPis-4s desnovelado na região C-terminal (circulada) do PAM, no tempo de 100ns

Fonte: Autora

A análise do RMSD refere-se a toda a estrutura do peptídeo, logo, sozinha, não

mostra quais foram os resíduos de aminoácidos que mais colaboraram para o desenovelamento
da α-hélice. Sabe-se que essa conformação secundária possui interações do tipo ligação de
hidrogênio a cada cerca de 4 resíduos de aminoácido. Assim sendo, tem-se uma previsão de
possíveis interações intermoleculares entre os grupos próximos uns aos outros.
Previu-se, através da análise das cadeias laterais dos aminoácidos presentes da
estrutura do ecPis-4s, onde poderia haver interações interresiduais, levando em conta a posição
i com i + 4 adotada pela distância entre os resíduos de aminoácidos na conformação α-hélice.
Observou-se, então, o distanciamento entre os resíduos no decorrer do tempo de simulação,
levando em conta que à medida que as voltas de hélice se repetem, logo uma distância de cerca
de 5,4 Å ao longo do eixo (correspondente a 0,54 nm). Foram feitos os gráficos das interações
entre alguns pares de aminoácidos selecionados (apresentado na Figura 14).
 37

Gráfico 5 – Gráficos das distâncias entre os resíduos de aminoácidos ao decorrer da simulação. A linha
vermelha representa a curva de variação da distância no decorrer do tempo de simulação.

Fonte: Autora
38

Os pares analisados foram: Phe 1 – His 4; Phe 2 – Arg 3; Arg 3 – Phe 8; Phe 8 –
Trp 9; Trp 9 – Lys 10; Phe 16 – Arg 17; Phe 16 – Arg 20. A escolha dos aminoácidos foi com
base nas cadeias laterais que possuem e a suas posições, visando a possíveis interações
interresiduais em átomos distantes de 3 a 4 resíduos entre si ou lado a lado. Por exemplo, no
caso da Phe 2 – Arg 3, é possível perceber que a fenilalanina (Phe) possui uma cadeia lateral
composta por um anel aromático apolar, já a arginina (Arg) apresenta um grupo positivamente
carregado em sua estrutura, dado os dipolos formados pela alta diferença de eletronegatividade
entre os átomos de N e C, N e H e a carga positiva. Logo é previsto como possível interação
cátion-π entre esses resíduos.
Analisando os gráficos do Gráfico 5, nota-se que os pares de aminoácidos matem
uma distância interresidual quase constante em torno de 0,54nm, correspondente a esperada na
α-hélice. Os pares analisados nos gráficos que apresentaram maior variação da distância entre
si no decorrer do tempo foram Arg 3 – Phe 8, Phe 8 – Trp 9, Phe 16 – Arg 17 e Phe 16 – Arg
20. É possível perceber que todos eles apresentam o aminoácido fenilalanina que, por sua vez,
possui um anel benzênico apolar. Esse pode fazer interações interresiduais do tipo cátion-π
(variação média da distância de 0,528 a 0,552nm) e π-π, o que, por sua vez, pode ajudar a
manter a estrutura α-hélice, ainda que o Phe tenha ΔΔG° que sugira o desenovelamento.
Uma característica importante que difere a Phe dos outros resíduos presentes na
ecPis-4s é a falta de flexibilidade oferecida pelo anel aromático, que apresenta caráter parcial
de dupla ligação entre seus átomos. Observa-se na Figura 15 que o grupo fenila apresenta
estrutura plana, cujos carbonos são hibridizados como sp2. Isso implica que cada carbono se
liga ao outro através dos orbitais sp2 e os terceiros orbitais p ficam paralelos (Figura 19-b) e
sobrepõem-se com os orbitais adjacentes. Assim é formada uma nuvem eletrônica continua
acima e abaixo do plano do anel (Figura 15-c). Os elétrons deslocalizados oferecem à estrutura
um caráter de ligação dupla em todo o ciclo. Logo, como as ligações π, diferentes das σ,
oferecem ao anel uma inflexibilidade.
Figura 15 – Características do anel benzílico. A letra b corresponde aos orbitais p paralelos aos orbitais
adjacentes sp2. A letra c mostra as nuvens eletrônicas acima e abaixo do anel.

Fonte: Leckband et al., 2001

 39

Figura 16 – Sequência de aminoácidos da ecPis-4s. As cores representam as características das cadeias

laterais de cada resíduo de aminoácido: verde representa a presença de anel aromático; rosa indica a
presença de carga positiva; preto representa cadeia aberta apolar; azul representa cadeia polar.

Fonte: Autora
Através da Figura 20 é possível verificar uma distribuição entre os resíduos de
aminoácidos seguindo o esquema de cores: verde representa a presença de anel aromático; rosa
indica a presença de carga positiva; preto representa cadeia aberta apolar; azul representa cadeia
polar. Apesar de a His estar representada como um resíduo de aminoácido que possui carga
positiva, no caso da simulação, sua carga líquida é nula, o que reflete o pH do meio em que se
determinou a estrutura. As interações interresiduais entre os grupos confeririam a eles uma
estabilidade, que contribui, juntamente com as ligações de hidrogênio da própria estrutura da
hélice, a manter a conformação inicial do peptídeo.
Observa-se a presença de poucas cadeias laterais apolares não aromáticas na
estrutura na ecPis-4s. Nota-se, pela Figura 16, que a região que o peptídeo se desnovelou
corresponde à C-terminal, na qual encontram-se essas moléculas apolares. Outro fator
importante são as possíveis interações interresiduais do tipo cátion-π, entre os grupos rosa
(exceto a histidina) e o grupo verde e π-π entre o grupo verde.
Obtiveram-se previsões de interações intermoleculares. A proximidade entre os
resíduos serve para fazer uma triagem, mas ela não caracteriza uma interação propriamente dita.
Uma abordagem geométrica mais consistente deveria levar em consideração as distâncias entre
os grupos que interagem entre si e não apenas dos resíduos como um todo. Além disso, para
um estudo posterior, é relevante levar em consideração parâmetros angulares referentes a esses
grupos e para uma caracterização de interações mais completa, seria necessário realizar cálculos
quânticos em partes específicas da molécula, para averiguar se os orbitais envolvidos são
passíveis de interação.
 41

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

É possível observar que o ecPis-4s não se comporta como os outros PAM em meio
aquoso, pois não apresentam desestruturação considerável da conformação α-hélice. A
estabilidade conformacional dar-se pelas interações interresiduais, devido a posição dos
resíduos de aminoácidos estrutura. Para posterior estudo é possível fazer a análise
computacional de mais de uma molécula de ecPis-4s para observar possível aglomeração entre
eles. Além disso, é proposto levar-se em consideração parâmetros angulares referentes a esses
grupos e para uma caracterização de interações mais completa, realizar cálculos quânticos (HF
ou DFT) em partes específicas da molécula, para averiguar se os orbitais envolvidos são
passíveis de interação.
 43

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