Estudo Dirigido Bioquímica da Informação Genética – Bioinformática

Curso de Farmácia – UNIOESTE

Nome: Karen Luiza Martins Moreira
Profª: Drª. Rita de Cássia Garcia Simão
Aula 01 – Como pescar uma sequência gênica e desenhar oligos visando clonagem molecular:
Sequência de aminoácidos do gene que codifica a calmodulina de Saccharomyces cerevisiae:
MSSNLTEEQIAEFKEAFALFDKDNNGSISSSELATVMRSLGLSPSEAEVNDLMNEIDVDGNH
QIEFSEFLALMSRQLKSNDSEQELLEAFKVFDKNGDGLISAAELKHVLTSIGEKLTDAEVDD
MLREVSDGSGEINIQQFAALLSK
Sequência do gene que codifica a calmodulina de Saccharomyces cerevisiae, gene symbol:
>CMD1
atgtcctccaatcttaccgaagaacaaattgctgaattcaaagaagcctttgccctctttgataaagataacaatggctctatctcatcaagtgaattg
gccactgtgatgaggtcattgggtctttcgcccagtgaagcagaagtaaatgatttgatgaacgaaatagatgttgatggtaaccatcaaatcgaat
ttagtgaatttttggctctgatgtctcgtcaactcaaatcaaatgactctgaacaagaactactagaagcttttaaagtattcgataagaacggtgatg
gttta
Seis frames possíveis: Na fita molde: +1 atg, +2 tgt, +3 gtc.
Na complementar: gttta, inverte para 5´→ 3´, atttg logo, -1 att, -2 ttt, -3 ttg.
Após BLASTAR:

Resultado diz que há entre 80 – 200, tendo uma

pequena faixa entre 50 – 80.

Mostra que inicia no frame +1, com identidade

de 100% e E-value de 3e-62.

Então:
Na fita molde, pega 18 nucleotídeos de 5´→ 3´, atg tcc tcc aat ctt acc.
Na complementar, também pega 18 nucleotídeos, porem de 3´→ 5´, aag aac ggt gat ggt tta, então
deve-se inverter para 5´→ 3´ e fica att tgg tag tgg caa gaa.
Realiza uma análise de restrição, levando em conta o plasmídeo vetor pPROEX HIa, para poder
criar um mapa de restrição.
 Segue os resultados encontrados, com as enzimas grifadas respeitando o não corte no meio da
sequência, além de satisfazer as condições de preço condizentes com o plasmídeo vetor:
Positio Positio Positio Positio
Site: Site: Site: Site:
ns: ns: ns: ns:
HincII gty|
AatI agg|cct none BbuI gcatg|c none 227 PsiI tta|taa none
rac
HindIII a|
AatII gacgt|c none BcuI a|ctagt none 264 PstI ctgca|g none
agctt
Acc16I tgc| PvuI cgat|
none BclI t|gatca none HinfI g|antc 242 none
gca cg
PvuII cag|
AccII cg|cg none BfaI c|tag 260 HpaI gtt|aac none none
ctg
AccIII t|
none BfrI c|ttaag none HpaII c|cgg none RsaI gt|ac none
ccgga
SacI gagct|
AclI aa|cgtt none BfrBI atg|cat none KasI g|gcgcc none none
c
SacII ccgc|
AcvI cac|gtg none BglII a|gatct none KpnI ggtac|c none none
gg
SalI g|
AfaI gt|ac none BlnI c|ctagg none MboI |gatc none none
tcgac
SbfI
AfeI agc|gct none BseCI at|cgat none MfeI c|aattg none none
cctgca|gg
BsePI g|
AflII c|ttaag none none MluI a|cgcgt none ScaI agt|act none
cgcgc
BseX3I c| SfoI ggc|
AgeI a|ccggt none none MscI tgg|cca 101 none
ggccg gcc
SmaI ccc|
AhlI a|ctagt none BshTI a|ccggt none MseI t|taa 270 none
ggg
Alw441 g| Bsp1407I t| SnaBI tac|
none none MspI c|cgg none none
tgcac gtaca gta
Bsp19I c| SpeI a|
AluI ag|ct 266 none NaeI gcc|ggc none none
catgg ctagt
Aor51HI SphI gcatg|
none BspDI at|cgat none NarI gg|cgcc none none
agc|gct c
ApaI gggcc|
none BspEI t|ccgga none NcoI c|catgg none SspI aat|att none
c
ApaLI g|
none BsrGI t|gtaca none NdeI ca|tatg none SstI gagct|c none
tgcac
AscI gg| BssHII g| SstII ccgc|
none none NdeII |gatc none none
cgcgcc cgcgc gg
NgoMIV g| StuI agg|
AseI at|taat none BstUI cg|cg none none none
ccggc cct
Asp718I g| SwaI attt|
none ClaI at|cgat none NheI g|ctagc none none
gtacc aaat
192,
AsuII tt|cgaa none DpnII |gatc none NlaIII catg| none TaqI t|cga
279
 NotI gc|
AvaI c|ycgrg none DraI ttt|aaa 271 none TliI c|tcgag none
ggccgc
AviII tgc|gca none EagI c|ggccg none NruI tcg|cga none VspI at|taat none
AvrII c| XbaI t|
none EcoRI g|aattc 35 NsiI atgca|t none none
ctagg ctaga
EcoRV gat| XhoI c|
BalI tgg|cca 101 none PacI ttaat|taa none none
atc tcgag
BamHI g| XmaI c|
none EgeI ggc|gcc none PciI a|catgt none none
gatcc ccggg
BanIII at| FseI ggccgg|
none none PhoI gg|cc 101
cgat cc
PmeI gttt|
BbeI ggcgc|c none FspI tgc|gca none none
aaac
BbrPI cac|
none HaeIII gg|cc 101 PmlI cac|gtg none
gtg

Assim BamHI g|gatcc KpnI ggtac|c NcoI c|catgg XbaI t|ctaga XhoI c|tcgag são as possíveis, se
escolhe duas (BamHI g|gatcc KpnI ggtac|c), uma para a fita molde e outra para a complementar
(respectivamente). Não podendo vir a da fita molde posterior a da complementar no plasmídeo
vetor.
Criando oligos para restrição, levando em conta que deve se tratar de uma sequência
palindrômica com corte especifico das enzimas correspondentes, usa-se de início a sequência tat
para que a enzima possa se ancorar e clivar onde é necessário, não interfere na leitura.
Nome do Primer Sequência 5´ → 3´ Sítio
CMD1-Met tat gga tcc atg tcc BamHI g|gatcc
tcc aat ctt acc
CDM1-Stop tat ggt acc att tgg KpnI ggtac|c
tag tgg caa gaa