BIOTECNOLOGIA Le URGEL DE ALMEIDA LIMA EUGENIO AQUARONE WALTER BORZANI WILLIBALDO SCHMIDELL 7 Hh y ‘ / Bioouimuca BIOLOGIA MOLE Can ery r De Proper . ah r a iy Seay ~ cere us “= “ee Hite Ee Ny atti, oe g "tg "il ie * in at SCENHaRiA QUIN 7 See eps eee Ns Tei |acre epee BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL VOLUME III PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMATICOScoos Sangoes A Lei de Direito Autoral > (Lei n° 9. 610 de 19/2/98) _ no Titulo VII, Capitulo I diz.» O titular cuja obra seja fraudulentamente reproduzida, divulgeda :qu'de qualquer forma utilizada, poderé requerer a apreensao dos exémplares reproduzidos ou a suspénsio'da divulgagio, sem prejiizo da indenizacio cabivel. Queim éditar obra literdria, artistica ou cientifica, sem autorizacSo do titular, perdera para este os, exemplates que sé apreenderem ¢ pagar-lhe-& 0 preco dos que tiver vendido. Paragrafo tinico. Nao se conhecendo 0 niimero de exemplares que constituem a edigdo frauduilenta, pagard o transgressor o valor de trés mil exemplares, além dos apreendidos. . Ace AN _./. Quem vender, expuser 2 venda, ocultar, adquirir, distribuir, tiver ‘em: depésite ou utilizar obra ou fonograma reproduzides com fraudé, com a finilidade de vender, obter ganho, vantage, pro- veito, lucro direto, ou, indireto, para si ou para outrem, sera so- lidariamente responsdvel com o céntrafator, nos termos dos z artigos precedentes, respondendo como contrafatores ‘0 ‘insportador ¢ © distribuidor ¢m caso de reprodugao no exterior. pesca Coordenadores: URGEL DE ALMEIDA LIMA EUGENIO AQUARONE WALTER BORZANI WILLIBALDO SCHMIDELL BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL VOLUME III PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMATICOS ¢ EDITORA EDGARD BLUCHER trpa—_———-__—4-Wwiteroorganisnvosbiotecrrolégicos I, Borzani; Walter IT. Schmid ©2001 Urgel de Almeida Lima Eugenio Aquarone Walter Borzani Willibaldo Schmidell F edigio - 2001 2 reitwpteseao ~ 2007 E proibida a reprodugéo total ou parcial por quaisquer meios cL sem autorizagao escrita da editora EDITORA BLUCHER Rua Pedroso Alvarenga, 1245 — 4° andar 04531-012 - Sao Paulo, SP — Brasil Fax: (11) 3079-2707 Tel: (11) 3078-5366 e-mail: editora@blucher.com.br site: www.blucher.com.br ISBN 85-212-0280-6 RS. GR, FA. Data AF lad} 0.8 Dept FICHA CATALOGRAFICA 7 Lima, Urgel de Almeida Biotecnologia industrial - Processos fermentativos e enzimaticos/ Urget de Almeida Lima - outros coordenadores: Eugénio Aquarone,Walter Borzani, Willibaldo Schmidell — Sao Paulo: Blucher, 2001. Bibliografia. ISBN 85-212-0280-6 1, Biotecnologia 2. Biotecnologia - Industriais 3. Microbiologia industrial Willibaldo III, Lima, Urgel de Almeida IV. Aquarone, Eugénio. 05-0906 1D-506.6 indices para catalogo sistemitico: 1, Biotecnologia industrial: Engenharia quimica 606.6 Universidade Estadual de Maring’ Sistema de Bibliotecas - BCE 001 Vane cee ec rn ane rn et en een aii Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o titulo amplo de BIOTEC- NOLOGIA INDUSTRIAL, é 0 resultado do trabalho de um grupo de profissionais com vistas a atualizacao da colec3o BIOTECNOLOGIA, cuja publicagao foi iniciada em 1975 e terminada em 1983. Aexperiéncia acumulada e as muitas mudangas ocorridas nestes tiltimos vinte anos, ao lado da indiscutivel e crescente importancia das aplicagdes da BIOTEC- NOLOGIA em diversos setores de produgao de bens e servi¢os, justificam plena- mente — assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Colegao — esta primeira atualizacao, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos de graduacao. Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentagao, € tomar conhecimento do que, hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL. Ademarcacao nitida do campo de atuagao de qualquer ramo do conhecimento é sempre tarefa muito dificil, para nao dizer impossivel. Tanto isto 6 verdade que, com certa freqiiéncia, tratados relativos a um dado setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma série de temas sem tentar esbogar, preliminarmente, um quadro que, em largos tragos, indique os objetivos e as aplicagGes do que vai ser estudado. Tal maneira de agir, principalmente em cursos de gradua¢ao, n4o nos parece aconselhdvel. Julgamos importante, no inicio dos estudos, a apresentagao de um panorama que dé, aos alunos, uma idéia, ainda que néo bem definida, daqueles objetivos e aplicagdes. Nao nos parece que seja imprescindivel transcrever, aqui, todas as propostas de “definigao” do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas serao suficientes para que seja possivel alcancar nosso objetivo. Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu trabalho intitulado “Patentes para a Biotecnologia”, apresentou, em dezembro de 1993, em reunido realizada na Academia Brasileira de Ciéncias: “Entende-se por Biotecnologia o conjunio de conhecimentos, técnicas e métodos, de base cientifica ou prdtica, que permite a utilizagao de seres vivos como parte integrante e ativa do processo de produgao industrial de bens e servicos.”© Office of Technology Assesment, por sua vez, “definiu” Biotecnologia como sendo: “O conjunto de processos industriais que englobum processes biolégicos”. Por outro lado, a Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée, concei- tuou Biotecnologia como: “Aplicacao da Bioquimica, da Biologia, da Microbiologiae da Engenharia Quimica aos processos e produtos industriais (incluindo os produtos relativos a satide, energia eagricultura) e ao meio ambiente”. Finalmente, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolégico (CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, “definiu” Biotecnologia nos seguintes termos: “A utilizagio de sistemas celulares para abtengdo de produtos ou desenvolvimento de processos industriais”. As poucas tentativas de definicao aqui transcritas mostram, nitidamente, que a Biotecnologia tem por base varios ramos do conhecimento que poderiam ser classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioquimica, Fisiologia, Genética, Microbiologia, Virologia, Botanica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros * lossobadenominaco genérica de ENGENHARIAS (prin- cpalmente a Engenharia Quimica). ‘Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, 0 que torna absolutamente imprescind{vel a efetiva colaboragao de profissignais atuantes em diferentes setores do conhecimento. Destaque-se, porém, que essa atividade multidisciplinar nao deve ser enten- dida como resultante de uma simples justaposi¢So de profissionais, cada um deles com sua formagio especializada e preocupado apenas com sua area especifica. Importa que seja, de fato, um trabalho de varios profissionais efetivamente integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente nao aprofundado, dos principios e das técnicas dos campos de atuagao dos demais. Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um grupo que estuda a otimizacao de um dado processo, ¢ desejavel que tenha alguns conhecimentos, mesmo que supertficiais, a respeito das estratégias empregadas para a modelagem matemética. Vice-versa, o especialista em modelagem deve efetuar uum esforco adicional para compreender as caracteristicas do sistema microbiano em estudo, a fim de incorpord-las ao modelo, Somente desta forma a atividade multidisciplinar efetivamente existird e poderd ser mais eficiente. peihecctere aha ene penne cane eeerbeiae enn canal (eens areas napa at aenaeere annette im Vu Se é verdade, por um lado, que a Biotecnologia s6 passou a ser considerada altamente prioritdria hé relativamente pouco tempo, também € verdade, por outro, que processos biotecnolégicos vém sendo utilizados na produgao de varios bens, principalmente alimentos, desde a mais remota antigitidade. Basta, neste particu- Jar, fazer referéncia ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na Babilénia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.) producao de pao, utilizando fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e & produgao de vinhos na Grécia (2.000 a.C.). A Biotecnologia encontra muitas aplicagées importantes nas seguintes dreas de atividade: * Agricultura © Pecudria * Satide * Preservacaio do meio ambiente » Industria Suas aplicagdes na indtistria constitutem o objetivo primordial da Biotec- nologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer Jonas, € uma boa representagao grafica da “localizagao” da Biotecnologia Indus- trial e de sua interagaio com outros ramos do conhecimento. BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL QUIMIC. Bre GIF Figura | — Representagio esquemitice da interacdo da Biotecnologia Industrial com outros ramos do conhe- cimento.vii Convém, finalmente, ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho, as dreas de aplicagao da Biotecnologia, anteriormente apontadas, nao sao “gavetas” estanques. Ha entre elas, freqiientemente, fortes interagdes. Apenas para citar um exemplo, considere-se 0 caso de uma dada vacina, desenvolvida na area’ da Savide. Na etapa final de producdo dessa vacina em larga escala surgirao, muito provavel- mente, problemas de cunho tecnolégico e de engenharia que poderao tornar impres- cindivel a efetiva participacaéo da Biotecnologia Industrial na busca das solugdes mais adequadas. A presente Colecao consta de quatro volumes. No primeiro— FUNDAMEN- TOS — revinem-se, como o proprio nome claramente indica, temas fundamentais indispensaveis ac estudo de processos biotecnolégicos. O segundo — ENGENHA- RIA BIOQUIMICA — focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos naqueles processos, a0 lado de assuntos correlatos de ambito mais geral, mas im- portantes na produgao em larga escala. Os dois tltimos volumes — PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMATICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUGAO DE ALIMENTOS — foram dedicados & descricdo e discusséo de processos biotecno- légicos de importancia industrial. Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se destina, primordialmente, a cursos de graduagao. A bibliografia indicada no final de cada capitulo poder servir como ponto de partida para os que pretenderem um exame mais aprofundado de um ou outro t6pico. Os Coordenadores, 0 Editor e, seguramente, também os Autores, agradecem todas as sugestées relativas 4 estrutura da Colegao ou de qualquer de suas partes, bem como a identificacao de falhas ou incorregées, infelizmente sempre possiveis, que lhes sejam encaminhadas pelo leitor. Literatura Recomendada (1) Ancides, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor ae CNP4, Brasilia, 1985. (2) Haehn, H. Bioquimica de las fermentaciones. Aguilar §.A. de Ediciones, Madri, 1956. (3) Jonas, R. GBF Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990. (4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentado & Academia Brasileira de Ciéncias em 06.12.1993. ee Leer I I tds be ee tence termes qamner sesieeanmnseeatt teens rm re areem artpe mn a — fb Cuando la coleccién “Biotecnologia”, editada por los profesores Eugénio Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, aparecié en 1975, causé un hondo impacto entre los biotecendlogos latinoamericanos. Se trat6 de la primeira obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra regién y representé una contribucién especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina. “Biotecnologia” consté originalmente de tres volimenes, Tecnologia das Fermentagées, Tépicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioquimica, a los cuales se sumé en 1981 Corrosiio Microbiolégica y luego Alimentos € Bebidas produzidos por Fermentagdo en 1983. Ahora, pasados ya mas de veinte afios, los mismos editores, com la participacién del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad de apreciar y disfrutar la nueva coleccién “Biotecnologia Industrial” como una sucesora natural de “Biotecnologia”. El contenido de Ja nueva obra ha sido totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances experimentados por el conocimiento en esta area enlas tltimas décadas, incluyendo las modernas técnicas de la ingenierfa genética y el uso de microorganismos recombinantes en bioprocesos. La nueva coleccién esta dividida en cuatro voltimenes que abarcan los mas variados topicos relacionados com Ja biotecnologia industrial: Fundamentos, Ingenieria Bioquimica, Procesos Fermentativos y Enzimdticos y Biotecnologia en la Produccién de Alimentos. En total son 74 capitulos escritos por distinguidos especialistas brasileros, conteniendo informacién actualizada acerca tanto de los aspectos badsicos como de los aplicados de la utilizacién de células microbianas y no microbianas para finalidades productivas. El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del conocimiento en microbiologia, genética, bioquimica y enzimologia, finalizando com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnologia, abriendo asi el camino a los préximos volimenes. En el Volumen 2, Ingenieria Bioquimica, se exponen los principales aspectos relacionados com Ja cuantificacién de los procesos microbianos y enziméticos y el disefio y operacién de los equipos de proceso requeridos en una instalacion industrial. El Volumen 3, Procesos Fermentativos y Enzimdticos, presenta y discute la aplicaci6n de los microorganismosa la producci6n de-una amplia gama de metabolitos y enzimas de interés prdctico, el uso de enzimas como biocatalizadores industriales y la aplicacién de los procesos microbianos a diversos sectores industriales y a la descontaminaci6n de efluentes liquidos y residuos sélidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnologia en Ja Produccion de Alimentos,detalla la aplicacién de la biotecnologia a una amplia variedad de industrias de ese importante sector. Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial esté destinada a constituirse en una obra insustituible para la ensefianza universitaria de pre y post-grado, asi como también en una valiosa fuente de consulta para el biotecndlogo en la industria. Fernando Acevedo Profesor Escuela de Ingenieria Bioquimica Universidad Catélica de Valparafso Valparaiso, Chile tei aoe hmastet ears matac mtbr esis at cymes emo pone \ jw xi = —AUTFORES André Luiz Ferraz Professor Doutor ‘Faculdade de Engenharia Quimica de ‘Lorena Centro de Biotecnologia Caixa Postal 116 12600-000, Lorena, SP, Brasil Celso Lellis Bueno Netto Doutor em Engenharia (Universidade de Toulouse) Consultor auténomo Celsobn@uol.com.-br Deise Maria Fontana Capalbo Pesquisadora Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuéria Rodovia $P 340, km 127,5 Caixa Postal.g9 13820-000, Jas iina, SP, Brasil Elisabeth F. Pires Augusto Pesquisadora Instituto de Pesquisas Tecnolégicas do Estado de Sao Paulo S.A. Divisdo de Quimica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal 0143 1064-970, Sao Paulo, SF, Brasil Eugénio Aquarone Professor Titular Universidade de Sdo Paulo Faculdade de Ciéncias Farmacéaticas Departamento de Tecnologia Bioquimico-Farmacéutica Av, Prof. Lineu Prestes, 580 - Bloco 16 05508-900, Sao Paulo, SP, Brasil Francisco Maugeri Filho Professor Doutor Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia de Alimentos Caixa Postal 6121 13081-970, Campinas, SP, Brasil Geraldo Lippel Sant’Anna Jr. Professor Titular ‘Universidade Federal do Rio de Janeiro COPPE Caixa Postal 68502 21945-970, Rio de Janeiro, RJ, Brasil Gérard Clement Chuzel Pesquisador Dr. Cirad - Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement ‘Avenue d°Agropolis 34398 Montpellier Cedex 5 - Montpellier - Franca Haroldo Hiss Pesquisador Cientifico Instituto Butanta Ay. Vital Brasil, 1500 5503-900, Sao Paulo, SP, Brasil Henrique Vianna de Amorim Professor Associado Fermentec S/C Ltda. Rua Treze de Maio, 768 - salas 43/44 13400-900, Pixacicaba, SP, Brasilxu Iracema de Oliveira Moraes Professora Titular Universidade de Guarulhos Centro de Ciéncias Exatas e Tecnologicas Praga Tereza Cristina, 1 07033-070, Guarulhos, SP, Brasil José Abrahao Neto Professor Doutor Universidade de Sao Paulo Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas Departamento de Tecnologia Bioquimico-Farmacéutica Av Prof. Lineu Prestes, 580 - Bloco 16 05508-900, Sao Paulo, SP, Brasil José Geraldo da Cruz Pradella Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnolégicas do Estado de Sao Paulo S.A. Divisio de Quimica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal 0141 01064-970, Sao Paulo, SP, Brasil José Gregério Cabrera Gomez Pesquisador 7 ‘Instituto de Pesquisas Tecnologicas do Estado de Sao Paulo S.A. Divisao de Quimica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal 0141 01064-970, S40 Paulo, SP, Brasil Luiz Carlos Basso Professor Doutor Universidade de Sao Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Caixa Postal 9 13418-900, Piracicaba, SP, Brasil Luiz Carlos Urenha Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnolégicas do Estado de Sao Paulo S.A. Divisdo de Quimica Agrupamenio de Biotecnologia Caixa Postal 0141 01064-970, Séo Paulo, SP, Brasil Margaretti Simoes de Oliveira Pesquisadora Instituto de Pesquisas Tecnoldgicas do Estado de Séo Paulo S.A. Divisao de Quimica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal 0141 01064-970, Sao Paulo, SP, Brasil Marney Pascoli Cereda Professora Titular Departamento de Gestao e Tecnologia Agro-industrial Faculdade de Cigncias Agrondmicas Universidade Estadual Paulista Fazenda Experimetal Lageado Caixa Postal 237 18603-970, Botucatu, SP, Brasil Michéle Vitolo Professor Titular Universidade de $40 Paulo Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas Departamento de Tecnologia Bioquimico-Farmacéutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580 - Bloco 16 05508-900, So Paulo, SP Brasil Olivier Vilpoux Pesquisador Dr. Raizes - Organizagéo Nao Governamental Av. Manacé, 524 - Casa 2 18607-170, Botucatu, SP, Brasil oe tint near aeons enn titansctnslenenars enn a Orténcia Leocddia G, da Silva Nunes Pesquisadora Doutora FUNDETEC - FUNDACAO PARA QO. DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO BR - 277, Km 573 - Trevo Sao Jodo Caixa Postal 4065 85.818-560, Cascavel, PR, Brasil Oswaldo Garcia Jr. Professor Doutor Universidade Estadual Paulista Instituto de Quimica Rua Professor Francisco Degni, s/n 14800600, Araraquara, SP, Brasil Rafae] Almudi Villen Professor Associado Centro Universitério do Instituto Maud de Tecnologia Escola de Engenharia Maud Departamento de Engenharia Quimica e de Alimentos Praga Maud, 1 (9580-900, Sao Caetano do Sul, SP, Brasil Regina de Oliveixa Moraes Arruda Professora Titiclar ‘Universidade de Guarulhos CBS/ Farmacia e Bioquimica Praga Teresa Cristina, 1 07023-070, Guarulhos, SP, Brasil xm Sunao Sato Professor Titular Universidade de Sao Paulo Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas Departamento de Tecnologia Bioquimico-Farmacéutica Aw. Prof. Lineu Prestes, 580 - Bloco 16 05508-900, Sao Paulo, SP, Brasil Thereza Christina Vessoni Penna Professora Titular Universidade de Sao Paulo Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas Departamento de Tecnologia Bioquimico-Farmacéutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580 - Bloco 16 05508-900, Sao Paulo, SP, Brasil Urgel de Almeida Lima Professor Pleno Centro Universitario do Instituto Maud de Tecnologia Escola de Engenharia Maud Departamento de Engenharia Quimica e de Alimentos Praca Maud, 1 09580-900, Sao Caetano do Sul, SP, Brasil Yong Kun Park Professor Titular Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia de Alimentos Caixa Postal 6121 13081-970, Campinas, SP, Brasilxv | | | bo : | | [, | | |, | P | _ 17 Corresio dos moste: PRODUCAO DE ETANOL. 1. Importéncia 12 Vias de obtengio ......... 13 Matérias-primas, compo: 1.4 — Preparagdo dos meios 1.5 Fermentagio alcoélica 16 Fatores que afetam a fermentaca« sigo € conservagao ... 18 — Preparo do inéculo . 19 Verificacao pratica da pureza das fermentag6e: 1.10 — Sistemas de fermentagao -..... 111 Fermentacao alcodlica continua 112 Salas de fermentaca 1.13 Recipientes de fermenta¢ 1.15 1.16 Pratica da retificagao industrial 1.17 Desidratag&o do etanol .. Bibliogr PRODUCAO DE ACIDOS. 21 Introdugao 2.2 Acido citrico 23 Acido itacnico 24 Acido glucénico ¢ glucono-§lactona .. 25 Acido latico ... 26 Oxogluconatos 58 Bibliografia .. 58 PRODUGAO DE SOLVENTES. 1 31 Introdugao 1 3.2 * Fermentagio acetono-butandlica 62 33 .Fermentacdo butanol-isopropanol . 5 77 34 Fermentaco acetona-etanol. Bibliografia ... PRODUGAO DE VITAMINAS. 41 Introducio. 42 Cianocobalamina 43 Riboflavina....XVI 44 Acido ascérbico ... 88 45 Obtencao de outras vitaminas por fermentacdo 92 Bibliografia ... 7 5 PRODUGAO DE ANTIBIOTICOS 5A Introducao... 5.2 Antibidticos B-lactamicos Bibliografia 6 PRODUCAO DE POLISSACARIDEOS. 125 61 Introdugio.... 6.2 Agentes de viscosidade 6.3 Polissacarideos geleificant 64 Polissacarideos com aplicagoes especificas 38 65 Pesquisa e desenvolvimento em polissacarideos microbianos .. 147 Bibliografia 49 7 PRODUCAO DE AMINOACIDOS. 7.1 Introdugio.. 7.2 Usos comerciais dos aminodcidos 73 Métodos de producio .. 74 Cepas para a produco direta de aminodcidos . 75 Controle do processo..., 7.6 Recuperagdo de produto. V7 Produgao de aminodcidos . Bibliografia .. 8 PRODUCAO DE ESTEROIDES. 81 Introducao 8.2 Omundodas formacoes 83 ‘Transformagées microbianas de esteréides e esterdis —_—$4— Tecnologia da biorranstorniacao 8.5 Modelos microbianos do metabolismo de mamiferos 8.6 Perspectivas futuras . Bibliografia .. 9 PRODUCAO DE MICRORGANISMOS. 91 Introducao e breve histérico ... . 9.2 Principios do crescimento microbiano 201 9.3 Produgiio de microrganismos e substratos usados 202 94 — Estudo de casos de produgao de microrganismos 206 95 Microrganismos visando outros produto: 213 Bibliografia . 140 PRODUCAO DE POLIESTERES BACTERIANOS. 101 — Introducao... 10.2 Polihidroxialcanoatos (PHAs) . 10.3 Metabolismo de PHAs .. 228 10.4 Produgao de PHB e P3HB-co-3HV 238 10.5 Extracao/ purificagao de PHB ou P3HB-co- SHV 242 10.6 —_Perspectivas futucas para PHAs 243 ~ Bibliografia 12 13 14 PRODUCAO DE BIOINSETICIDAS. Wa n2 ns in 115 116 m7 PRODUGAO DE INOCULANTES AGRICOLAS. 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 * 126 PRODUCAO DE VACINAS. 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 PRODUCAO DE ENZIMAS MICROBIANAS. 41 42 15.1 15.2 15.3 Introdugao.... Produgao comercial Processo fermentativo Separagio de toxinas Ensaio e formulagao Comercializacao e aplicagéo Principais avancos € Simitagies Bibliografia .. Introdugio....... Inoculantes para a a fixacéo biolégica de nitrogenio (FBN) em leguminosas.. Processo de producao de inoculantes para FBNe¢ em 1 legurninosas .. Inoculantes micorrizicos ... Producao e uso de inoculantes & base de fungos ectomicor Consideracées finais Bibliografia .. Tipos de imunidade conferidos por vacinas. Principais tipos de vacinas.... A fermentacao na produgio de vacinas A produgao de vacinas como proceso unitario cterianas — classificagao e procesos de produgio .. Bibliografia Introdugio. Produgao industrial de enzima Bibliografia .... PRODUGAO DE ENZIMAS INDUSTRIAIS DE ORIGEM ANIMAL. ....363 Introducio.. 363 Pancreatina 363 Pepsina .. 364 Renina (coatho) 364 15.4 15.5 PRODUCAO DE ENZIMAS INDUSTRIAIS DE ORIGEM VEGETA 161 16.2 16.3 164 16.5 Catalase . Bibliografia Papaina....... Produgao de papaina . Bromelina Ficina . Malte Bibliografiaxvill (ee - - 22. LIXIVIAGAO BACTERIANA DE MINERIOS. 224 Introdugio... 22.2 As bactérias do processo.. “973 Os minerais lixividveis 224 Desenvolvimento experiment 22.5 A bioidrometalirgica n no Brasil ..... Bibliografia 23. TRATAMENTO BIOLOGICO DE EFLUENTES. 23.1 Introdugio.. 23.2 Abordagem dos problemas de residuos industriais 23.3 Processos biolégicos de tratamento de residuos . 23.4 ‘Tratamento bioldgico aer6bio 23.5 Tratamento biolégico anaerébio 23.6 — Lagoas .. Bibliografia .. 24 PROCESSOS COM CELULAS ANIMAIS. 24.1 Introdugao 17 PURIFICAGAO DE ENZIMAS. 17.1 Introdugdo . 172 ~~ Extragdo 173 Purificaco baseada na solubilidade 17.4 — Purificacdo baseada na carga ...... 175 Purificagao baseada no tamanho 17.6 — Purificacdo baseada na afinidad 177 — Concentraca Bibliografia . 18 fMOBILIZAGAO DE ENZIMAS. 18.1 Introdugao 18.2 Métodos de imobi 18.3 Tipos de suporte 18.4 Efeitos causados pela imobilizagao 18.5 Conclusao Bibliografia .. 19 ALGUMAS APLICAGOES DE ENZIMAS. 19.1 Introdugao 19.2 Enzimas em medicamentos e andlises clinicas 19.3 _Enzimas em detergentes ... 19.4 Na industria téxtil, em curtumes e ena producao de antibidticos 19.5 Sintese enzimatica de aspartame e insulina 24.2 As células 24.3 Condigées basicas de cultivo .. 24.4 Catabolismo celular 24.5 — Biorreatores.. 24.6 Produtos... Bibliografia . 19.7 Usos diversos .. Bibliografia .. 20 PRODUGAO DE POLVILHO AZEDO. 20.1 Introduséo... 20.2 Produtos fermentados a partir de matérias-primas amildceas ns — Produtos fermentados 3 partir da fecul 20.4 Amatéria-prima —a fécula 20.5 A tecnologia para produgao da fécula fermentada.... 20.6 AprodugSo comercial de fécula fermentada ou polvilho azedo 20.7 Apesquisa 20.8 A comercializacao do polvilho azedo no Brasil .. 20.9 A caracterizacao e a qualidade do polvilho azedo 20.10 Os produtos de polvilho azedo no Brasil e na América Latina 20.11 Novos produtos .. 20.12. Omercado de polvilho azedo no Brasil e na América Latina... Bibliografia ... 21 APLICACOES DA BIOTECNOLOGIA NA iNDUSTRIA DE PAPEL E CELULOSE. 21.1 Introdugao 21.2 Madeira —composicao quimica e ultra-estrutura 21.3 Biodegradacdo da madeira e seus components ... : 214 — Processamento da madeira na indiistria de papel e celulose 215 Aplicagdes da biotecnologia na industria papeleira Bibliografia 25 CONTROLE DE CONTAMINACOES MICROBIANAS EM PROCESSOS FERMENTATIVOS. 25.1 Introdugio... 25.2. Desinfetantes quimicos 25.3 Antibiéticcs Bibliografia . ae Pada: di: ii pid i RS pees enatittrtantnt snail tht tran— coca tances etn EA pth dks bata sr ER asm cel e— ilk Urgel de Almeida Lima uiz Carlos Basso Henrique Vianna de Amorim 1.1 - Importancia No Brasil, as industrias de agicar e de dlcool\estiveram sempre intimamente ligadas, desde o tempo do descobrimento. Deduz-se que aprodugao de alcool iniciou na Capitania de Sao Vicente, porque nela foi montado o primeiro engenho de agécar do Pais, apés a vinda das primeiras mudas de cana-de-agticar, trazidas da ilha da Madeira em 1532. Certamente, transformava-se o melago residual da fabricagao do agticar em cachaca e, diretamente da garapa fermentada produzia-se aguardente. Por séculos, as bebidas destiladas foram 0 tmico dleool produzido. A industria de Alcool industrial desenvolveu-se na Europa, nos meados do século 19; no ultimo quarto desse século iniciou-se a producao de etanol no Brasil, com as sobras de melaco da indtistria de agucar, que ampliava sua capacidade produtiva. ..A Alemanha e, principalmente a Franga, deram grande contribuicao ao desenvolvimento das técnicas de fermentacao alcodlica, de destilagao e de construgao de aparelhos de destilacao. Utilizava-se o etanol para fins farmacéuticos, para a produgao de alguns produtos quimicos derivados, para bebidas e como fonte de energia térmica, por combust, em algumas atividades. AI Grande Guerra (1914/1918) contribuiu para o desenvolvimento da produgao em grande escala. Naquele periodo usou-se 0 alcool como combustivel Mquido de motores de explosao. Em 1929 a grande crise internacional colocou em xeque as economias de todos os paises e, no Brasil, a industria agucareira nao ficou a salvo. Sobrava agiicare cana e faltavam divisas para a aquisicado de combustivel liquido. A primeira destilaria de 4lcool anidro foi instalada e o Governo Federal, em 1931, estabeleceu a obrigato- tiedade da mistura de 5 % de etanol gasolina (Decreto 19.717), como medida de ~ @conomia na importa¢ao de combustfvel e para amparar a lavoura canavieira. Por muitos anos nao houve alcool suficiente para misturar a todo 0 combustivel2 Produgae de etanot consumido, Durante a guerra de 1939 a 1945, faltou gasolina e fez-se necessario substitui-la por gasogénio ou Alcool. Terminada a guerra, voltou a importagao de gasolina e o combustivel alternativo perdeu sua importancia. Entretanto, continuou- se a misturar etanol & gasolina em larga escala. Acrise internacional do petréleo que se deflagrou em 1974, fez com que se iniciasse, no Brasil, uma nova fase na produgao de etanol. Na busca de alternativas para combustivel liquido, 0 4lcool adquiriu uma importancia sem paralelo. Dos 700 milhées de litros por ano, em pouco tempo a industria passou a produzir 15 bilhées de litros, para abastecer uma frota de mais de 4 milhdes de automéveis, que se movem com alcool puro e também, para misturar-se a toda a gasolina usada no Pais, Com a utilizagio desse combusttvel alternativo, ampliou-se 0 parque canavieiro, fez-se a modernizag4o das destilarias anexas, a instalacdo de unidades auténomas, a criacdo de grande nimero de empregos diretos e indiretos e uma _ r4pida e importante evolugao na construgao de motores para esse combustivel. O plano de desenvolvimento da produgao de dlcool no Brasil, denominado de Prodlcool, nao foi uma solucao improvisada para a crise de combustiveis; nao foi mais do que a continuidade e evolucao de um programa de uso do alcool como . combustivel, iniciado em 1931. Com o abaixamento do prego do petréleo no mercado internacional, perdeu-se o interesse politico pela sua produca&o. 1.2 - Vias de obtencao Obtém-se etanol por trés maneiras gerais: por via destilatéria, por via sintética e por via fermentativa. A via destilatria nao tem significagéio econémica no Brasil, a nao ser para ____certas regides vinicolas, para o controle de prego de determinadas castas de vinhos de mesa. Por via sintética obtém-se o etanol a partir de hidrocarbonetos nao saturados, como 0 eteno e 0 etino, e de gases de petréleo e da hulha. Nos pafses em que ha grandes reservas de petréleo e uma industria petroquimica avancada, é uma forma econémica de produzir Alcool. A via fermentativa 6 a maneira mais importante para a obtencao do Alcool etilico no Brasil. Mesmo que venha a haver disponibilidade de derivados de petréleo que permitam a produgao de dlcool de sintese, a via fermentativa ainda serd de grande importancia paraa produc4o de Alcool de boca, sob a forma de aguardentes. As bebidas fermento-destiladas possuem carateristicas proprias de aroma e sabor, conferidas por impurezas decorrentes do proceso fermentativo. A menos que se modifique um habito arraigado, as aguardentes nao seréo produzidas por diluicao do etanol puro, obtido por siniese. Além disso, sera necessario mudar a legislagao, que no permite o desdobramento de Alcool para produzir bebidas. Um dos fatores que torna a producao de etanol por fermentagdo a forma mais econdmica de sua obtencdo, 6 o grande numero de matérias-primas naturais existentes em todo 0 Pais. Sua distribuicdo geogréfica, que encerra diversos climas a i Mné-acprimss composigio e conservacia 8 2 pew mvesster fees actiecs ethene di Suni te fo ct tt i i ti tiie dni i ete Ansett oceania e tipos de solos, permite seu cultivo em quase todo o territério e durante todo o ano. - —Na obtengio do 4lcool por via fermentativa, distinguem-se trés fases: o preparo do substrato, a fermentagao e a destilacao. Opreparo do substrato é o tratamento da matéria-prima para dela se extrairem os acticares fermentesciveis. Difere para as distintas matérias-primas. A fermentacdo é um processo comum a todos os substratos acucarados, cujo . principio é a transformagao dos acticares em etanol e di6xido de carbono. As variagdes entre os processos de fermentagao sao apenas em detalhes. Na destilacao, separa-se o etanol, geralmente em duas operagées. A primeira para o separar do substrato fermentado, sob a forma de mistura hidroalcodlica impurificada com aldeidos, ésteres, dlcoois superiores e Acidos organicos. Outra, para separar as impurezas do etanol. "1.3 - Matérias-primas, composi¢do e conservacao Qualquer produto que contenha agicar ou outjo carboidrato, constitui-se em matéria-prima para a obtengdo do etanol. Entretanto, para que seja vidvel econo- micamente é preciso considerar-se seu volume de produgao, o rendimento indus- trial e o custo de fabricagao. . Ha varias maneiras de classificar as matérias-primas para a producao de etanol, mas qualquer dos critérios que se adote deixa algo a desejar. Podemos classificd-las em matérias agucaradas, agrupando cana-de-acucar, beterraba acucareira, sorgo sacarino, milho sacarino, melacos, mel de abelhas e frutas; em matérias amildceas ¢ feculentas, agrupando graos amilaceos, raizes ¢ tubérculos feculentos; ¢ em matérias celulésicas, incluindo palhas, madeiras, res{duos agricolas e residuos sulfiticos de fabricas de papel. Entre as matérias acucaradas, costuma-se distinguir as diretamente fermen- tesciveis e as nao diretamente fermentesciveis. As primeiras so as que contém monossacarideos e se limitam aos sucos de frutas. Sua importancia reside na producdo de dlcool em bebidas como o vinho e a sidra. As nao diretamente fermentesciveis sio as que contém os dissacarideos, que fermentam apés uma hidzélise, 4 qual se d4 o nome de inversdo, e que se realiza naturalmente por agao da invertase, enzima produzida pelo agente de fermentacao. A sacarose € a repre- sentante mais importante dos componentes da cana-de-agiicar e dos melacos. O processo de alcoclizagio é facil, nao exige conhecimentos profundos e a matéria- prima que se usa nas industrias nem sempre é pura. As matérias amildceas e feculentas fermentam.apés uma hidrélise, que se denomina de sacarificag4o, pela qual o amido infermentescivel se transforma em agicar fermentescivel. A alcoolizagao processa-se através de técnicas industriais mais complexas, em alguns casos, & semelhanca de trabalhos de laboratério. Pela necessidade de maiores conhecimentos, pelas dificuldades de conservagao e deaa TTT =Melagos 4 Produste de etanol fermentacSo da matéria-prima original e pelo custo de fabricacao, os Alcoois de cereais produzem-se no Brasil em pequena escala, com maior importancia para a industria de bebidas. - Amassa de matérias celulésicas disponivel é vultosa, mas ainda nao oferece, para 0 Pais, condigées econdmicas para a produgao de etanol. O processo de hidré- lise, necessario para sacarificar a celulose é complexo, ¢ 0 teor de agucares fermen- tesciveis obtenivel é inferior ao encontrado nas matérias-primas sacarinas. Para o Brasil as matérias-primas, de importAncia econémica imediata para a producao de etanol industrial, sio os melacos ea cana-de-agucar; para a preparagao de bebidas destiladas, a cana-de-aguicar e as matérias amildceas, com destaque para o milho. A mandioca é matéria feculenta potencial. |.3.1 — Composigao das matérias-primas A composicao de qualquer produto vegetal varia com grande numero de fatores, uns control4veis pelo homem, outros nao. Entre eles destacam-se: a variedade, a idade, as regides ¢ as condigGes climéticas e edaficas, de matura¢ao, de sanidade, de colheita, de transporte, de armazenamento e de industrializacao. Esses fatores também afetam a composicao das matérias-primas derivadas da industrializacZo dos vegetais. As composi¢ées que se seguem, ilustrativas, referem-se principalmente ao material suscetivel de transformacao em etanol. Os outros componentes, como sais minerais, gomas, fibras, pectinas e outros, encontram-se facilmente em obras especificas sobre a matéria-prima ou exclusivamente sobre produgao de etanol. Denominam-se melacos 0s residuos da fabricagao de agdcar que nao sao mais utilizados para a separacao da sacarose. Eles se originam nas usinas de agucar, pela centrifugacao das massas cozidas para a separagao dos cristais de agucar. No Brasil, afora uma pequena percentagem oriunda da fabricacao de agdcar demerara para exporta¢io, os melagos provém da fabricagio de agiicar cristal branco, para consumo direto, apés processo de industrializago, no qual clarifica-se o caldo de cana-de-acticar com sulfitagdo seguida de calagem. Conforme o tipo de processamenté ‘do acucar, pode-se ter melago de primeira, mel pobre de primeiza, melaco de segunda, mel rico de segunda ¢ mel final, também chamado de mel residual ou esgotado. No Brasil, todos os méis que se enviam para a destilaria, qualquer que seja sua composicao, denominam-se de mel final. Sua composi¢ao varia de acordo com 0 processo de produgdo do agiicar; entretanto, pode-se admitix que encerra, em mumeros gerais, até 62% de agticares, 20% de Agua, 8% de cinzas, 3% de matérias nitrogenadas e 7% de outros, como gomas ¢ écidos. Na fracao agicares distinguem- se 32% de sacarose, 14% de dextrose e 16% de levulose. De maneira geral, nao se fem “ah that ness recat dit sei een real aoa eecasie—arscede ante —mauiraiace bad al ets bated PNM ears r Matérias-primas, composicio @ conservagdo 5 jncorre em erro afirmar que 0 melago encerra 50% de acticares fermentesciveis. Quanto mais agticar se obtiver das massas cozidas, menos sacarose se encontra no _ mel final. Estese obtém em proporgées varidveis, segundo 0 processo de fabricacao, excesso de cana-de-agticar e outros fatores. Admite-se comumente a produgao de 25 a 40 litros por tonelada de cana consumida na industria, mas esta proporcdo pode atingir 50—60 litros, por efeito de fendmenos de estiagem, geadas e outros. «(3.1.2 — Cana-de-agdcar O agticar predominante € a sacarose. Os agticares redutores compéem-se primordialmente de glicose ¢ frutose. Esses acuicares se encontram em proporcées quase iguais nas canas imperfeitamente maduras. A medida que avanga o amadu- recimento, seus teores diminuem, podendo nao ser detectados nas canas perfei- tamente maduras. O teor de frutose diminui primeiro, até desaparecer. Por influéncia dos fatores que influem na composi¢ao da matéria-prima, a cana-de-agucar pode conter: 74,5% de agua, 14% de acucares (12,5 de sacarose, 0,9 de dextrose e 0,6 de frutose) 10% de fibras e o restante dividido entre matérias minerais, compostos nitrogenados, ceras, pectinas e dcidos. O caldo obtido pela moagem da cana-de-agticar encerra entre 78 e 86% de Agua, 10 e 20% de sacarose, 0,1 e 2% de agticares ruts, 0,3 e 0,5% de cinzas e entre 0,5 € 1,0 % de compostos nitrogenados. O pH do ci do varia entre 5,2 e 6,8. A cana-de-acticar 6 uma cultura plurianual, com colheita anual. De maneira geral, ela é economicamente produtiva por trés anos consecutivos. Dependendo da regio e dos cuidados agriculturais, esse perfodo pode ser estendido. Admite-se que a média do rendimento agricola atinge entre 85e 100 toneladas por hectare por ano, em grandes cuituras eem condigdes normais. Atonelagem da primeira colheita éa maior e decresce anualmente, até a reforma do canavial. A proporcao de caldo produzido pela moagern varia de 50a 100% do peso da cana, isto é, uma tonelada produz de 500 a 1.000 litros de'caldo; comumente admite- se a média de 850 litros. A extracéo em caldo depende do preparo da cana para moagem, ntimero de esmagamentos e porcentagem de embebicao usada. Primor- dialmente depende do processamento, se para produzir agicar ou alcool, e do custo do balango térmico. A embebigao extrai mais sacarose, mas dilui o caldo normal, aumenta 0 volume em operagao e, em conseqiiéncia, aumenta o gasto de vapor. 13.1.3 - Milho Omilho limpo, ventilado, em condigoes de armazenamento, apresenta-se com 9 a 15% de Agua, 59 a 70% de extrativos-ndo-nitrogenados, 5 a 15% de material protéico, 1,5 a 8,5% de material celuldsicoe 1,3 a 4% de cinzas. A produgao no Brasil é varidvel, de 1,1 a 3 toneladas de graos por hectare, mas pelas campanhas de produtividade incentivadas, ha registros de mais de 7 toneladas por hectare.6 ____Procusdo de etanol 1.3.1.4 - Milho sacarino Durante a vigéncia do programa de incentivo & produgio de Alcool, no Brasil, apés 0 ano de 1979, pensou-se em utilizar como matéria-prima uma variedade de milho com reservas de agticares em seu colmo. O teor de s6lidos totais do caldo do colmo chega a 18° Brix, coma presenca de aqicares, sobretudo de sacarose. Areducao do estimulo oficial a produgao de etanol paralisou o interesse por maiores estudos dessa matéria-prima. 1.3.1.5 - Sorgo sacarino Dentre as variedades de sorgo, algumas apresentam um caldo agucarado em seu colmo, com teores de agacares semelhantes ao da cana-de-acicar. Também, durante a vigéncia do programa de incentivo a produgio de Alcool, cogitou-se da utilizagaio do sorgo como matéria-prima para a industrializacao do 4lcool. Alguns experimentos foram levados a efeito e algumas microdestilarias o usaram. Nio s6 possui um alto teor de agucares fermentesciveis, como produz alta tonelagem de colmos por hectare, em um periodo agricola inferior ao da cana-de-agucar. Entretanto, o periodo de colheita € mais curto também, conduzindo a problemas de utilizacao industrial. A reducio do estimulo oficial A producdo de etanol também reduziu o interesse por mais estudos dessa matéria-prima. 1.3.1.6 — Mandioca As raizes frescas contém de 67 a 75% de agua, de 18 a 23% de fécula e 0 restante distribuido entre material protéico, celulose, graxas € cinzas. Encontram- se variedades melhoradas, que acusam teores de amido superiores a 30%. Durante a vigéncia do programa de incenfivo a producao de alcool procurou- se estimular a utilizagao da mandioca como matéria-prima paraa industrializagao do alcool e algumas destilarias chegaram a ser instaladas. O volume de 4lcool produzido por uma tonelada de mandioca é superior ao produzido por uma tonelada de cana-de-acuicar, porém a produtividade agricola da mandioca nado compete com a da cana-de-agiicar. Outros fatores, como a maior dificuldade de preparagao dos mostos, e a falta de residuo combustivel, desaconselharam seu uso. (3.1.7 — Residuos celuldsicos A disponibilidade de residuos celulésicos, representada por palhas, folhas, res{duos de exploracéo madeireira e outros, despertaram 0 interesse para seu uso como matéria-prima para producio de Alcool. Entretanto, fatores como dificuldade da preparagao do mosto, presenga de elementos t6xicos nos substratos hidrolisados de celulose, capazes de dificultar a fermentagao alcoélica, somados ao baixo rendimento em acticares fermentesciveis (2 a 3%) e a alto volume de residuos da destilacao, reduzem, no Brasil, as possibilidades de seu emprego para a producao de etanol. ane i E ue eaten bmotbanet tetera ater stents serarersaantte cn entra ferecennenitehrte Preparagdo dos meios, 7 1.3.1.8 - Outras matérias-primas A literatura é rica em informagées sobre matérias-primas adequadas para -producao de. etanol. Arroz, centeio, cevada, milheto, trigo, batata, batata doce e tupinambo podem produzir alcool, mas ainda nao tém importancia econémica no Brasil. A cevada eo arroz sdo usados em cervejarias. Abatata-doce foi experimentada durante a vigéncia do Prodlcool. 1.3.2. Conservagio da matéria-prima Na industria faz-se um aprovisionamento de matéria-prima para urn periodo de operagées mais ou menos longo, em depésitos proximos 4 destilaria. O melaco conserva-se em reservatorios fechados de chapas de ferro, com capacidade compa- tivel com a produgio da destilaria. O volume aproximado de armazenamento de melaco cakcula-se pela formula V=TCD-MTC-FS, (1) em que V é0 volume, em litros; TCD as toneladas de cana moidas por dia; MTC o volume de melaco em litros, produzido por tonelada de cana, varia ebefitre 30 ¢ 40; e FS 0 fator de seguranca, representado por 30 dias de produgaéno minimo. Deve-se colher e moer a cana-de-aguicar 0 mais rapido possivel, sendo ideal cortar e moer no mesmo dia. Admitem-se até trés dias de conservacao para canas colhidas sem queimar, As que sao queimadas antes de colher, para eliminar a palha, tém periodo de conservagao mais curto. Quanto mais dilatado for o tempo entre corte e moagem, maiores s40 os riscos de deterioracio fisica, quimica, enzimatica ou microbiana, que prejudicam a fermentagao futura do caldo, rendimento e qualidade do produto. Recomenda-se a moagem da cana colhida crua e picada em no maximo 10 dias. © milho pode-se conservar por longo periodo, para utilizar durante todo o ano. A produgao agricola restringe-se a um perfodo, mas as industrias trabalham por muitos meses, até todo 0 ano. Consegue-se a conservacao do cereal pelo controle das condigGes sanitarias e das condicées climaticas. As primeiras relacionam-se com presen¢a de insetos € microrganismos, que se combatem por substancias que afugentam os insetos, que osmatam, eas que matam os esporos de fungos. Os fatores climaticos controlam-se por dessecagaio até a umidade mdxima de 15%. O armazenamento faz-se em silos de diversos tipos, que permitem o controle da umidade e da temperatura. 1.4 - Preparacao dos meios As matérias-primas adequadas 8 fabricaga0 do etanol, fornecem amido, glicose e mistura de sacarose, glicose e frutose. No Brasil produz-se pequena porgao de Alcool de milho, para bebidas e minima quantidade de Alcool vinico. A quase \ -8 Produsiodeetanal totalidade do 4lcool industrial produz-se com cana-de-aguicar e melago, que contém predominancia de sacarose em mistura com dextrose € levulose. Os mostos, ou seja, os substratos agucarados que se obtém dessas matérias- primas, requerem preparacao prévia adequada, de acordo com suas caracteristicas, antes de passarem aos recipientes de fermentagao, ou dornas. O preparo dos mostos nas destilarias faz-se em dependéncias que contam com tanques de medigao, balangas, diluidores mecanicos, depésitos de sais minerais e de antissépticos, aquecedores ou resfriadores, medidores de acido e outros acessérios. 1.4.1 — Preparo dos mostos de melago Obtém-se pela diluicgo conveniente com Agua. Normalmente nao se faz diluigao com vinhaca, recomendada para alguns tipos de rum. A diluigdo faz-se de modo continuo, em misturadores especiais, com freqiiente supervisao para garantir as concentragées adequadas; os melagos tém ar ocluso, temperaturas diferentes € viscosidade varidvel ao longo dos dias de producao, que dificultam seu escoamento uniforme, fundamental para o bom funcionamento dos diluidores. As concentragdes dos mostos, nas destilarias brasileiras, sio comumente expressas em graus Brix, diluindo-se os melagos entre 15 e 25° Brix, com médias de 18 a 20° Brix. Mostos muito diluidos fermentam mais rapidamente e sujam menos os aparelhos de destilacao, mas exigem maior volume ttil de fermentadores, mais ___espaco para eles, mais consumo de vapor, mais 4gua para diluicdo, exigem um periodo maior de safra e favorecem as infecgdes, além de outros inconvenientes. Por outro lado, os muito concentrados ocasionam maiores perdas em agticares infermentados, temperaturas mais altas durante a fermentagao, sujam mais os aparelhos de destilagdo, e outros inconvenientes, ao lado das vantagens de diminufrem o volume titil de dornas, o consumo de vapor e o periodo de safra. 1.4.2 — Preparo de mostos de caldo de cana-de-acucar Ocaldo que se obtém do esmagamento das canas nas moendas, misturado com agua de embebico, ou obtido em difusores é rico em sacarose e em agucares redutores e esté convenientemente diluido para sofrer a fermentagao alcodlica. Eventualmente pode-se diluir mais. Embora se possa fazer a fermentago com 0 caldo bruto, é pratica comum clarificd-lo por meio de aquecimento, decantagao e filtragdo para separar coldides, gomas € materiais nitrogenados. O caldo torna-se um mosto mais limpo, que fermenta melhor, espuma menos e suja menos as colunas de destilacao. Apés a clarificagao resfria-se 0 caldo e envia-se as domas. 1.4.3 - Preparacdo dos mostos de materiais amilaceos Preparagdc dos meios 9 £necessario sacarificar os amilaceos (gros) e feculentos (raizes e tubérculos), Pp que os agentes de fermentacao alcoélica nao possuem enzimas amiloliticas. A sacarificacdo € o processo de transformagao do amido ou fécula em aguicares fermen- tesciveis. Realiza-se por via quimica, biolégica ou por ag&o direta de enzimas, mas as destilarias comumente usam a via biol6gica. A sacarificagdo faz-se por aco enzimiatica do malte ou pela acdo microbiana de certos fungos no processo Amilo. 1.4.3.1 —Sacarificagao pelo mate Preparo do malte Malte 6 um cereal germinado em condigoes especiais de umidade, temperatura e aeracao. Durante a germinacéo ocorrem modificacées fisicas, bioquimicas e quimicas no cereal, causadas por fenémenos vitais. Caracterizam-se, respectiva- mente, pela germinacao do embrido, secregao de enzimas e transformacées que elas ocasionam, tais como a solubilizago do amido, difusao, absorgao e dissolugado das substancias solubilizadas. Nas cervejarias e fabricas de ufsque prepara-se 0 malte com cevada. Nas destilarias de dlcool usa-se malte do proprio milho. A maltagem, embora seja uma operagao complexa, esquematiza-se como segue. a) Limpezae classificagao dos graos em peneiras, ventiladores, aparelhos magnéticos e classificadores. b) Maceracio, para propiciar adequadas condigées de umidade. Procede-se em cubas préprias, com Agua limpa a 10—12°C, na proporcéo de uma parte de eros para trés de Agua, renovando-se o liquido a cada 8—12 he promovendo-se o arejamento da cuba a cada renovagao de agua, para ativar a respiragdo dos graos e acelerar a germinacdo. A maceracdo a baixa temperatura é mais lenta, mas conduz a.uma germinagao mais homogénea; a operacao finda-se quando os graos tiverem. absorvido 4gua correspondente a 40—50% de seu peso, o que se dd em 40—60h paza a cevada e 60-—70 h para o milho. c) Germinacdo, que é a operagao final, na qual controlam-se permanentemente 0 fornecimento de ar, a umidade e a temperatura, de 15°C, aproximadamente. Du- rante essa etapa ativa-se uma série de enzimas, das quais a amilofosfatase, aamilo- pectinase, a a-amilase e a f-amilase desempenham papel importante na sacarifi- cago. A maltase é outra enzima que desdobra a maltose formadaem duas moléculas de glicose. A germinacdo industrial faz-se em sal6es pr6prios ou em. germinadores, nos quais faz-se uma periédica movimentacao do cereal, para evitar acimulo de diéxido de carbono, elevacao de temperatura e dessecacao dos graos. Interrompe-se a germinacéo quando as gémulas atingem dimensao de 3/4 do comprimento do grao, momento que coincide com o maximo poder ‘sacarificante.10 Producto de etanal Daj parte-se para a preparacao do leite de malte ou para a secagem do material maltado em secadores especiais, para sua conservagao prolongada. O malte verde tem maior poder sacarificante, mas conserva-se mais dificilmenie, Sacarificagao Para que se possa fazer reagir as enzimas sobre o material amildceo, é necessdrio que este se encontre sob forma de goma, ou como se costuma dizer, geleificado. Para isso os graos passam por uma série de operages que inicia por, uma pesagem e prossegue com moagem, hidratacao e cozimento. Do armazenamento encaminha-se a matéria-prima para moinhos, onde é fragmentada em pedacos de 3-4 mm, evitando-se um maior fracionamento para nao dificultar a operacao posterior de cozimento. A seguir, faz-se a hidratacao com agua acidulada de pH 4,5—5,0, a 55—65°C, até a absorcao de 40-50%, o que se consegue em 13—15 h. Passa-se o maierial hidratado para os cozedores, onde se procede ao maximo de desagregacao do produto, na forma coloidal de goma. Para facilitar a solubilizagio das matérias protéicas e 0 cozimento do amido ou da fécula, opera-se sob pressdo de 3 atm, aproximadamente, e em presenca de solugéo de Acido cloridrico de pH 5,5, com adigao de 200—300 litros de agua por 100 kg de graos hidratados. O tempo de cozimento, assim como a pressdo e a temperatura, varia de acordo com a natureza do amido, podendo-se estabelecer 3 h como parametro indicativo. Apés a obtencdo da goma esté-se em condigées de proceder a sacarificacao, colocando-a em contato com o malte. Pela agdo das enzimas amilolfticas dos graos germinados produz-se maltose, dissacarideo diretamente fermentescfvel e dextrinas, ___._--_ndio fermentesciveis.Axelagao-maltose-dextrinas varia porinfluéncia da concentra- co de amido no produto que se deseja sacarificar, concentracao de enzimas sacarifi- cantes, duracao da aco enzimatica, reacao do meio e temperatura. Os trés primeiros fatores sao econ6mico-limitantes. A reacao do meio favordvel é pH 5,5—5,7 e a temperatura mais conveniente para a obtengao de maior percentagem de maltose situa-se entre 40 e 60°C. Apés o cozimento resfria-se a massa, adicionam-se de 7 a 15% de leite de malte e mantém-se o conjunio sob agitagaéo e temperatura constantes por 1h, aproximadamente. Eleva-se a temperatura lentamente para 65°C, resfria-se para 28—-30°C, efetua-se a corregdo do mosto ¢ envia-se as dornas para fermentar. 1.4.3.2- Sacarificacao por agao microbiana ‘Usam-se nesse proceso fungos com propriedades amiloliticas. Por meio deles, com técnica e assepsia apuradas, transforma-se economicamente o amido em aguicares fermentesciveis. As espécies que mais se usam sao Amylomyces rouxti, As- pergillus oryzae, Chlamydomucor oryzae, Rhizopus japonicus e Mucor delemar. Comumente se associa 0 fungo com uma levedura que realize a fermentacao alcodlica dos agticares, de preferéncia leveduras puras e selecionadas. | | | | Fermentacio akcoatica «IL Preparo do inéculo ---—— Prepara-se um meio com 20 g de material amildceo em | litro de dgua, toclava-se_a 2 atm por 20 min, resfria-se e inocula-se com uma suspensdo de esporos. Incuba-se por 3-4 dias a 35—38°C, obtendo-se um inéculo para 100 mil litros de mosto. Preparo do mosto Prepara-se uma goma de amido de maneira semelhante 4 que se descreveu e descarrega-se a massa fluida para a autoclave intermediaria, onde se adiciona 4gua até obter-se densidade de 1,06 a 1,08. Esteriliza-se e passa-se as dornas de capacidade. varidvel, providas de agitagdo mecAnica, injegdo de 4gua, ar estéril e vapor, termémetros, mandmetros, sistema de refrigeracdo, funil de inocula¢ao, purgador de diéxido de carbono e outros acessérios. Refrigera-se o mosto e inocula-se com o fango. Apés 24 h de agitacao e injegao de ar, o fungo desenvolveu-se perfeitamente eo mosto estard sacarificado, tendo o amido se transformado em maltose e glicose. Ento, faz-se a inoculacao da levedura & temperatura de 30—-32°C. Apés 40 h da inoculacao do fungo, tem-se um substrato com 9 a 12% de agdcares, que se desdobram pela aco da levedura em um tempo total de 72 a 96 h. Apés a fermentagao, separa-se o 4lcool em colunas de destilagdo especiais, pois o substrato fermentado € muito espesso. 1.5 - Fermentacao alcodlica 1.5.1 — Breve histérico O homem vem se utilizando da fermentagao alcodlica desde a mais remota antigitidade; ha mais de 4.000 anos os egipcios fabricavam o p4o e produziam bebidas alcodlicas a partir de cereais e frutas. Entretanto, apenas recentemente é que se péde relacionar a fermentagao com a levedura, funge amplamente distribuide na natureza e com capacidade de sobrevivéncia tanto em condigGes aerGbias como anaerObias. “ Assim, a humanidade por longo periodo se beneficiou desse organismo, mesmo sem saber de sua existéncia, notada pela primeira vez por Antonie van Leewenhoek (1623-1723), ao observar amostra de cerveja em fermentagdo, com seu microscépio rudimentar. Depois da formulagao da estequiometria da fermentagdo por Gay-Lussac (1815), Pasteur (1863) demonstrou a natureza microbiolégica da fermentagao alcoélica como um processo anaerébio, ou seja, a vida se manifestando na auséncia de ar (oxigénio). A partir dai, e principalmente durante as primeiras décadas de 1900, as pesquisas culminaram com a elucidacao das reacGes enzimaticas responsa- teispela transforma¢ao quimica do agicar em etanole gas carbénico no interior da levedura.12 Procure de et Devido & importancia econ6mica dos processos biotecnoldgicos envolvendo. alevedura Saccharomyces, quer na panificagao, na produgao de cerveja, vinhoe outras bebidas alcoélicas, quer, como no caso do Brasil, na produgao de um combustivel alternativo e renovavel, tal organismo pode ser considerado 0 eucaridtico (célula ~ com nucleo organizado e processos metabdlicos compartimentalizados) mais estudado e cujo metabolismo € o mais conhecido. Mesmo assim 0 homem ainda se maravilha com as recentes descobertas sobre os mecanismos de regulacdo metabélica, em leveduras. 1.5.2 —© metabolismo no interior da célula A transformacao do agucar (glicose) em etanol e COz, envolve 12 reagdes em seqiiéncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especifica. Tal aparato enziméatico est4 confinado no citoplasma celular, sendo portanto nessa regiao da célula que a fermentacao alcodlica se processa (Big. 1.1). Essas enzimas, referidas como “glicoliticas”, sofrem ages de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores, subst4ncias do proprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que estimulam e outros que reprimem a agao enzimética, afetando o desempenho do processo fermentativo conduzido pela leveduras. Convém ressaltar que a levedura Saccharomyces € um aerdbio facultativo, ou seja, tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tantoem condicées de aerobiose como de anaerobiose (auséncia de oxigénio molecular). Os produtos finais da metabolizagao do acticar irao depender das condicdes ambientais em que a levedura se encontra. Assim, enquanto uma porcio do agicar é transformado em biomassa, CO, eH,0 em aerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO, em anaerobiose, processo denominado de fermentacio alcodlica. Os carboidratos considerados —-—-—substrates-para-a-fermentacao; tanto odem-ser-endégenos (constituintes da P ge levedura, como glicogénio e trealose) como exdgenos (sacarose, glicose, frutose e outros), estes tiltimos fornecidos a levedura. O objetivo primordial da levedura, ao metabolizat anaerobicamente 0 agticar, é gerar uma forma de energia (ATF, adenosina trifosfato) que ser empregada na realizacdo dos diversos trabalhos fisiolégicos (absor¢ao, excrecdo e outros) e biossinteses, necessdrios & manutenciio da vida, crescimento e multiplicagao, para perpetuar a espécielO etanol e 0 CO, resultantes se constituem, tao somente, de produtos de excrecdo, sem utilidade metabélica para a célula em anaerobiose. Entretanto, o etanol, bem como outros produtos de excregao (come o glicerole dcidos organicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condigdes de aerobiose. |.5.3 — Produtos secundarios da fermentagdo Na seqiiéncia de reagGes enzimaticas de produgao de ATP, e intrinsecas formacdo de etanol, rotas metab6licas alternativas aparecem para propiciar a formag&o de materiais necessdrios a constituigao da biomassa (polissacarideos, 13 _ Fermencacio acostca a Fermentagao alcodlica ———}-" CH;OH-CH,OH CH,OH Etanoi i CH,OH +H,PO, Glicogénio a H, fosforilase NAD* ° AMP(4) desidrogenase | NADH+H* CH,OH CH,OK ‘CH,OH GHO + CO. CC . oO CR, 2 » = Vo. descarboxilase Maltose piruvica, Mg | fosfoglicomutase, Mg'* maltase COOH cH, [P CH,OH re 3 ADP are i . CH —_[ii quinase hexoquinase, Mg* © Ywoalase + ealose Pirdvica kk ar Ke, Mgr ADP | fosfoisomerase Goon ce cH,-[P CH,OH ul | Me CH,oH ADP ATP To oH CH, , “ CH,OH Sacaroge] enolase hexoquinase, Mg” invertase Ms | ATP fosfofrutoquinase, Mg GOOH appx AMP Os) ATP(-) Citrato(-) +c-[P - cH, [PF CH,OH % CH[P fostogliceromutase, Mg | [aldolase CHeOH cHO NAD* NADH+H* 500, P ‘ADP ATP COOH 5 a I C-0 === CHOH + Pi CHOH = CHOH T isomerase [ desidrogenase | fosfoglice- CH, {P CH, [P| cH,[P] auinase CH,-[P i NADH+He IAD+ desidrogenase GH.OH CH,OH _Mgn CHOW isiatasd (HOM + PI cH, CH,OH OP Gliceral ) Figura 1.1 — Seqircia das reagSes enzimiticas pela fermentagio aleodlca de carbsidratos endégenos (glcogénian e trealose) ou exdgenos (sacarose ¢ maltose), conduzida por Saccharomyces.