VETERINARIA

Deteco de patgenos no smen

de distribuio de smen congelado, e pela capacidade que possui um touro para produzir at 1000 doses deste material a partir de uma nica ejaculao. Atualmente, as enfermidades vricas transmitidas via smen, como a Rinotraquete Infecciosa Bovina (IBR) e a Diarria Bovina a Vrus (BVD), tm despertado um

Nivaldo da Silva Doutor em Veterinria pela Universidad Complutense de Madrid - Espanha Prof. Adjunto do Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Minas Gerais Email: nivsilva@dedadlus.lcc.ufmg.br

Deteco de agentes patognicos em smen bovinos destinado a inseminao artificial

utilizao da inseminao artificial (I.A.) tornou possvel o intercmbio de material gentico de melhor qualidade, e atravs dessa tecnologia, uma melhora da produo de leite e carne, tanto a nvel nacional como internacional. As possibilidades da contaminao do smen por agentes patognicos (Fig. 1) e sua possvel disseminao atravs do mesmo, entretanto, se converteram em uma das principais preocupaes para criadores e autoridades sanitrias dos pases onde se emprega essa tecnologia (Afshar & Eaglesome, 1990). A tudo isso se deve, tambm, acrescentar o risco que supe o uso do smen infectado nos processos de transferncia de embries (Bielanski & Dubuc, 1994). Este alarma crescente est relacionado s implicaes epizootiolgicas da presena de vrus no smen, implicaes essas que no s se centram na infeco exclusiva da fmea receptora, ou do coletivo da explorao pecuria, como tambm na possvel introduo de viroses exticas no pas importador. Esse risco potencial de transmisso, gera uma grande preocupao sobre o intercmbio nacional e internacional deste material gentico, e em especial, sobre os mtodos de deteco dos possveis vrus vinculados atravs do smen ou dos embries, obrigando quase todos os pases a implantarem rigorosos programas sanitrios voltados para o controle das importaes. A origem dos vrus no smen pode ser extrnseca, devido a contaminao fecal do smen no momento da coleta (por exemplo, os enterovrus) ou intrnseca, devido as infeces locais ou sistmicas com a disseminao dos vrus atravs dos testculos, glndulas acessrias ou prepcio. Dessa maneira, o smen um excelente veculo para a difuso de agentes patognicos e de defeitos genticos, principalmente pela gran28 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

grande interesse nas autoridades sanitrias mundiais, principalmente por que nesses processos infecciosos os sinais clnicos so raramente evidentes, sendo de grande importncia a deteco desses vrus no smen (Philpott, 1993). Uma vez que a congelao do smen possibilita a sobrevivncia da maioria dos agentes patognicos, e o uso dos crioprotetores diminue a eficcia dos antibiticos, se faz necessrio normas oficiais para regulamentar a produo e o comrcio de material gentico livre de agentes infecciosos (Afshar & Eaglesome, 1990). Desta maneira, a Oficina Internacional de Epizootias (OIE) definiu suas diretrizes no ano de 1986. Nos Estados Unidos da Amrica (EEUU) essas normas foram padronizadas em 1989, sob controle da Associao Nacional de Repro-

duo Animal (NAAB) (Philpott, 1993) e, recentemente, a Unio Europia (EU) atravs da diretiva 93/60/EEC estabeleceu suas normas de controle. Essas exigncias esto baseadas na transmisso dessas viroses atravs do smen infectado. Por esses motivos, recomendam um rigoroso controle sanitrio sobre os touros mantidos nos centros de I.A., exigindo provas de isolamento de agentes infecciosos, ou provas sorolgicas de todos os animais com idades superiores aos seis meses. Pases do MERCOSUL esto, ainda, estudando normas para o comrcio de smen entre seus integrantes. Apesar dessas medidas, o perigo da transmisso de vrus via smen segue vigente, como consequncia da existncia nos centros de I.A. de animais clinicamente sadios ou sorologicamente negativos, porm que esto latentemente infectados pelo herpes vrus bovino tipo 1 (BHV-1) causador da IBR ou persistentemente infectados pelo vrus da BVD. Por outro lado, e especificamente no caso da IBR, ainda existe uma reconhecida demanda por smen de touros de aprecivel valor gentico e que apresentam sorologia positiva frente a este vrus. Isso obriga a um contnuo monitoramento dos seus ejaculados para a deteco do vrus e, assim, evitar o risco de transmisso por essa via. Segundo Afshar & Eaglesome (1990), os vrus da IBR e BVD esto presentes em quase todos os centros de I.A. dos EEUU e Canad, de onde provm a maioria do smen importado pelo Brasil. Por outro lado, e apesar de no dispor de muitas informaes sobre a incidncia dessas enfermidades nos pases sul americanos, pode-se considerar que pelo menos as infeces causadas

pelo BHV-1 esto presentes nesses pases, apesar de no serem rotineiramente diagnosticadas ou notificadas. Nesse sentido, no Brasil esto registrados casos de Balanopostites em touros com eliminao de vrus no smen, assim como a presena de anticorpos em doadoras e receptoras de embries. Em pases do Mercosul, o vrus da IBR est amplamente disseminado, sendo detectado em amostras de smen congelado na Argentina. O xito dos programas de controle das doenas infecciosas depende, em boa medida, da identificao e eliminao de animais infectados e ou portadores. Usualmente nesses animais, o controle feito atravs do isolamento de microrganismos em meios de cultura, cultivos celulares, inoculao em animais susceptveis ou, ento, pela deteco indireta atravs de tcnicas sorolgicas, como a soroneutralizao, fixao de complemento, imunofluorescncia indireta, hemaglutinao, imunodifuso, etc. A maioria destas tcnicas, entretanto, apresentam limitaes principalmente de ordem prtica, resultantes da sua complexidade, da infra-estrutura necessria sua realizao, ou da lentido dos procedimentos laboratoriais necessrios para a deteco e caracterizao dos agentes patognicos. Por outro lado, existem, tambm, limitaes de sensibilidade e especificidade. Por estes motivos, nos ltimos anos tm-se intensificado a busca por tcnicas de maior rapidez, preciso e confiana, que possibilitem o diagnstico das doenas infecciosas com um grau de sensibilidade e especificidade similar ou superior aos procedimentos convencionais, e cujos resultados sejam dados no mesmo dia (Rodriguez & Schudel, 1993). Desta maneira, tcnicas simples e de fcil execuo para a caracterizao de protenas e cidos nuclicos, como as imunoenzimticas - ELISA (Enzyme-linked immunoabsorvent assay) e Immmunobloting, ou as amplificaes "in vitro" de cidos nuclicos atravs da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), so recomendadas para substituir os mtodos convencionais de diagnstico de vrias doenas. Utilizao da tcnica de PCR para deteco de agentes patognicos no smen A amplificao "in vitro" dos cidos nuclicos (PCR) permite a obteno de milhares de cpias de uma sequncia especfica de DNA. Por isso, a PCR tem facilitado o desenvolvimento de uma variedade de sistemas, baseados na deteco de cidos nuclicos de bactrias, vrus, e outros microrganismos, bem como de alteraes genticas. Devido a

sua alta sensibilidade, especificidade e rapidez, a PCR oferece muitas vantagens sobre os mtodos convencionais de diagnstico, porque est baseada na am-

plificao especifica de um fragmento de cido nuclico, compreendido entre dois oligonucleotidos sintticos complementares (primers), respectivamente, a cada uma das duas fitas de DNA a ser amplificada. O tamanho deste fragmento definido pela distncia entre a posio de anilamento dos primers (iniciador e reverso) dentro da sequncia genmica. A PCR realizada em repetidos ciclos, cada um consistindo de trs etapas com diferentes temperaturas. Na primeira etapa, a dupla fita de DNA desnaturada a alta temperatura, resultando em uma molcula simples de DNA (DNA molde). Em seguida os primers (iniciador e reverso) se unem s suas sequncias homlogas e complementares nas regies correspondentes ("target") da molcula do DNA

molde (anilamento). Na terceira fase, a regio 3' de cada um dos primers estendida nos dois sentidos pela ao enzimtica da enzima termoestvel Taq polimerase (alongamento), formando uma nova molcula de DNA de dupla fita. As novas molculas de DNA, sintetizadas pelo processo, serviro de molde para a produo de outras cpias de DNA em outros ciclos da reao, resultando em uma amplificao exponencial (Silva, 1995). Apesar de sua simplicidade, a amplificao "in vitro" dos cidos nuclicos pode ser afetada por uma variedade de parmetros, entre eles, o desenho dos "primers", a existncia de reas de homologia na sequncia do DNA molde, as temperaturas de anilamento, concentrao de nucletidos, e principalmente pela presena de inibidores (protenas) (Erlich et al., 1989). A aplicao desta tcnica para a deteco de vrus RNA, feita mediante a sntese de uma molcula de DNA complementar (cDNA), atravs de uma reao de retrotranscripo, utilizandose a enzima transcriptase reversa (RT). Normalmente, o primer utilizado para iniciar esta sntese o mesmo que se utiliza para a amplificao especfica do DNA. Essa reao conhecida como RTPCR, e pode ser realizada no mesmo tubo de reao, evitando-se, assim, a possibilidade de contaminaes com outros DNAs por excesso de manipulaes. O produto de PCR (amplicon) pode ser detectado em gel de agarose, aps a tino com brometo de etidio. Seu tamanho comparado com pesos moleculares de referncia (DNA Ladder) e corresponde ao nmero de pares de bases (pb) de nucletidos distribudos ao longo da sequncia genmica do DNA molde. O amplicon tambm pode ser digerido por endonucleases de restrio, para confirmar se as reas do DNA amplificado correspondem aos stios de restrio dessas enzimas. A PCR em combinao com os fragmentos de diferentes tamanhos, obtidos pela digesto do DNA com enzimas de restrio (RFLP) , frequentemente, usada para classificar um grupo de microrganismos patognicos, ou definir a posio de diferentes alelos na deteco de doenas de carter hereditrio. A especificidade tambm pode ser definida atravs da tcnica de hibridao de Southern blot, na qual o produto da PCR transferido aps a eletroforese para uma membrana de nylon de carga eltrica positiva e hibridizado com uma sonda sinttica especfica, marcada com istopos radioativos ou no radioativos (Silva, 1995). Segundo Rodrguez & Schudell (1993), o emprego dessa tcnica de maior preciso e confiana, recomendada, principalmente, para o diagnstico de vrus em
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smen, e possibilita a deteco mais rpida dos vrus da IBR e BVD e de outros vrus, com menores custos e sobretudo com altas taxas de sensibilidade e especificidade (Reubel & Studdert, 1998). Apesar da ampla aplicabilidade das tcnicas de amplificao dos cidos nuclicos em smen, ela sofre algumas limitaes, devido presena de inibidores da polimerizao do DNA ou grande quantidade de protenas presentes nos diluentes usados para proteger os espermatozides, durante os processos de congelao. Assim, os processos descritos para a extrao dos cidos nuclicos de que j haviam sido sacrificados h vrios anos por apresentarem reaes sorolgicas positivas prova de ELISA (Silva et al., 1997). Falhas no isolamento do vrus da BVD podem ser atribudas aos efeitos viricidas do smen, aos baixos ttulos
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deste vrus no smen, entre 5 y 75 DI50CT/ ml, ou natural inibio da transcripo do vrus, como consequncia da presena no plasma seminal de bovinos de uma protena, a seminalplasmina. Essa ltima propriedade do plasma seminal afeta a deteco do vrus no smen quando se emprega a tcnica de RT-PCR, razo pela qual no se conhecem muitos trabalhos relacionados ao tema. Silva et al. (1995), entretanto, utilizando o procedimento de passar o plasma seminal pela coluna de Sephacryl S-400, previamente extrao do RNA viral pelo mtodo do tiosulfato de guanidina, conseguiram detectar atravs da RT-PCR, at 4 DI50 CT/ml de vrus da BVD, no smen infectado, tanto fresco como congelado. Esses autores amplificaram um fragmento de 440 pb visvel em gel de agarose a 2%, tingido com brometo de etdio, do gene da protena de infeco p80 desse vrus (Fig. 3). Essa tcnica apresentou

especificidade e sensibilidade maiores que aquelas apresentadas por outros mtodos convencionais de deteco de vrus em smen, sugerindo sua utilizao para o diagnstico dessa virose em smen fresco ou congelado, tanto nacionais como importados. Outros microrganismos foram tambm detectados em smen, a partir das tcnicas de amplificao dos cidos nuclicos. Masri et al. (1997), descreveram um rpido e especfico mtodo para deteco de Leptospiras spp a partir do smen bovino infectado. Esses autores amplificaram atravs de um nested-PCR, um fragmento de 450 pb do genoma da L e p t o s p i r a borgpetersenii serovar hardjobovis, detectando at 50 organismos/ml de smen infectado.Em outro estudo, Eaglesome et al. (1995), detectaram por PCR at 4 organismos/ml de smen infectado pelo Campylobacter fetus subsp venerealis. Na Tabela 1, encontram-se descritas as aplicaes PCR e RT-PCR, para o diagnstico de algumas das principais doenas infecciosas da reproduo de bovinos. A sensibilidade e especificidade destas tcnicas foram comparativamente maiores que as tcnicas convencionais de diagnstico. Os resultados demonstraram o potencial da PCR para a deteco rpida de microrganismos, ou mesmo para substituir conhecidos mtodos. Apesar desses aspectos amplamente favorveis, nos dias de hoje a aplicao da prova de PCR para deteco de agentes patognicos no smen e em outros materiais clnicos, est restrita a laboratrios bem equipados, dificultando, principalmente, sua ampla utilizao na prtica Veterinria. O que se espera, entretanto, que no futuro a tcnica da PCR possa ser utilizada por profissionais de campo, sob a forma de kits de diagnstico, como se faz hoje, por exemplo, com a tcnica de ELISA para o diagnstico da influenza equina ou para outras doenas.

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