Natural Infection and Vertical Transmission of Two Flaviviruses.

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bioRxiv preprint doi:https://doi.org/10.1101/688713; esta versão postada em 1º de julho de 2019. O detentor dos direitos autorais desta pré-impressão (que não foi
certificado por revisão por pares) é o autor/fundador, que concedeu à bioRxiv uma licença para exibir o preprint em perpetuidade. É disponibilizado
debaixo deLicença internacional CC-BY 4.0.
1 Infecção natural e transmissão vertical de dois flavivírus (febre amarela e
2 Zika) em mosquitos em florestas primárias no estado brasileiro do Rio de Janeiro
3 (Diptera: Culicidae)
5 Título curto: Infecção natural e transmissão vertical de dois flavivírus
7 Jerônimo Alencar1*, Cecília Ferreira de Mello1,2, Carlos Brisola Marcondes3,
8 António Érico Guimarães1, Helena Keiko Toma4, Amanda Queiroz Bastos1,2,
9 Shayenne Olsson Freitas Silva1,5, Sérgio Lisboa Machado4*
10
11 1Laboratório de Diptera, Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Av. Brasil 4365, CEP: 21040-360
12 Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil
13 2Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade
14 Federal Rural do Rio de Janeiro, CEP: 23890-000 Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil
15 3Departamento de Microbiologia Imunologia e Parasitologia, Centro de Ciências
16 Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-900, Florianópolis, Santa
17 Catarina, Brasil
18 4Laboratório de Diagnóstico Molecular e Hematologia, Universidade Federal do Rio de
19 Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
20 5Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz (Fiocruz), Rio de
21 Janeiro, Brasil
22
23 * Autores correspondentes
24 E-mail:jafalencar@gmail.com (JA)
25 E-mail:machadosl@globo.com (SLM)
1
26 Abstrato
27 Fundo:O vírus Zika (ZIKV) foi recentemente introduzido no continente americano,
28 provavelmente transmitido porAedes aegyptie possivelmente porAe. albopictuseCulex
29 quinquefasciatusem ambientes urbanos. O ZIKV representa um conhecido problema de saúde pública
30 problema, pois tem sido envolvido em casos de microcefalia congênita em recém-nascidos no Sul
31 América desde 2005. A transmissão deste vírus em áreas florestais de outros países
32 e sua relativa ubiquidade em relação a seus vetores e reservatórios levanta suspeitas de sua
33 adaptação a ambientes modificados não humanos (ou seja, reserva de florestas naturais) ou neste
34 continente, semelhantes aos observados para o vírus da febre amarela (YFV). O objetivo deste
35 trabalho foi ter uma ferramenta de monitoramento epidemiológico mapeando insetos, bem como
36 arbovírus circulantes em áreas silvestres com baixa interferência humana. Este estudo foi baseado
37 sobre a história do ciclo de disseminação do flavivírus do inseto.Métodos/Descobertas Principais:
38 Usando um ensaio baseado em PCR sensível descrito anteriormente para avaliar o NS5 conservado
39 região doFlavivírusgênero, tanto o genoma parcial do YFV quanto o ZIKV foram encontrados em pools
40 doAedes albopictus, um mosquito silvestre adaptado a ambientes modificados pelo homem, e
41 dentroHaemagogus leucocelaenus, um mosquito silvestre.Conclusões:Este é o primeiro relatório
42 de infecção natural por ZIKV em mosquitos em ambiente silvestre na América
43 continente. A ampla distribuição desses mosquitos é provavelmente importante no
44 transmissão do ZIKV. A transmissão vertical indica uma maior eficiência para o
45 manutenção e transmissão do vírus na natureza, bem como a presença do ZIKV
46 em caráter permanente nas áreas florestais como ocorre com o YFV tornando assim mais
47 dificulta a prevenção de novos casos de Zika em humanos.
48
49
50
2
51 Resumo do autor
52 Arboviroses são doenças transmitidas por vetores artrópodes, daí a origem do termo
53 ARthropod BOrne VIRUS, que é adotado desde 1942. Este trabalho teve como objetivo
54 pesquisar os insetos circulantes, bem como detectar a presença de vírus neles.
55 Arbovírus circulam entre insetos e hospedeiros vertebrados, tendo importância para
56 promovendo doenças em humanos e animais. As doenças mais conhecidas na época, por
57 os casos recentes relatados pela América do Sul, são Dengue, Zika, Febre Amarela e
58 Chikungunya. Para este estudo, utilizamos armadilhas apropriadas para coletar os insetos e suas
59 ovos em áreas selvagens onde há pouca interferência humana. Após a coleta, os mosquitos
60 e/ou ovos foram identificados e separados quanto à origem e espécie. Os ovos foram
61 mantidos em condições de laboratório para a eclosão de novos insetos. Todos os insetos obtidos
62 foram separados em pools para serem macerados e assim extrair o RNA dos vírus para
63 ser estudado. Utilizando técnicas de biologia molecular, no nosso caso o RT-PCR (Reverse
64 Reação em Cadeia da Polimerase Transcriptase), amplificamos o RNA e sequencialmente,
65 realizamos a reação de sequenciamento. Com o sequenciamento, é possível identificar quais
66 material de vírus está presente, uma vez que cada vírus tem um arranjo característico. Para o
67 identificação das sequências, precisamos usar alguns programas computacionais que
68 garantem-nos o resultado correcto.
69
70 Palavras-chave:Culicidae;Haemagogus leucocelaenus,Aedes albopictus,vírus Zika;
71 infecção natural; Febre amarela
72
73
74
75
3
76 Introdução
77 A família Flaviviridae possui quatro gêneros e oFlavivírusgênero contém mais de 90
78 vírus, alguns dos quais são de importância clínica para humanos e animais, como o
79 Vírus da febre amarela (YFV), vírus da dengue (DENV), vírus Zika (ZIKV) e vírus do Nilo Ocidental
80 vírus (WNV). Os flavivírus são vírus envelopados, icosaédricos e possuem um RNA
81 genoma composto por uma única cadeia de fita positiva de aproximadamente 11.000 nucleotídeos.
82 Seus genomas codificam três proteínas estruturais (capsídeo [C], envelope [E] e pré-
83 Membrana/membrana [prM/M]) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2a, NS2b,
84 NS3, NS4a, NS4b e NS5) que têm funções envolvidas na replicação, virulência e
85 patogenicidade [1].
86 O ZIKV, identificado pela primeira vez em uma floresta em Uganda, recentemente se espalhou para a Ásia, Pacífico
87 ilhas e o continente americano, causando séria preocupação com a microcefalia em
88 fetos [2-4]. Transmitida principalmente em ambientes urbanos porAedes aegyptie possivelmente
89 Aedes albopictus, foi encontrado em muitas espécies de mosquitos, principalmente emAedes
90 espécies (31 spp.), mas também em algunsAnopheles,Culexe outros gêneros, e mesmo em um
91 espécies de mosca de cavalo [2,5]. O primeiro caso autóctone de ZIKV no Brasil foi diagnosticado
92 em maio de 2015[6], e sua circulação foi confirmada em todos os 26 estados e distrito federal
93 [7].
94 Técnicas moleculares, assim como métodos imunológicos, têm sido usadas para
95 diagnosticar ZIKV em uma variedade de espécies de mamíferos pertencentes a nove ordens
96 (Artiodactila, Carnivora, Cetartiodactyla, Chiroptera, Lagomorpha, Perissodactyla,
97 Primatas, Proboscidea e Rodentia), três ordens de aves (Anseriformes,
98 Charadriiformes e Ciconiiformes) e lagartos Squamata [8], principalmente na África. No
99 continente americano, possivelmente devido à sua introdução recente e menor número de
100 estudos, só foi encontrado em macacos no estado do Ceará [9]. Alguns primatas e
4
101 Edentata são sorologicamente positivos paraFlavivírusno sul de
102 Estado da Bahia [10].
103 Embora os primatas não humanos (PNHs) sejam considerados de baixa importância, sua
104 circulação em ambientes florestais de baixa degradação, especialmente a fauna diversificada de
105 mosquitos e mamíferos encontrados no Brasil, precisa ser avaliada [8, 11].
106 Neste estudo, relatamos a infecção natural e transmissão vertical do ZIKV
107 e YFV emHaemagogus leucocelaenuseAe. albopictusem uma floresta em Casimiro de
108 Abreu e Nova Iguaçu, no estado brasileiro do Rio de Janeiro.
109 Atualmente, há um surto em andamento de febre amarela silvestre no Brasil. O
110 O surto provavelmente começou no final de 2016, quando o primeiro caso foi relatado na
111 estado de Minas Gerais, mas desde então se espalhou para os estados do Espírito Santo, São Paulo,
112 e Rio de Janeiro. De acordo com um relatório da OMS, em abril de 2017, a transmissão do YFV
113 (casos epizoóticos e humanos) continua a se expandir em direção à costa atlântica do Brasil em
114 áreas anteriormente não consideradas de risco para transmissão da febre amarela [12].
115 Os principais gêneros de mosquitos capazes de se infectar e transmitir o
116 YFV silvestre sãoHemagogoeSabethesque são considerados biológicos
117 vetores e ser responsável pela manutenção do ciclo natural desta zoonose em
118 florestas das Américas. No sudeste do Brasil, durante a atual epidemia,
119 Hg. leucocelaenuseHg. janthinomyssão considerados vetores importantes [13].
120 Hemagogosão mosquitos essencialmente silvestres, com acrodendrofilia diurna
121 habitats, e são encontrados principalmente em áreas densamente florestadas [14]. Hemagogo
122 leucocelaenusé a espécie mais encontrada no Brasil e é considerada
123 vetor para SYF no sudeste do Brasil. É amplamente distribuído de Trinidad ao sul
124 do Brasil, este Culicidae é comumente encontrado no Brasil e é considerado de
125 importância epidemiológica devido ao seu envolvimento na transmissão de arboviroses,
5
126 sendo a febre amarela uma das mais importantes. Um grupo de pesquisas [15] relatou
127 através do uso de sequências de identificação de PCR de transcriptase reversa hemi-nested
128 compatível com DENV-1 emHg. leucocelaenusde Coribe, cidade do nordeste
129 Bahia, sugerindo a ocorrência de um ciclo silvestre e destacando a importância da
130 estudos sobre esses mosquitos selvagens [16,17].
131
132 materiais e métodos
133 Declaração de ética
134 Toda a pesquisa foi realizada de acordo com a licença científica número 44333
135 fornecido por (Ministério do Meio Ambiente - MMA, Instituto Chico Mendes de Biodiversidade
136 Conservação - ICMBio, Sistema de Informação e Autorização da Biodiversidade – SISBIO).
137 Florestascoletas foram realizadas com consentimento informado e cooperação do
138 proprietários, proprietários ou autoridades locais.Todos os membros da equipe de coleta
139 foram adequadamente vacinados contra o YFV e estavam cientes dos riscos potenciais no
140 área em estudo.
141
142 Áreas de estudo
143 Os ovos deHg. leucocelaenuseAe. albopictusforam coletados com ovitrampas,
144 de setembro de 2018 a março de 2019. O presente estudo foi realizado em Três Montes
145 Fazenda (TMF), Reserva Particular do Patrimônio Natural Três Morros - TMPRNH, Casimiro
146 de Abreu) e Sítio Boa Esperança (Tinguá, município de Nova Iguaçu). Casimiro de Abreu
147 localizada no sudeste do Brasil, a aproximadamente 140 km da cidade do Rio de Janeiro
148 e Tinguá a aproximadamente 30 km do Rio de Janeiro. As amostras foram coletadas de
149 quatro locais de amostragem. As coordenadas geográficas dos locais de amostragem foram obtidas usando
150 a Garmin GPSMAP 60CS (Garmin International, Inc., Olathe, KA, EUA) (Tabela 1).
6
151 Tabela 1. Detecção do vírus da febre amarela (YFV), vírus Zika (ZIKV) emAedes
152 albopictuseHaemagogus leucocelaenusem florestas primárias no estado brasileiro
153 do Rio de Janeiro, Brasil.
FRIGIDEIRA
Total Mês ano Geográfico Flavivírus Sequenciamento

Sexo
Armadilha
Piscina Espécies de mosquito
espécimes coletado coordenadas identificação PCR resultado
Resultado
TMPRNH -
♀
22°33'01,3" S
43 Ae. albopictus 32 jan/19 Positivo Zika Vírus
42°00'52,7" W 32*
♂
22°31'40,1" S
45 Ae. albopictus 2 Out/2018 TMF-2 * Positivo Zika Vírus
42°02'58,6" W
♀
22°35'11,98" S
54 Hg. leucocelaenus 6 jan/19 Tinguá* Positivo Zika Vírus
43°24'34,12" W
♀
22°31'43,9" S Amarelo
62 Ae. albopictus 9 Out/2018 TMF -3 * Positivo
42°02'56,8" W Febre
Amarelo
3 Set/2018 Positivo
Febre
♂
22°31'49,5" S
64 Hg. leucocelaenus TMF-7 *
42°02'56,3" W
Amarelo
5 Out/2018 Positivo
Febre
154
155 * (Fazenda Três Montes – TMF, sítios 2, 3 e 7), * (Reserva Particular do Patrimônio Natural Três
156 Morros – TMPRNH, sítio 32), e * (Sítio Boa Esperança, Tinguá, Nova Iguaçu).
157
158 Localização da área de estudo e locais de amostragem no Rio de Janeiro. Geográfico
159 as coordenadas dos locais de amostragem foram obtidas usando o Garmin GPSmap 60 CS GPS.
160 Os mapas foram preparados em dados do ArcGIS PRO no domínio público (URL:
161 https://pro.arcgis.com/en/pro-app/ . Acessado em maio de 2019) e editado no CorelDRAW
162 Suíte Gráfica X7 (Fig 1).
163 A principal cobertura vegetal da região é a vegetação típica da Mata Atlântica, com
164 florestas de submontanha ombrófila em estágios moderados e avançados de regeneração.
165 A região, localizada na bacia hidrográfica do Rio São João, está situada na
166 zona intertropical (em baixas latitudes) e é altamente influenciada pelo Oceano Atlântico.
167 Assim, seu clima é predominantemente do tipo tropical úmido [18]. A temperatura média
7
168 é de 26,8°C, com umidade relativa de 56% e precipitação de 1.200 mm [19]. Mais alto
169 os níveis de precipitação ocorrem de outubro a março.
170 Em cada local de amostragem, as amostras foram coletadas por meio de ovitrampas. As ovitrampas
171 consistia de recipientes cilíndricos de plástico preto de 1L, contendo quatro pás de madeira
172 (2,5 × 14 cm). As armadilhas foram colocadas a uma altura que variou entre 2 e 10 m acima
173 nível do solo. Detalhes sobre o uso e fabricação das ovitrampas podem ser encontrados em estudos
174 feito anteriormente [20,21]. As pás das armadilhas foram examinadas a cada duas semanas para
175 detectar e quantificar os ovos.
176 Logo após chegar ao laboratório, as pás-positivas foram imersas em bandejas brancas
177 preenchidos com água desclorada a 29 ± 1°C e essas bandejas foram mantidas em
178 câmara para incubação. Após 3 dias, as pás foram retiradas da água e deixadas em
179 secar ao ar por mais 3 dias para quantificar as larvas eclodidas. As formas imaturas foram criadas como
180 descrito anteriormente [22], e processado para diagnóstico de infecção natural por
181 arbovírus por meio de técnicas moleculares.
182 Antes da extração, todos os mosquitos foram retidos em criotubos a -80°C
183 ultrafreezer, separados por espécie e identificação da armadilha. Os exemplares foram mantidos vivos
184 para determinação específica na idade adulta, por observação direta da
185 caracteres evidenciados pelo microscópio estereomicroscópico (Zeiss®) e consulta
186 com as respectivas descrições/diagnósticos da spp, utilizando chaves dicotômicas [14, 23].
187 Os gêneros de mosquito foram abreviados de acordo com uma abreviação bem estabelecida [24].
188
189 Extração de RNA
190 Fizemos pools de 3 a 33 mosquitos, misturando machos e fêmeas para
191 macerado. O RNA viral foi extraído dos pools de mosquitos usando MN Nucleo Spin®
192 RNA (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, ref. 740955.250) e cDNA foi
8
193 imediatamente sintetizado usando o kit RNA-to-DNA™ de alta capacidade (Applied Biosystems™, ref.
194 4388950), ambos de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi então quantificado
195 usando o Quantificador Denovix DS-11+b (DeNovix Inc., EUA) e mantido a -20-C até
196 investigação molecular dos flavivírus.
197
198 PCR paraFlavivírus
199 Usamos sequências de primers derivadas da região NS5 conservada do
200 Flavivírusgênero que havia sido descrito anteriormente [25], e então adaptou as
201 condições para amplificação por PCR.
202 As condições utilizadas foram 1 x tampão PCR, 1,5 mM MgCl2, 10 pmol Pan-Flavi
203 Primer direto (5--TAC AAC ATG ATG GGG AAR AGA GAR AA-3-) e 10 pmol
204 Iniciador Reverso Pan-Flavi (5--GCW GAT GAC ACM GCN GGC TGG GAC AC-3-),
205 1,0 U de DNA polimerase (Thermo Fisher Scientific, 168 Third Avenue, Walthan, MA 02451,
206 Estados Unidos), e uma extensão final de 72°C por 5 min.
207 Os produtos de PCR foram avaliados por eletroforese em géis de agarose 1,5% em 1 -
208 Tampão TBE (Trizma, ácido bórico, EDTA) e visualizado sob luz UV (260 nm) após coloração
209 com brometo de etídio. O fragmento amplificado esperado variou de 200-300 pb e foi
210 purificado usando o kit de purificação Cellco PCR (Cellco Biotec do Brasil Ltda.
211 Cat.#DPK-106L).
212
213 Sequenciamento de nucleotídeos
214 O sequenciamento foi gentilmente realizado pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)
215 no laboratório de sequenciamento RPT01A conforme descrito anteriormente [26]. Aproximadamente 10-
216 40 ng de produto de PCR purificado foi sequenciado seguindo o BigDye Terminator v.3.1
217 Protocolo de sequenciamento de ciclo usando um sequenciador de DNA ABI 3730. As sequências foram
9
218 em seguida, analisado usando Geneious R10 (Biomatters, v.10.2.6). Os contigs foram comparados
219 com sequências de referência usando a Ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico de nucleotídeos
220 (BLASTn, GenBank, PubMed).
221 Acessos–Sequências de nucleotídeos dos segmentos NS5 obtidos no presente
222 estudo foram depositados no GenBank.
223
224 Resultados
225 Desde setembro de 2018, 924 insetos foram coletados e armazenados a -80°C
226 ultrafreezer até o processamento. Os insetos foram separados com base na localização da ovitrampa e
227 espécies. O número de mosquitos em cada pool processado foi baseado em dados anteriores
228 relatos da literatura [27–30] bem como a eficiência do kit de extração de RNA; como resultado, nós
229 piscinas de mosquitos usados que variam de 3 a 33 insetos. O processamento de piscinas de mosquitos
230 requer um método molecular sensível, uma vez que a taxa mínima de infecção em fêmeas
231 mosquitos varia de 0,1 a 3,9 por 1000 [31]. Até agora, processamos 70
232 piscinas da Fazenda Três Montes (TMF), Reserva Particular do Patrimônio Natural Três Morros
233 - TMPRNH e Sítio Boa Esperança.
234 Conseguimos identificar cinco pools de mosquitos positivos de diferentes espécies por
235 realizando a PCR utilizando os primers da região NS5 descritos anteriormente [25]. Quando o
236 Os produtos de PCR foram sequenciados e analisados por NCBI Blast (Basic Local Alignment
237 Search Tool, em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), três pools positivos para YFV
238 e dois pools positivos para ZIKV foram encontrados. Embora nossas sequências de produtos de PCR
239 variou entre 200 e 241 pb, descobrimos que os pools sequenciados tiveram pontuações mais altas
240 de 200 e índices de identidade entre 90 a 96,4% de identidade cobrindo 94 a 98% de
241 as sequências (Tabela 1), números de acesso ao Gene Bank: MK972825, MK972826,
242 MK972827, MK972828 e MK972829.
10
243 Discussão
244 A região NS5 da família Flaviviridae foi utilizada neste estudo por ser uma
245 região comumente conservada e foi usado anteriormente para identificar vírus usando
246 métodos de sequenciamento [25,32-36]. Por meio dessa abordagem de sequenciamento, identificamos
247 ZIKV e YFV em diferentes espécies de mosquitos silvestres. A febre amarela silvestre é geralmente
248 encontrado emAe. albopictus,Haemagogus leucocelaenus,eHg. janthinomysespécies [37-
249 38]. Também é importante entender que o ciclo silvestre completo pode ser mantido
250 em florestas na presença de reservatórios de vertebrados [39]. Uma publicação recente mostrou que
251 Aedesmosquitos também podem ser contaminados com ZIKV ao se reproduzirem em
252 ambientes aquáticos [40].
253 Aqui, pela primeira vez, o ZIKV foi encontrado em um ambiente florestal na
254 continente americano tanto no mosquito silvestreHg. leucocelaenuseAedes
255 albopictus, um mosquito adaptado a ambientes silvestres e urbanos. Tem sido
256 informou anteriormente queAedes albopictusé um vetor natural do ZIKV em vários países
257 [41-44].
258 A descoberta deHg. leucocelaenus, uma espécie silvestre, infectada com ZIKV indica
259 a circulação do vírus nesta área, presumivelmente junto com alguns reservatórios de vertebrados.
260 Aedes albopictusapresenta um potencial de transmissão para ZIKV [45] e a
261 encontrar esse mosquito na área significa um risco de transbordamento da floresta para o homem
262 ambientes modificados [46].
263 As fontes de alimentação de sangue deHg. leucocelaenussão diversos, alimentando-se principalmente de
264 aves, mas também em diversos mamíferos do Rio de Janeiro e Goiás [22].Aedes
265 albopictusse alimenta principalmente de mamíferos, preferindo sangue humano quando disponível [47, 48],
266 mas também é onipresente em sua ausência [49, 50].
267 Outro fator de risco é queAe. albopictuspode ser o vetor, de pelo menos, para dois
268 Flaviviruses diferentes desde que foi encontrado em pools de insetos da África. Além disso,
11
269 por meio de exames laboratoriais de coinfecção e superinfecção, a possibilidade de
270 a transmissão de infecção para humanos foi demonstrada [51].
271 Os presentes resultados indicam um ciclo silvestre para o vírus Zika; portanto, é importante
272 investigar sua presença em outros vetores, principalmente próximo a áreas urbanas. DesdeAe.
273 albopictuspode facilmente passar de ambientes florestais para áreas peridomésticas e vice-versa
274 no Rio de Janeiro [52], há uma alta probabilidade de transporte viral entre essas áreas.
275 Localidades do Ceará e Bahia, onde o ZIKV foi encontrado em mamíferos, devem
276 ter sua fauna de mosquitos cuidadosamente estudada. Vale ressaltar que a presença
277 doHg. janthinomys, a outra espécie altamente suspeita [13] em uma floresta urbana (Parque
278 Dois Irmãos) em Recife, estado de Pernambuco [53], uma cidade altamente endêmica para ZIKV e
279 outros vírus (DENV e CHIKV) [54] devem ser estudados para infecção natural.
280 O achado de infecção em mosquitos criados a partir de ovos obtidos em condições naturais
281 condições indica a ocorrência de transmissão transovariana do ZIKV, e a
282 A presença de vírus nas glândulas salivares desses mosquitos deve ser investigada.
283 A transmissão vertical foi encontrada em muitos arbovírus [55], e seu papel na
284 manutenção desses vírus na natureza deve ser avaliada. Uma magnitude baixa e longa
285 viremia de duração (a estratégia da 'tartaruga'), demonstrou resultar em maior taxa de
286 persistência em vetores e populações hospedeiras em comparação com alta magnitude, curta duração
287 viremia (a estratégia da 'lebre') [56].
288 A competência vetorial dessas espécies e outras presentes na área precisa ser
289 cuidadosamente avaliados, para elucidar o real papel na transmissão do ZIKV em
290 ambientes de degradação com baixa presença humana, como reservas florestais e
291 possibilidade de transferência entre estas e áreas modificadas. A competência de muitos
292 espécies, principalmente emAedeseCulex, já foi testado, mas nãoHemagogo[57].
12
293 Um estudo anterior utilizando armadilhas CDC em uma reserva em Casimiro de Abreu indicou
294 a presença de pelo menos 15 espécies, não incluindoHg. leucoceleunuseAe. albopictus
295 [58], provavelmente devido à sua atividade predominantemente diurna. Entre os vetores conhecidos de
296 febre amarela silvestre, as espécies encontradas em Casimiro de Abreu foramHg. leucocelaenus
297 eHg. janthinomys, sendo que este primeiro táxon foi encontrado naturalmente infectado por
298 YFV no mesmo local e horário do surto da doença. Os resultados confirmam a
299 papel deHg. leucocelaenuscomo um importante vetor de YFV no Sudeste do Brasil.
300 Alencar et al (2016) [21] relataram três
301 espécies de mosquitos na transmissão de arbovírus (Hg. leucocelaenus,Hg.
302 janthinomys, eAe. albopictus) na presente região de estudo. Considerando que cada
303 macaco virêmico pode infectar centenas de mosquitos, é crucial entender
304 dinâmica de transmissão. É possível que um grande número deHg. leucocelaenusestá
305 infectados e por transmissão vertical, podem desempenhar um papel na manutenção
306 infecção epizoótica e humana, o que contribui para a disseminação do vírus para outras
307 áreas [59].
308 Em geral, a transmissão do YFV ocorre dentro de florestas, afetando principalmente humanos
309 envolvidos em atividades como extração de madeira, pesca, caça e assim por diante, mas no caso deHg.
310 leucocelaenus, que tende a sair da floresta, pode infectar humanos de ambos os sexos e
311 várias idades.Haemagogus leucocelaenusinfectados com YFV foram capturados no solo
312 nível, onde a maioria de nossos espécimes foram obtidos, durante o surto ocorrido em
313 Rio Grande do Sul (Brasil) entre 2008 e 2009 [60], o que reforça nossa
314 hipótese.
315 A ocorrência do vírus da febre amarela em condições naturais demonstra sua
316 circulação atual nas áreas de Mata Atlântica do município de Casimiro de Abreu,
317 estado do Rio de Janeiro. Este é o primeiro relato da detecção do vírus da febre amarela emHg.
13
318 leucocelaenusno estado do Rio de Janeiro desde o último relatório há 88 anos em YF urbana em
319 este estado [61].
320 Evidência de transmissão ativa de SYFV silvestre nas reservas naturais estudadas
321 aqui e a abundância do principal mosquito vetor dessa doença no Brasil,
322 necessita de vigilância ativa para o surgimento deste vírus em
323 comunidades. Florestas próximas a áreas modificadas pelo homem positivas para arbovírus, como
324 florestas (ex: Tijuca – Rio de Janeiro; Buraquinho – João Pessoa; Dois Irmãos – Recife)
325 são uma prioridade.
326 Mosquitos adaptados a ambientes urbanos, principalmenteAe. aegypti, transmitir YFV e
327 ZIKV entre humanos. Como ambos estão bem adaptados a mosquitos de várias espécies, o
328 transbordam para florestas preservadas, circulando entre reservatórios de vertebrados silvestres e
329 mosquitos não deve ser surpreendente. No entanto, se não estudados, tais ciclos silvestres
330 provavelmente descoberto Baixos níveis de reatividade de primatas infectados com ZIKY ou YFV
331 perto de áreas urbanas [11] não deve desencorajar estudos adicionais nessas áreas.
332 Esses resultados corroboram o alerta de [56] de adaptação do ZIKV à floresta
333 ambientes, impossibilitando a erradicação do vírus do continente e
334 reforçando a necessidade de controle de mosquitos urbanos e o desenvolvimento de uma boa
335 vacina.
336
337 Reconhecimentos
338
339 Os autores agradecem às Fazendas Reunidas Agropecuárias Três Montes; Fazenda Três
340 Morros, por fornecer as facilidades para a realização do presente estudo.
341
342 Declaração de divulgação:
14
343 Os autores declaram não ter interesses conflitantes.
344
345 Financiamento
346 Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
347 Rio de Janeiro(FAPERJ; número de bolsa E-26/202.658/2018) e a Coordenação de
348 o Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES; bolsa número 1719247;
349 1741497) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq
350 (301707/2017-0).
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581 Fig 1. Mapa dos locais utilizados para coleta de mosquitos no estudo.(Vermelho: Positivo
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583 o brasileiro, municípios de Nova Iguaçu e Casimiro de Abreu, estado do Rio de
584 Janeiro, Brasil). Os mapas foram preparados em dados do ArcGIS PRO no domínio público (URL:
585 https://pro.arcgis.com/en/pro-app/ . Acessado em maio de 2019) e editado no CorelDRAW
586 Suíte Gráfica X7.
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Natural Infection and Vertical Transmission of Two Flaviviruses.

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1 Infecção natural e transmissão vertical de dois flavivírus (febre amarela e

2 Zika) em mosquitos em florestas primárias no estado brasileiro do Rio de Janeiro

5 Título curto: Infecção natural e transmissão vertical de dois flavivírus

7 Jerônimo Alencar1*, Cecília Ferreira de Mello1,2, Carlos Brisola Marcondes3,

8 António Érico Guimarães1, Helena Keiko Toma4, Amanda Queiroz Bastos1,2,

9 Shayenne Olsson Freitas Silva1,5, Sérgio Lisboa Machado4*

12 Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil

13 2Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade

15 3Departamento de Microbiologia Imunologia e Parasitologia, Centro de Ciências

16 Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-900, Florianópolis, Santa

18 4Laboratório de Diagnóstico Molecular e Hematologia, Universidade Federal do Rio de

19 Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

20 5Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz (Fiocruz), Rio de

27 Fundo:O vírus Zika (ZIKV) foi recentemente introduzido no continente americano,

28 provavelmente transmitido porAedes aegyptie possivelmente porAe. albopictuseCulex

29 quinquefasciatusem ambientes urbanos. O ZIKV representa um conhecido problema de saúde pública

37 sobre a história do ciclo de disseminação do flavivírus do inseto.Métodos/Descobertas Principais:

40 doAedes albopictus, um mosquito silvestre adaptado a ambientes modificados pelo homem, e

41 dentroHaemagogus leucocelaenus, um mosquito silvestre.Conclusões:Este é o primeiro relatório

42 de infecção natural por ZIKV em mosquitos em ambiente silvestre na América

43 continente. A ampla distribuição desses mosquitos é provavelmente importante no

44 transmissão do ZIKV. A transmissão vertical indica uma maior eficiência para o

45 manutenção e transmissão do vírus na natureza, bem como a presença do ZIKV

47 dificulta a prevenção de novos casos de Zika em humanos.

54 pesquisar os insetos circulantes, bem como detectar a presença de vírus neles.

55 Arbovírus circulam entre insetos e hospedeiros vertebrados, tendo importância para

56 promovendo doenças em humanos e animais. As doenças mais conhecidas na época, por

64 Reação em Cadeia da Polimerase Transcriptase), amplificamos o RNA e sequencialmente,

65 realizamos a reação de sequenciamento. Com o sequenciamento, é possível identificar quais

67 identificação das sequências, precisamos usar alguns programas computacionais que

68 garantem-nos o resultado correcto.

70 Palavras-chave:Culicidae;Haemagogus leucocelaenus,Aedes albopictus,vírus Zika;

71 infecção natural; Febre amarela

77 A família Flaviviridae possui quatro gêneros e oFlavivírusgênero contém mais de 90

80 vírus (WNV). Os flavivírus são vírus envelopados, icosaédricos e possuem um RNA

83 Membrana/membrana [prM/M]) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2a, NS2b,

87 ilhas e o continente americano, causando séria preocupação com a microcefalia em

88 fetos [2-4]. Transmitida principalmente em ambientes urbanos porAedes aegyptie possivelmente

89 Aedes albopictus, foi encontrado em muitas espécies de mosquitos, principalmente emAedes

90 espécies (31 spp.), mas também em algunsAnopheles,Culexe outros gêneros, e mesmo em um

95 diagnosticar ZIKV em uma variedade de espécies de mamíferos pertencentes a nove ordens

96 (Artiodactila, Carnivora, Cetartiodactyla, Chiroptera, Lagomorpha, Perissodactyla,

97 Primatas, Proboscidea e Rodentia), três ordens de aves (Anseriformes,

98 Charadriiformes e Ciconiiformes) e lagartos Squamata [8], principalmente na África. No

99 continente americano, possivelmente devido à sua introdução recente e menor número de

101 Edentata são sorologicamente positivos paraFlavivírusno sul de

102 Estado da Bahia [10].

104 circulação em ambientes florestais de baixa degradação, especialmente a fauna diversificada de

106 Neste estudo, relatamos a infecção natural e transmissão vertical do ZIKV

107 e YFV emHaemagogus leucocelaenuseAe. albopictusem uma floresta em Casimiro de

108 Abreu e Nova Iguaçu, no estado brasileiro do Rio de Janeiro.

109 Atualmente, há um surto em andamento de febre amarela silvestre no Brasil. O

115 Os principais gêneros de mosquitos capazes de se infectar e transmitir o

116 YFV silvestre sãoHemagogoeSabethesque são considerados biológicos

118 florestas das Américas. No sudeste do Brasil, durante a atual epidemia,

119 Hg. leucocelaenuseHg. janthinomyssão considerados vetores importantes [13].

120 Hemagogosão mosquitos essencialmente silvestres, com acrodendrofilia diurna

122 leucocelaenusé a espécie mais encontrada no Brasil e é considerada

124 do Brasil, este Culicidae é comumente encontrado no Brasil e é considerado de

125 importância epidemiológica devido ao seu envolvimento na transmissão de arboviroses,

127 através do uso de sequências de identificação de PCR de transcriptase reversa hemi-nested

128 compatível com DENV-1 emHg. leucocelaenusde Coribe, cidade do nordeste