2604/2022 15:29 CComparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélilas © SNP genémicos Pesquisa de Pequenos Ruminantes ‘otume 201 gosto da 2021, 108300 Comparagio de estimativas de parentesco em ovelhas Santa Inés usando marcadores microssatélites e SNP genémicos Ara Regina sivaee Des” AEB, ice RiboroSiv°Luciane ShaSens*F io Barostits"DsboraNatiode Conahe"lorge Vicor Gomesde Frets ub Lindenberg Mostre mais contomo | anterior Préximo Palavras-chave Co-ascendénciaConservagaoEndogamialstimadores de parentescoMelhoramento genéticoMarcadores moleculares 1. Introdugio A produgao de ovinos se expandiu nas tiltimas décadas no Brasil e, atualmente, o rebanho ovino nacional possui mais de 18 milhdes de cabegas ( Instituto Brasileiro de Geografia e Kstatistica — IBGE, 2018 ). A maior parte deste rebanho é composto por ovelhas Santa Inés e seus mestigos. A raga Santa Inés tem despertado o interesse de criadores e pesquisadores devido a importantes aspectos produtivos. Os animais desta raga apresentam boa adaptabilidade as condigées tropicais, excelente potencial de crescimento e excelente qualidade de carne ( Sousa et al., 2003 ; Associagdo Brasileira de Criadores de Ovinos = ARCO, 2019 ). ‘Apesar da grande importaneia dos ovinos Santa Inés para a produgo de came, faltam programas eficientes sem 0 uso ou com uso limitado de registros de pedigree para melhoramento genético e conservagio da diversidade genética desta raga (Rego Neto et al, 2018 ; Lobo, 2019 ) . Além disso, erros de pedigree e a selegdo baseada apenas em registros fenotipicos representam um risco para a perda de caracteristicas importantes em ovinos Santa Inés ¢ tornam 0 melhoramento genético desse recurso genético ineficiente. Isso pode afetar a conservagao e o desempenho desta raga ( McManus et al., 2010 ; Alves et al., 2016). Uma alternativa para o manejo genético de rebanhos com poucos ou nenhum registro de pedigree consiste na determinagao das relagdes de parentesco por meio de marcadores moleculares, por meio do célculo das frequéncias alélicas de cada individu, Essa alternativa leva em consideragdo que os alelos de individuos aparentados sao idénticos por deseendéncia (IBD) (Thompson, 2013 Varios estudos mostraram que os marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sto uma ferramenta poderosa para atribuigio de parenteseo e anslise de parentesco (por exemplo, Heaton et al., 2002 ; Hayes, 2011 ; Lopes et al, 2018 ; Panetto et al., 2017 ; Goudet et al., 2018 }. Os mareadores SNP estao espalhados por todo o genoma, so altamente informativos para a previsio de valores genéticos gendmicos e tém uma baixa taxa de mutagao e baixa taxa de erro de genotipagem (‘Tokarska et al., 2009 ; Yu etal, 2015 ), No entanto, andlises de parentesco requerem um grande néimero de SNPs, pois esses marcadores sio bialélicos ( Morin et al., 2004 ;Kling et al., 2012 ). Isso aumenta o custo ea complexidade do uso de SNPs para avaliagio de parentesco, Marcadores de microssatéites (ou sequéncia simples de repeti¢ao (SSR)) representam outra importante alternativa para anilise de parentesco devido ao seu alto polimorfismo e relativamente facil aplicagio. Os marcadores SSR consistem em sequéncias simples de um a seis pares de bases que so repetidas em tandem ¢ amplamente distribuidas por todo o genoma llegren, 2004 ). A natureza codominante dos microssatélites os torna faceis de serem usados em estudos populacionais como uma ferramenta eficiente para estimativa de parentesco ( Webster e Reichart, 2005 ).. No presente estudo, objetivamos avaliar o poder de diferentes nimeros de marcadores microssatélites em comparacéo com uma matriz SNP de alta densidade na estimativa de parentesco em rebanhos de ovelhas Santa Inés, a fim de dar suporte a programas de melhoramento e conservagio de recursos genéticos em rebanhos com fraco controle genealégico. 2. material e métodos 2a. Estrutura da populagio hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub ane26510472022 15:39 __Comparagdo de estimativas de parentesco em ovelhas Sanla Inés usando marcadores microssatéiles e SNP genémicos Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comité de Etica no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Piau! (UFPD, Brasil (protocolo nimero 337/17). Foram utilizados dados de 257 animais da raca ovina Santa Inés criados em seis rebanhos localizados em diferentes muniefpios dos estados do Piauf (PI) e Maranhao (MA), na sub-regido Centro-Norte do Brasil. Os animais eram registrados na Associagio Brasileira de Criadores de Ovinos (ARCO) ou pertenciam ao niicleo de conservagio de ovinos e caprinos da unidade federal de pesquisa Embrapa Meio Norte (Campo Maior, Piauf). Para as anilises, consideramos todos os individuos como a populagiio total (POP 1) e os subconjuntos de seis populagées divididos de acordo com a origem dos animais (Tabela 1). Tabela . Lista das populagGes de ovinos Santa Inés ¢ respeetivas eoordenadas de localizacao. Rebanho _—-Municipio- Estado Localizacdo geogrética ‘Némero de amostras PoP1* 257 Pop2 José de Freitas ~PI 4°39'27,2"S 42°28'97.8°W 135 Pops Santa Inés - MA 3°42"43,4S 45°38'09,9"W 52 PoP4 “José de Freitas —PI 4°39'347°S 42°28'20,1°W a POPs Floriano ~ PI 6°46"19,9"8 43°03'42,4"W 19 POPS ‘Campo Maior ~ PI 4°47'58,2"S 42°08'03,4"W 18 Por? ‘Campo Maior - PI 5°02'50.4"S 42°01'12,9"W 6 POP: population; PI: state of Pian, Brazil; MA: state of Maranhio, Brazil, POP 1 fois populagao total, ou sea, ineluiu todas as outras populacoes em estudo, 2.2..Coleta de material biolgicoe extragdo de DNA Amostras de sangue foram coletadas na veia jugular do animal utilizando-se tubos a vacuo (Vacutainer®) com eapacidade de 4,50 mL contendo anticoagulante EDTA. Antes da extracio do DNA , as amostras de sangue foram armazenadas a -20°C. Aextrago do DNA foi realizada com o kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com 0 protocolo do fabricante. Para este procedimento, foram utilizados 300 iL de sangue de cada individuo. Apés a extragio, um transiluminador ultravioleta (UV) foi utilizado para visualizago do DNA utilizando geis de agarose 1% e-coloragdo com brometo de etidio para verificar a qualidade do DNA. A concentragao de DNA também foi verificada por comparaciio com o padrao de DNA lambda usando concentragées conhecidas. 0 DNA obtido apés a extragio foi armazenado a -20°C até a execugio dos demais procedimentos. ‘A genotipagem do SNP foi realizada no laboratério DEOXI em Aragatuba, So Paulo, Brasil. Todos os demais procedimentos e andlises estatisticas foram realizados no Laboratério de Genética Animal (LABGEN) do Departamento de Zootecnia (DZO) da UFPI, Teresina, Piauf, Brasil 231. Amplificagéo de DNA e genotipagem com marcadores mierossatélites Um total de 20 loci de microssatélites foram selecionados da lista de microssatélites recomendados para ovinos pela Organizagao das Nagées Unidas para a Alimentagfo e Agricultura (FAO) (‘Tabela 2 ) (Food and Agriculture Organization (FAO), 2004 ) para amplificagdo de DNA usando cadeia de polimerase reacdo (PCR). As reagoes foram testadas e otimizadas em um volume de 16 pL contendo o seguinte perfil: 2,50 mMANTPs, 1 x de tampao Tris-HCY KCI, 1,00-2,00 ‘mM MgCl», 1,25 uM de cada primer, uma unidade de'Taq DNA Polimerase, agua desionizada e 3 pl. de DNA extraido (3 ng/nl). Tabela 2 . Locais marcadores, sequéncias direta e reversa do primer, temperatura de hibridizagao (At), concentragio de cloreto de magnésio (MgC1 .) utilizada na reagao em cadeia da polimerase (PCR), tamanhos de alelos obtidos por PC hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub 382604/2022 15:20 CComparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélilas © SNP genémicos referéneias e ntimero de alelos. Mareadores MAFo6s MAF209 BM6526 Remo FCB304 cSRM60" cssMio6 rsit INRAZ3 ETIho BMai25 MMiz BMng29 BMuBi8 INRA063 msts87 INRABERN172 cSRDa47 TGLAt22 ETHo25 RemoFCB48 ‘Sequéneia de inicia Frente (F) R6(R) F: AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG R: CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG: F: GATCACAAAAAGTIGGATACAACCGTG R: TCATGCACTTAAGTATGTAGGATGCTG F: CATGCCAAACAATATCCAGC R: TGAA TAGAGAGCAAGCAGC F: CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG R: CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG F: AAGAGTGTGATCCAAGAGAGAGGCA, R:AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG F: ACAAAATCCTTTCTGCCAGCTCA, R: AATTTAATGCACTGAGGAGCITGG AC ATG GAA AGT. GC R: CTA AAA TGC AGA GCC CTA CC F: GCrT6 F: GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC R: TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC F: GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA R: CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC F: CICTATCTGTGGAAAAGGTGGG R: GGGGGTTAGACTTCAACATACG rrTCAATCT R: ATCGACTCTGGGGATGATGT F: CAAGACAGT F: TIGTITAGGCAAGTCCAAAGTC. R: AACACCGCAGCTTCATCC F: AGCTGGGAATATAACCAAAGG: R: AGIGCTTTCAAGGTCCATGC F: ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC R: AAACCACAGAAATGCTTGGAAG F: AGCAGACATGATGACTCAGC R: CTGCCICTTTTCTTGAGAG F: CcacrTecererarecrecr R: GGTGCTCCCATIGTGTAGAC F: GGACTTGCCAGAACTCTGCAAT R: CACTGTGGTTTGTATTAGTCAGG F: CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC R: AATCACATGGCAATAAGTACATAC. F: GATCACCTTGCCACTATTTCCT R: ACATGACAGCCAGCTGCTACT F: GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC R: GACICTAGAGGATCGCAAAGAACCAG A=nimero de alelos. Monémeros, hitps:www-sciencedirect.<217,periadicos.capes.gov.brisciencefartcleipiv$00214488210008452v'n%63DIhub Em CO) 60 62 55 55 55 57 57 56 50 52 ‘MgCl(mM)" Ciclos Variagdo (pb)" 13 13 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 35 30 100-158 100-154 140-180 160-198 60-92 12-208 254-2094 190-296 200-242 108-192 100-144 146-180 248-298 150-184 140-182 ag2-192 200-264 196-182 30-162 138-170 UMA 19 8 36 29 4 ane2604/2022 15:29 CComparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélilas © SNP genémicos > ares de bases, 0 termociclador (GeneAmp Thermal Cycler 2720, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) usado para as amplificagies {oi programado com os seguintes parimetros para PCR (‘Tabela 2): 94 °C por 5 min, seguido por 30-35 ciclos de desnaturagio (94°C, 45 5); recozimento (50-62 °C, 45 8); € extensio (72°C, 50 s). Apos os ciclos, uma extensio final (72°C, ‘7 min) foi realizada. Os produtos de amplificacio foram visualizados em gel de poliacrilamida néo desnaturante a (6% corado com solugao de nitrato de prata (1,50 mg/mL) com solugio de formaldetdo a 0,40 % (v/v) € revelado por NaOH (4,50 mg/mL) com 0,40 % ( v/v) formaldeido, utilizando uma modificagao do método proposto por Benbouza et al. (2006). Os fragmentos foram registrados em planilha para obtengao de um banco de dados de frequéncias alélicas. 2.4. Andlise de dados de microssatélites Inicialmente, utilizou-se o software Micro-Checker v.2.2.3 ( Van Oosterhout et al, 2004 ) para detectar possiveis erros de sgenotipagem e a presenga de alelos nulos . As frequéncias alélicas em cada locus e o contetido de informagao polimérfiea (PIC) foram estimados usando o software Cervus v.3.0.3 ( Marshall et al., 1998 ). PIC 6 uma medida de informatividade relacionada heterozigosidade esperada que é calculada com base nas frequéncias alélicas ( Botstein et al, 1980 ). Valores de PIC acima de 0,50 so considerados altamente informativos, enquanto valores entre 0,25 ¢ 0,50 so moderadamente informativos e valores de PIC menores que 0,25 so considerados nao informativos. ara estimar o parentesco usando marcadores moleculares, o coeficiente de parentesco (r) pade ser calculado usando dados de genotipagem e frequéncia alélica, O coeficiente de parenteseo mede a proporgao esperada de alelos eompartilhados {dénticos por descendéncia (IBD) entre os individuos ( Blouin, 2003 ). Considerando que existem varios estimadores de parentesco e nao existe um estimador universal para todos 0s tipos de dados, utilizou-se o programa COANCESTRY v.1.0.1 (Wang, 201) para derivar o melhor estimador de parentesco. Foram comparados os seguintes estimadores de parentesco: estimador de verossimilhanga triadica (TrioML) ( Wang, 2007 }; estimador de parentesco genético de Wang ( Wang, 2002 ); estimador LynehLi ( Lynch, 1988 ; Li et al, 1993 ); estimador LynchRd ( Lynch e Ritland, 1999 ); estimador de Ritland ( Ritland, 1996 ); estimador QuellerGt ( Queller € Goodnight, 1989 ); ¢ estimador de probabilidade diédico (DyadML) ( Milligan, 2003 ; Wang, 2007). Para isso, inicialmente foram realizadas simulagdes utilizando o programa COANCESTRY com dados de gendtipos e frequéncias alélicas de todos os individuos utilizando um painel com 19 locos de microssatélites. As sirmulagoes foram realizadas usando ‘um procedimento de permutago com 100.000 bootstraps que mostraram a relagdo média entre os individuos. A selegio do estimador foi baseada em um valor verdadeiro de 1. Portanto, o estimador com o valor mais proximo de 1 foi considerado 0 ‘melhor para a populagio proposta. Os valores obtidos tiveram 95% de confianga ( Wang, 2011), Todos os estimadores mencionados acima inferem parentesco assumindo a presenga de individuos consanguineos, possiveis erros de genotipagem e a presenga de alelos nulos. Portanto, pares de individuos hapl6ides-hapl6ides (A ; = 0) ou diploides-haploides (A = 2) assumem quatro grupos de parentesco com base na seguinte equagio: r= A, /2+A.,.Os grupos de parentesco assumem valores de parentesco de zero para individuos nao relacionados (UR), 0,25 para mei irmaos (HS), 0,50 para irméos completos (FS) (ou seja, individuos com pai e mae comuns) e 0,50 para pais-filhos (PO) (Weng, 2006). Embora FS e PO tenham os mesmos valores de parentesco, esses dois grupos tém diferentes padres de compartithamento de alelos IBD. Uma dade (isto 6, os gendtipos de um par de individuos) de PO deve compartilhar pelo ‘menos um alelo em cada locus, enquanto uma diade de FS pode compartilhar 0, 1 ou 2 alelos. Assim, o grupo PO apresenta ‘menor variagdo entre os locos em comparagiio ao FS. Ap6s a determinacao do melhor estimador de parentesco, utilizou-se o pacote RELATED ( Pew et al., 2015) do software R (R Development Core ‘Team, 201; ) para criar um grafico com os valores de parentesco dos 257 animais genotipados, bem como o parentesco para cada populacao avaliada. O pacote RELATED estima o parentesco usando as mesmas abordagens dispontveis no programa COANCESTRY, para que seja possivel analisar marcadores moleculares codominantes, como microssatélites. Inicialmente, inserimos os dados no software R utilizando a fungao 'readgenotypedata’ do pacote RELATED. Posteriormente, a fungZo ‘familysim’ foi utilizada para gerar os pares de individuos para cada grau de parentesco. Em seguida, a fungio ‘coancestry’ foi usada para obter estimativas pontuais de parentesco usando o estimador hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub 5182604/2022 15:29 CComparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélilas © SNP genémicos DyadML, que foi o melhor estimador com base nas andlises realizadas usando o programa COANCESRY. Por fim, foram sgerados graficos para visualizagio dos valores de parentesco para cada grau de parentesco esperado. ‘As andlises mencionadas acima foram realizadas usando painéis contendo 10 (Painel 1), 12 (Painel 2), 15 (Painel 3) € 19 (Painel 4) loci de microssatélites (‘Tabela 3 ). Os mareadores de cada painel foram selecionados com base nos valores de PIC ena possivel presenca de alelos nulos. Apenas os marcadores que apresentaram os melhores valores para os parmetros mencionados acima foram mantidos nos painéis menores. 0 desempenho de cada painel quanto as estimativas de parentesco foi avaliado graficamente. Além disso, foram comparadas as médias de todos os valores de parentesco obtidos nos quatro painéis, Tabela 3 . Lista de marcadores utilizados nos quatro painéis de microssatélites avaliados. Painels Painel 2 Painel 3 Painel 4 MAFo65 MAFO65, MAFo65 MAFO65, BM6526 BM6526 M6526 MAF209 INRA23 INRA23 Remo FCB304 BM6526 ETI0 ETIo INRAZg, Remo FCB304 BMB125 BMBi25 ETTho cssMiss BMi818 BMi8i8 BM8125, msTsi1 MsTs87 usts87 BMi818 INRAZg INRABERN172 INRABERN172 usts87 ETH10 csRD247 SRD 247 INRABERN172 BMBi25, Remo FCP48 TELA csRD247, MMi ETH225 TGLAz2 Byng29 Remo FCP48 ETH225 Bangs Remo FCP4S INRA063 INRAO63 msts87 Remo FOP48, INRABERN172 csRD247 ToLAwe ETH225 Remo FCP48 Anilise de dados do SNP Para a andlise de parentesco com mareadores SNP, os 257 individuos analisados eom microssatélites foram usados para criar a matriz.G (matriz de relacionamento gendmico). Para isso, foram utilizadas informagGes de animais genotipados com © array OvineSNP50 BeadChip (lumina Inc, San Diego, CA, EUA). Este painel contém 54.241 SNPs uniformemente espacados ao longo dos cromossomos da ovelha ( Ouis aries). Inicialmente, realizamos o controle de qualidade dos dados do SNP utilizando o programa PREGSF9o ( Misvtal etal, 2018 ). O controle de qualidade consistiu em excluir mareadores SNP com posigdes gendmicas desconhecidas, localizados -xuais ou DNA mitocondrial, com frequéncia alélica menor (MAF) inferior a 0,01, taxa de chamada inferior a 0,90 (ou seja, taxa de genotipagem < 90%) e em extremo desvio do equilibrio de Hardy-Weinberg (valor P < 10 ~). Além disso, mareadores monomérficos foram removidos. Apés o controle de qualidade, 47.069 SNPs permaneceram para novas andlises, ‘A matriz G foi calculada de acordo com Vanaden (2008) , como segue: onde Z é uma matriz que relaciona genétipos de cada locus, D é uma matriz. diagonal de pesos para variancias de SNPs e pié a frequéncia alélica menor de SNP i. hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub ane26/0472022 1539 Comparagéo de estimativas de parenisco em ovelhas Santa Inés usando marcadores mirossaléles e SNP genémicos 2.6 . Comparagio de desempenho de marcadores SNP e microssarélites Existem poucos relatos comparando o poder de microssatélites e SNPs para anilise de parentesco, especialmente em ovinos. Portanto, comparamos estimativas de parentesco obtidas usando informagdes de 47.069 SNPs com resultados obtidos usando os quatro painéis de microssatélites( Tabela ) para avaliar a variagio nas estimativas. ara verificar 0 verdadeiro parentesco gerado a partir de SNPs e dados de microssatélites, bem como inferir o desempenho de cada painel, eriamos grficos de distribuigao dos valores de parentesco estimados usando SNPs e os quatro painéis de rmicrossat imados por SNPs e microssatélites foi calculada para avaliar a associagdo entre os valores estimados pelas diferentes abordagens. ites, A correlagio de Pearson entre parentescos es 3. Resultados 3a. Andlises gerais Com base nas estimativas, assumindo equilibrio de Hardy-Weinberg e deficiéneia de heterovigotos ( Brookfield, 1996 ), a presenca de alelos nulos foi observada em 10 microssatélitesmarcadores quando todos os individuos foram considerados na anélise. Quando consideradas as andlises de diferentes fazendas, o ntimero de marcadores com alelos nulos diminuiu. No entanto, nao foi possivel estimar a presenca de alelos nulos no POP 7, devido ao seu pequeno tamanho amostral. 0 locus CSRM60 demonstrou a ocorréncia de alelos nulos em todas as populagdes, com frequéncia acima de 0,40, enquanto o locus ETH225 continha alelos nulos apenas quando todos os individuos foram considerados. Em todas as andlises, as frequéncias de alelos nulos foram inferiores a 0,20 para todos os marcadores microssatélites, com excegao do locus CSRM60. De acordo ‘com Dakin ¢ Avise (2004), frequéncias alélicas nulas inferiores a 0,20 nao afetam a qualidade dos marcadores para anélise de parenteseo. Assim, apenas 0 locus CSRM60 foi excluido da andlise de parentesco, devido A sua alta frequéncia de alelos nulos (> 0,20). As andlises de desempenho indicaram que todos os marcadores se desviaram do equilibrio de Hardy-Weinberg, O nimero de alelos variou de 9 (locus ILSTS11) a 36 (locus INRABERN172), com um total de 308 alelos gerados por todas as amostras. Todos os marcadores foram altamente polimérficos, com PIC minimo de 0,72 (ILST11), PIC maximo de 0,93, (CSRD247) ¢ PIC médio de 0,88 + 0,05. A heterozigosidade esperada (He ) variou de 0,76 (sm) 0,93 (MAF209, BM1818 e CSRD247), com média de 0,89 + 0,21. A heterozigosidade minima observada (Hq ) foi de 0,00 (CSRM60), enquanto a Hg maxima foi de 0,93 (OarFCB304) ¢ a média de H » foi de 0,78 + 0,04 3.2 . Andlise de parentesco usando mierossatélites Aandlise de simulagao dos marcadores de todos os individuos indicou que os estimadores TrioML e DyadML foram os ‘melhores para anélise de parentesco verdadeiro na populagio proposta, com médias 0,34 € 0,35, respectivamente. Os valores de ambos os estimadores foram os mais proximos do valor verdadeiro de 1. Além disso, os estimadores TrioMLe DyadML. foram altamente correlacionados (0,99). A menor média de parentesco foi apresentada pelo estimador de Ritland (0,31). A menor correlagao foi observada entre os estimadores Ritland e Wang (Tabela 4). Tabela 4. Médias ¢ variancias das estimativas de parentesco ¢ correlagdes entre os sete estimadores utilizados na populagio total (POP 1) de ovinos Santa Inés avaliados. Parimetro Estimador ‘TrioML, Wang LynchLi_-—LynchRd = Ritland Quelle Gr DyadML Quer dizer 04 032 oe og2 og og2 035 Variagio 0.03 0.03 0.03 0.04 0.04 0.03 0.03 Estimador = Wang Lynch Li Lynehd Ritland ——Queller Gt DyadML, ‘TrioML, 097 0.98 oot 087 0.98 0.99 ‘Wang 0.98 0.90 084 97 097 Correlagio Lynch Li 0.90 085 0.99 0.98 LynchRd 0.94 0.90 ose Ritland 0.86 0.87 Queller Gt 0.98 hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub m82604/2022 15:29 CComparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélilas © SNP genémicos Quando 0 Painel 4 foi usado em toda a populagao (POP 1), os pares de individuos (ou seja, grupos de quaisquer dois animais na populagdo) foram agrupados em quatro categorias de acordo com os valores médios de parentesco. Portanto, r = 0,25 para meio-irmdos (HS), r = 0,00 para individuos nao aparentados (UR), r = 0,50 para 0 para pais-filhos (PO). O parentesco mfnimo entre pares foi de 0,00, enquanto o maximo irmfos completos (FS) er = foi de 0,81, ea média foi de 0,35. Individuos dos grupos FS (r = 0,23 a 0,81) e HS (r = 0,04 0,51) apresentaram maior variagao de r , enquanto individuos 10 0,76) tiveram r valores mais proximos do esperado. A maioria grande nimero de pares de animais foi niio aparentados ( das relagdes entre os indi composto por irmios completes, enquanto pi individuos. Quando as populagGes foram analisadas separadamente, o niimero de pares de FS aumentou. Isso sugere que grande parte dos individuos esta intimamente relacionado e muitos individuos com ancestrais comuns acasalaram. Como 0,00 a 0,22) e pais-filhos ( (duos estava nas categorias UR e HS ( Fig. 1). s-filhos representaram o menor niimero de relacionamentos entre pares de consequéncia, isso pode causar perdas genéticas nos lotes estudados devido & endogamia, 0 ste sco ct wR Hs fs Po Rotanonshp eatgory Downloss: Saxerimagom do alta resckzéo (708) Downlbad: Bato a imagem em amanno real Fig. 1. Distribuigdo de pares de individuos nas diferentes categorias de relacionamento, UR: nfo relacionado; HF: meios- irmios; FS: irmaos completos; PO: pai-filho, Nas andlises de parentesco considerando os 257 individuos genotipados, os quatro painéis de microssatélites permitiram estimar o grau de parentesco entre os individuos. No entanto, o painel contendo 10 loci no demonstrou alto nivel de confianga. O parentesco estimado pelo Painel 1 apresentou a maior variagdo em torno dos valores de parentesco esperados, enquanto os Painéis 2, 3 ¢ 4 apresentaram valores de r mais proximos do esperado para cada grau de parentesco ( Hig. 2). Unrelated Half siblings on °° : W 3 Boz Bos Eos Be: eit FA Fa E+ Bobo: oF Full siblings Parent-offspring 4.00 os : - goa Bor Zoe x 2, 1 Bese - 254 Boas oz =F = 7 + - = = 2 = bobo: of PoP iof Doves Suseriagen Ge ta esto (80K) Comba Bae man entra a hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub ane2604/2022 15:29 CComparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélilas © SNP genémicos Fig, 2. Valores de parenteseo para pares de individuos com diferentes graus de parentesco obtidos usando painéis, de microssatélites eontendo 10 (painel 1), 12 (painel 2), 15 (painel 3) ¢ 19 (painel 4) mareadores. s parentescos gendmicos médios foram semelhantes nos quatro painéis de microssatélites avaliados, ou seja, 0,08 para 0 Painel 1, 0,07 para o Painel 2, 0,07 para o Painel 3 ¢ 0,06 para o Painel 4. Esses valores eram esperados, pois a maioria dos pares de individuos no eram relacionados . Isso indica que um ntimero baixo de marcadores microssatélites pode gerar resultados confiéveis, considerando que um painel contendo 12 marcadores apresentou resultados semelhantes aos obtidos usando um painel com 19 marcadores microssatélites ( Fig. 2). 3.3 - Comparacdo de estimativas de parentesco obtidas usando SNP e mareadores microssatéites A matriz de relago gendmica obtida pelo painel SNP apresentou valores de r variando de 0,00 a 0,66, com média de 0,04. Esses valores foram semelhantes aos obtidos com paingis de microssatélites. A maioria dos pares de individuos apresentou valores de r proximos a 0,04 quando o painel SNP foi usado, enquanto que usando os painéis microssatélites, a maioria das estimativas de parentesco entre quaisquer dois individuos da populagio foram centradas em zero ( Fig, 3). Além disso, enquanto o mimero de marcadores microssatélites aumentou, o nimero de individuos com r = 0,00 diminuiu e a frequéncia de valores de parentesco entre 0,06 ¢ 0,08 aumentou. O valor médio de parentesco no Painel 1 (0,08) foi o mais distante do valor médio obtido no painel SNP (0,04). Por outro lado, a média obtida pelo Painel 4 (0,06) foi a que mais se aproximou do valor médio obtido pelos SNPs. Os valores da moda foram iguais «em todos os painéis de microssatélites, onde o valor mais frequente foi zero SNP panel Panel 1 Panel 2 80) ean = 0.04 mee) ean =008 ean = 007 Standard deviaton = 0.08 ‘Stancard deviaton = 0.10 ‘Sondard aovaton = 0.09 Males 000 eeoly Mode =0.00 ose = 000 ; uate PISSITFEIISF — GSESTTTSIIIIS — FIESITISIISIS ‘Kinship values Kinch values Kinship valves Panel Panel 4 om Mean = 0.07 me “Mean = 0.08 q Stancare aevision = 0.08 q Sracerd deviates = 0.08 3 ver 3 roe. 2 z & om. & soe. : 5 SHS SS FIL EP ISK PIII vanahip Dou Bakarimagem am skeet (87 KB) Dayna ae nage amar a Fig. g . Distribuigao dos valores de parentesco estimados usando um painel SNP (47.069 SNPs do painel OvineSNP50 BeadChip, Illumina Inc.) e diferentes painéis de microssatélites contendo 10 (Painel 1), 12 (Painel 2), 15 (Painel 3) ¢19 (Painel 4) ) marcadores. Em geral, as estimativas de parentesco geradas usando o painel SNP ou os painéis de microssatélites foram préximas, pois as matrizes de relacionamento foram altamente correlacionadas ( Tabela 5 }. Como esperado, a menor correlagao foi obtida entre os parentescos estimados pelo painel SNP ¢ o Painel 1 (0,89), enquanto a maior correlagao foi obtida entre os parentescos obtidos pelo painel SNP ¢ o Painel 4 (0,94). Tabela 5 . Correlagao de Pearson entre matrizes de relacionamento obtidas usando um painel SNP e diferentes painéis de microssatélites hitps:iwwe-sciencedinect.ez17.periodicos.capes.gov-brisciencetartcleipivS0921448821000845?va%3Dihub ane2604/2022 15:29 Comparagée de estimaivas de parentesco em ovsthas Santa Inés usando marcadores microssatélils © SNP genémicos Painel Painel Painel 2* Painel 3* Painel 4* sNP> 0.89 ose ose 094 Painels* 1.00 0.99 099 Painel 2" 1.00 099 Painel 3 * 1.00 Paingis de mierossatélites contendo 10 (Psinel 1), 12 (Painel 2), 15 (Painel 3) € 19 (Painel 4) mareadores. InformagGes de 47.069 SNPs do painel OvineSNP50 BeadChip (Illumina Ine). 4. Diseussaio Quando o desempenho dos marcadores foi avaliado, foi possivel observar que apenas 0 locus CSRM60 apresentou frequéncia alélica nula superior a 0,20, enquanto que as frequéncias alélicas nulas de todos os outros ‘marcadores microssatélites nio afetaram sua qualidade para andlise de parentesco ( Dakin e Avise, 2004 ). Isso pode ser confirmado pelos resultados do grau de polimorfismo e do ndmero de alelos, que foram clevados para os 19 mareadores microssatélites avaliados. Esses resultados sto esperados para locos de microssatélites, pois polimorfismos elevados sio comuns em varias espécies, como observado por Al-Atiyat (2015) em ovelhas australianas e por Agung et al. (2019) em bovinos. Os resultados da simulagdo mostraram que os estimadores de verossimilhanga ‘TrioML e DyadML apresentaram os maiores valores médios de parentesco, Por outro lado, o estimador de Ritland apresentou o menor valor médio de parenteseo. O TrioMI é um estimador de verossimilhanga triédico que usa um tereeiro individuo (W) como controle na estimativa der entre dois individuos foeais (X e Y), reduzindo assim a chance de genes idénticos por estado (IBS) serem erroneamente inferidos como idénticos por deseendéncia (IBD) ( Wang, 2007 ). DyadML é um estimador de probabilidade diddico que leva em conta diferentes condigdes de amostragem, como o mimero de loci amostrados, niimero de alelos segregantes e frequéncias alélicas (MILLIGAN, 2003 ).). O estimador de Ritland, por sua vez, depende muito da verdadeira relagao entre 0s individuos e a informagio genética real. Assim, este estimador é mais sensivel a erros de genotipagem ( Ritland, 1996 ). Nas andlises considerando as fazendas separadamente ou utilizando uma tinica populagio com todos os individuos, grande parte dos pares de individuos apresentou algum grau de parentesco. Esses resultados indicam que essas populagoes possuem um grande ntimero de individuos com um reprodutor ou mae comum. Esse tipo de parentesco é comum em rebanhos de ovinos, pois a maioria dos criadores de ovelhas utiliza um ou poucos machos reprodutores por muito tempo, 0 que contribui para a estrutura familiar citada acima ( Tino et al., 2020 ), Isso pode causar alguns efeitos indesejéveis a médio ¢ longo prazo, como a perda de informago genética, Como consequéncia, isso pode afetar a conservagio dos recursos genéticos e aumentar a homozigosidade. Assim, 0 monitoramento cuidadoso dessas populacdes ¢ importante para realizar um controle de endogamia mais eficiente. 0 conhecimento do grau de parentesco entre dois individuos de uma populagao é essencial para diferentes tipos de estudos, como conservacao de espécies, melhoramento genético e predigdo de valores genéticos em populagSes com pouca informagio de pedigree, mas que posstem individuos com parentes proximos. com registros conhecidos, A raga Santa Inés tem sido submetida a acasalamentos e cruzamentos aleatérios que causam perda de variabilidade genética, bem como a diminuigao da qualidade do rebanho ( Santos et al., 2016 ). Além disso, erros de pedigree causados principalmente por falhas nos registros de acasalamento so comuns em rebanhos de ovelhas Santa Inés ( (et al., 20:2), Nesse contexto, deve- se considerar também a dificuldade de implantagao de programas de apoio a selegdo e conservagao de recursos genéticos, pois a maioria desses programas tem dificil execucio e custos elevados, No presente estudo, painéis contendo mais de 12 mareadores microssatélites foram eficientes para estimativa de parentesco com 95% de confianca. Isso indica que um miimero baixo de marcadores pode gerar resultados precisos. Esses resultados corroboram 0 estudo de Yilmaz (2016) , que testou sete painéis de microssatélites para andlise de paternidade em ovelhas ¢ obteve o melhor resultado utilizando um painel contendo 12 marcadores. Yilmaz et ai. (2018)também demonstraram que o teste de paternidade alcangou alta preciso usando um ndimero relativamente pequeno de microssatélites (menos de hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub sone.26510472022 15:39 __Comparagdo de estimativas de parentesco em ovelhas Sanla Inés usando marcadores microssatéiles e SNP genémicos 12). No entanto, como mencionado acima, ha uma escasser de anélises comparando a preciso de microssatélites e SNPs para anélise de parentesco em ovelhas. Até onde sabemos, ndo hé relatos deste tipo de estudo em ovelhas Santa Inés. ‘Varios estudos jé utilizaram marcadores SNP para construir a relago dos individuos (ex . Santure et al., 2010 ; Harlizius et al,, 2011 Lopes etal, 2013 ). Os mareadores SNP tém como vantagens sa ampla cobertura do genoma ( Brumfield etal, 2003) ea baixa taxa de erro de genotipagem. No entanto, os SNPs sao bialélicos e apresentam baixa taxa de heterozigosidade ( Kaiser et al, 2017 ). Portanto, um nimero maior de SNPs 6 recomendado para andlise de parentesco (Glaubitz etal, 2003 ; Santure et al, 2010 ) A grande quantidade de dados gerados quando os SNPs sio utilizados pode limitar seu uso, devido ao aumento da complexidade das andlises eomputacionais ( Hubley et al., 2003 ). Isso pode aumentar o custo das anilises, o que pode ser ‘um problema, principalmente para pequenos lotes ( Santos etal, 2017). No presente estudo, os valores de parentesco obtidos com os painéis de microssatélites foram semelhantes aos obtidos com os dados do SNP. No entanto, mais pares de individuos com r = 0,00 foram identificados usando os painéis contendo 10 & 12 microssatélites do que usando o painel SNP. Esses resultados eram esperados e confirmam que um némero reduzido de ‘marcadores microssatélites tem potencial informativo para estimativa de parentesco equivalente a um grande nimero de ‘marcadores SNP. Assim, a anzilise de parentesco utilizando marcadores microssatélites pode ser inclufda em programas de melhoramento e conservacio de ovinos Santa Inés para garantir um controle eficiente da endogamia e evitar a perda de informagées genéticas. Além disso, a aplicagio desta metodologia em programas de melhoramento pode auxiliar no melhoramento genético da raga Santa Inés através da estimativa dos valores genéticos destes ovinos para caracteristicas de interesse. No presente estudo, essa metodologia gerou resultados confldveis e teve custos menores do que a anilise que utilizou SNPs para estimativa de parentesco em lotes com tamanho pequeno ou controle de pedigree ruim. 5 -Conclus Um painel contendo apenas 12 mareadores microssatélites pode estimar adequadamente o parentesco em ovelhas Santa Inés, com 95% de confianga. O parentesco obtido usando este painel foi altamente correlacionado com o estimado usando marcadores SNP Assim, 6 possivel inferir que o uso de marcadores microssatélites é uma alternativa adequada para estimativa de parentesco em ovinos Santa Inés e pode ser utilizado para dar suporte em programas de melhoramento, conservagiio de recursos genéticos e rebanhos com controle genealégico deficiente. Além disso, as informagGes geradas pelos microssatélites neste estudo podem ser utilizadas para corrigir erros de pedigree e para controle de endogamia, resultando em ganhos na prediglo de valores genéticos . Esses beneficios do uso de microssatélites melhorariam a produgao e a sade dos animais e aumentariam a lucratividade dos eriadores de ovinos, prineipalmente em pafses em desenvolvimento ou emergentes. Financiamento © Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolégico (CNPq) concedeu bolsa de estudos ao primeiro autor. Este estudo também foi parcialmente financiado pela Coordenagao de Aperfeigoamento de Pessoal de Nivel Superior — Brasil (CAPES ~ Registro n°: 001). Instituto Nacional de Ciéncia e Tecnologia em Zootecnia (INCT-CA; Processo 465377/2014-9), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq; Processo: 481031/2012-0), Universidade Federal do Piaut ( UFPI; Bolsa 2013NE'801717 ), e Fundagao de Amparo a Pesquisa e Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico do Maranhao(FAPEMA; Processo 01488/16) deu apoio financeiro para a genotipagem dos animais. Contribuigio dos autores Alzira Regina Silva de Deus: Conceituacio, Curadoria de Dados, Investigacao, Metodologia, Administracio de Projetos, Software, Redagdo - Rascunho Original. Geice Ribeiro Silva : Metodologia, Software, Andlise Formal, Redagdo ~ Revisio € Edigio, Luciano Silva Sena : Metodologia, Software, Andlise Formal, Investigago, Redagao ~ Revisio e Edigao. Fabio Barros Britto : Validacio, Redacio — Revisio e Edicio. Débora Aratijo de Carvalho : Metodologia, Redacdo ~ Revistio € Edigio, Jorge Victor Gomes de Freitas : Metodologia, Redagio - Revisio e Edigio. José Lindenberg Rocha hitps:ww-sciencedinect.ez17.peridicos.capes.gov-brisciencelartcleipivS0821448821000845?va%3Dihub 11826/0472022 1539 Comparagéo de estimativas de parenisco em ovelhas Santa Inés usando marcadores mirossaléles e SNP genémicos Sarmento: Conceituagio, Metodologia, Validagio, Supervisio, Administragio de Projetos, Captagio de Recursos, Redagio — Revisio e Ediclo, Declaragio de Interesse Concorrente 0s autores declaram que néo hé confitos de interesse. Reconhecimentos Os autores agradecem o apoio dos criadores de ovinos Santa Inés dos estados do Piaui e Maranhio e da Embrapa Meio~ Norte pela coleta de dados. Attigos recomendados Referéncias “Agung eLal, 2019 PP Agung, F, Saputra, MSA Zein AS Wolandari, WB Putra, S. Said, J. 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