Fosforilação Oxidativa

Princípios chave

Mitocôndrias tem papel central no metabolismo aeróbico eucariótico

Mitocôndrias tem origem evolucionária ligada a bactérias

Elétrons fluem de doadores de elétron (substratos oxidáveis) através de uma

cadeia de carregadores membranares a um aceptor final com grande potencial
de redução

A energia livre disponível pelo fluxo exergônico de elétrons é acoplado ao

transporte de prótons através de uma membrana impermeável a prótons

O fluxo transmembranar de prótons de volta pelo gradiente eletroquímico

através de canais específicos fornece energia livre para a síntese de ATP

A teoria quimiosmótica

teoria quimiosmótica → diferenças transmembranares de concentrações de

prótons são o reservatório para a extração de energia a partir de reações de
oxidação biológica

Fosforilação Oxidativa 1
 A cadeia respiratória mitocondrial ou cadeia transportadora de elétrons

Mitocôndrias possuem duas membranas

membrana externa que é permeável a pequenas moléculas e íons

- transporte ocorre por porinas

membrana interna é impermeável à maioria das moléculas pequenas e íons

- transporte necessita de transportadores específicos

Fosforilação Oxidativa 2
 A matriz mitocondrial

a matriz mitocondrial contém:

- o complexo piruvato desidrogenase
- enzimas do ciclo do ácido cítrico
- enzimas da beta-oxidação
- enzimas da via de oxidação de aminoácidos

Fosforilação Oxidativa 3
 a membrana mitocondrial interna segrega intermediários e enzimas das vias
metabólicas citosólicas e mitocondriais

Efeito do estresse na mitocôndria

durante crescimento e divisão celular, mitocôndria se divide por fissão

condições de estresse podem ativar

- fissão mitocondrial
- mitofagia → quebra de mitocôndria e reciclagem de aminoácidos,
nucleotídeos e lipídeos

a medida que o estresse acaba, pequenas mitocôndrias se fundem para formar

organelas tubulares longas e finas

Elétrons são canalizados a aceptores universais de elétrons

cadeia respiratória → série de carregadores de elétrons

desidrogenases coletam elétrons de vias catabólicas e afunilam eles em

aceptores universais
- nucleotídeos de nicotinamida (NAD+ ou NADP+)
- nucleotídeos de flavina (FMN ou FAD)

Desidrogenases ligadas a nucleotídeos de nicotinamida

catalizam reações reversíveis do tipo:

dois átomos de hidrogênio são removidos do substrato

- um é transferido como íon hidreto ao NAD(P)+
- um é liberado como H+ no meio

Reações importantes catalisadas por essas enzimas

Fosforilação Oxidativa 4
 M→ mitocôndria, C → citosol
Flavoproteínas

Flavoproteínas → contém nucleotídeo de flavina fortemente ligado e as vezes

covalentemente (FMN ou FAD)

O nucleotídeo de flavina oxidado pode aceptar tanto:

- um elétron (gerando a forma semiquinona)
- dois elétrons (gerando FADH2 ou FMNH2)

Elétrons passam através de uma séria de carregadores membranares

três tipos de transferência de elétrons acontecem na fosforilação oxidativa

- transferência direta de elétrons
- transferência como átomo de hidrogênio (H+ + e-)
- transferência de íon hidreto (H-)

equivalente redutor → único elétron equivalente transferido numa reação

redox

Moléculas carregadores de elétron na cadeia respiratória

cinco tipos de moléculas

- NAD
- flavoproteínas
- ubiquinona (coenzima Q ou Q)
- citocromos
- proteínas ferro-enxofre

Ubiquinona

Fosforilação Oxidativa 5
 benzoquinona solúvel em lipídeos com uma cadeia lateral isoprenoide longa
- pode aceitar um ou dois elétrons
- difundida livremente dentro da membrana mitocondrial interna
- papel central no acoplamento do fluxo de elétrons com movimentação de
prótons

Citocromos

proteínas com característica forte de absorção de luz visível por conta do grupo
heme prostético contendo ferro
- carregam um elétron
- 3 classes na mitocôndria: a, b e c
→ hemes do a e b não são ligados covalentemente a
proteínas associadas
→ c é ligado covalentemente por resíduos de cisteína

Grupos prostéticos dos citocromos

Fosforilação Oxidativa 6
 Proteínas ferro-enxofre

proteínas que contém ferro em associação com átomos de enxofre inorgânicos

e/ou com átomos de enxofre de resíduos de cisteína na proteína
- participam na transferência de um elétron

proteínas ferro-enxofre de rieske → proteínas onde um átomo de Ferro é

coordenado com dois resíduos de histidina (ex: hemoglobina)

Fosforilação Oxidativa 7
 Métodos para determinar a sequência dos carregadores de elétrons

determinar o potencial de redução individual dos carregadores de elétrons

reduzir a cadeia completa de carregadores por remoção de oxigênio e então

medir a taxa de oxidação de cada carregador quando oxigênio é reintroduzido

medir os efeitos de inibidores da transferência de elétrons em cada estado de

oxidação de cada carregador

Potenciais de redução padrão de carregadores de elétrons individuais

elétrons tendem a fluir espontaneamente de carregadores com menor potencial

de redução para carregadores com maior potencial

Fosforilação Oxidativa 8
 Sequência dos carregadores de elétrons

a ordem é:

NADH → Q → citocromo b → citocromo c1 → citocromo c → citocromo a →

citocromo a3 → O2
Carregadores de elétrons funcionam em complexos multienzimáticos

quatro complexos carregadores de elétrons catalisam a transferência de

elétrons através de uma porção da cadeia
- Complexo I do NADH para ubiquinona
- Complexo II do succinato para ubiquinona
- Complexo III da ubiquinona para citocromo c
- Complexo IV do citocromo c para O2

Componentes proteicos da cadeia mitocondrial de transferência de elétrons

Separação dos complexos funcionais da cadeia respiratória

Fosforilação Oxidativa 9
 Complexo I: NADH a Ubiquinona

Complexo I (NADH:ubiquinona-oxidorredutase ou NADH-desidrogenase)

→ grande enzima em formato de L com mais de 40 cadeias polipeptídicas
- flavoproteinas que contém FMN aceptam 2 elétrons do NADH
- 8+ centros Fe-S passam elétrons a ubiquinona

Fosforilação Oxidativa 10
 Complexo I catalisa dois processos simultâneos e acoplados

Complexo I catalisa:
- transferência exergônica de um íon hidreto do NADH e um próton da matriz
para a ubiquinona
- transferência endergônica de 4 prótons da matriz para o espaço inter-
membrana

Complexo I é uma bomba de prótons

Complexo I é uma bomba de prótons direcionada pela energia da transferência

de elétrons

Complexo I catalisa a reação vetorial (move prótons em uma direção específica

de um lugar para o outro)

Reação global do Complexo I

Fosforilação Oxidativa 11
 as letras P e N indicam a direção dos prótons

Agentes que inibem a fosforilação oxidativa

inibidores do complexo I
- amital (fármaco barbitúrica)
- rotenona (inseticida)
- piericidina A (antibiótico)

*pensar o que acontece quando você perde a capacidade de transferir elétrons na

cadeia respiratória
Complexo II: Succinato a Ubiquinona

Complexo II (succinato-desidrogenase) → acopla a oxidação de succinato

com a redução de ubiquinona
- elétrons passam do FAD para os centros Fe-S para Q
- não há bombeamento de prótons
- também funciona na conversão de succinato a fumarato no ciclo do ácido
cítrico

Fosforilação Oxidativa 12
 Heme b do complexo II

Heme b reduz a frequência em que elétrons “vazam” do sistema, movendo do

succinato ao oxigênio molecular para produzir Espécies reativas de oxigênio
(ERO) H2O2 e o radical superóxido, heme b reduz a frequência disso
acontecer

Complexo III: Ubiquinona a citocromo c

Complexo III (complexo citocromo bc1, ubiquinona:citocromo c-

oxidorredutase) → acopla a transferência de 2 elétrons de ubiquinol ao
citocromo c com o transporte vetorial de 4 prótons ao espaço intermembrana
- contém citocromo b, citocromo c1 e a proteína ferro-enxofre de Rieske

Fosforilação Oxidativa 13
 Caminho dos elétrons através do complexo III

ubiquinona se difunde através da membrana mitocondrial interna e transfere

elétrons ao citocromo b

elétrons passam a um centro Fe-S no qual passa elétrons, um de cada vez,

através do citocromo c

Ciclo Q

Fosforilação Oxidativa 14
 Complexo IV: citocromo c a O2

Complexo IV (citocromo oxidase) → carrega elétrons do citocromo c para

oxigênio molecular reduzindo-o a H2O
- enzima grande
- 3 subunidades foram conservadas através da evolução
- contém citocromo a e a3
- contém dois íons de cobre

Fosforilação Oxidativa 15
 *cobre é muito bom em conduzir eletricidade, logo ele facilita o fluxo de elétrons
Citocromo c

citocromo c:
- se move pelo espaço intermembrana
- carrega um único elétron do complexo citocromo bc1 para o complexo IV
- absorve luz visível

Caminho dos elétrons através do complexo IV

Fosforilação Oxidativa 16
 Complexos mitocondriais se associam em respirassomos

respirasssomo → supercomplexo contendo os complexos I, III e IV

- podem facilitar a transferência de elétrons ou limitar a produção de ERO

citocromo c e ubiquinona se difundem rapidamente entre supercomplexos

Outras vias doam elétrons a cadeia respiratória via ubiquinona

Fosforilação Oxidativa 17
 Resumo do fluxo de elétrons e prótons através da cadeia respiratória

grande parte da energia livre gera é recuperada e armazenada na forma de um

gradiente eletroquímico de prótons através da membrana mitocondrial interna

Força próton-motriz

a energia armazenada em um gradiente eletroquímico de prótons através da

membrana mitocondrial interna
- composto de energia potencial química e elétrica

Fosforilação Oxidativa 18
 Espécies reativas de oxigênio são geradas durante a fosforilação oxidativa

superóxido-dismutase → catalisa a conversão de superóxido e dois prótons a

H2O2 e O2

glutationa-peroxidase → converte H2O2 em H2O

baixo nível de ERO serve como sinal que reflete O2 insuficiente (hipóxia)

Fosforilação Oxidativa 19
 Síntese de ATP

No modelo quimiosmótico, oxidação e fosforilação são obrigatoriamente

acoplados

modelo quimiosmótico → descreve o acoplamento da síntese do ATP a um

gradiente eletroquímico de prótons (força próton-motriz)

Fosforilação Oxidativa 20
 Síntese de ATP

ATP-sintase → direciona a síntese de ATP a medida que prótons fluem

passivamente de volta a matriz através do seu poro de prótons

para enfatizar o papel da força próton-motriz, a quação para a síntese do ATP é:

Acoplamento da transferência de elétrons e síntese de ATP na mitocôndria

inibidores da transferência de elétrons bloqueiam a síntese de ATP

inibidores da síntese de ATP bloqueia a transferência de elétrons (a menos que

a oxidação e fosforilação sejam desacopladas)

Desacopladores químicos da fosforilação oxidativa

detergentes ou ação física pode desacoplar a transferência de elétrons da

síntese de ATP

Fosforilação Oxidativa 21
 DNP e FCCP → ácidos fracos que carregam prótons através da membrana
mitocondrial
- irão dissipar o gradiente de prótons

Força próton-motriz sozinha direciona a síntese de ATP

na ausência de um substrato oxidável, a força próton-motriz consegue

direcionar a síntese de ATP

Fosforilação Oxidativa 22
 ATP-sintase possui dois domínios funcionais, Fo e F1

ATP-sintase mitocondrial é uma ATPase do tipo F

- similar em estrutura e mecanismo a ATP-sintases de bactérias e cloroplastos

ATP-sintase mitocondrial

contém dois componentes distintos

- Fo = proteína integral da membrana com um poro para prótons
- F1 (originalmente F1 ATPase) = proteína membranar periférica → catalisa a
hidrólise do ATP quando isolada

ATP é estabilizado em relação ao ADP na superfície de F1

na superfície de F1, a reação ADP + Pi ⇌ ATP + H2O é prontamente reversível

ATP-sintase estabiliza ATP em relação a ADP + Pi por ligar mais fortemente o
ATP, liberando energia suficiente para equilibrar o custo da energia de produção
do ATP

Fosforilação Oxidativa 23
 O gradiente de prótons influencia na liberação de ATP da enzima superficial

a energia livre requerida para liberação do ATP é fornecida pela força próton-
motriz

Fosforilação Oxidativa 24
 Cada subunidade beta da ATP-sintase pode assumir 3 conformações

F1 mitocondrial tem diversos domínios e um deles é o domínio beta que possui

3 subunidades beta
- cada uma das 3 subunidades beta tem um sítio catalítico para a síntese de
ATP
- cada subunidade tem uma conformação diferente
→beta-ATP
→beta-ADP
→beta-vazio

Fosforilação Oxidativa 25
 roxo = subunidades beta

Estrutura do complexo Fo

Fo mitocondrial tem a composição de 3 subunidades a b e c

anel c → arranjo de subunidades c em dois círculos concêntricos

- as subunidades c rodam juntas como uma unidade

Estrutura do complexo FoF1

Fosforilação Oxidativa 26
 H+ passa pelo poro e fornece energia pra subunidade c rotacionar, a rotação
promove a síntese de ATP

Catálise rotacional é chave para o mecanismo de alteração na ligação durante

a síntese do ATP

catálise rotacional → mecanismo onde o fluxo de prótons através de Fo causa

a rotação do anel c e, em troca, ativa mudanças conformacionais em F1

Modelo de troca de ligação

o sítio ativo de cada subunidade beta cicla pelas três conformações possíveis
- beta-ATP → ligação forte
- beta-ADP → ligação frouxa
- beta-vazio → ligação muito frouxa

Modelo de troca de ligação para a ATP-sintase

os três sítios ativos tem turnos catalisando a síntese de ATP

translocação de três prótons alimenta a síntese de um ATP

cada rotação completa sintetiza três ATP

Fosforilação Oxidativa 27
 Acoplamento da translocação de próton com síntese de ATP

translocação dos prótons causa rotação de Fo

- causa mudança conformacional entre todos os três pares alfa beta, onde um
deles promove a condensação de ADP + Pi em ATP

Demonstração experimental da rotação de Fo e y (eixo)

a subunidade y gira em uma direção quando FoF1 está sintetizando ATP e na

direção oposta quando está hidrolisando ATP

Fosforilação Oxidativa 28
 A força próton-motriz energiza o transporte ativo

adenina-nucleotídeo-translocase → antiportador que move ADP para matriz e

ATP pra fora

fosfato-translocase → promove simporte de um H2PO4- e um H+ para a

matriz

ATP-sintassomo → complexo de ATP-sintase a ambas translocases

Fosforilação Oxidativa 29
 Sistemas de lançadeiras conduzem o NADH citosolico indiretamente para a
oxidação na mitocôndria

a membrana mitocondrial interna é impermeável a NADH e NAD

equivalentes de NADH são movidos do citosol para a matriz pela

- lançadeira malato-aspartato
- lançadeira glicerol-3-fosfato

A lançadeira Malato-Aspartato

Equivalentes redutores de NADH são movidos pela lançadeira malato-aspartato

e entram na cadeia respiratória no complexo I

Fosforilação Oxidativa 30
 1- O NADH no citosol entra no espaço intermembrana e passa dois equivalentes
redutores ao oxaloacetato, produzindo malato pela malato-dehidrogenase

2 - O malato cruza a membrana interna por um transportador de malato-α-

cetoglutarato.

3 - Na matriz, o malato passa os dois equivalentes redutores que pegou no espaço

intermembrana ao NAD+ da matriz (e o NADH resultante disso é oxidado na cadeia
respiratória) e é transformado em oxaloacetato

4 - O oxaloacetato é transaminado por uma aminotransferase que transfere um

grupamento amino do glutamato (α-cetoácidos recebem grupamento amina para
formar um aminoácido) em aspartato e produzindo α-cetoglutarato (que sai pelo
transportador do passo 2)

5 - O aspartato sai da matriz para o citosol por um transportador de

glutamatoaspartato

6 - O aspartato é regenerado a oxaloacetato (aspartato + α-cetoglutarato) e

produzindo glutamato (que volta para a matriz pelo transportador do passo 5)
completando o ciclo

Lançadeira glicerol-3-fosfato

equivalentes redutores de NADH que são movidos pela lançadeira glicerol-3-

fosfato entram na cadeia respiratória no complexo III

Fosforilação Oxidativa 31
 1 - A di-hidroxiacetona-fosfato recebe dois equivalentes redutores do NADH
citosólico e é convertida em glicerol-3-fosfato pela enzima citosólica

2 - O glicerol-3-fosfato entrega os dois equivalentes redutores ao FAD, gerando

FADH2 e a enzima mitocondrial na superfície da membrana regenera a di-
hidroxiacetonafosfato
3 - FADH2 entrega os dois equivalentes redutores a ubiquinona que os carrega para
o complexo III
Regulação da fosforilação oxidativa

Produção de ATP a partir da oxidação completa da glicose

Fosforilação Oxidativa 32
 glicólise em condições anaeróbicas (fermentação lática) produz somente 2
ATPs por molécula de glicose

Fosforilação Oxidativa é regulada pela necessidade de energia

controle pelo aceptor da respiração = ADP

- a taxa de consumo de O2 depende da disponibilidade de ADP, o aceptor de
fosfato inorgânico Pi

Uma proteína inibitória impede a hidrólise de ATP

IF1 = proteína inibitória que simultaneamente liga 2 moléculas de ATP para inibir
atividade enzimática em ambas as direções
- ativa na forma dimerica, ocorre quando o pH < 6,5 (células em condição de
hipóxia produzem muito ácido lático, o que diminui o pH e ativa essa proteína
inibitória)

em condição de hipoxia, IF1 liga e previne a queda drástica na concentração de

ATP
→ a queda drástica poderia acontecer pela ação inversa da ATPsintase,
impedindo que ela hidrolise ATP para jogar prótons para fora

Fosforilação Oxidativa 33
 Hipoxia leva a produção de ERO e outras respostas adaptativas

defesas contra ERO:

- sistema glutationa peroxidase
- regulação da piruvato desidrogenase
→ fosforilada em condições de hipóxia (PDH-cinase)
- modificação de uma subunidade do Complexo IV → age de maneira mais
eficiente em condições de hipoxia

Regulação de expressão gênica por HIF-1

HIF-1 = fator induzido por hipoxia

- acumula em células hipóxicas
- age como fator de transcrição
- regulador da homeostase de O2
- medeia mudanças no transporte de glicose e enzimas glicolíticas que
produzem o efeito Warburg

Fosforilação Oxidativa 34
 Vias produtora de ATP são reguladas coordenadamente

A concentração relativa de ATP e ADP controlam as taxas de:

- transferência de elétrons
- fosforilação oxidativa
- ciclo do ácido cítrico
- oxidação do piruvato
- glicólise

Fosforilação Oxidativa 35
 → saber quais vias são inibidas e induzidas baseado na concentração de ATP e
ADP

Fosforilação Oxidativa 36
 Mitocôndrias na termogênese, síntese de esteróides e apoptose
Desacoplamento na mitocôndria em tecido adiposo marrom produz calor

tecido adiposo marrom = tecido adiposo em recém nascidos que funciona

para gerar calor através de oxidação de combustível

proteína desacopladora 1 (UCP1)(termogenina) = transportador simporte de

ácido graxo de cadeia longa/H+ que fornece um meio para prótons retornarem a
matriz sem passarem pela ATP sintase
- resulta na energia da oxidação sendo dissipada como calor

hidrólise de fosfocreatina (PCr) também libera calor

Mitocôndrias são centrais para o início da apoptose

apoptose (morte celular programada) = processo onde células individuais

morrem para o bem do organismo

podem ser ativado:

- durante desenvolvimento embrionário (ligações entre os dedos, etc)
- resposta a sinalização externa
- eventos internos (dano ao DNA, infecção viral, estresse oxidativo por acumulo
de ERO, choque térmico)

Papel do citocromo c na apoptose

complexo do poro de transição de permeabilidade (CPTP) = proteína de

subunidades multiplas na membrana que se abrem para aumentar
permeabilidade

Fosforilação Oxidativa 37
 Apaf-1 (protease fator de ativação de apoptose) = monomeros que interagem
com citocromo c para formar um apoptossomo

caspases = proteases envolvidas na apoptose

Genes mitocondriais: origem e efeitos de mutação

Fosforilação Oxidativa 38
 13 proteínas mitocondriais são codificadas pelo genoma mitocondrial e
sintetizadas na mitocôndria

cerca de 1200 proteínas mitocondriais são codificadas pelo genoma nuclear e

importados para a mitocôndria

Proteínas respiratórias codificadas por genes mitocondriais em humanos

Mitocôndrias evoluíram a partir de bactérias endossimbióticas

Fosforilação Oxidativa 39
 mitocôndrias surgiram a partir de bactérias aeróbicas que entraram numa
relação endossimbiótica com eucariotos primitivos
- bactérias endossimbióticas eventualmente viraram mitocôndrias

o mecanismo quimiosmótico provavelmente evoluiu antes da emergência de

eucariotos

Extrusão de prótons ligada a respiração também medeia outros processos

absorção de nutrientes extracelulares contra um gradiente de concentração

ocorre em simporte com prótons

o movimento rotacional do flagelo bacteriano é realizado pelo potencial

eletroquímico transmembranar

Mutações no DNA mitocondrial acumulam ao longo da vida do organismo

defeitos no DNA mitocondrial ocorrem ao longo do tempo por:

- maior exposição a ERO
- o sistema de replicação do DNA mitocondrial é menos efetivo que o nuclear
em corrigir erros e danos

animais herdam essencialmente toda mitocôndria do parente fêmea

Heteroplasmia e Homoplasmia

Heteroplasmia = diferentes tipos de genoma mitocondrial em uma célula

- resulta em fenótipos mutantes com graus de severidade variados

Homoplasmia = o genoma mitocondrial é o mesmo em uma célula

Fosforilação Oxidativa 40
 Diferentes graus de heteroplasmia produzem mitocondrias diferentes, mutações na citocromo-
oxidase (complexo IV) foram coloridos de marrom

Algumas mutações no genoma mitocondrial causam doenças

encefalomiopatias mitocondriais = grupo de doenças genéticas que afetam

principalmente o cérebro e músculo esquelético
- herdadas da mãe

Fosforilação Oxidativa 41
 neuropatia optica hereditária de Leber (LHON) = doença rara que afeta o
sistema nervoso central
- substituição de um amino ácido no complexo I faz com que a mitocôndria seja
parcialmente defeituosa na transferência de elétrons do NADH para ubiquinona

Doença da epilepsia mioclônica e fibra vermelha rota (doença de MERRF)

causada por uma mutação no gene que codifica tRNA específico para lisina

fibras do músculo esquelético de indivíduos afetados possuem mitocôndrias de

formato anormal que, as vezes, contém estruturas paracristalinas

Doação de mitocôndrias

doação de mitocôndrias = transplante dos genes nucleares de uma mãe

prospectiva em um óvulo enucleado de um doador com mitocôndria saudável
- cria um óvulo livre de uma mutação que levaria a uma doença mitocondrial
- levantamento de questões éticas

Fosforilação Oxidativa 42
 Forma rara de diabetes é resultado de defeitos na mitocôndria em células beta
pancreáticas

defeitos mitocondriais em células beta pancreáticas podem limitar a produção

de ATP quando níveis de glicose estão altos

compromete a liberação de insulina e da origem a um tipo de diabetes tipo 2

célula produzindo ATP normalmente → fecha canal de cálcio → despolariza membrana → abre
canal de cálcio → influxo de cálcio libera grânulos de insulina.

Fosforilação Oxidativa 43