UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS - UEA ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA EST CURSO DE ENGENHARIA FLORESTAL

PADRONIZAO DO TESTE DE TETRAZLIO DE SEMENTES DE PARKIA VELUTINA BENOIST

ADRIANA DE ARAJO BASTOS

Manaus/AM Janeiro/2007

PADRONIZAO DO TESTE DE TETRAZLIO PARA SEMENTES DE PARKIA VELUTINA BENOIST

ADRIANA DE ARAJO BASTOS

Monografia apresentada Escola Superior de Tecnologia-EST da Universidade do Estado do Amazonas para obteno do grau de Engenheira Florestal.

Orientadores: ngela Maria da Silva Mendes, M. Sc. Maria da Glria Gonalves de Melo, M.Sc.

Manaus/AM Janeiro/2007

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS / UEA ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA / EST

Manaus, 24 de Janeiro de 2007.

Ns aceitamos e recomendamos o trabalho intitulado "Padronizao do teste de Tetrazlio para sementes de Parkia velutina Benoist, submetido por Adriana de Arajo Bastos da Escola Superior de Tecnologia como parte para obteno do grau de Engenharia Florestal da Universidade do Estado do Amazonas.

Banca Examinadora

_______________________________________________ Sheyla Melo Fontes, Especialista.

_______________________________________________ Micheli Braule Pinto, M. Sc.

_________________________________________________ ngela Maria da Silva Mendes, M. Sc. ORIENTADORA

DEDICO Aos meus pais, Izabel e Joo Augusto, como forma de expressar meu amor e minha gratido pela vida e educao, aos meus irmos e sobrinhos, e especialmente minha filha Isabela, meu grande amor.

AGRADECIMENTOS Agradeo a Deus, fora que no se explica, mas que est sempre presente; Aos meus pais Izabel Arajo dos Santos e Joo Augusto Medeiros Bastos pelo amor, carinho, dedicao, pacincia e incentivo aos estudos; Fundao de Amparo Pesquisa do Amazonas FAPEAM, financiadora do Projeto Estudos Morfolgicos e Tecnolgicos para Incluso de Sementes do Gnero Parkia de Ocorrncia na Amaznia Ocidental nas RAS e deste trabalho; s Professoras ngela Maria da Silva Mendes e Maria da Glria Gonalves de Melo, expresso meus sinceros agradecimentos pela orientao e pacincia dispensada durante a realizao deste trabalho e durante a graduao; Aos colegas de curso, companheiros de venturas e desventuras; Aos queridos amigos Keit Maciel da Gama e Orson Herwellin de Oliveira, pelos momentos maravilhosos de descontrao, as aulas eram mais divertidas com vocs por perto; grande amiga Adriana Bind Lima, que teve grande participao no que eu hoje sou com seu exemplo de honestidade, simplicidade e perseverana; colega Larissa Ramos Chevreuil, meu muito obrigado; Ao querido amigo Adamir da Rocha Nina Junior, pela amizade sincera, paciente e constante, presente durante todo o curso, dentro da sala de aula e fora dela; querida e amada filha Isabela Bastos Pio, pelo apoio, amor e compreenso nas horas difceis, de solido e saudade da mame; Aos meus irmos, sobrinhos e toda a minha famlia pela ajuda, pacincia, compreenso e total apoio; minha amiga Sheyla Fontes Pinto, pela grande ajuda, apoio e incentivo; E a todos que contriburam direta ou indiretamente para minha formao.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Teste de tetrazlio em sementes de algodo........................................... Figura 2. Parkia velutina Benoist.............................................................................. Figura 3. Sementes de P. velutina Benoist..............................................................

15 18 19

Figura 4. Base de Operaes Gelogo Pedro de Moura......................................... 20 Figura 5. Escarificao das sementes..................................................................... Figura 6. Pr-condicionamento................................................................................ Figura 7. Semente embebidas................................................................................. Figura 8. Sementes coloridas................................................................................... Figura 9. Eixo embrionrio e cotildones predados de P. velutina.......................... Figura 10. Classes de viabilidade obtidas no teste de tetrazlio............................. Figura 11. Sementes viveis e Sementes inviveis................................................. 22 27 28 29 31 32 33

RESUMO A demanda por sementes florestais vem aumentando a cada dia, existe no mercado uma necessidade de obter resultados cada vez mais rpidos e seguros sobre a qualidade das sementes. O presente estudo teve como objetivo auxiliar na utilizao do teste de tetrazlio nas sementes de Parkia velutina Benoist, padronizando os procedimentos pr-condicionantes e a concentrao de tetrazlio adequada na soluo para o teste nesta espcie. Na primeira etapa foram avaliados os mtodos pr-condicionantes das sementes, com trs mtodos de escarificao, desponte, puno e lixa nas laterais das sementes, com 100 ml de gua para cada 50 sementes e permanncia em cmara a 25C por 16 hs sendo que nenhum destes mtodos apresentou resultado satisfatrio. Baseado nos resultados obtidos neste primeiro teste optou-se pela unio de dois mtodos de escarificao: desponte e lixa nas laterais, com 200 ml de gua para cada 50 sementes e permanncia em cmara a 30C por 16 hs, obtendo assim 100% de xito. Na segunda etapa, foram avaliadas as solues com trs concentraes de tetrazlio: 1,0%, 0,5% e 0,1%. Constatou-se que o teste de terazlio na concentrao de 0,5% pode ser avaliado para avaliar a viabilidade das sementes de P. velutina,como complemento do teste de germinao, contudo, este teste no permite avaliar o vigor das sementes, mas pode ser utilizado na caracterizao de leses ocasionadas pelo ataque de insetos e danos mecnicos. Com os resultados obtidos neste trabalho, recomenda-se que sejam estabelecidas classes de vigor prprias para sementes de P. velutina.

Palavras chaves: P. velutina, tetrazlio, viabilidade, vigor.

ABSTRACT The demand for forest seeds is increasing every day, it exists at the market a need to obtain resulted more and more fast and insurances about the quality of the seeds. The present study had as auxiliary objective in the use of the tetrazolium test in the seeds of Parkia velutina Benoist, standardizing the procedures pay-condicionant and the concentration of appropriate tetrazolium in the solution for the test in this species. In the first stage they were appraised the methods pay-condicionant of the seeds, with three removal of tegument methods, lopping of the tops, perfurate and sandpaper in the lateral of the seeds, with 100 ml of water for each 50 seeds and permanence in camera to 25C for 16 hours and none of these methods presented satisfactory result. Based on the results obtained in this first test she opted for the union of two removal of tegument methods: blunt and sandpaper in the lateral ones, with 200 ml of water for each 50 seeds and permanence in camera to 30C for 16 hours, obtaining like this 100% of success. In the second stage, they were appraised the solutions with three tetrazolium concentrations: 1,0%, 0,5% and 0,1%. it was Verified that the terazolium test in the concentration of 0,5% can be evaluated to evaluate the viability of the seeds of P. velutina, complement of the germination test, however, this test doesn't allow to evaluate the energy of the seeds, but it can be used in the characterization of lesions caused by the attack of insects and mechanical damages. With the results obtained in this work, it is recommended that are established own energy classes for seeds of P. velutina.

Key-words: P. velutina, tetrazolium, viability, vigor.

SUMRIO

INTRODUO............................................................................................................ 1 REFERENCIAL TERICO....................................................................................... 1.1 AVALIAO DA QUALIDADE FISIOLGICA DAS SEMENTES.................... 1.2 TESTE DE TETRAZLIO EM SEMENTES....................................................... 1.3 GNERO PARKIA............................................................................................. 1.4 CARACTERSTICAS GERAIS DE Parkia velutina Benoist............................ 1.4.1 Morfologia de Semente de Parkia velutina Benoist................................ 2 MATERIAL E MTODOS......................................................................................... 2.1 PROCEDNCIA DAS SEMENTES.................................................................... 2.2 LOCAL DO EXPERIMENTO.............................................................................. 2.3 BENEFICIAMENTO E ARMAZENAMENTO DAS SEMENTES........................ 2.4 TESTE PADRO DE GERMINAO................................................................ 2.5 PADRONIZAO DO TESTE DE TETRAZLIO............................................. 2.5.1 Tratamentos pr-condicionantes.............................................................. 2.5.2 Concentrao da soluo de Tetrazlio................................................... 3 RESULTADOS E DISCUSSO............................................................................... 3.1 VIABILIDADE DO LOTE.................................................................................... 3.2 AVALIAO DO PR-CONDICIONAMENTO.................................................. 3.3 AVALIAO DA COLORAO SOB DIFERENTES CONCENTRAES DE TETRAZLIO..................................................................................................... CONCLUSO.............................................................................................................. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...........................................................................

09 12 12 14 16 17 18 20 20 21 21 21 22 22 23 26 26 26 29 36 37

INTRODUO

O aumento da populao mundial vem criando uma forte presso sobre os recursos florestais. O elevado consumo de madeira, para mobilirio ou produo de energia, a busca por novas substncias, o desmatamento de novas reas para formao de pastos, so fatores inerentes a esse crescimento populacional.

A estimativa preliminar para a taxa de desmatamento em 2003 foi de 23.750 km2/ano, um aumento modesto (2,3%) em relao taxa de 23,266 de km2/ano em 2002. A taxa em 2002 representou um aumento de 27,9% em relao taxa de 18.165 km2/ano em 2001 (FEARNSIDE, 2004).

Ante esta realidade, o uso sustentvel dos recursos florestais tem sido sugerido como uma alternativa vivel para reconciliar a conservao das florestas com as necessidades de desenvolvimento que freqentemente causam o desmatamento.

A produo de sementes de espcies florestais ganhou grande importncia para a formao de mudas a serem utilizadas em programas de reposio

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florestal, reflorestamento, recuperao de reas degradadas, arborizao urbana e a preservao das espcies florestais nativas em extino, entre outras atividades, que necessitam deste insumo (VIEIRA et al., 2001).

A demanda por sementes no Estado do Amazonas est em crescimento, porm h pouca oferta de sementes, que muitas vezes no atendem aos requisitos tcnicos necessrios comercializao e distribuio, como o controle de qualidade baseado na origem, beneficiamento e garantia da viabilidade durante o armazenamento. A disponibilidade de sementes de boa qualidade proveniente de espcies e prognies mais adaptadas um dos fatores crticos que asseguram plantaes sadias e conseqentemente produtivas.

Vale salientar que um dos componentes, seno o mais importante, de um programa de produo de semente a pesquisa, a qual fornece a base e sobre a qual se apiam os demais elementos do sistema (ROSINHA, 1981).

Para o manejo sustentvel de qualquer espcie florestal necessrio um amplo conhecimento de suas caractersticas. A pesquisa em tecnologia de sementes tem buscado incessantemente modos de desenvolver ou aprimorar testes que possibilitem a avaliao da qualidade das sementes. Informaes sobre sementes florestais, especialmente no que diz respeito padronizao e ao aperfeioamento de mtodos de anlise, tm sido motivos de estudo por parte de pesquisadores e analistas de sementes, em funo da no-existncia de prescries para a conduo de teste de germinao para espcies florestais nativas (OLIVEIRA et al., 1989).

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O mtodo rotineiro para determinar a qualidade das sementes o teste de germinao, que, embora muito til, requer um perodo relativamente longo para se obter resultados, principalmente quando se considera os interesses comerciais dos produtores de sementes.

A nica maneira confivel para conhecer a fundo sobre a qualidade das sementes efetuar a anlise e fazer uma interpretao correta dos resultados. Dessa maneira, sero fornecidas garantias para produtores, comerciantes e agricultores, diminuindo o risco de aquisio de sementes com qualidade desconhecida e cotao de preo do produto no compatvel com o valor real (MACEDO, 2006).

Neste contexto, segundo Bhering et al. (2005), o teste de tetrazlio tem se mostrado uma alternativa promissora pela qualidade e rapidez na determinao da viabilidade e do vigor da semente.

O teste bioqumico do tetrazlio caracterizado pela reduo de um indicador, no interior das clulas vivas da semente. Este indicador uma soluo incolor e difusvel preparada com o sal de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazlio, o qual absorvido pela semente em avaliao (BRASIL, 1992).

O presente trabalho tem por objetivo padronizar a eficincia de mtodos de pr-condicionamento e concentraes da soluo de tetrazlio na avaliao da qualidade de lotes de sementes da espcie Parkia velutina Benoist.

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1 REFERENCIAL TERICO

1.1 AVALIAO DA QUALIDADE FISIOLGICA DAS SEMENTES

O estabelecimento de testes de avaliao da qualidade de sementes passa inicialmente pela definio do prprio termo. Tecnicamente, qualidade refere-se s caractersticas relativas s propriedades genticas, fsicas, fisiolgicas e sanitrias das sementes e dos lotes (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).

Os componentes de desempenho da semente tais como germinao, vigor, emergncia e uniformidade em campo, so fatores da qualidade das sementes que so de suma importncia para quem deseja iniciar um plantio de qualquer que seja a espcie.

O vigor pode ser definido como aquela propriedade das sementes que determina a sua emergncia sob condies desfavorveis (DELOUCHE, 2005).

Durante a germinao, a noo de vigor surge de forma muito natural, j que de uma amostra de sementes postas para germinar, resultam plntulas com diferenas marcantes quanto velocidade de crescimento e ao desenvolvimento total atingido (CARVALHO, 1994).

A pesquisa em tecnologia de sementes tem atuado em carter permanente no sentido de desenvolver e/ou aprimorar testes que possibilitem a avaliao da

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qualidade das sementes, principalmente das espcies que requerem um longo perodo para completar o teste de germinao (MARCOS FILHO, 1994).

Contudo, quando se trata de espcies florestais, a variedade de espcies confere uma imensa variao de formas e tipos de sementes florestais, o que acaba sendo um fator limitante no que diz respeito utilizao do conhecimento j adquirido em pesquisas e trabalhos anteriores. Muito j foi feito, porm ante a grande diferena de caractersticas entre as espcies, os resultados obtidos ainda se mostram insuficientes.

A avaliao da qualidade fisiolgica um parmetro importante a ser considerado em um programa de produo de sementes, e, atualmente, testes que fornecem resultados em perodo de tempo relativamente curto so os mais demandados para agilizar as tomadas de deciso nas diferentes etapas do processo produtivo, especialmente na fase de ps-colheita (BHERING et al.,2005).

Os testes que demandam perodos de tempo curto fundamentam-se nos eventos iniciais da deteriorao, baseando-se na integridade das membranas celulares e na reduo das atividades enzimticas e respiratrias das sementes, como o teste de tetrazlio (DELOUCHE e BASKIN, 1973 apud BARROS et al., 2005).

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1.2 TESTE DE TETRAZLIO EM SEMENTES

O Teste de Tetrazlio de foi criado com o intuito de prover estimativas rpidas sobre a viabilidade das sementes, tem grande utilidade por facilitar a compra e o manuseio das sementes, suas vantagens so testar lotes de sementes dormentes, realizar testes preliminares no trabalho de controle de sementes, avaliar lotes com relao ao vigor, suplementar testes de germinao e diagnosticar causas de deteriorao da semente (DELOUCHE, 1976 apud MACEDO, 2006).

Delouche (2002) descreve deteriorao como um complexo de mudanas que ocorrem com o passar do tempo, causando prejuzos a sistemas e funes vitais e resultando na diminuio no grau de capacidade e desempenho da semente.

O processo enzimtico envolvido ocorre atravs da respirao do embrio da semente, seguido da decomposio e degradao dos carboidratos e outros compostos orgnicos armazenados nos tecidos vivos. As enzimas desidrogenases transferem ons de hidrognio liberados pela respirao dos tecidos vivos para o sal tetrazlio, e o mesmo reduzido a formazan, um produto insolvel e vermelho. Como essa reao, representada abaixo, se processa dentro da clula viva e o formazan no difusvel, h uma ntida separao dos tecidos vivos e coloridos que respiram, daqueles mortos que mantm sua cor natural. (BRASIL, 1992; MARCOS FILHO 1994; DELOUCHE, 2002; OLIVEIRA et al. 2005; e MACEDO, 2006). Cloreto de 2,3,5 trifenil tetrazlio + H+
DESIDROGENASE

Formazan + HCl

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Tecidos deteriorados, no entanto, apresentam danos nas membranas, liberando ons H+ e substancias que reagem de modo intenso com o sal de tetrazlio, conferindo aos tecidos uma colorao vermelho-intensa (Figura 1).

Figura 1.Teste de tetrazlio em sementes de algodo.

Fonte: Delouche, 2002

Segundo MARCOS FILHO et al. (1987) a reao das sementes com o cloreto de tetrazlio pode ser afetada por vrios fatores dentre os quais destacamse: Temperatura: o desenvolvimento da colorao mais rpido a 35-40 C, sendo que o aumento de 5C na temperatura corresponde a uma duplicao na velocidade da reao, at o limite de 45C. Valor do pH: para melhores resultados, o pH deve se encontrar entre 6,0 e 8,0, pois a velocidade de reao mais rpida e a colorao se tona mais ntida. Quando o sal armazenado por um longo perodo pode haver aumento na acidez, inibindo a colorao ou provocado anormalidades e interferindo no resultado do teste. Idade e Deteriorao da Semente: de modo geral, o aumento da permeabilidade das membranas favorece a penetrao da soluo, podendo ocorrer alteraes na intensidade normal de colorao.

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Concentrao da soluo: necessita ser o suficiente para obteno da colorao, onde seja possvel diferir entre tecidos vivos e tecidos injuriados, deteriorados ou mortos. Maiores concentraes aumentam o custo do teste e dificultam o reconhecimento de injrias.

Outros fatores tambm podem interferir na obteno de resultados satisfatrios no teste de tetrazlio, principalmente aqueles relacionados metodologia de execuo como, por exemplo, o preparo das sementes antes da colorao.

Este preparo chamado de pr-condicionamento, que visa garantir a penetrao da soluo nos tecidos a serem avaliados. A retirada do tegumento possibilita o contato da soluo de tetrazlio com o embrio e a embebio ativa a atividade respiratria destes, conferindo assim uma melhor colorao. Em sementes de espcies florestais, diversos tratamentos de pr-condicionamento vm sendo utilizados como corte, escarificao e embebio em gua (OLIVEIRA et al., 2005).

1.3 GNERO PARKIA

O gnero Parkia pantropical e pertence famlia LeguminosaeMimosoideae, apresentando 27 espcies de porte arbreo, dezesseis delas nativas do Brasil (HOPKINS, 1986). As espcies pertencentes a esse gnero so representativas da paisagem florstica amaznica, ocupando papel importante entre as leguminosas arbreas.

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Esse gnero apresenta uma grande diversidade na Amaznia, com rvores de grande porte na terra-firme, vrzea sazonal, floresta secundria, e no norte da Amrica do Sul, onde existem cerca de 17 espcies (HOPKINS, 1986). Todas as espcies de Parkia caracterizam-se por apresentarem adaptaes zoofilia (RIBEIRO et al., 1999).

1.4 CARACTERSTICAS GERAIS DE Parkia velutina Benoist

Parkia velutina pertence famlia Leguminosae, sub-famlia Mimosoideae. A espcie conhecida popularmente no Brasil como corazeiro e visgueiro (HOPKINS, 1986). Em Coar, municpio do Amazonas, recebe o nome de angico-da-folhapequena.

A rvore mede 40m de altura. Ocorre geralmente em mata de terra-firme, frequentemente perto dos rios e crregos da regio amaznica. uma espcie distribuda extensamente no Brasil, Peru, e Guiana Francesa, Leste da Venezuela e Colmbia e Oeste dos Andes (HOPKINS, 1986).

Muitas partes, incluindo os brotos terminais, folhas novas, eixo das inflorescncias, pednculos, gemas e valvas das vagens, so cobertas por uma densa pubescncia velutinosa vermelho-castanho (HOPKINS, 1986) (Figura 2-A).

As flores so prpuras e as vagens compridas, deiscentes, aveludadas (DUCKE, 1949). Inflorescncia em captulo; flores hermafroditas; frutos deiscentes.

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As sementes apresentam testa escura, sendo 36 por vagens (HOPKINS, 1986) mostradas na (Figura 2-B). As sementes de P. velutina so pequenas e estenosprmicas. Aps a retirada do fruto, pesa em mdia 0,44 g e apresenta as seguintes dimenses: comprimento de 12,10 a 19,90 mm com mdia de 16,60 mm; largura de 5,60 a 9,30 mm e mdia de 7,81 mm (Figura 2-C).
A B C

Figura 2. Frutos e sementes de P. velutina. A) Fruto; B) Disposio das sementes no Fruto, e C) Sementes.
Fonte: Projeto Parkia

1.4.1 Morfologia da Semente de Parkia velutina Benoist.

A semente de P. velutina apresenta forma obovada com margem inteira, pice e base arredondados, sendo a base mais estreita que o pice, com superfcie lisa e sem brilho. Sua testa possui consistncia ssea desidratada, monocrmica, preta, apresentando pequenas estrias na superfcie, de textura ptrea. Apresenta linha divisria e pleurograma regular com linhas iguais de 90%, segundo classificao de Gunn (1991) (Figura 3-A). A testa, quando hidratada, desprende-se inicialmente na linha do pleurograma, translcida e de consistncia coricea e quebradia (SILVA, 2003).

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O embrio axial, total, invaginado, oblongo, amarelado quando hidratado e perolado desidratado. Cotildones dominantes, oblongos, suavemente planoconvexos, com base entalhada, de consistncia ptrea (desidratados) e carnosos (hidratados); com relao posio da radcula, apresenta radcula exposta com margem escondida. A semente exalbuminosa, com suas reservas de lipdeos armazenadas em seus grandes cotildones (SILVA, 2003)(Figura 3-B).

Eixo hipoctilo-radcula distinto, apresentando radcula espessa, obcnica com extremidade amarelada quando hidratada; hipoctilo curto e cilndrico; plmula bem desenvolvida com primrdios foliares diferenciados (SILVA, 2003).

A
Fonte: SILVA, 2003

Figura 3. Semente de Parkia velutina: A) Semente desidratada; B) Embrio em seco longitudinal; ct cotildone; eh eixo hipoctilo-radcula; pm plmula; te testa.

As sementes de P. velutina apresentam comportamento ortodoxo, podendo ser armazenadas com 4,4% de teor de gua a temperatura de 5C por um perodo de 12 meses, permanecendo viveis (SILVA, 2003).

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2. MATERIAL E MTODOS

2.1 PROCEDNCIA DAS SEMENTES

As sementes foram coletadas em 15 de maio de 2004, de matrizes selecionadas em rea de floresta natural na Base de Operaes Gelogo Pedro de Moura, Coari, AM, localizado a 623 km de Manaus em linha reta (Figura 4). O solo do tipo latossolo-amarelo de textura argilosa. O clima do tipo Afi, segundo classificao de Kppen, correspondendo ao clima tropical chuvoso, com temperatura no ms mais frio nunca inferior a 18C e, precipitao mdia anual de 2000 mm.

Figura 4. Base de Operaes Gelogo Pedro de Moura, Provncia do Urucu, Coari.

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2.2 LOCAL DO EXPERIMENTO

A pesquisa foi desenvolvida no Laboratrio de Sementes da Escola Superior de Tecnologia EST, da Universidade do Estado do Amazonas - UEA.

2.3 BENEFICIAMENTO E ARMAZENAMENTO DAS SEMENTES

As sementes foram submetidas a tratamento de choque trmico (congelamento) para eliminao de insetos predadores em seguida acondicionadas em recipientes de vidro fechados e armazenadas em geladeira temperatura mdia de 7 C, durante 30 meses.

2.4 TESTE PADRO DE GERMINAO

Antes do teste de germinao foi determinado o teor de gua, com duas repeties de 5 sementes cortadas, em estufa temperatura de 105 C 3 C, por 24 horas (MENDES et al., 2006).

O mtodo de superao da dormncia tegumentar foi conduzido conforme descrito em Souto (2003), utilizando-se a escarificao qumica com cido sulfrico concentrado (H2SO4) por 15 minutos, seguidas de lavagem com gua corrente at a completa eliminao dos resduos.

Para o teste de germinao, foi utilizada uma amostra de 100 sementes, divididas em 4 subamostras de 25 sementes cada. As sementes foram colocadas

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para germinar utilizando como substrato vermiculita de textura mdia, em cmara de germinao a 30C, com um fotoperodo de 12 horas.

Os critrios adotados para avaliar a germinao foram a emisso da raiz primria e a formao de plntula normal. Foram realizadas contagens dirias de germinao at a estabilizao do experimento (formao de todas as plntulas).

2.5 PADRONIZAO DO TESTE DE TETRAZLIO

O trabalho foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa, foram realizados experimentos para a padronizao dos tratamentos pr-condicionantes, e na segunda etapa foram testadas as concentraes da soluo de tetrazlio.

2.5.1 Tratamentos pr-condicionantes

As sementes foram submetidas a trs mtodos de pr-condicionamento para a retirada do tegumento: escarificao mecnica com lixa nas laterais da semente; escarificao mecnica por desponte na regio oposta ao hilo; escarificao mecnica por puno nas regies medianas dos cotildones. Foram utilizadas 100 sementes para cada tratamento dividido em quatro repeties de 25 (Figura 5).

Figura 5. Tratamentos pr-condicionantes em de P. velutina escarificao das sementes. A) Puno, B) Lixa nas laterais, e C) Desponte.

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Aps os tratamentos as sementes foram imersas em 100 ml de gua destilada para cada 50 sementes, em caixa plstica gerbox, por 16 horas, em cmara de germinao regulada na temperatura de 25oC.

2.5.2 Concentrao da soluo de Tetrazlio

Foram testadas as concentraes de 1,0%, 0;5% e 0,1%. Para cada concentrao, utilizou-se 100 sementes divididas em quatro repeties de 25. Os embries foram imersos em 40 ml de soluo para cada repetio e levados cmara mantida temperatura de 40oC durante duas horas, para o desenvolvimento da colorao (Frana Neto et al., 1998).

Aps

colorao,

as

sementes

foram

lavadas

seccionadas

longitudinalmente entre os cotildones (com o cuidado para que o eixo embrionrio fosse dividido ao meio nessa seco). Para a interpretao dos resultados, cada semente foi analisada e classificada em classe de viabilidade de 1 a 8, segundo Frana Neto et al., (1998):

Classes de 1 a 3 identificam sementes viveis e vigorosas. Classe 1: todas as estruturas do embrio esto intactas. Colorao uniforme e superficial, indicando uma penetrao lenta da soluo de tetrazlio. Superfcies internas dos cotildones esto coloridas apenas nos bordos. Todos os tecidos esto normais e trgidos.

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Classe 2: Danos pequenos e superficiais, ocorrendo apenas na superfcie externa dos cotildones. As superfcies internas dos cotildones e do eixo embrionrio no apresentam danos. Classe 3: estrias superficiais de colorao vermelho carmim forte ou brancas esto presentes na superfcie externa dos cotildones e os danos superficiais no crtex do eixo radicular hipoctilo, mas no alcanando o cilindro central. A superfcie interna da semente pode apresentar pequenas reas mais escuras correspondentes s estrias externas. As sementes nestas trs categorias so viveis, vigorosas e usualmente tm germinao e emergncia rpidas e uniformes. Classes 4 e 5: as sementes so viveis, porm, no vigorosas. Classe 4: reas de colorao vermelha carmim forte (tecido em estado adiantado de deteriorao) ou branco intenso (tecido morto). Os danos so visveis na superfcie interna dos cotildones. A regio vascular no est afetada, bem como a juno entre o eixo embrionrio e os cotildones. O cilindro central encontra-se intacto. Classe 5: os cotildones esto danificados severamente, mas 50% ou mais do tecido de reserva permanece vivel e funcional. A regio vascular, prxima ao ponto de ligao entre o eixo embrionrio e os cotildones est bem definida e vivel. Sementes classificadas nesta classe germinaro e produziro plntulas normais somente sob condies ideais. Classes 6 a 8 englobam sementes que no germinam. Classe 6: esta classe caracterizada pela presena de leses similares s descritas na Classe 5 . Mas a quantidade de tecido danificado grande, tornando a semente no vivel.

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Classe 7: dano profundo no cilindro central. A regio vascular entre o eixo embrionrio e ambos cotildones est severamente danificada. A plmula pode apresentar danos. Mais de 50% do tecido de reserva est deteriorado. Classe 8: todas as estruturas do embrio esto mortas, tecidos flcidos e quebradios.

A somatria do percentual das classes 1 a 3 indica o ndice de vigor e a somatria dos percentuais 1 a 5 a viabilidade do lote.

Vigor muito alto: superior a 80%; Vigor alto: entre 70 a 79%; Vigor mdio: 50 a 69%; Vigor baixo: 30 a 49%; Vigor muito baixo: inferior a 29%.

O experimento foi organizado em delineamento inteiramente ao acaso, com quatro repeties de 25 sementes para cada tratamento. Foi aplicado Anlise de Varincia (ANOVA) para testar o grau de significncia entre as concentraes e o teste de germinao. Para as mdias significativas foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

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3. RESULTADOS E DISCUSSO

3.1 VIABILIDADE DO LOTE

O lote de sementes de P. velutina utilizado no presente trabalho apresentou 11,3% de teor de gua, no momento da instalao do experimento. A umidade das sementes no foi alterada durante o armazenamento, pois o teor de gua inicial foi de 11,6%. O teste padro de germinao revelou taxas de 96% de emisso de raiz e 94% de formao de plntulas normais, as quais apresentaram-se bastante vigorosas.

3.2 AVALIAO DO PR-CONDICIONAMENTO

O tegumento das sementes de P. velutina extremamente duro e impermevel, necessitando, portanto, de tratamentos pr-condicionantes para a aplicao do teste de tetrazlio. Esses tratamentos foram feitos para viabilizar a retirada do tegumento, facilitando assim a penetrao da soluo de tetrazlio e uma colorao mais uniforme.

O primeiro teste foi realizado com trs tratamentos pr-condicionantes: desponte, puno e lixa, sendo postas para embeber durante 16 horas a 25C. Conforme Frana Neto et al. (1998), para as sementes de leguminosas que no apresentam permeabilidade do tegumento, recomenda-se o pr-condicionamento por 16 horas a 25oC.

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Observou-se que as sementes submetidas ao desponte no hidrataram suficientemente para facilitar a retirada do tegumento. As mesmas embeberam at a metade do seu comprimento, prximo ao local onde foi feito o desponte (Figura 6-C). As sementes submetidas puno embeberam somente uma mnima frao do tegumento prximo ao local perfurado (Figura 6-A).

Figura 6. Pr-condicionamento em sementes de P. velutina. A) Puno, B) Lixa nas laterais, e C) Desponte.

Para as sementes submetidas ao lixamento nas laterais, 50% das sementes hidrataram totalmente, amolecendo o tegumento suficientemente para sua retirada com facilidade (Figura 6-B). Em 35% das sementes foi necessrio o uso de estilete para auxiliar a retirada do tegumento e 15% no hidrataram o suficiente. O tegumento permaneceu duro na regio oposta ao hilo e sua retirada forada causou danos mecnicos ao embrio.

Analisando

os

resultados

que

no

se

apresentaram

satisfatrios,

considerou-se aumentar o tempo de embebio, porm, o ideal nos testes rpidos, como o do tetrazlio, que se obtenha resultados o mais breve possvel, sendo, portanto, inconveniente aumentar o tempo de embebio. Segundo Piana et al. (1992), a rapidez na avaliao de sementes proporciona vantagens, como a possibilidade de descarte de lotes com qualidade inadequada.

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Sementes de Tabebuia serratifolia e Tabebuia impetiginosa submetidas ao teste de tetrazlio, obtiveram resultado em um dia, enquanto o teste de germinao teve durao de 28 dias (OLIVEIRA et al, 2005).

Conforme resultado do primeiro teste e considerando que perodos mais longos de embebio implicam em mais tempo gasto para a conduo do teste, foi definido unificar dois mtodos escarificadores para facilitar a retirada do tegumento: o desponte na regio oposta ao hilo e o lixamento nas laterais, com o mesmo tempo de embebio, aumentando a quantidade de gua para 200 ml, para cada 50 sementes, e a temperatura da cmara para 30C. Atravs deste mtodo, obteve-se 100% de xito, sendo o tegumento retirado sem qualquer dano mecnico ao embrio (Figura 7).

Figura 7. Pr-condicionamento em sementes de P. velutina atravs de desponte e lixa nas laterais. A) Sementes embebidas, B) Retirada do tegumento, C) Embries preparados para o teste de tetrazlio.

De acordo com Bhering et al. (2005), a eficincia do teste tetrazlio em avaliar a viabilidade e vigor das sementes est relacionada ao desenvolvimento de metodologia adequada para cada espcie, de modo a definir as condies mais apropriadas para o preparo e o pr-condicionamento e colorao das sementes.

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Assim, o preparo e o pr-condicionamento das sementes antes da colorao so fatores decisivos.

Para as sementes de P. velutina que apresentam tegumento muito duro, e das dimenses relativamente grandes (o embrio de P. velutina ocupa toda dimenso da semente), a hidratao para o amolecimento do tegumento deve ser aplicada por imerso em gua. Alm disso, o perodo de hidratao no deve ser menor que 16 horas com a temperatura no excedendo 30oC. Temperaturas mais elevadas aceleram a embebio, porm temperaturas maiores que 30oC com o intuito de diminuir o tempo de embebio podem ser prejudiciais ao teste, j que uma embebio muito rpida pode causar danos ao embrio da semente.

3.3 AVALIAO DA COLORAO SOB DIFERENTES CONCENTRAES DE TETRAZLIO

As sementes submetidas a concentrao de 0,1%de tetrazlio no coloriram o suficiente para a correta interpretao dos resultados (Figura 8-A), portanto esse tratamento foi retirado da anlise dos resultados.

Figura 8. Colorao de sementes de P.velutina concentraes de tetrazlio: A) 0,1%; B) 0,5%, e C) 1,0%.

sob

diferentes

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Tabela 1. Viabilidade e vigor (%) das sementes de Parkia velutina avaliadas pelo teste de tetrazlio em diferentes concentraes e pelo teste de germinao. TRATAMENTOS CARACTERSTICAS *Viabilidade (%) 0,5 % 1,0 % Teste de germinao DMS (Tukey) Coeficiente de Variao (%) 94,0 ab 90,0 b **Vigor (%) 68,0 b 53,0 c 94,0 a 7.79 6.59

97,0 a 7.94 5.24

Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. * Teste de tetrazlio (classe 1-5). Caracterstica de germinao (emisso de raiz). ** Teste de tetrazlio (classe 1-3). Caracterstica de germinao (formao da plntula).

Houve diferena significativa entre o teste de germinao e de tetrazlio nas diferentes concentraes para a caracterstica viabilidade. A viabilidade apresentada pelo teste de germinao mostrou-se observada pelo superior ao teste de tetrazlio, sendo que a concentrao de 0,5% no diferiu estatisticamente dos demais tratamentos. Para a caracterstica vigor, os resultados teste de germinao foram significativamente superiores aos do teste de tetrazlio e a concentrao de 1% demonstrou valor inferior aos demais tratamentos, subestimando o vigor das sementes (Tabela 1).

Observa-se pelos dados obtidos que o teste de tetrazlio para a espcie estudada foi eficiente apenas para avaliar a viabilidade. A formao de plntula normal foi o parmetro utilizado para avaliar o vigor no teste de germinao e o lote estudado se mostrou bastante vigoroso, o mesmo no aconteceu para o teste de tetrazlio nas duas concentraes testadas, onde o parmetro utilizado foi as diferentes classes, conforme metodologia de Frana Neto et al. (1998).

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Geralmente o teste de tetrazlio coincide com o teste de germinao ou os valores de tetrazlio so maiores. Segundo Catie (2000) citado por Oli8veira et al. (2005), isso acontece porque no teste de tetrazlio somente o embrio avaliado, no considerando a influncia das estruturas externas das sementes nos resultados dos testes de germinao, como a possveis infestaes com patgenos no lote. Dessa forma, nem todas as anormalidades encontradas nas plntulas podem ser observadas nos embries e, como conseqncia, o teste de tetrazlio pode apresentar resultados maiores.

As sementes de P. velutina maduras concentram suas reservas no prprio embrio, em seus grandes cotildones carnosos, alm disso, seu eixo embrionrio completamente desenvolvido, podendo ser distinguido em radcula, hipoctilo e plmula (Figura 9-A). Portanto, mesmo que os cotildones sejam lesados em at 50%, o restante da reserva suficiente para que durante a germinao o embrio se transforme em uma plntula normal e vigorosa (Figura 9-B). Essa caracterstica inerente espcie provavelmente influencia na interpretao dos resultados quando utiliza-se as diferentes classes na determinao do vigor das sementes.

A
pm eh

Figura 9. Caractersticas da semente e plntula de P. velutina. A) Eixo embrionrio de P. velutina e B) Cotildones predados por insetos.

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Na figura 10 so apresentadas as classes de viabilidade estabelecidas no teste de tetrazlio para as sementes de P. velutina conforme descrio de Frana Neto et al., 1998.
40 35 30 Viabilidade (%) 25 20 15 10 5 0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8

0,5 (%) 1,0 (%)

Classes de Viabilidade

Figura 10. Classes de viabilidade obtidas no teste de tetrazlio em sementes de P. velutina, em diferentes concentraes.

As classes de 1 a 3 identificam sementes viveis e vigorosas, nas classes 4 e 5 as sementes so viveis, porm no vigorosas e as classes 6 a 8 englobam sementes que no germinam (FRANA NETO et al., 1998).

Os dados apresentaram maiores valores nas classes 2, 3 e 4 para ambas as concentraes testadas. A viabilidade foi de 22% nas classes 2 e 4 e 38% na classe 3 para a concentrao 0,5%. Na concentrao 1% as classes 2, 3 e 4 apresentaram 19%, 29% e 28% respectivamente.

As sementes presentes nas classes 1, 2, 3 e 4 apresentaram uma colorao em tom rosado/avermelhado uniforme e aspecto sadio dos tecidos (Figura 11-A).

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Em ambas as concentraes as classes 1, 5, 6, 7 e 8 mostraram valores inferiores a 10%. Em 75% das sementes indicadas nas classes 6, 7 e 8 houve ataque por insetos, onde as estruturas internas dos cotildones, o eixo embrionrio e a plmula apresentavam-se deteriorados e corrodos. Alm de danos mecnicos em suas estruturas externas (Figura 11-B), tais dados puderam ser notados pela colorao vermelha intensa nas estruturas do embrio. A ausncia de colorao (cor natural do embrio), indicou a morte dos tecidos do embrio.

Segundo Delouche (2002), neste teste os danos fisiolgicos e necroses nas sementes so mostrados em vvidos padres de vermelho e branco (ou cor natural da semente), e ficam claramente evidentes os padres e a natureza progressiva da deteriorao.

Figura 11. Sementes avaliadas teste de tetrazlio. A) Sementes viveis; e B) Sementes inviveis.

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Analisando os dados do teste de tetrazlio (Tabela 1) possvel afirmar que as sementes de P. velutina apresentaram uma alta porcentagem de viabilidade, porm o vigor mostrou-se mdio.

No entanto a avaliao individual das sementes contradiz tal resultado, pois em 90% dos embries aps desenvolvimento da colorao, era ntida a sanidade. Atribui-se a esse resultado o fato dos cotildones de P. velutina serem dominantes e de consistncia carnosa quando hidratado, o que pode ter dificultado o entumescimento adequado dos tecidos cotiledonares e embrionrios da semente, quando em contato com a soluo de tetrazlio. Em sementes de soja Costa et al. (1998) observaram alteraes no processo de colorao pelo teste de tetrazlio, onde partes expressivas das sementes mostraram caractersticas de mosaico, o que foi prejudicial durante a leitura e a interpretao do teste.

Com esta constatao pode-se afirmar que o teste de tetrazlio no permite identificar classes de vigor em sementes de P. velutina, mas pode ser utilizado na caracterizao das classes de viabilidade e de leses, ocasionadas pelo ataque de insetos e danos mecnicos resultantes do beneficiamento.

Verificou-se que a concentrao de 0,5% da soluo do tetrazlio permitiu uma colorao mais ntida dos embries, o que facilitou a anlise visual da viabilidade.

Marcos Filho et al. (1987) salientam que vrias concentraes da soluo do tetrazlio podem ser utilizadas na conduo do teste, dependendo da espcie

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avaliada, do mtodo de preparo das sementes e da permeabilidade do tegumento, sendo que, para sementes de espcies florestais, essas concentraes variam de 0,5% a 1%.

Diante de tais constataes, o teste de tetrazlio utilizando a concentrao de 0,5% e as classes de viabilidade segundo Frana Neto et al.(1998), pode ser usado na avaliao da viabilidade de sementes de P. velutina, como complemento ao teste de germinao.

Com os resultados obtidos no trabalho, onde definiu-se a metodologia mais adequada de pr-condicionamento, recomenda-se que sejam estabelecidas classes de viabilidade e vigor, prprias para sementes de P. velutina pelo teste de tetrazlio. Para auxiliar no estabelecimento destas classes, pode-se considerar os resultados da porcentagem de germinao e o vigor das plntulas normais obtidas no teste de germinao. Alm de utilizar como critrios a intensidade de colorao e a localizao dos danos no embrio.

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CONCLUSES

A unio dos tratamentos de escarificao da semente, desponte no lado oposto ao hilo e o lixamento nas laterais, com 16 horas de embebio em 200 ml de gua destilada a 30 C, apresenta eficincia no pr-condicionamento de sementes de P. velutina.

O teste de tetrazlio na concentrao de 0,5% pode ser utilizado para avaliar a viabilidade das sementes de P. velutina Benoist, como complemento do teste de germinao.

O teste de tetrazlio no permite avaliar o vigor em sementes de P. velutina, mas pode ser utilizado na caracterizao de leses, ocasionadas pelo ataque de insetos e danos mecnicos por ocasio da coleta ou durante o armazenamento.

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