T?CNICAS TAXON?MICAS PARA COP?

PODES*
Janet W. Reid

Limnotemas No. 1 Sociedade Brasileira de Limnologia Fevereiro de 1999

Sociedade Brasileira de Limnologia

Presidente: Francisco de Assis Esteves, Departamento de Ecologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, C.P. 68020 Ilha do Fundo 21941-590 Rio de Janeiro RJ Sandra M. F. O. Azevedo, Ncleo de Pesquisa em Produtos Naturais, Universidade Federal do Rio de Janeiro, CCS, Bloco H Ilha do Fundo 21941-590 Rio de Janeiro RJ Reinaldo Luiz Bozelli, Departamento de Ecologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, C.P. 68020 Ilha do Fundo 21941-590 Rio de Janeiro RJ Antnio F. M. Camargo, Departamento de Ecologia, Universidade Estadual Paulista, Av. 24 A, 1515 Bela Vista 13506-900 Rio Claro SP Christina W. Castelo Branco, Departamento de Cincias Naturais, Universidade do Rio de Janeiro, Rua Voluntrios da Prtria, 107 Botafogo - Rio de Janeiro - RJ

Vice Presidente:

Primeiro Secretrio:

Segundo Secretrio:

Primeira Tesoureira:

Editor: Reinaldo Luiz Bozelli - UFRJ - Rio de Janeiro Revisores do Volume 1: Dra. Christina W. Castelo Branco UNIRIO Rio de Janeiro Dr. Reinaldo Luiz Bozelli UFRJ Rio de Janeiro Dr. Srgio Luiz Costa Bonecker UFRJ Rio de Janeiro Traduo: Paulo Roberto H. B. Barros Informtica: Manuel Costa de Azevedo - UFRJ - Rio de Janeiro Agradecimentos Especiais: Cludia B. M. Barros, Srgio de Melo e Paulina Maria Maia Barbosa Limnotemas distribudo gratuitamente, atravs de solicitao, a todos os scios da SBL que estiverem em dia com a anuidade.

TCNICAS TAXONMICAS PARA COPPODES* Janet W. Reid Departament of Invertebrate Zoology, MRC-163 National Museum of Natural History Smithsonian Institution, Washington, DC 20560 USA Fone 202-357-4674, Fax 202-357-3043 E-mail reid.janet@nmnh.si.edu

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p?podes foi adotado de acordo com o Novo Dicion?rio da L?ngua Portuguesa, 2a ed. 1986.

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Este texto descreve resumidamente alguns dos mtodos mais usados para o tratamento de espcimes de coppodes, principalmente para propsitos taxonmicos. A maior parte destes mtodos delineada em mais detalhes nas referncias fornecidas. Os nomes de alguns fornecedores comerciais do equipamento especializado so fornecidos. Esta lista foi includa apenas para a maior informao do leitor, sem implicao de recomendaes. A autora agradeceria se os nomes de outros fornecedores lhe fossem enviados. (Inicialmente desenvolvido em 1992; revisado e atualizado em 1997) Contedo: 1. Tratamento inicial dos espcimes a. Agentes narcotizantes b. Fixao win c. Aplicao de corantes para a seleo d. Armazenamento e. Recuperao de espcimes ressecados 2. Exame microscpico a. Pr-tratamento b. Corantes c. Meios de montagem c.1. Meios temporrios c.2. Meios permanentes d. Manipulao e disseco e. Montagem 3. Resumo do procedimento 4. Referncias 5. Agradecimentos 6. Fornecedores de equipamentos

1. Tratamento inicial dos espcimes a. Agentes narcotizantes: Os agentes narcotizantes podem ser teis para evitar a flexo do corpo e das antenas, e para ajudar na reteno de sacos de ovos e contedo estomacal durante a fixao. O agente normalmente adicionado de forma demorada, gota a gota. gua exaurida de oxignio: ferva gua por 5-10 min. e esfrie. excesso de CO2 : produz-se por a) borbulhamento de CO2 pela gua; b) despejo lento de gua gaseificada na amostra; c)ou adio de pedaos de gelo seco.
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frio: refrigere os espcimes na geladeira, e adicione o agente fixador amostra na mesma temperatura. MgCl2 6H2O (73,2 g/l; isotnico gua do mar): adicione lentamente e mantenha os espcimes em soluo por 10-15 minutos antes da fixao. lcool: adicione etanol, metanol ou isopropanol puro lentamente. formol: age como um agente narcotizante se adicionado lentamente. fenoxetol de propileno: use uma soluo estoque a 1,5%, misture 1:10 (v/v) em gua do mar e despeje sobre a amostra. Recomendado para meiofauna (Hulings e Gray, 1971).

b. Fixao Encha as garrafas de amostragem at 3/4 do volume. Tente fixar em at 5 minutos aps a captura. Formol 3-5% tamponado com um dentre vrios compostos para a reduo da acidez o agente fixador mais utilizado. Brax (tetraborato de sdio -- Na2B4O7) talvez o agente tamponador mais utilizado. Para fazer uma soluo de fixao, adicione 2 g de brax a 100 ml (formol 40%) - isso elevar o pH a aproximadamente 8 8,2 - e inverta o recipiente vrias vezes durante uma hora. Outros tampes ocasionalmente utilizados so carbonato de sdio (NaHCO3) e acetato de sdio (C2H3NaO2 3H2O).

Etanol 70 a 95% tambm um bom fixador. Vantagens e desvantagens do etanol sobre o formol: o uso do etanol resulta em espcimes mais relaxados; evita a necessidade de se transferir o material mais tarde para uma soluo de armazenamento de longo prazo e menos txico. Porm, o etanol uma substncia controlada; mais incmodo do que o formol para o uso no campo; e o transporte areo de quantidades significativas de etanol, assim como o de todas as substncias inflamveis, ilegal. c. Aplicao de corantes para a seleo: Corar as amostras antes ou durante a fixao ajuda na separao visual de espcimes em amostras do sedimento ou saturadas com detritos. Entretanto, no se recomenda o uso de corantes se os espcimes sero examinados pela Microscopia de Contraste da Interferncia Diferencial de Nomarski. Rosa de Bengala um corante vital facilmente solubilizado em gua, e provavelmente o mais usado. Faa uma soluo 1%. Como o corante adsorvido por argila e detritos orgnicos, utilize mais corante em amostras especialmente sujas. Alguns gros de corante slido podem ser adicionados amostras com um palito de dentes umedecido. A melhor colorao obtida se o corante adicionado amostra alguns minutos antes da fixao. O Rosa de Bengala vai desbotar em espcimes armazenados em etanol. Para corar animais vivos, o Vermelho Neutro possivelmente o menos danoso; o Azul de Metileno tambm utilizado.

Vidros de relgio foram desenvolvidos pelos relojoeiros para segurar pequenas

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peas. Eles so muito mais eficientes para a seleo de pequenos coppodes do que pequenas placas de Petri. Isso ocorre porque os vidros de relgio so levemente cncavos no centro, encorajando o movimento dos espcimes para o centro do vidro. O fundo de algumas placas de Petri mais baixo nas bordas do que no centro, e os espcimes vo se acumular nas bordas neste caso. Outra vantagem dos vidros de relgio que eles podem ser empilhados. Alguns possuem bordas de vidro onde se pode escrever. d. Armazenamento: Meio de armazenamento: Aps 7-10 dias passe os espcimes para o etanol ou outro meio de armazenamento de longo prazo. No deixe os espcimes por longos perodos em formol, mesmo tamponado, pois os espcimes ficam quebradios e as cerdas podem se partir. Etanol 70% - glicerina 1% um bom meio de armazenamento a longo prazo que mantm a flexibilidade dos espcimes. A glicerina uma segurana contra a evaporao do etanol. Metanol ou isopropanol tambm podem ser utilizados com meios de armazenamento de longo prazo. Um preservativo de longo prazo para o zooplncton uma soluo de fenoxetol de propileno (0,5 ml), glicol de propileno (4,5 ml) e gua destilada ou gua do mar (95 ml) (Steedman, 1976).

Recipientes de armazenamento: Shell vials (sem bordas) tampados com algodo so provavelmente o mais simples para o armazenamento de pequenos espcimes. Qualquer frasco de vidro serve, se a boca no for estreita demais. Potes de vidro com tampas de Bakelite e um encaixe de Teflon so provavelmente o melhor tipo de recipiente para se guardar os frascos menores. Tampas de metal enferrujam, tampas de um plstico mais delicado vo se partir eventualmente, e tampas de borracha se deformam, especialmente se expostas a algum tipo de lcool. O armazenamento de muitos frascos pequenos feito da forma mais conveniente em um grande frasco, cheio de etanol a 70% ou outro meio de armazenamento. A tampa do frasco deve ser checada periodicamente (a cada 2-3 anos) para rachaduras ou deformao, e substituda se necessrio. A tampa dos frascos pode ser selada com parafina derretida, que talvez o melhor lacre a longo prazo. As desvantagens incluem a inflamabilidade da parafina e a necessidade de se relacrar os frascos abertos. J que a maioria das tampas de plstico (incluindo todas as tampas de encaixe) racham ou se deformam aps alguns anos mergulhadas em lcool, tampe os frascos com algodo. Tampas negras (Bakelite de rosca so as melhores. ) Para o armazenamento a longo prazo de espcimes importantes, o sistema de trs

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frascos o mais seguro. Isto porque o lcool tem que evaporar at a base do frasco externo, e ento de todo o prximo frasco antes do ar alcanar o espcime (Fig. 1):

Fig. 1 a) Espcime em frasco pequeno; b) Frasco pequeno invertido dentro do frasco maior contendo a etiqueta; c) os dois frascos invertidos no recipiente externo.

Etiquetas: O papel de etiqueta deve ser pesado e com um alto teor de fibras. Papel pergaminho aceitvel, mas se parte facilmente. Novos materiais plsticos esto se tornando disponveis. Papel leve, tipo caderno no recomendvel. As etiquetas devem ser colocadas dentro do frasco, ou em um frasco externo se os espcimes so delicados. Especialmente se os espcimes delicados sero embarcados, nunca coloque a etiqueta junto com os espcimes. Tinta nanquim ou outra tinta de desenho permanente, que se associe com as fibras do papel, ainda a melhor. Letras impressas ou datilografadas, que se aderem apenas superfcie do papel, vo se descolar em alguns anos se no forem especialmente tratadas. Etiquetas impressas a laser podem ser umedecidas com um fixador e ento cozidas. Para a produo em massa de etiquetas, uma impressora de presso termal a melhor. Etiquetas externas devem ser consideradas como temporrias. Condies gerais e manuteno do armazenamento: Material biolgico deve ser armazenado longe da luz do sol e protegido de extremos de temperatura. A sala de armazenamento deve ser bem ventilada para evitar o acmulo de vapores de formol ou lcool. Barras nas prateleiras so sempre recomendveis, para diminuir o risco de se acidentalmente derrubar uma garrafa. claro que o lcool vai evaporar mais rpido do que a gua, essencialmente diluindo o contedo dos frascos. Assim, a cada dois ou trs anos, o lcool nos frascos deve ser totalmente substitudo, e no apenas receber uma adio de gua.

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e. Recuperando os espcimes ressecados: Mesmo sob as melhores condies, amostras alcolicas podem evaporar. cido lctico ou um soluo fraca de hidrxido de potssio podem ser utilizados com algum sucesso para a reconstituio de espcimes ressecados, mas estes produtos apresentam desvantagens. O mtodo de reconstituio mais suave embeber os espcimes por horas ou dias em uma soluo diluda (0,25 - 0,5%) de fosfato de trisdio ou outro detergente forte. As caractersticas principais dos espcimes devem se tornar visveis, e os espcimes podem ser ento rinsados e devolvidos para o lcool. O mtodo do fosfato de trisdio foi discutido por Van Cleave e Rose (1947). 2. Exame Microscpico: A taxonomia dos coppodes baseada principalmente na morfologia externa. Assim, necessrio ver os detalhes do tegumento. Pode ser aconselhvel o uso de um meio que clareie o animal, para reduzir a interferncia das estruturas internas, e corar o tegumento para que os padres das espinhas, poros e outras particularidades se sobressaiam. Sequncia do tratamento: a. Pr-tratamento b. Corantes c. Colocao no meio, termporrio ou permanente d. Disseco e. Montagem em lminas, temporria ou permanente f. Arquivar o espcime a. Pr-tratamento opcional para remover as partes moles: Os tecidos musculares de alguns gneros como Eucyclops no ficam suficiente esbranquiados em glicerina ou cido ltico, e para eles, um pr- tratamento pode ser til. Tratamento 1: Aquecer em soluo de KOH 10% a 90 oC por 1-2 horas. Tratamento 2: Submergir em soluo desbotadora caseira 0,1% por alguns minutos. O tempo na soluo desbotadora ou no KOH deve ser ajustado cuidadosamente para que as espinhas no caiam, ou o espcime no se desarticule completamente! Se um pr-tratamento for usado, prossiga rinsando rapidamente em gua destilada e ento transfira o espcime atravs de concentraes seriais at o meio de sua escolha. b. Corantes O espcime pode ser corado neste estgio. Bons corantes para crustceos pequenos so Clorazol Negro E, Verde Ligeiro, Fucsina cida, Rosa Lignina. Todos os corantes podem ser preparados com uma soluo 1% em peso em gua destilada ou etanol 70%.

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Clorazol Negro E til para detalhes do tegumento e estvel por anos em vrios meios. um leve carcingeno; evite ingerir a poeira ou comer no laboratrio, etc. O Clorazol Negro E requer vrios dias para se dissolver em alguns meios, e resduos podem permanecer no frasco. Filtre o meio ou use um basto de vidro para retirar o corante do topo do frasco, evitando sacudir os resduos do fundo. Os corantes podem ser adicionados ao meio de disseco ou ao meio de montagem de lmina. J que um corante pode eventualmente escorrer para fora de um espcime, uma boa idia adicion-lo ao meio de montagem permanente. Um bom corante suave para o uso com cido ltico so algumas gotas de soluo aquosa de azul de metileno ou rosa lignina, adicionado ao cido concentrado ou uma soluo aquosa 50%. Um corante alternativo 1 parte de Clorazol negro E (1% peso em gua destilada/lcool 70%) em 19 partes de cido ltico ou glicerol. O cido ltico pode simplesmente ser adicionado ao meio at ficar aproximadamente da densidade de um ch fraco. Nota: Corar pode interferir com a Microscopia de Contraste de Interferncia Diferencial de Nomarski. c. Meio de montagem: A escolha do meio de montagem depende do uso que se far dos espcimes montados, do tipo de microscopia empregada, e da necessidade de uma preservao a longo prazo ou no. Certos meios, particularmente lactofenol polivinil e lactofenol, so mais apropriados do que outros para a Microscopia de Contraste de Interferncia Diferencial de Nomarski. Alguns agentes desbotadores, corantes e de montagem foram avaliados com esse propsito, por Koomen e Vaupel Klein (1995). O uso de um meio desbotador vs. no desbotador vai depender do propsito da lmina. Se for necessrio manter um espcime dissecado por um longo tempo, lembrese de que um meio desbotador vai eventualmente fazer com que os apndices dissecados se tornem difceis de se encontrar e/ou ver. A adio de um corante ao meio ajuda com esse problema. Apndices desbotados so normalmente mais visveis com tica de contraste de fase ou de Nomarski. O lactofenol recomendado por Huys e Boxshall (1991) para colees de tipo. Nota: A inalao de vapores de fenol ou de hidratos de cloro de alguns meios inevitvel a no ser que o microscpio esteja instalado em uma capela, ou um pequeno ventilador de mesa seja utilizado para afastar os vapores. A longa exposio a esses vapores indesejvel. Sintomas comuns de superexposio incluem dores de cabea, tonturas, e sinusite. Se esses sintomas ocorrerem, aumente a ventilao. O meio deve: - fornecer um bom contraste tico, ou seja, um ndice de refrao apropriado - ser razoavelmente viscoso para manter a estabilidade do espcime - ser produzido com materiais facilmente disponveis - ser estvel por um determinado perodo de tempo, dependendo do propsito da lmina - no reagir com corantes ou com o lacre - ser relativamente no txico Problemas comuns com o meio:

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- espcimes muito desbotados - formao de precipitados ou cristais - evaporao excessiva e formao de bolhas - toxidez c.1. Meios de montagem temporria A glicerina est includa nesta seo por ser lquida, mas ela ocasionalmente utilizada em montagens permenentes. gua: barata, mas evapora; o ndice de refrao (contraste) no bom para crustceos. Glicerina: os espcimes devem ser levados gradualmente at o estado isotnico por transferncia ou evaporao. Fornece um bom contraste para o exame microscpico; desbota levemente os espcimes; no-txica; estvel quase que indefinidamente, i. e. por anos. O problema que permite o crescimento de bactrias ou fungos aps alguns meses. Adicione um refreador de bactrias/fungos com formol 1% se necessrio. Tambm atrai formigas e outros insetos. Ver os comentrios sobre montagem permanente em gel de glicerina. cido Ltico: desbota e fornece excelente contraste. Os espcimes devem ser colocados em soluo aquosa 50% antes de serem transferidos para o cido puro. Baixa toxidez, agradvel de se trabalhar. O cido ltico tambm tende a estender os espcimes, s vezes facilitando a viso das patas e tornando a disseco desnecessria. Graas a este efeito, quando comunicar medies, melhor informar o meio em que elas foram tomadas. Como problemas temos que o cido ltico desbota e amolece os espcimes indefinidamente. Depois de algum tempo, os espcimes vo ficar to claros como o vidro e extremamente delicados, podendo se desarticular. Para o armazenamento permanente, eles devem ser transferidos para outro meio. Alm disso, o cido ltico desbota algumas estruturas internas como receptculos seminais que so utilizados na taxonomia de alguns gneros. Examine o espcime em glicerina antes de transferir para o cido ltico.

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c.2. Meio de montagem permanente: Meios com base de goma arbica (todos meios desbotadores): de Apathy:

50 g de goma arbica (use em forma de bolinhas, no em p) 50 g de acar puro 50 ml de gua destilada 0,05 g timol / 1 ml de formol Aquea a gua e a goma at que ela esteja dissolvida; adicione ento o accar, e depois o timol. de Reyne:

10 g de hidrato de cloro 10 ml de gua destilada 2,5 ml de glicerina 6 g de goma arbica Dissolva o hidrato de cloro na gua; adicione a glicerina e misture com um basto de vidro; adicione goma arbica e misture cuidadosamente, evitando bolhas; aguarde 1 semana antes de usar. A goma arbica slida e a gua podem ser substitudas por 12 ml de goma arbica lquida. Mantenha o meio no escuro O meio de Reyne pode formar pequenos cristais, assim no permanente alm de um ano, mais ou menos. de Faur:

50 ml de gua destilada 50 g de goma arbica (cristais claros) 200 g de hidrato de cloro 20 g de glicerina Misture os ingredientes como com o meio de Reyne. Para um meio mais viscoso, a quantidade de gua destilada pode ser reduzida a at 25 ml. Este meio pode ficar estvel e fornecer boas condies de visualizao por 10 anos ou mais (F. Stoch, comunicao pessoal). de Gray:

10 ml de gua 3 ml de cido actico glacial 5 ml de xarope de dextrose 8 g de goma arbica 75 g de hidrato de cloro Misture a gua com o cido e o xarope. Dissolva na goma (precisa de 1 semana

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ou mais). Homogeneize de vez em quando; quando a soluo estiver completa, adicione o hidrato de cloro. Similar ao meio de Reyne em propriedades. de Hoyer:

8 g de goma arbica 10 ml de gua destilada 75 g de hidrato de cloro 5 ml de glicerina 3 ml de cido actico glacial Dissolva a goma arbica em gua destilada. Adicione hidrato de cloro, glicerina, e cido actico glacial. Filtre em l de vidro. Mantenha no escuro. de Hoyer (outra verso):

30-40 g de goma arbica 200 g de hidrato de cloro 20 ml de glicerina 50 ml de gua destilada Dissolva a goma na gua por 24 horas, adicione o hidrato de cloro, espere at ele se dissolver, ento adicione glicerina. Se o meio no estiver claro, filtre duas vezes em l de vidro. Mantenha em uma garrafa com tampa de vidro. de Hoyer (outra verso, desenvolvida por Tatsunori Ito):

8 g de goma arbica 30 g de hidrato de cloro 10 ml de gua destilada 1 ml de cido actico glacial 2 ml de glicerina 100% Triture a goma arbica e o hidrato de cloro at o p e misture. Adicione gua, cido actico e glicerina, misture suavemente, aquecendo levemente se necessrio. Filtre se a goma arbica no estiver clara (W. Mielke, comunicao pessoal). Os espcimes podem ser montados em lminas com o meio de Hoyer sem que seja necessrio desidrat-los antes. Alm disso, ele grosso o suficiente para no precisar de suportes de lamnula (Baker & Wharton 1952). Meio com Gel de glicerina (semi-desbotador): Gel de glicerina excelente para montagens permanentes; ele desbota apenas um pouco e assim estruturas internas como o receptculo seminal e as faixas musculares ficam facilmente visveis. Voc pode adicionar corantes ao gel, e eles vo gradualmente passar do meio para o espcime. Boas preparaes comerciais so facilmente encontradas. Primeira receita:

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15 g de gelatina da melhor qualidade 100 ml de gua destilada 100 ml de glicerina pura Mais qualquer uma das seguintes substncias, para inibir o mofo: 1 g de fenol 0,01 g de mertiolato 1 g de timol 1 ml de zefiran 1 ml de formol Dissolva a gelatina na gua com um calor moderado (abaixo de 75oC), e ento adicione a glicerina + o inibidor de mofo; mexa at ficar homogneo. Mantenha refrigerado em frasco tampado. Segunda receita (Morholt et al., 1966): 10 g de gelatina 60 ml de gua destilada 10 ml de glicerina 1 g de fenol Embeba a gelatina na gua destilada por 2 horas, mais ou menos. Adicionie ento a glicerina e o fenol. Aquea em banho maria (aproximadamente 40oC), mexendo suavemente at a mistura estar completa. Esfrie. No permita que a temperatura ultrapasse os 40 oC, ou o colide no vai mais se solidificar. Para montar uma lmina com gel de glicerina: Adicione glicerina ao lcool ou formol onde o espcime est acondicionado, at que 10% do fluido seja glicerina; ento evapore at 100% glicerina. Nesse ponto voc pode transferir o espcime para o gel de glicerina. Coloque uma gota do gel em uma lmina e aquea a lmina a aproximadamente 40oC. Se ele for aquecido a mais de 75oC, o gel se transforma em metagelatina e no se solidifica mais na temperatura ambiente. No deve haver meio em excesso, i. , a gota no deve se estender alm da lamnula. Se quiser, adicione 3 ou mais pedaos de vidro partido (pedaos de lamnulas) para oferecer suporte para a lamnula. Adicione o espcime inteiro ou as partes dissecadas e posicione-os prximo ao centro da lmina. Coloque a lamnula sobre o conjunto - lentamente, pegando a borda da gota do meio. Permita que o gel esfrie por pelo menos algumas horas antes de lacrar (lminas feitas em glicerina pura podem ser lacradas imediatamente). Lacres apropriados para lminas de glicerina ou de gel de glicerina incluem o blsamo do Canad, Glyceel Murrayite , , ou poliuretano impermevel. Esmalte de unha claro tambm pode ser utilizado, mas ele vai secar e se separar aps alguns anos. Guarde as lminas horizontalmente. Problemas com o gel de glicerina: Os espcimes devem estar em glicerina antes da transferncia para o gel, de

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outra forma podem implodir. A disseco deve ser feita em glicerina anteriormente e as partes transferidas para o gel aquecido e derretido antes que ele esfrie e endurea. Com experincia, a disseco pode ser feita na gelatina enquanto ela est lquida; se ela comear a se solidificar antes da hora, simplesmente reaquea a lmina. O gel de glicerina seca, e a lmina deve ser selada para o armazenamento permanente. Cuidado para no aquecer as lminas terminadas, como por exemplo prximo a uma fonte poderosa de luz, pois elas podem derreter. Isto tambm pode acontecer no transporte das lminas. Meio de Lactofenol polivinil (PVL) (desbotador): Receita 1 (J. R. Hendricks): 20 ml de cido ltico 20 g de cristais de fenol ou 20 ml de fenol lquido Soluo B: 100 ml de H2O, 8 g de cristais de polivinil, homogeneizada e aquecida para torn-la mais clara e viscosa. Pegue as solues A e B, misture-as sem homogeneizar. Deixe descansando de um dia para o outro, misture novamente. Vai ficar mais clara aps vrios dias. Receita 2: (Gray e Weiss, 1950): 2 g de p de lcool de polivinil 7 ml de acetona 70 %. 5 ml de gua destilada, 5 ml de glicerina, 5 ml de cido ltico. 5 ml de gua destilada. Coloque o polivinil na acetona e misture. Ento, adicione a gua destilada, a glicerina e o cido ltico. Misture e adicione mais 5 ml de gua destiliada. Aquea cuidadosamente, misturando at que a soluo fique clara (no ferva). Se estiver muito viscosa, adicione mais gua, algumas gotas de cada vez. No existe fonte comercial de PVL no momento Lacres apropriados para PVL incluem Glyceel e esmalte de unha. Murrayite no deve ser usada, pois forma bolhas. Ver disucsso em Koomen & Vaupel Klein (1995). CMC (desbotador): CMC o nome comercial de uma outra famlia de meios contendo lcool de polivinil, cido ltico, e outros ingredientes. CMC rende melhor se os espcimes forem montados diretamente da gua do mar. Verses de baixa viscosidade (CMC-9) e de alta viscosidade (CMC-10), com vrios corantes adicionados, ou sem corantes, so disponveis. Uma receita para CMC:
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6 g de lcool de polivinil 133,000 mw 40 ml de acetona 70% 25 g de hidrato de cloro 80 ml de gua destilada 15 ml de cido ltico, grau branco USP CMC-P tem fenol ao invs de hidrato de cloro, seca mais devagar do que o CMC, e usado para relaxar espcimes vivos e desbot-los rapidamente. Montagens com CMC podem ser lacradas com o prprio CMC, esmalte transparente de unhas, poliuretano impermevel, Glyceel e Murrayite , . Vantagens de PVL e CMC: Os espcimes podem ser montados diretamente da gua e de solues de formol ou etanol, de glicerina, ou de cido ltico, sem distores srias de todos os espcimes, com exceo dos mais delicados. Os dois meios so supostamente auto-ressoantes, ou seja, as lminas podem ser acondicionadas horizontalmente em condies normais de temperatura/umidade por longos perodos (meses) sem ressecar seriamente. Para um armazenamento mais longo, em condies inusitadas, ou para lminas que sero transportadas: permita que as lminas de PVL sequem em uma posio horizontal, preferivelmente em um dessecador, ento lacre. As lminas com CMC podem ser lacradas imediatamente com mais CMC, ou outro lacre. Desvantagens: PVL / CMC evaporam continuamente. Permita a evaporao por 1-15 minutos, dependendo da viscosidade inicial do meio, antes de colocar a lamnula. Isto permite a evaporao de algum fenol, evitando assim a formao excessiva de cristais afilados de fenol sob a lamnula. A formao de cristais menos sria com o CMC do que com o PVL. Permitir que o meio fique um pouco viscoso antes de aplicar a lamnula tambm evita o movimento excessivo de pequenas partes do corpo para as bordas da lmina. Uma tcnica para fixar partes da lmina deixar escorrer uma pequena linha do meio na lmina, arrumar as partes dissecadas sobre ela, deixar secar por alguns minutos, e depois cobrir com mais meio e com a lamnula. Isto funciona melhor com os espcimes maiores. A disseco deve ser feita em 5-10 minutos, antes que o meio fique excessivamente viscoso. Se isto se tornar um problema, a dissseco pode ser feita em cido ltico ou glicerina e as partes transferidas rapidamente para a lmina final. Alm disso, PVL e CMC podem ser diludos com gua destilada. Partes montadas em PVL apresentam uma tendncia a se achatar, isto , perder algum contraste, depois de alguns dias. Este problema pode ser atenuado mas no evitado com a adio de um corante suave. Nota: Huys & Boxshall (1991) no recomendam o uso de PVL para colees de tipos porque o PVL tende a desbotar excessivamente o espcime em aproximadamente 10 anos, pode formar cristais, e seca se no for selado. Huys e Boxshall recomendam lactofenol para tipos.

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Lactofenol (semi-desbotador): 30 ml de cristais de fenol derretidos 10 ml de cido ltico 20 ml de glicerina 10 ml de gua destilada Lactofenol recomendado por Huys & Boxshall (1991) para colees de tipos. Ela no desbota muito e permite remontagem se necessrio. Precisa ser lacrado. Blsamo do Canad (desbotador): Retirado de um artigo de Thatcher (1987): Fixe o espcime em AFA (85 partes de etanol 85%; 10 partes de formol; 5 partes da cido actico glacial) por pelo menos 10 minutos. Depois, passe o espcime diretamente do AFA para a soluo corante (etanol 95% colorido at a intensidade de um ch fraco com partes iguais dos corantes eosina e laranja-G). Mantenha nesta soluo por 3-10 minutos e ento transfira os espcimes para fenol puro (liquefaa os cristais de fenol com um pouco de etanol 95% para obter esta soluo). O fenol simultaneamente desidrata, desbota e descolore o material. Quando o espcime estiver claro no fenol ele leva poucos segundos para ficar desidratado, mas se uma descolorao maior necessria ele pode ser deixado nesta soluo por mais alguns minutos. Depois que o grau apropriado de descolorao foi alcanado, passe o coppode para salicilato de metila, que paralisa o processo de desidratao. Depois de 2 minutos no salicilato de metila, o espcime pode ser montado no blsamo. O processo todo leva de 8-10 minutos. Material fixado de outras formas e armazenado em etanol 70% pode ser processado da mesma forma, mas espcimes em solues aquosas (p. ex. formol) devem ser colocados em etanol 70% por alguns minutos antes de se aplicar o corante. Se um espcime colapsa em salicilato de metila (coppodos raramente o fazem), pode significar que ele no foi fixado corretamente ou que estava morto h muito tempo quando foi fixado. Devolva o espcime ao fenol onde ele vai voltar forma normal em poucos minutos. Pode ser necessrio perfurar o animal com uma agulha fina para permitir uma troca mais rpida de lquidos. ocasionalmente til passar estes espcimes por uma soluo1:1 (fenol e salicilato de metila) antes da exposio ao salicilato de metila puro. Frequentemente acontece que um coppode fixado em uma posio indesejvel, com as antenas enroladas em torno do corpo, ou com o abdmen enrolado sob o corpo. Estas condies podem ser corrigidas porque um espcime fica mole e manipulvel no fenol. Ele pode ser retirado do fenol, colocado em uma lmina seca e manipulado at uma posio boa com agulhas de disseco. Arrumar as patas neste momento pode tornar a disseco desnecessria. Quando o animal estiver na posio desejada, coloque uma lamnula sobre ele e adicione um pouco de salicilato de metila. Ele vai endurecer o espcime em poucos segundos e ele vai ficar naquela posio quando for colocado no blsamo. Vantagens:

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Fornece HYP (hundred-year preservation, preservao por cem anos). O blsamo do Canad um dos poucos meios que reconhecidamente ficam estveis por tanto tempo. Qualquer lmina feita com blsamo pode ser desmontada mergulhando-se em salicilato de metila ou xileno por algumas horas. Lminas feitas com PVL ou gel de glicerina, por outro lado, no podem ser satisfatoriamente desmontadas. Desvantagens: Este mtodo fornece boas lminas de corpo inteiro, mas difcil us-lo com partes dissecadas. O blsamo do Canad um meio grosso e viscoso, e no pode formar as montagens finas necessrias para a inspeo adequada dos menores detalhes. d. Manipulao e disseco: Para arrumar e manipular inicialmente os coppodes, um objeto rombudo ou um espinho de cactus montada em um apoio de agulhas pode ser utilizado. Frceps finos (com agulhas na ponta), pipetas pasteur com um bulbo flexvel de borracha, ou Alas de Irwin so teis para a transferncia de espcimes individuais sem que se transfiram quantidades desnecessrias do meio. Alas de Irwin so disponveis comercialmente (Seo 5) ou podem ser feitas pela eletrlise de um fio de tungstnio na ponta de um cabo, seguida da deformao do fio em uma ala com um frceps fino. Pipetas pasteur devem estar limpas antes do uso. Para manipular e transferir pequenas peas bucais, use uma agulha fina ou um clio montado em um cabo. A disseco feita mais facilmente em glicerina, cido ltico, PVL, ou CMC de baixa viscosidade. Os espcimes podem ser dissecados em glicerina para montagem temporria, ou diretamente no meio permanente. Freqentemente conveniente dissecar no meio final de montagem, ao invs de tentar transferir partes pequenas. A escolha do meio de disseco depende do meio final de montagem. Disseque em cido ltico se o espcime ser montado em PVL ou lactofenol. Disseque em gua se o meio final uma soluo aquosa. Para a disseco, use alfinetes entomolgicos finos (0,2 mm de espessura) de ao inoxidvel, montados em cabos de madeira; agulhas de tungstnio; ou um microescalpelo. Para fazer agulhas de disseco de tungstnio: Afie pedaos de fio de tungstnio (tamanho aproximadamente #29, 0,25 mm, ou dimetro de 400 m) eletrolizando uma das pontas em um circuito de 6 volts. Use um transformador de microscpio para fornecer os 6 volts: uma ponta fio nu, a outra uma fio com cabea jacar que segura um pedao de fio de tungstnio com aproximadamente 2 cm de comprimento. Segure a ponta do fio em uma soluo de KOH ou NaOH mais ou menos 20%, por vrios minutos a at uma hora, mergulhando e retirando o fio at que o formato desejado seja obtido. Monte o fio afiado em um cabo de madeira ou plstico. O tungstnio no reativo a cidos, lcalis ou solventes ordinrios de laboratrio, e pode ser limpado em uma chama. Para fazer um micro-escalpelo:

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Use um alfinete entomolgico normal (no inoxidvel) de tamanho 00 ou 000. Monte o alfinete na ponta de um cabo fino de madeira ou plstico. Afie o alfinete nos dois lados com uma pedra fina e um pouco de leo mineral, at que forme-se um lmina de faca. Disseco com esta ferramente mais eficiente em uma placa de Petri de plstico. Com a mo esquerda, impale o coppode em uma rea conveniente e ancore-o ao fundo da placa. Com o micro-escalpelo na mo direita, retire as peas bucais e os apndices (Comunicao pessoal de J. Cordell). Cabos de agulha: Os cabos devem ser leves e ter por volta de 15 cm de comprimento. A espessura de acordo com a preferncia pessoal. Cabos de madeira podem ser confeccionados facilmente cortando-se o tamanho apropriado, prendendo-se uma ponta a uma mesa com fita crepe, e fazendo um furo em uma ponta com um alfinete de costura. Depois, coloque uma gota de epxi sobre o furo, insira a agulha no furo, e guarde a ferramenta com a agulha voltada para cima at que o epxi endurea completamente. Tubos capilares de vidro grosso tambm so teis como cabos de agulha, mas esto ficando mais difceis de se encontrar. Use o melhor microscpio de disseco disponvel, como o Wild M5A. Este microscpio fornece uma qualidade tica excelente e uma gama de magnificaes (oculares fixas de 60x, 120x, 240x e 500x), com objetivas de 10x. Uma lente auxiliar de 2x fornecida para dobrar estas magnificaes; mas ela tende a reduzir a quantidade de luz disponvel quando usada a 500x, que um fator crtico. ticas de zoom so adequadas, mas no alcanam a qualidade tica das lentes fixas. Algumas pessoas preferem apoios para os braos, tambm disponveis no Wild M5. Iluminao a partir da base da do aparelho, fornecendo luz transmitida quase essencial para o melhor contraste. Procedimento de disseco: Esta a parte mais frustrante da manipulao dos coppodos e apenas muita prtica pode fornecer resultados. Segure um alfinete em cada mo. Prenda o espcime com um alfinete, remova a parte do corpo com o outro alfinete. Para espcimes menores, a remoo de um somito inteiro com as patas associadas (P1-4) pode ser mais fcil; o somito pode ento ser removido das patas pareadas. A peas bucais devem ser dissecadas individualmente. Algumas pessoas preferem comear a disseco nos apndices ceflicos, outras no urossomo. Sequncias de disseco foram discutidas por Coull (1973), Hamond (1969), Humes & Gooding (1964) e Huys & Boxshall (1991). e. Montagem: Use lminas padro de vidro, com uma ponta fosca se preferir. Lminas finas so as melhores. Limpe com etanol 70%. As lamnulas devem ser de espessura No. 0 ou 1 para espcimes de tamanho planctnico.

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A1s A2s pe?as bucais

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P3 P5

Etiqueta

O formato da lamnula (retangular ou redondo) e a disposio dos espcimes Urossomo P1, P2 uma questo de preferncia pessoal. Uma opo so lamnulas redondas de 15 mm, duas das quais se encaixam facilmente em uma lmina com espao para uma etiqueta (Fig. 2):

Fig. 2. Uma arrumao possvel dos apndices dissecados em uma lmina. Faa uma faixa do meio de disseco horizontalmente ou verticalmente no meio da lmina. Adicione uma pequena gota do meio na ponta da lmina. Permita que a faixa seque levemente. Pegue ento uma lamnula limpa com um frceps, faa uma cruz com o meio de montagem na lamnula, e gentilmente coloque a lamnula sobre a faixa do meio na lmina, com os braos da cruz em um ngulo de 45o faixa de meio parcialmente ressecada. Faa isso para reduzir a formao de bolhas de ar. A lamnula pode ser reforada com fragmentos de vidro, fios, ou pedaos de cera. No use massa de modelar, que eventualmente se desintegra. As lminas podem ser convenientemente armazenadas por algum tempo e placas de Petri de plstico ou vidro, cobertas contra poeira e insetos. Em climas midos, um dessecador til. Guarde as lminas horizontalmente por 1-2 semanas para estabilizar e secar o meio. Lacre com esmalte transparente de unhas, Murrayite blsamo, poliuretano , impermevel, epxi, parafina, etc., ou com o prprio meio se ele endurece. Esmalte de unha tende a endurecer e se separar depois de alguns meses. O lacre deve poder correr para baixo das bordas da lamnula se possvel. melhor etiquetar as lminas permanentemente com uma agulha de diamante alm das etiquetas de papel, especialmente em climas midos. 3. Um Procedimento Simples para o Exame e Montagem de Espcimes: 3.1 Transfira o espcime para uma lmina escavada com algumas gotas de etanol 70% - glicerina 10 %.A espessura da lmina escavada vai depender do tamanho do espcime. Use a lmina mais fina possvel, pois as lminas finas fornecem melhores condies ticas. 3.2 Espere 5-10 minutos enquanto a soluo evapora a glicerina quase pura. Observe para ter certeza de que o espcime permanece na gota de lquido. 3.3 Coloque uma lamnula (as redondas so as melhores) parcialmente sobre a concavidade, permitindo que o lquido escorra sob a lamnula. Adicione um pouco de glicerina pura se necessrio. 4. Com agulhas, empurre o espcime sob a lamnula, prximo borda da concavidade. O espcime pode ser rolado suavemente sob a lamnula at qualquer orientao

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desejada. Para calanides, procure detalhes das projees torcicas e do urossomo; detalhes das antnulas (A) tambm podem ser visveis neste estgio. Depois, remova, o espcime de sob a lamnula e disseque as duas antenas e a pata 5, devolvendo-as para baixo da lamnula ou transferindo-as para um meio de montagem temporrio ou permanente em uma lmina normal, se desejado. Para ciclopides, procure por uma espinha na expanso medial do basipodito da pata 1 (P1). Contar o nmero de artculos na antnula (A1) e as patas natatrias (P1-4) tambm fcil neste estgio. Depois, remova o ciclopide de sob a lamnula, pressione as 4as patas contra a borda da lamnula, e empurre o espcime de volta para baixo da lamnula de modo que as patas natatrias fiquem voltadas anteriormente (Fig. 3a). Isto prende o espcime em uma posio estvel com as estruturas (4a e 5a patas e urossomo) normalmente necessrias para a determinao taxonmica a nvel de espcie facilmente visualizadas (Fig. 3b, c).

Fig. 3.

a. Vista lateral do ciclopide por inteiro sob a lamnula com as patas natatrias voltadas anteriormente; b) vista ventral do corpo posterior de um ciclopide com a pata 4 voltada anteriormente; c) vista ventral de um harpacticide na mesma posio (b, c de Graeter, 1910). Para a maioria dos harpacticides, pode ser possvel ver todas as estruturas necessrias sem a disseco, manipulando o espcime debaixo da lamnula em vrias posies. s vezes, a maioria das estruturas visvel se o espcime for separado entre as 4a e 5a patas. Se as patas 1-4 estiverem preservadas em posies complicadas, a disseco completa pode ser necessria. Para espcies pequenas, os detalhes podem no ser suficientemente visveis em
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glicerina. Transfira para cido ltico, apoiando a lamnula com vrios pedaos de vidro. O cido ltico normalmente estica os espcimes de modo que a disseco pode no ser necessria. 5. Os espcimes podem ser devolvidos da glicerina para o etanol 70% se for necessrio; diluies seriais podem ser desejveis. Para fazer lminas permanentes, os espcimes podem ser trnasferidos diretamente da glicerina para o gel de glicerina, meio de Hoyer, CMC, ou PVL.

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4. Referncias: BAKER & WHARTON. 1952. An Introduction to Acarology. BECKETT, D. C. & LEWIS, P. A. 1982. An efficient procedure for slide mounting of larval chironomids. Transactions of the American Microscopical Society 101: 9699. COULL, B. C. 1977. Marine fauna and flora of the northeastern United States. Copepoda: Harpacticoida. U. S. Dept. of Commerce, National Oceanographic and Atmospheric Administration Technical Report, NMFS Circular 399. 48 p. GRAETER, E. 1910. Die Copepoden den unterschdischer Gewsser. InauguralDissertation zur Erlangung der Doktorwrde, Universitt Basel. E. Schweizerbart sche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart. 1-87 + Tafeln I-III. GRAY, P. & WEISS, G. 1950. The use of polyvinyl alcohol and its derivatives as microscopical mounting media. Part I. Water miscible mounting media. Microscopical Society Series III, XX, 3: 287-291. HAMOND, R. 1969. Methods of studying the copepods. Journal of the Quekett Microscopical Club 31:137-149. HULINGS, N. C., & GRAY, J. S. 1971. A manual for the study of meiofauna. Smithsonian Contributions to Zoology 78:1-83. HUMES, A. G. & GOODING, R. U. 1964. A method for studying the external anatomy of copepods. Crustaceana 6:238-240. HUYS, R. & BOXSHALL, G. A. 1991. Copepod evolution. The Ray Society, London. 468 p. KOOMEN, P. & Von VAUPEL KLEIN. 1995. The suitability of various mounting media for permanent mounts of small chitinous crustaceans, with special reference to the observation of integumental organs. Crustaceana 68: 428-437. McKINNON, D. 1991. A Toolbook for the Practical Identification of Pelagic Copepods. 60 p. (panfleto no-publicado) MORHOLT, E., BRANDWEIN, P. F. & JOSEPH, A. 1966. A sourcebook for the biological sciences. 2nd ed. Harcourt, Brace & World, Inc., New York. STEEDMAN, H. F. 1976 Zooplankton fixation and preservation. UNESCO Press, Paris. 350 p. THATCHER, V. E. 1987. Hope for HYP. Monoculus Copepod Newsletter 15: 20-23. WESTHEIDE, W. & PURSCHKE, G. 1988. Organism Processing. Captulo 10, pp. 146-160 in Higgins, R. P. & Thiel, H., eds. Introduction to the Study of Meiofauna. Smithsonian Institution Press, Washington, DC.

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VAN CLEAVE, H. J. & ROSS, J. A. 1947. A method for reclaiming dried zoological specimens. Science 105 (2725):318. Nota: Algumas destas referncias so disponveis na Biblioeca de Coppodos C. B. Wilson, Dept. of Invertebrate Zoology, National Musuem of Natural History, Smithsonian Institution, Washington, DC 20560 USA. 5. Agradecimentos Eu agradeo pelos comentrios e contribuies teis a Dorothy B. Berner, Jeffrey R. Cordell, Vicki Medland, Wolfgang Mielke, Carlos E. F. da Rocha, Fabio Stoch, Regina Wetzer, e muitos outros colegas ao longo dos anos.

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7. Alguns fornecedores de Equipamento e Reagentes: Clorazol Negro E: Sigma Chemical Co. P. O. Box 14508 St. Louis, Missouri 63178-9916 1-800-325-3010 (EUA & Canad) 314-771-5750 (Fora dos EUA & Canad) Fax 800-325-5052 (EUA & Canad) Fax 314-771-5757 (Fora dos EUA & Canad) Nmero do catlogo C1144 (1997). Masters Chemical Co. 200 Wilson Court Bensenville, Illinois 60106 Fone 708-238-9292 Fax 708-238-9297 Polysciences, Inc. 400 Valley Road Warrenton, Pennsylvania, 18976-2590 USA 215-343-6484 DePeX: SERVA Heidelberg, Alemanha ou Crescent Chemical Co. 1324 Motor Park Way New York USA Fone 516-348-0333 Bodo Schmitt Nikolausberger Weg 37 D-37073 Gttingen Alemanha

CMC:

Eukitt:

Murrayite, cimento de G. B. I. Laboratories LTD. longa durao Shepley Industrial Estate Audenshaw, Manchester M34 England Fone 061-336-5418 Fio de tungstnio:

5DW

Polysciences, Inc. 400 Valley Road Warrenton, Pennsylvania, 18976-2590 USA 215-343-6484 (apenas pedidos) 1-800-523-2575 Fax 215-343-0214

Alfinetes finos, Carolina Biological Supply Co. Lamnulas redondas, 2700 York Road

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Lminas escavadas finas, Vidros de Relgio Alas de Irwin

Burlington, North Carolina 27215 USA 919-584-0381 1-800-334-5551

Dr. Mark D. Schram 25 Ponderosa Drive Batesville, Arkansas 75201 USA Fone 501-698-0762 schram@lorien.lyon.edu

Bulbos de pipeta de borracha flexvel (2 ml de capacidade, 2 1/4 de comprimento, No. 14-065B; so tambm conhecidos como bulbos nerf, e do o melhor controle de fluidos em micropipetas): Fisher Scientific 711 Forbes Avenue Pittsburgh, Pennsylvania 15219 USA 412-562-8300 1-800-766-7000 Papel de etiqueta (papel Resistall, feito por Byron Weston Paper Co.; para colees molhadas, i. e. em lcool -- no deteriora se molhado): University Products, Inc. 517 Main Street P. O. Box 101 Holyoke Massachusetts 01041-0101 USA Atendimento ao Consumidor: 1-800-762-1165 Pedidos apenas: 1-800-628-1912

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