ESTUDO DA CINTICA DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM CULTURA IN VITRO QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS

Ana Oliveira, Eng. Do Ambiente, n 8947 (laudia_5@hotmail.com); Hugo Barreiro, Eng.. Do Ambiente, n 10104 (hugo22_barreiro@hotmail.com); Marco Soares, Eng. Do Ambiente, n 2238 (marcopalmasoares@gmail.com); Sandra Costa, Eng. Do Ambiente, n 8234 (tetecomfiletes@hotmail.com)

RESUMO: Determinou-se a cintica do crescimento bacteriano, a partir de solues contendo Staphylococcus aureus com diferentes tempos de incubaes e de diluies. Para este estudo foram utilizados: Quantificao por turbidimetria que consiste na leitura da densidade ptica atravs do espectofotmetro e a contagem do numero de clulas viveis em placa, atravs das unidades formadoras de colnias (u.f.c.). Os resultados obtidos pelo mtodo da turbidimetria so diferentes do mtodo da contagem das u.f.c. pois no primeiro caso no se diferencia clulas viveis de clulas no viveis. Com os valores obtidos pelos dois processos traou-se os grficos da curva de crescimento. Os resultados mais relevantes foram os observados na fase de latncia das u.f.c. no qual verificou-se uma diminuio do nmero de microrganismos em relao ao que seria de se esperar, pois esta fase caracteriza-se por uma manuteno dos mesmos. Na restante leitura do grfico no se verificou nenhum acontecimento fora do normal j que as bactrias tiveram um comportamento que se enquadra com o que seria de esperar com as fases bem visveis, fase exponencial; desacelerao; estacionria e por ltimo a fase de morte. Palavras-chave: Staphylococcus aureus; turbidimetria; unidades formadoras de colnias; incubao; curva de crescimento.

1. MATERIAL E MTODOS: Material: Bata Papel absorvente Caneta de acetato Contentor para material utilizado Cuvetes para o espectofotmetro Espectofotmetro Isqueiro Tubos com 4,5 ml de gua destilada Lamparina e lcool Micropipetas e pontas esterilizadas Pipetas graduadas de 1 ml Placas de Petri esterilizadas Soluo Fisiolgica Vrtex Tubos com 15 ml de meio agar triptose fundido a 50C Estufas de incubao Parafilm Cultura bacteriana previamente incubada durante 0, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h e 24 h e >24 h. (Staphylococcus aureus)

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Para a contagem do nmero de clulas viveis a metodologia utilizada foi a identificao dos tubos e das placas de Petri com a respectiva diluio decimal e tempos. A preparao das diluies foi sempre feita da menos diluda para a mais diluda. Seguidamente pipetou-se 1 ml para as respectivas placas de Petri previamente identificadas. Aps isto fizemos a esterilizao da bancada e seguidamente transferiu-se de imediato o meio de cultura fundido para a placa de Petri e homogeneizamos, com movimentos circulares e deixou-se repousar. Seguiu-se a incubao na estufa a 37C durante 24 a 48 horas. Passado este tempo fez-se a contagem do nmero de colnias de cada placa. Na contagem por turbidimetria o tubo foi inoculado com Staphylococcus aureus. Seguidamente, em condies asspticas, retiramos 1 ml do tubo inoculado para uma cuvete que foi levada ao espectofotmetro onde se fez a leitura e se registou os dados obtidos.

2. RESULTADOS E DISCUSSO:
Quadro 1- Valores obtidos de densidade ptica da bactria Staphylococcus aureus por Turbidimetria.

Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8

Tempo de incubao a 28 C ou 37C T0- 0 min. (inoculao do meio de cultura) T1- 1 hora de incubao T2- 4 horas de incubao T3- 8 horas de incubao T4- 12 horas de incubao T5- 16 horas de incubao T6- 24 horas de incubao T7- >24 horas de incubao

Leitura da densidade ptica (DO600nm) 0,02 0,021 0,02 0,186 0,395 0,437 0,494 0,535

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Figura 1- Curva de crescimento obtida por Turbidimetria da bactria Staphylococcus aureus.

Quadro 2- Valores obtidos por contagem do nmero de clulas viveis

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8

Tempo de inoculao a 37C (horas) 0 1 4 8 12 16 24 30

Volume do inoculado (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1

Diluio decimal 1,0 x 102 1,0 x 102 1,0 x 10 1,0 x 103 1,0 x 106 1,0 x 107 1,0 x 10 1,0 x 10
7 6

Nmero de Colnias 207 110 300 121 296 38 48 252

Ufc ml-1 20700 11000 3000 121000 3 x 10 8 3,8 x 10 8 4 x 10

8 8

Log(ufc ml-1) 4,32 4,04 3,48 5,08 8,47 8,58 8,58 8,4

2,5 x 10

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Figura 2- Curva de crescimento obtida por contagem do nmero de clulas viveis em meio de cultura apropriado da bactria Staphylococcus aureus.

A bactria Staphylococcus aureus, sem nenhum tempo de incubao apresenta um crescimento de 4,32 Ufc/ml. Com 1 hora de incubao apresenta um crescimento inferior ao valor anterior continuando a decrescer at ao terceiro valor (4h), ou seja, a fase lag, tendo em conta que o tempo de duplicao em condies ptimas de 27-30 minutos. Este facto pode-se justificar pela bactria ainda no se ter adaptado, pois o meio ao ser diferente daquele de que o organismo provm, novas enzimas ter que ser sintetizadas para utilizar novos nutrientes. Durante a fase de lag d-se a sntese do ADN, a massa celular comea a aumentar e finalmente d-se a diviso celular da bactria. Um outro motivo para este decrscimo na fase lag pode dever-se temperatura, pois uma temperatura elevada pode danificar as clulas. Possivelmente na execuo do trabalho prtico o meio de cultura que se encontrava a 50 C no tenha sido suficientemente arrefecido. S a partir do quarto valor (8 horas) (Figura2) com valores na ordem dos 5,08 Ufc/ml que pode-mos considerar a fase exponencial de crescimento, os microrganismos crescem e dividem-se sua taxa mxima devido ao potencial gentico, natureza do meio e s condies de crescimento. Esta fase em relao s outras, caracteriza-se por um consumo significativo de nutrientes. A taxa de crescimento constante durante a fase exponencial o que significa que os microrganismos se dividem em intervalos regulares de tempo e a biomassa duplica igualmente nesses intervalos de tempo. O valor 8,58 Ufc/ml respeitante as 12 horas de incubao representa o valor mais alto do trabalho prtico, portanto aqui entra-mos na fase estacionria. O crescimento populacional cessa, e a curva de crescimento torna-se horizontal. Esta fase estacionria geralmente atingida quando a populao bacteriana atinge valores mximos de multiplicao. O processo de crescimento limitado pelo esgotamento dos nutrientes e principalmente acumulao de produtos do metabolismo celular que inibem o crescimento. Nesta fase a velocidade de crescimento diminui e o nmero de clulas vivas igual ao nmero de clulas mortas. No valor 8,4 Ufc/ml respeitante a 30h (>24h) verifica-mos uma diminuio de concentrao significativa, o que poder ser devido aproximao da fase de morte que ser a partir das 30h. Inevitavelmente devido a alteraes ambientais, como sejam a falta de nutrientes e acumulao de produtos txicos provenientes do prprio metabolismo celular que inibem o crescimento e conduzem a um declnio no nmero de clulas viveis que caracterstico da fase de morte. Nesta fase o nmero de clulas mortas excede o nmero de clulas vivas.

3. CONCLUSO: Entre os mtodos utilizados para quantificar o crescimento de microrganismos atravs do nmero de clulas (contagem feita por u.f.c.) e o mtodo da turbidimetria. Este ltimo o mais simples e rpido para obtermos resultados, recorre determinao
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de densidade ptica (absorvncia). Uma desvantagem da turbidimetria, como mostra os resultados obtidos, de no conseguir distinguir as clulas viveis das no viveis. A contagem de clulas atravs das u.f.c. uma metodologia mais demorada, mas com resultados mais precisos. Este mtodo no permite a contagem de clulas activas que no tm capacidade de se multiplicarem no meio de cultura. Sendo Staphylococcus aureus uma bactria que o tempo de duplicao em condies ptimas de 27-30 minutos, verificou-se uma fase lag de adaptao muito longa. A sua curva de crescimento um pouco diferente da curva de crescimento que se esperava, pois podem ter ocorrido pequenos erros laboratoriais, tais como, a m pipetao, m diluio ou morte das bactrias pelo meio de cultura excessivamente quente.

4. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS: Ferreira W; Sousa J. Lima N.; Microbiologia ; Lidel MADIGAN, M.; Martinko, J.; Parker, J. 2004. Microbiologia de Brock. 10 Edio