PREPARO DE LMINAS HISTOLGICAS

Ana Lcia Tosta Ribeiro, Anderson Carrijo da Costa, Cntia Ruiz Denadai, rika Maria Antonino Fonseca, Fabiana Peghim, Janayne Aparecida Pentino, Luiz Alves Rodrigues, Priscila Maria Antonini, Teresinha de Jesus Borin de Carvalho, Vanessa Cristina Mazzi Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos

INTRODUO O mtodo mais comum usado em histologia vegetal permite a obteno de preparados histolgicos permanentes (lminas) para estudo ao microscpio ptico. Nesse instrumento os objetos so examinados por transparncia e como rgos muito delgados so raros, a maioria precisa ser reduzida a cortes finos, suficientemente transparentes para serem examinados ao microscpio. Estes cortes so feitos com um micrtomo, mas antes de serem cortados os tecidos devem passar por uma srie de tratamentos. Obviamente, o que se deseja levar ao microscpio um preparo no qual os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura

e composio qumica que possuam quando vivos. Mas apesar dos cuidados tomados, esse ideal no alcanado plenamente, observando-se em todos os cortes histolgicos certos artefatos decorrentes do processamento que sofreram. A fim de evitar a destruio das clulas por suas prprias enzimas, ou por bactrias, os tecidos removidos devem ser adequadamente tratados imediatamente aps a sua retirada. Esse tratamento denominado fixao. A principal funo dos fixadores insolubilizar as protenas dos tecidos. Para obteno dos cortes, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por substncia de consistncia firme. As substncias mais usadas para essa finalidade (meios de incluso) so a parafina e as resinas plsticas. Os tecidos devem sofrer uma srie de tratamentos antes da impregnao. Na primeira etapa do processo, denominada desidratao, a gua extrada dos tecidos pela passagem dos mesmos em banhos de concentraes crescentes de etanol, geralmente de 70%, at etanol puro (100%). Em seguida, o etanol substitudo por um lquido miscvel e geralmente usa-se xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substncias tornam-se translcidos, razo por que essa etapa denominada clareamento. Mergulhamse, ento, os tecidos em parafina fundida numa estufa a 60C. Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam, e os espaos anteriormente ocupados pela parafina ficam livres. Coloca-se o tecido num recipiente contendo um pouco de parafina fundida e deixa-se solidificar, formando-se um bloco de parafina com o tecido no seu interior (incluso). Os blocos de parafina, contendo os tecidos includos, so seccionados pela navalha de ao do micrtomo, obtendo-se geralmente cortes de 6 a 8 m de espessura. A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao microscpio ptico. Devido a isso, foram introduzidos mtodos para a colorao dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis e destacados uns dos outros.

A maioria dos corantes usados em histologia comporta-se como cidos ou bases e tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos. A hematoxilina comporta-se como um corante bsico, ligando-se s estruturas basfilas dos tecidos. A hematoxilina cora em azul os ncleos celulares e outras estruturas de natureza cida, como regies do citoplasma ricas em RNA e espessamentos celulares de celulose. Ao estudar um corte histolgico no microscpio, preciso ter em mente que a estrutura das clulas e tecidos est alterada pela tcnica histolgica. As etapas da tcnica histolgica, e subseqentes fixao (desidratao, algumas clareamento, impregnao colorao), tambm introduzem

modificaes nos tecidos, que no devem dificultar a caracterizao das estruturas estudadas. Alm disso, a delgada espessura dos cortes cria um obstculo ao estudo tridimensional dos tecidos e rgos. Para se chegar a compreender a arquitetura tridimensional de um rgo ou tecido, torna-se necessrio o estudo de cortes realizados em diferentes direes.

MATERIAIS E MTODOS Para a realizao dos cortes histolgicos, foram cortados e retirados segmentos no 1/3 proximal da regio laminar, retirando cerca de 1 cm2 cada pea nas folhas de Hibiscus rosacinencis L. com auxlio de uma rgua e tesoura. Estes pedaos de folhas foram submetidos s seguintes metodologias:

Metodologia I: Utilizou-se a mesma tcnica para os cortes histolgicos de tecido animal, procedendo desidratao, clareamento, impregnao, incluso e a colorao com o auxilio de cassete (Lupe), pinas, bqueres, cronmetro, proveta,

estufa, geladeira, micrtomo, lminas, lamnulas, resina Permount (Fisher Scientific) e o microscpio para visualizao dos cortes preparados. Consistindose na passagem dos cassete (Lupe) (onde contm a pea da planta) nas seguintes substncias e nos tempos indicados: DESIDRATAO: lcool lcool lcool lcool lcool lcool lcool lcool 70% 75% 80% 85% 90% absoluto I absoluto II absoluto / xilol 30 30 30 30 30 30 30 30 minutos minutos minutos minutos minutos minutos minutos minutos

CLAREAMENTO: Xilol I Xilol II Xilol III IMPREGNAO: Parafina I Parafina II Parafina III 30 minutos 30 minutos 30 minutos 20 minutos 20 minutos 20 minutos

Aps estes procedimentos, realizou-se a incluso da pea no molde de parafina, onde ela inclusa no centro do molde at completa solidificao, resfriada e levada a geladeira por no mnimo 40 minutos. A pea moldada de acordo com o tamanho do micrtomo, sendo realizado os cortes de 7 m que so levados ao banho-maria na temperatura entorno de 50C. Os cortes so colocados na lmina e corados com a hematoxilina (HE), seguindo os tempos necessrios: Xilol I Xilol II lcool absoluto I 7 minutos 7 minutos passagem

lcool absoluto II lcool 90% lcool 70% gua Hematoxilina gua lcool 70% lcool absoluto I lcool absoluto II Xilol I Xilol II Xilol III

passagem passagem passagem 2 minutos 2 minutos 2 minutos passagem passagem passagem passagem passagem passagem

Feita a colorao, as lamnulas foram fixadas nas lminas com permount, estando pronta para a visualizao no microscpio.

METODOLOGIA II: Aplicou-se a tcnica anterior mudando somente o tempo de permanncia do xilol no clareamento, de 20 minutos para 10 e 5 minutos. Na colorao, de 7 minutos para 3 e posteriormente para 1minuto, seguindo normalmente as outras etapas at visualizao. METODOLOGIA III: Quando as peas das plantas foram removidas, elas ficaram por cerca de 12 horas no formol para que fosse realizada a fixao e prosseguiu-se normalmente com a desidratao, clareamento, impregnao e colorao da metodologia anterior. METODOLOGIA IV: As peas foram colocadas por 10 minutos na gua destilada, 20 minutos no xilol, incluidas no molde de parafina e ento foram feitos os cortes no micrtomo.

METODOLOGIA V: As peas contidas no cassete (Lupe) passaram pelos seguintes procedimentos: gua destilada 10 minutos Xilol 20 minutos Descansou at que o xilol tenha escorrido. Xilol 20 minutos Depois foram colocadas em parafina e levadas para a estufa a 56C. Fezse a incluso nos moldes, esperou-se secarem e foram levadas para a geladeira. As peas foram moldadas no micrtomo e feitos os cortes, tiradas do banhomaria e passadas para as lminas, fazendo-se a colorao nas seguintes substncias: Hipoclorito Hematoxilina gua de torneira Lugol 7 minutos 1 minuto lavagem 1 minuto

As lamnulas foram fixadas nas lminas com Permount (Fisher Scientific) e visualizadas ao microscpio. METODOLOGIA VI: Utilizou-se o procedimento da desidratao, clareamento, impregnao e a incluso da metodologia I, e cortes no tamanho de 20, 25 e 40 m. Para a colorao foram usadas as seguintes substncias e tempos: Xilol I Xilol II lcool absoluto I lcool absoluto II lcool 90% lcool 70% gua de torneira Hipoclorito gua de torneira Lugol 1 minuto 1 minuto passagem passagem passagem passagem lavagem 5 minutos lavagem 1 minuto

Hematoxilina gua de torneira lcool 70% lcool 90% lcool absoluto I Xilol I Xilol II Xilol III

38 segundos lavagem passagem passagem passagem passagem passagem passagem

Aps a colorao as lamnulas foram colocadas nas lminas com Permount (Fisher Scientific) e visualizadas ao microscpio.

METODOLOGIA VII: Fez-se o mesmo procedimento da metodologia V, mudando as substncias e tempos na colorao: Xilol I Xilol II lcool absoluto I lcool absoluto II lcool 90% lcool 70% gua de torneira Lugol Hematoxilina gua de torneira lcool 70% lcool 90% lcool absoluto I lcool absoluto I Xilol I Xilol II Xilol III 3 minutos 3 minutos passagem passagem passagem passagem lavagem 5 minutos 38 segundos lavagem passagem passagem passagem passagem passagem passagem passagem

Foram colocadas as lamnulas e visualizadas ao microscpio. RESULTADOS

Todas as Metodologias I a VI descritas e testadas, no produziram cortes bons, montados em lminas para visualizao ao microscpio ptico adequadas, tornando-se difcil a distino dos tecidos a serem estudados. Dependendo da finalidade a que se destina pode-se montar os cortes em lminas para observao imediata ou em lminas ditas permanentes. Neste estudo obtivemos os melhores cortes semi-permanentes com a Metodologia VII. Outra dificuldade encontrada no estudo da histologia decorreu do fato de que, quando se cora um preparado histolgico, dependendo da tcnica empregada, apenas alguns aspectos das estruturas teciduais so evidenciados. difcil o preparo de uma lmina que mostre todos componentes celulares e todos os detalhes dos tecidos.

Leia mais sobre a produo de lminas vegetais em: a) Junqueira, L. C.; Carneiro, J.; Histologia Bsica, 8 edio, Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995. b) Esau, K., Anatomia das Plantas com Sementes; Editora Edgard Blucher, S.P.,1974.

Figuras e legendas

Figura 1: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L., corado com lugol no tamanho de 20 m.

Figura 2: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L., corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.

Figura 3: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L., corado com hematoxilina no tamanho de 20 m. Endereo Encontrado: www.cdcc.sc.usp.br/ciencia/artigos/art.../Aprendendo_lminas.doc