Introduo ao

Diagnstico Molecular
Prof. Rben Fernandes

Programa
1-O diagnstico molecular
2-Tcnicas de diagnstico molecular
3-Fluorescncia
4-Biomarcadores
5-Citogentica clssica e molecular
6-Diagnstico molecular de doenas infecciosas

Diagnstico molecular em medicina

O diagnstico qumico e molecular desempenha hoje um papel
fundamental em medicina.
Pode-se assumir que os dados obtidos dos laboratrios clnicos
contribuem para cerca de 50 a 80% do diagnstico mdico.
Alm dos mtodos clssicos de diagnstico em bioqumica clnica
(ensaios enzimticos, fotometria, electroqumica, espectrometria de
absorao atmica, mtodos colorimtricos, ) os mtodos
imunolgicos e genticos ganharam uma importncia nas ltimas
dcadas.

Diagnstico molecular em medicina

A tecnologia de anlise de cidos nucleicos tambm tem contribudo
para o desenvolvimento do diagnstico molecular
Tem-se verificado ainda, um aumento crescente do nosso
conhecimento acerca das doenas gentica e dos princpios
moleculares da doena
O termo diagnstico molecular pode ser usado em vrias situaes

Diagnstico molecular em medicina

Definio sensu latu:
Utilizao de mtodos analticos que so usados em laboratrios
clnicos para determinar, em amostras de pacientes, a presena de
molculas ou da sua funo.
Definio sensu strictum:
O termo diagnstico molecular pode ser usado como abreviatura de
diagnstico gentico molecular. E pode ser usado para a determinao
das alteraes no material gentico (sequenciao), interpretao da
sua informao (expresso gentica) ao nvel molecular (DNA ou
mRNA).

Diagnstico molecular em medicina

Importncia/utilidade
- doenas genticas
doenas infecciosas (virologia e bacteriologia)
Devido grande sensibilidade e especificidade das tcnicas e rapidez
de deteco

Doenas monognicas e polignicas

Doenas monognicas
mutao ou perda de funo de um nico gene
padro de hereditariedade (recessivo / dominante)
Doenas polignicas
mltiplas modificaes genticas
maior frequncia em algumas famlias mas
sem um padro de herana gentica tpico/reconhecvel

Doenas monognicas
Um exemplo tpico de doena monognica recessiva:
Fibrose qustica 1:600 perda de funo do canal ClGene CFTR (cystic fibrosis transmembrance conductance regulator)
Para cada clula diploide, a alterao s se manifesta se ocorrer a
perda da funo do gene em ambos cromossomas homlogos;
No entanto podem ocorrer heterozigticos para o gene defeituoso
mas uma quantidade de suficiente de protena funcional produzida

Fibrose qustica

ATP

Cl-

AMPc

ClCl-

ATP

Cl-

AMPc

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Fibrose qustica
Estatisticamente, da descendncia de portadores desta condio
ser afectada (homozigticos) para o gene com perda de funo
Dadas as suas caractersticas, diagnstico da FQ obtido apenas por
gentica molecular
No entanto, apenas algumas mutaes causam mais de 80% de perda
de funo da protena
Existem ainda muitas mutaes que causam protenas imperfeitas
O diagnstico muito complexo

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Doenas monognicas
As doenas dominantes (um nico alelo suficiente para
desencadear a doena) so ainda mais raras que as recessivas
So geralmente causadas por novas mutaes
A doena gentica dominante mais frequente talvez a
cardiomiopatia hipertrfica (CMH) que causada por mutaes em
diferentes protena do msculo cardaco.
As protenas mais frequentemente afectadas so as protenas do
sarcmero, como por exemplo a -miosina.

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13

Gene

Name

MYH7

- Myosin heavy chain

MYBPC3

Cardiac myosin-binding protein C

TNNT2

Cardiac troponin T

TNNI3

Cardiac troponin I

TPM1

Tropomyosin 1

ACTC

Cardiac actin 1

MYL3

Essential myosin light chain 3

MYL2

Regulatory myosin light chain 2

LAMP2

Lysosome-associated membrane protein

2

PRKAG2

Noncatalytic AMP-activated protein

kinase gamma 2

GLA

Galactosidase alpha (Fabry)

CAV3

Caveolin 3 (Muscular dystrophy)

MTTG

Mitochondrial transfer RNA glycine

MTTI

Mitochondrial transfer RNA isoleucine

MTTK

Mitochondrial transfer RNA lysine

TTR

Transthyretin (Amyloidosis)

TNNC1

Troponin C

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Cardiomiopatia hipertrfica
Uma das complicaes frequentes a fibrilao ventricular, que
conduz morte cardaca e afecta sobretudo homens saudveis e
desportistas.

Ataca sobretudo homens de meia idade o risco de morte aumenta com

a idade devido ao aumento da insuficincia cardaca;
Conhecem-se centenas de mutaes que podero causar CMH mas
nenhuma delas relativamente frequente (?)
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Doenas polignicas
Causadas pela interaco de diferentes mutaes em diferentes
genes;
Individualmente as mutaes no apresentam grandes efeitos, mas
em conjunto podem ter consequncias catastrficas;
Os diferentes genes ou alelos associados doena referem-se como
factores de risco;

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Doenas polignicas
Ex: enfarte do miocrdio:
Um dos principais factores de risco a hipercolesterolmia familiar
mutaes
a) receptor da LDL (LDLR)
b) ou no seu ligando a ApoB100
forma mais suave de hipercolesterolmia
c) polimorfismos e mutaes da ApoE

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Variabilidade individual

Prof. Rben Fernandes

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Variabilidade individual / diagnstico molecular

Biologia forense
Tipagem HLA
Farmacogenmica
Susceptibilidade a doenas infecciosas
Virologia / bacteriologia /
Epidemiologia/filogenia molecular
Resistncias

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1. Biologia Forense
Base de dados de DNA do FBI: CODIS
Combined DNA Index System
Lanado em 1998
Utilizado para resolver crimes em srie
Requer:
>4 marcadores RFLP
e/ou13 marcadores STR

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Biologia Forense
Base de dados de DNA do FBI: CODIS
STRs short tandem repeats
AATG

Homozigticos se ambos os alelos tiverem o mesmo tamanho

Heterozigticos se os alelos tiverem tamanhos diferentes

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195 bp / GTAA
170 bp / TCAT

Cuidado !
Primers diferentes produzem produtos de PCR (amplices) de diferentes
tamanhos para o mesmo alelo STR

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Identificao humana com um kit de multiplex STR

2 indivduos diferentes

(AmpFlSTR SGM Plus kit)

amelogenin D3 D8
D19

TH01
VWA

probabilidade de
correspondncia
ao acaso: ~1 em
3 trilhes
amelogenin D3
D19

D8

VWA
TH01

D16

D21
FGA

D18

D2

Tempo de todo o
processo de
identificao: 5
horas
D21 D16
D18
FGA
D2

Anlise simultnea de 10 STRs e identificao sexual

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2. Tipagem HLA

Sistema antignio leucocitrio humano (#6)

A espcie humana exibe um grande
polimorfismo no gene HLA e os seus produtos
(MHC I e MHC II) apresentam os antignios
s clulas T.
O sistema HLA contribui para a rejeio dos
rgos transplantados.

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Tipagem HLA

Um transplante s levado a cabo se houver compatibilidade do

sistema HLA.
A tipagem do sistema HLA pode
ser feito por FACS ou por genotipagem.

FACS Fluorescence activated cell sorting

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Tipagem HLA
Genotipagem do sistema HLA:

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1-Obteno do
sangue perifrico

2-Extraco de
mRNA

6-Anlise dos resultados e

consulta de base de dados

3-Amplificao dos alelos HLA

5Hibridao
num
microarray
4-Marcao
fluorescent
e dos
produtos
amplificado
s
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Tipagem HLA
Tipagem celular do sistema HLA:

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1-Obteno do
sangue perifrico

2-Extraco dos
leuccitos

3-Reaco imunolgica in
vitro com atc marcados com
fluorescncia

4-Leitura no
citmetro de
fluxo
5-Interpretao dos
histogramas

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3. Farmacogenmica

Farmacogentica vs. Farmacogenmica

um campo da Farmacologia clnica
Estuda a influncia de factores genticos na resposta administrao
de frmacos
Para cada gene isoladamente,
resultados
experimentais

interpretando os

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Farmacogenmica

Farmacogentica vs. Farmacogenmica

o estudo de conjuntos completos de genes com relevncia
farmacolgica
De como evidenciam as suas variaes
De como essas variaes interagem para produzir diferentes
fentipos
De como esses fentipos afectam a resposta administrao de
frmacos

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100 mil pacientes morrem anualmente nos EUA devido a efeitos txicos ou
secundrios da administrao de frmacos. Uma das principais razes est no
polimorfismo gentico.
Amalia M. Issa, Nature Reviews, 2002, 1, 300-308 Pharmacogenomics, 2004, 5, 571-579

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Amalia M. Issa, Nature Reviews, 2002, 1, 300-308 Pharmacogenomics, 2004, 5, 571-579

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Farmacogenmica
Poucas so os sistemas enzimticos que esto envolvidos no
metabolismo de frmacos, como o exemplo das oxidases do
citocromo P450.
O complexo Citocromo oxidase P450 extremamente polimrfico e
o responsvel pela grande variabilidade individual ao metabolismo de
um grande nmero de frmacos.
Actualmente, uma pequena quantidade de DNA pode ser usada para
genotipar polimorfismos do CYP450

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Farmacogenmica
Genotipagem dos polimorfismos da citocromo oxidase P450

(Roche-AmpliChip)

35

36

4. Susceptibilidade a doenas infecciosas

A variabilidade individual tambm se apresenta bastante importante na
questo da sensibilidade a doenas infecciosas.
Muitos microrganismos reconhecem receptores celulares especficos
do hospedeiro como portas de entrada neste. Muitos agentes
patognicos usam ainda os sistemas celulares do hospedeiro para sua
replicao e secreo.
Tanto os receptores celulares como os marcadores de susceptibilidade
intracelular podem ser analisados ao nvel genmico.

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Susceptibilidade a doenas infecciosas

4.1. Susceptibilidade gentica

A sndrome da imunodeficincia
grave combinada (SCID) uma
doena que est presente
nascena e deve-se deficincia
em ADA (Adenosina desaminase)
Maior susceptibilidade s
infeces

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SCID

Diagnstico:
Imunolgico (Citometria de fluxo, ELISA, RIA, Western):
- Funo imunolgica do sangue
Nveis de clulas B e T
Nveis de IgG, IgA, IgM
Bioqumico
Actividade da enzima
Efectuam-se ensaios in vitro em culturas celulares e os metabolitos
so analisados por electroforese capilar (ou HPLC, TLC bidimensional)

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Teraputica da SCID
Terapia gentica/celular

40

Teraputica da SCID

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Susceptibilidade a doenas infecciosas

4.2. Resistncia gentica

A sndrome da imunodeficincia
adquirida (SIDA) em alguns
indivduos pode ser mais
dificilmente adquirida devido
mutao num gene de um
receptor celular (CCR5),
denominada de 32
Menor susceptibilidade ao HIV

HIV-1 interacts with a cell-surface receptor,

primarily CD4, and through conformational changes
becomes more closely associated with the cell
through interactions with other cell-surface
molecules, such as the chemokine receptors
CXCR4 and CCR5.

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Diagnstico da resistncia ao HIV

Gene CKR-5 wildtype responsvel pelo fentipo normal da CCR5 a o gene mutado EU
CKR-5 responsvel pelo fentipo de susceptibilidade reduzida ao HIV.
Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some MultiplyExposed
Individuals to HIV-1 Infection Liu et al. (1996). Cell, 86, 367377,.

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Diagnstico da resistncia ao HIV

A deteco da deleco 32 do gene receptor CCR5 (CKR5) faz-se
mediante PCR convencional:

Electroforese de produtos amplificados por PCR. 1 marcador; 2 indivduo homozigtico para o

CKR5-WT; 3 e 5 homozigticos para a mutao (EU CKR5); 4 e 6 heterozigticos (CKR5WT/EU CKR5).
Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some Multiply-Exposed
Individuals to HIV-1 Infection Liu et al. (1996). Cell, 86, 367377.

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5. Diagnstico molecular de agentes infecciosos

O diagnstico molecular de agentes infecciosos (vrus, bactrias,
leveduras e fungos filamentosos, microparasitas) tem vindo a ganhar
terreno relativamente aos mtodos microbiolgicos convencionais
(culturais, bioqumicos, imunolgicos, celulares, )

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HIV
Diagnstico:
Imunolgico (Western-blotting, ELISA)

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HIV
Diagnstico:
Imunolgico (Western-blotting, ELISA)

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HIV
Diagnstico:
Gentico (RT-PCR)

Alm do diagnstico carga viral

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6. Epidemiologia molecular/filogenia molecular

A identificao de surtos infecciosos tem utilizado importantes
ferramentas da filogenia e da biologia molecular:
Importncia:
Doenas infecciosas de origem hospitalar/comunitrio
Doenas infecciosas de origem alimentar

Tcnicas de genotipagem (molecular fingerprinting)

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Epidemiologia molecular

Afe
c
t
a
do

N
afe o
ct a
do

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Epidemiologia molecular

Afectado

No
afectado

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Epidemiologia molecular

Afectado

No
afectado

A mesma estirpe?

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Epidemiologia molecular
Existem vrios mtodos de fingerprinting molecular

MEE - multilocus enzyme electrophoresis; REA restriction enzyme analysis;

PFGE - pulsed field gel electrophoresis; RAPD random amplified polymorphic DNA;
AFLP amplified fragment length polymorphism; MLST multiple locus sequence
subtyping; MLVA - multiple locus variable number of tandem repeat analysis;
MBMS microarray-based multi-target sequencing

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Epidemiologia molecular

Enterobacterial repetitive intragenic consensus (ERIC) fingerprinting profiles of multidrug-resistant

(MDR) Escherichia coli (A) and Klebsiella pneumoniae (B) isolated from bloodstream-infected
patients from two distinct Portuguese hospitals A and B. Dendrograms were generated by UPGMA
(unweighted pair group method with arithmetic averages) analysis of the agarose gels
contrastained by rainbow algorithm with Pearsons correlation coefficient.
Bloodstream infections caused by multidrug-resistant Enterobacteriaceae: report from two
different Portuguese hospitals. Fernandes et al. (2008). J Hospital Infection, 70(1):93-5.

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7. Resistncia aos xenobiticos

As estirpes bacterianas possuem uma gentica que lhes permite a
rpida aquisio de genes de resistncia a poluentes ambientais,
metais pesados, antibiticos entre outros.

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Gentica molecular da resistncia

Mutaes espontneas em genes endgenos
Genes estruturais: aumento do espectro da actividade enzimtica, modificao do alvo,
defeitos no transporte
Genes reguladores: aumento da expresso

Aquisio de genes exgenos:

Geralemente genes que codificam enzimas inactivadoras ou alvos modificados e genes
reguladores
Mecanismos de transferncia de DNA: conjugao (contacto clula-clula);
transformao (uptake do DNA em soluo); transduo (transferncia de DNA por
bacterifagos)

Expresso dos genes de resistncia

Induo reversvel/os sistemas de represso podem afectar os fentipos de resistncia

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