UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE SADE DA COMUNIDADE

Testagem selectiva e seguimento de individuos com HIV: Uso de parmetros alternativos (Globulinas, Protenas totais e Velocidade de Sedimentao) como marcadores de infeco e progresso da doena

Manuel Antnio Chipeja

Dissertao de candidatura ao grau de Mstre em Sade Pblica

DECLARAO

Eu, Manuel Antnio Chipeja declaro por minha honra ser este um trabalho da minha autoria, realizado como parte dos requisitos do programa de formo de Mestrado em Sade Pblica.

Maputo, Setembro de 2010

_________________________________________ Manuel Antnio Chipeja

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DEDICATRIA Em primeiro lugar dedico a minha Tese s minhas duas filhas e aos meus dois filhos, Silmi, Ivana, Malton-Alex e Mollis-Max Manuel Chipeja e aos meus sobrinhos pela pacincia e compreenso da minha ausncia em grande parte das suas vidas ao me dedicar a esse trabalho que agora dispe em mos. minha grande companheira e esposa, Ana Ldia Buque pelo apoio e incentivo em todas as fases de ausncia no decorrer desse trabalho e no geral em todas as fases boas e ms da minha vida. Ao meu falecido irmo, Joo Chipeja pelo exemplo de vida e camaradagem de todos os bons e maus momentos que nunca esquecerei; aos meus pais, pelo esforo e amor que sempre me prestaram em especial no seu persistente conselho de estudar, estudar sempre. E a todos os amigos(as) e aos que me apoiaram em todos os momentos da vida. E finalmente a todos os meus adversrios e aos meus inimigos, porque me souberam fortalecer para melhores batalhas da vida enfrentar e pela oportunidade do quanto os seus obstculos me fortaleceram e me tornaram o homem que sou.

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INDICE
RESUMO..................................................................................................VII A INFECO POR HIV CONTINUA A SER UM PROBLEMA GLOBAL. O NMERO DE INFECES CRESCE EXPONENCIALMENTE A CADA ANO QUE PASSA E O DIAGNSTICO ATEMPADO A NVEL CLNICO E O SEU USO NO CONTEXTO DE PREVENO E CONTROLE DA DOENA NO MBITO DA SADE PBLICA ASSUMEM UM PAPEL IMPORTANTE PARA ESBOAR MELHORES ESTRATGIAS DE COMBATE A DOENA. DESSE MODO, PROMOO DE TESTAGENS MACIAS DA POPULAO TEM SIDO ENCORAJADAS DE MODO A REDUZIR O NMERO DE NOVAS INFECES ASSIM COMO REDUZIR CASOS NO DIAGNOSTICADOS NA POPULAO. POR OUTRO ENCONTRAR UM MTODO ALTERNATIVO DE MONITORIA MAIS BARATO E MAIS ACESSVEL QUE OS ACTUAIS TESTES DE CD4 E DA CARGA VIRAL ALIVIARIA IMENSO A CARGA FINANCEIRA PARA A PROSSECUSSO DO SUCESSO DE TRATAMENTO QUE PASES COMO MOAMBIQUE PRECISAM SEGUIR. PRETENDEU-SE COM ESSE ESTUDO ENCONTRAR PARMETROS ALTERNATIVOS (USANDO GLOBULINAS, PROTENAS TOTAIS E A VELOCIDADE DE SEDIMENTAO) COMO MARCADORES DE INFECO POR HIV E DA PROGRESSO DA DOENA PARA O DIAGNSTIVO PRESUMPTIVO DO HIV E PARA A MONITORIA DA INFECO VISTO ESSES MARCADORES SEREM DE EXECUO TCNICA RELATIVAMENTE SIMPLES E DISPONVEIS EM MAIOR NMERO DE UNIDADES SANITRIAS EM COMPARAO OS TESTES PARA MONITORIZAO DE CD4 E CARGA VIRAL; POR PODEREM PERMITIR UMA SELECO MAIS APURADA DE INDIVDUOS COM INDICAO DE FAZEREM O TESTE DE HIV, REDUZINDO CONSTRANGIMENTOS PSICO-SOCIAIS DESNECESSRIOS EM INDIVDUOS DE SE SUBMETEREM AO TESTE DE HIV; E FINALMENTE POR SEREM MAIS BARATOS QUE QUALQUER DOS ACTUAIS TESTES DE HIV, DE CONTAGEM DE CLULAS CD4 E DE CARGA VIRAL NO MERCADO.........................................VII GLOSSRIO...............................................................................................X CAPTULO 1..............................................................................................XI INTRODUO...........................................................................................XI DEFINIO
DO

PROBLEMA

JUSTIFICAO....................................................................XI

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CAPTULO 2.............................................................................................XV REVISO DA LITERATURA.........................................................................XV CAPTULO 3...........................................................................................XXII METODOLOGIA DO ESTUDO....................................................................XXII CAPTULO 4..........................................................................................XXVI RESULTADOS .......................................................................................XXVI DISCUSSO DOS RESULTADOS...............................................................XLVI CAPTULO 6............................................................................................LIV CONCLUSES E RECOMENDAES...........................................................LIV 6.1 CONCLUSES............................................................................................LIV 6.2 RECOMENDAES........................................................................................LV CAPTULO 8.............................................................................................LV CAPTULO 7.............................................................................................LV REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................LV

AGRADECIMENTOS Os meus agradecimentos especiais: Ao meu Tutor, Prof. Doutor Moshin Sidat, ao Prof. Doutor Baltazar Chilundo pelo encorajamento e todo o apoio prestado na Realizao dese estudo.

Ao Benjamim Boto e ao Dr. Francisco Mbofana, pelo apoio tcnico e pela ajuda na apresentao dos dados desse estudo. Aos patrocinadores desse estudo, nomeadamente ao Projecto NPT/MOZ

083&127 da DICES (QIF-SIDA), do Ministrio de Educao de Moambique, ao PNUD e a NORAD (Tambm patrocinadora de todo curso de Mestrado) pelo apoio incondicional concedido. E os meus agradecimentos se estendem tambm A Universidade Eduardo Mondlane, Faculdade de Medicina pela oportunidade de frequenter o Curso de mestrado em Sade Pblica Ao Departamento de Sade da Comunidade da Faculdade de Medicina pelo apoio concedido A NORAD, de novo, pelo apoio na formao pela abolsa de estudo atribuida. E a Direcao do Curso de Mestrado e a todos os Professores do mestrado pelo apoio.

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RESUMO A infeco por HIV continua a ser um problema global. O nmero de infeces cresce exponencialmente a cada ano que passa e o diagnstico atempado a nvel clnico e o seu uso no contexto de preveno e controle da doena no mbito da sade pblica assumem um papel importante para esboar melhores estratgias de combate a doena. Desse modo, promoo de testagens macias da populao tem sido encorajadas de modo a reduzir o nmero de novas infeces assim como reduzir casos no diagnosticados na populao. Por outro encontrar um mtodo alternativo de monitoria mais barato e mais acessvel que os actuais testes de CD4 e da carga viral aliviaria imenso a carga financeira para a prossecusso do sucesso de tratamento que pases como Moambique precisam seguir. Pretendeu-se com esse estudo encontrar parmetros alternativos (usando Globulinas, Protenas totais e a Velocidade de Sedimentao) como marcadores de infeco por HIV e da progresso da doena para o diagnstivo presumptivo do HIV e para a monitoria da infeco visto esses marcadores serem de execuo tcnica relativamente simples e disponveis em maior nmero de Unidades Sanitrias em comparao os testes para monitorizao de CD4 e carga viral; por poderem permitir uma seleco mais apurada de indivduos com indicao de fazerem o teste de HIV, reduzindo constrangimentos psico-sociais desnecessrios em indivduos de se submeterem ao teste de HIV; e finalmente por serem mais baratos que qualquer dos actuais testes de HIV, de contagem de clulas CD4 e de carga viral no mercado. Foram estudados 235 indivduos nas provncias de Manica e Sofala , sendo 129 do sexo Masculino (54.9%) e 106 indivduos do sexo Feminino (45.1%) e dos quais 39 indivduos eram seronegativos para o HIV (16.6%) e 196 (83.4 %) seropositivos para o HIV. A idade dos individuos varou dos 18 aos 63 anos Observou-se um nvel elevado de globulinas, um nvel elevado de Protenas Totais elevadas e e um nvel elevado da Velocidade de Sedimentao nos

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indivduos com infeco com HIV e um aumento desses marcadores com o decrscimo dos nveis das clulas CD4.

LISTA DE ABREVIATURAS E ACRNIMOS 2-m AIDS ARVs AZT CV DNAM EFV EUA HCM HDD HIV IC ICAP IO MEM MISAU NVP OMS ONUSIDA OR SIDA SPSS PT TARV US USs WHO 2 microglobulina Acquired Immunodeficiency Syndrome Anti-retrovirais Zidovudina Carga Viral Departamento Nacional de Assistencia Mdica Efavirenz Estados Unidos de Amrica Hospital Central de Maputo Hospital de Dia Human Immunodeficiency Virus Intervalo de confiana International Center for AIDS Care and Treatment Programs Infeces oportunistas Monitoramento Electrnico dos Medicamentos Ministrio da Sade Nevirapina Organizao Mundial da Sade Programa Conjunto das Naes Unidas sobre o HIV/SIDA Odds ratio (Razo das Chances) Sindrome de Imunodeficincia Adquirida Statistical Package for Social Sciences Proteinas Totais Tratamento Anti-retroviral Unidade sanitria Unidades sanitrias World Health Organization

LISTA DE FIGURAS

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LISTA DE TABELAS

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GLOSSRIO

CAPTULO 1 INTRODUO
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Definio do Problema e Justificao

O HIV/SIDA ainda continua a ser um problema global. S em 2006 a doena matou cerca de 3 milhes de pessoas em todo o mundo, milhes mais que em 2004 - e dessas pessoas 63% sendo que actualmente mais de 40 milhes de pessoas vivem com o vrus de HIV 2,6 residem na frica

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Subsahariana, regio da qual Moambique faz parte (UNAIDS, Aids Epidemic Update, Dec 2006) S em 2006 houve mais de 4 milhes de novas infeces em todo o mundo sendo que igualmente cerca de 3 milhes de novas infeces ocorreram na regio da frica subsahariana. E apesar dos considerveis esforos feitos para melhorar o acesso ao tratamento antiretroviral nos ltimos anos o SIDA continua causando muitas mortes em todo o mundo sendo de novo a regio subsahariana de frica contribuido com cerca de 72% de todas as mortes (dos cerca de 3 milhes de mortes em todo o mundo) (UNAIDS, Aids Epidemic Update, Dec 2006). Ainda segundo o mesmo relatrio a epidemia em Moambique, frica do Sul e Swazilndia segue crescendo. Segundo o relatrio sentinela de 2001, Moambique um dos pases mais afectados da regio (INE/MOH/MPF/CNCS/CEP-UEM/Fac. Medicina-UEM/MINED 2001) onde 13% da populao adulta dos 15-49 anos, era HIV-positivos sendo 17,1% no Centro e 14.3% no Sul do pas e 6.9% no norte do pas (Moz. Country Report, Jan-Dec 2002). A taxa mais alta foi encontrada na regio de Mabote, no sul do pas com 36%.(UNAIDS, situao de SIDA; Dez, 2003). E Estimava-se que havia no pas mais de um milho de infectados dos cerca de 18 milhes de habitantes (censo de 1997). E em 2006, segundo dados do Conselho nacional de Combate ao SIDA a prevalncia em mulheres grvidas (15-49 anos) subiu de 11% (em 2004) para 16% nesse ano e destacava o facto de ter sido uma das subida mais marcantes em toda a Africa Subsahariana nos anos recentes em infeco por HIV nas mulheres grvidas - e onde na regio Sul subiu de 18 para 27%. Na regio Centro em todos os postos sentinelas em Quelimane e na Beira uma em cada trs mulheres que foi a consulta pr-natal estava infectada com o vrus de HIV em 2004 (National STD and HIV/ AIDS Control Programme, 2005). No Norte do pas onde inicialmente a epidemia caminhava muito lentamente, a prevalncia em mulheres grvidas duplicou desde o ano 2000 atingindo 9,2% e 11% em

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Nampula e Niassa respectivamente em 2004 (Conselho Nacional de Combate ao HIV/SIDA, 2006). E o facto da prevalncia estar a aumentar em mulheres jovens grvidas sugere que novas infeces continuam a aumentar e isso pode significar uma nova acerelao da epidemia no pas, continua o relatrio. A utilizao de dados de mulheres grvidas das consultas pr-natais para estudos de prevalncia foi e tem sido uma metodologia usada na maioria dos pases para avaliao do estado serolgico duma comunidade em relao ao HIV devido a impossibilidade de avaliar toda a Comunidade (Saphonn et al, 2002; Fylkesnes et al, 1998). Isso baseia-se fundamentalmente no propsito de primeiro - as mulheres que vo s consultas pr-natais no estarem doentes e segundo ser obrigatrio em alguns pases da testagem de todas as mulheres grvidas que vo consulta prnatal (ACOG CLINICAL REVIEW, 1997). Contudo testagens em geral para indivduos na Comunidade que seria o ideal para estudar a real prevalncia da doena numa dada populao e esboar melhores estratgias de combate - ou mesmo em hospitais ou outros centros, tem se debatido fortemente por duas razes essenciais: razes de foro tico relacionados com testagem de HIV (Brown et al, 2007; Bassett et al 2007) e ausncia de estratgias de avaliao de risco adequadas para melhor direccionar a testagem de HIV (Manavi et al, 2006). Uma deteco atempada da infeco por HIV em doentes com

aconselhamento para estes e para seus parceiros - pode reduzir grandemente a disseminao da doena (Valdiserri, 1997). Nesse contexto, promoo de testagens em massa ao nvel populacional tem sido enconrajadas e pressupese que possam reduzir o nmero de novas infeces assim como reduzir casos no diagnosticados de infeco por HIV. Por outro lado, a introduo do HAART (Terapia Antiretroviral altamente activa) pode prevenir o rpido e disseminado desenvolvimento de imunossupresses nos pacientes infectados (Palela, et al,2003).

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O Conhecimento do estado serolgico em relao infeco pelo HIV tem sido e continuar a ser no presente e cada vez mais no futuro prximo um elemento fundamental na preveno da transmisso do HIV e no melhoramento de esforos de tratamento (Valdiserri, 1997). Assim encontrar um mtodo de rpida avaliao de pacientes para testagem de HIV com base em parmetros mdicos e bioqumicos facilmente mensurveis e que no envolvam perturbaes psico-sociais nos doentes (como acontece com testagem de HIV) simplificaria imenso a tarefa de muitos clnicos e seria mais cmodo para muitos pacientes (Manavi et al, 2006), assim como seria uma grande contribuio para a tomada de medidas mais adequadas no mbito de sade pblica para o controlo da epidemia. Por outro lado o monitoramento de pacientes Seropositivos em Tratamento usando marcadores biolgicos do sistema Imunolgico produzido pelo hospedeiro em resposta a replicao viral tais como a neopterina srica e a -2 microcglobulina assim como pelo prprio vrus tem sido usado para determinar o estgio da infeco, identificao de indivduos em alto risco de desenvolver a doena, a progresso da doena assim como avaliar a eficcia do Tratamento anti-retroviral (Lifson et al, 1992; Bass et al, 1992). Por isso estudos no nosso meio para avaliar a eficcia desses marcadores assim como outros conhecidos e estudados noutros meios poderia ser de grande utilidade para o monitoramento do Tratamento anti-retroviral no noso meio, sabendo que so escassos as disponibilidades de realizao dos Testes de CD4 eda Carga viral para o monitoramento desse mesmo Tratamento.

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CAPTULO 2 REVISO DA LITERATURA

______________________________________________________________________________ A infeco pelo HIV desencadeia uma resposta celular imediata com a produo de citokinas (que so um grupo de protenas e pptidos usados no organismo para comunicao entre as clulas) como o factor necrose tumoral (TNF) e a interleucina-6 pelos linfcitos CD4 e pelos macrfagos ganglionares. Essas por sua vez causam uma activao de um nmero crescente de linfcitos com uma maior expresso de molculas CD4 na superfcie. O vrus adere-se aos receptores das clulas CD4 e atravs da glicoprotena capsular gp120 penetra no interior desses linfcitos (Rafael & Ernesto 1997). Ocorre a trascripo reversa produo de partculas virais a partir do ADN celular e milhes de partculas virais so produzidas e com a morte da clula so lanados na circulao sangunea com consequente aumento do nmero de partculas virais no plasma. Segue-se igualmente uma produo macia de anticorpos especficos contra o vrus e comea a destruio pelos linfcitos CD8 dos linfcitos CD4 infectados pelo vrus e que expressam antgenos virais na sua superfcie assim como a destruo dos prprios linfcitos devido infestao pelo vrus (Davis & Bjorkman 1988; Cossarizza, 1997). O HIV um vrus composto por uma capa glicoproteca que expressa importantes protenas como a protena p6, p9, p15 p24, p17, p27 e outras (sendo as mais importantes a p17 e a p24) (Fiebig et al, 2003; Petersen et al,1994) e glicoprotenas como gp41 e gp 120 que derivam de gp160 aps clivagem (Hallenberger et al, 1997; Veronese et al,1985). O vrus e as enzimas necessrias replicao vrica. Os anticorpos produzidas por clulas de defesa para combater o vrus de HIV so protenas, da classe das globulinas - tambm chamadas imuno-globulinas. As protenas no geral se dividem em dois grandes grupos de acordo com as tem um ncleo central que consiste num revestimento de protenas que encerra o ARN

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suas propriedades de Solubilidade em solues salinas: em Albuminas, solveis em gua e Globulinas (uma classe heterognea de protenas que inclui lipoprotenas, imuno-protenas, enzimas e at pode incluir o fibrinognio, uma classe especial de protenas - que nalgumas vezes se considera um terceiro grupo) que so insolveis em gua e solveis em solues salinas fracas e insolveis em solues salinas concentradas (Tietz 1976). As Albuminas ainda compreendem vrias protenas fibrosas. As Albuminas e as Globulinas constituem assim as protenas totais. As globulinas se subdividem em alfa, beta e gamma, sendo as Imnuglobulinas pertecentes a ltima classe. Marcadores da activao imunitria tais como o receptor da interleukina-2 srica, a -2 microglobulina e os nveis da neoptina tem sido associados com o risco da progresso da doena SIDA (Fahey et al, 1990; Simmonds et al, 1991) A molcula de -2 microglobulina se encontra nas clulas imunitrias e a sua concentrao aumenta com a destruio das clulas imunes e linfides. Muitos estudos revelaram altas concentraes de -2 microglobulinas em indivduos seropositivos (Anderson et al 1990). A -2 microglobulina uma subunidade do Complexo Histocompatibilidade maior de Classe I que encontrado na superfcie de todas as clulas nucleadas incluindo linfcitos. As suas concentraes no soro sanguneo mostram que esse pptido produzido durante o turn-over celular ou seja aparece muito elevado na fase de sero-converso e seu aumento geralmente indica uma generalizada activao linfocitria (Bass et al, 1992). O Aumento dos nveis da concentrao independente da -2 microglobulina da tem da sido usado como em um forte predictor progresso doena SIDA doentes

seropositivos homossexuais e como um marcador do aumento da mortalidade entre os doentes seropositivos da raa negra do sexo feminino (Hofmann et al, 1990; Kerlikoswske et al, 1994). E alteraoes temporrias dos nveis de -2 microglobulina antes do incio do TARV pode ser usado para a avaliao da eficcia desse mesmo Tratamento (Bass et al, 1992; Jacobson et al, 1995)

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uso

da

-2

microglobulina

para

monitoramento

do

Tratamento

Antiretroviral tem mltiplas vantagens, desde custos baixos, a feasibilidade de uso de amostras congeladas assim como poder ser feito na maior parte dos laboratrio que realizam exames comuns na rotina clnica para as doenas mais comuns na prctica clnica diria. As concentraes da protena antignica p24 da capa do vrus HIV so muito elevadas nos pacientes infectados assim como quando desenvolvem a doena SIDA (Cunningham et al, 1993). E ainda segundo outros autores h uma forte correlao entre a presena de altos nveis no soro sanguneo de p24 e o aumento da replicao viral (Fahey et al, 1990). Por outro lado as imunoglobulinas (ou Gamma-globulinas) especificamente a IgG e a IgA sistmica total aumentam progressivamente durante a progresso da infeco por HIV (Phillips et al, 1993). E temos ainda um aumento de outra classe de protenas como a protena C-reactiva, encontrada nos processos inflamatrios e as interleukinas 5 e 6, com o factor Necrose tumoral j referenciado acima (Rafael & Ernesto 1997; Matsuda et al, 1993). Assim como se depreende, h um aumento macio de protenas virais e aumento tambm de protenas produzidas pelo hospedeiro humano - incluindo o fibrinognio - em todo o estgio de infeco por HIV. E o aumento da protena p24 continua a ser o mais potente predictor de infeco pelo HIV. (Mellors et al, 1995; Henrard et al, 1995; Bruisten et al,1997 ; Lathey et al,1998). O Fibrinognio uma protena importante para a coagulao do sangue e a responsvel pelo aumento da Velocidade de Sedimentao (que a velocidade com que as clulas sanguneas se precipitam durante uma hora num tubo graduado) observada tambm em indivduos infectados com o vrus de HIV, assim como para outras doenas como as doenas inflamatrias e crnicas. Pascale et al, (1997) avaliou a utilidade de contagem total de linfcitos, clulas CD4 e as concentraes de 2-microglobulina, protena antignica p24 e a

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concentrao de IgA no soro como marcadores de desenvolvimento da doena SIDA em indivduos infectados por HIV no Panam e encontrou Correlaes significativas entre o decrscimo das clulas linfocitrias e a progresso da doena e - mais importante e significativo para o nosso estudo - uma forte correlao entre os nveis de IgA e os nveis de 2-microglobulina com a progresso de doena em indivduos seropositivos. Fazendo o diagnstico diferencial com outras patologias (na sua maioria muito pouco frequentes relativamente infeco por HIV na regio da frica Subsahariana e em Moambique em particular) em que as globulinas, as protenas totais e a Velocidade de Sedimentao se encontram elevadas, como o Mieloma mltiplo, a Sarcoidose, Colicistite Obstrutiva crnica, Cirrose heptica, Lpus Eritematoso Sistmico, Artride reumatide crnica, na maior parte dos Cancros j estabelecidos e com outros sintomas sistmicos (Tietz, 1976) e na Tuberculose (que actualmente aparece associada ao HIV) poderemos com bastante proximidade utilizar o mtodo de quantificao dos nveis de globulinas, das Protenas Totais e da Velocidade de Sedimentao como marcadores de Infeco por HIV e por outro lado como marcadores da progresso da doena em Indivduos infectados pelo vrus de HIV.

2.1. Justificao para levar a cabo o estudo;

Apesar do impacto devastador da infeco pelo HIV em Africa e em Moambique em particular, e da enorme falta de recursos para testar os indivduos que necessitam ser testados e ainda da grande falta igualmente de recursos para aquisico de testes de CD4 e de Carga viral para o monitoramento do Tratamento, assim como para compra de maquinaria e reagentes e treino do pessoal para a realizao desses Testes, poucos estudos foram feitos e tem sido feitos para encontrar marcadores alternativos para o restreio da populao e fundamentalmente para o monitoramento da infeco pelo Hiv e o monitoramento do Tratamento anti-retroviral.

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 nesse mbito que pretendemos estudar ao marcadores biolgicos as Globulinas, as Protenas Totais e a Velocidade de Sedimentao para uma rpida avaliao de indivduos que precisam ser testados para o teste de HIV, ou seja marcadores que possam identificar a presena do vrus de HIV nos pacientes a testar; e por outro lado o utilizar esses mesmos marcadores biolgicos (as Globulinas, as Protenas Totais e a Velocidade de Sedimentao) que so mais baratos na prctica clnica diria pelo tempo que levam a executar, custos de reagentres e custos de pessoal para o seu manuseio (Pascale et al, 1997), mais simples de manejar e mais acessveis na prctica clnica diria que os actuais testes de CD4 e de carga Viral podem ser usados para o monitoramento do curso da infeco pelo HIV dos pacientes seropositivos assim como para o monitoramento do Tratamento Antiretroviral dos doentes Seropositivos em tratamento. Se este estudo demonstrar que os parmetros acima referidos so de facto teis na identificao dos indivduos eventualmente infectados por HIV e/ou mostrar-se til para avaliar/monitorar a progresso da infeco por HIV ento, a sua introduo na rotina clnica ir trazer vrios benefcios: Os testes so de execuo tcnica relativamente simples e disponveis em maior nmero de Unidades Sanitrias em comparao os testes para monitorizao de CD4 e carga viral e, por isso seriam de utilidade em Moambique; Podem permitir uma seleco mais apurada de indivduos com indicao de fazerem o teste de HIV, reduzindo constrangimentos psico-sociais desnecessrios em indivduos de se submeterem ao teste de HIV; So mais baratos que qualquer dos actuais testes de HIV, de contagem de clulas CD4 e de carga viral no mercado (apesar de, ressalte-se aqui, este mtodo no querer substituir o teste

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especfico para deteco de anticorpos ou antgenos de HIV, mas sim para ser um mtodo para avaliar indivduos com maior risco de ter a doena para melhor testar e por outro lado poupar tempo e recursos em pr-aconselhamento e questes ticas que o teste de HIV acarreta e recusas de muitos indivduos em fazer o teste, nem querer substituir os testes de CD4 e de carga viral).

Perguntas da pesquisa:
Que utilidade tm as medies dos nveis sricos/ plasmticos de globulinas, das Protenas totais e da velocidade de sedimentao como parmetros alternativos para diagnstico presumptivo de infeco por HIV? Que utilidade tm as medies dos nveis sricos/plasmticos de globulinas, das Protenas totais e da velocidade de sedimentao como parmetros alternativos para monitorar a progresso da doena em indivduos j infectados pelo HIV e em TARV?

3. Objectivos e hipteses de estudo 3.1. Objectivo geral

Avaliar a utilidade das medies dos nveis sricos/ plasmticos de globulinas, das Protenas totais e da Velocidade de Sedimentao como parmetros alternativos para diagnstico presumptivo de infeco por HIV e da progresso da doena em indivduos j infectados pelo HIV e em TARV. .

3.1.2 Objectivos especficos;

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3.1.2.1. Comparar e correlacionar as diferenas de nveis sericos/plasmaticos de globulina, de protenas totais e da Velocidade de Sedimentao em indivduos infectados e no infectados com o HIV 3.1.2.2. Determinar os valores preditivos dos nveis de globulinas, de protenas totais e da Velocidade de Sedimentao que melhor se correlacionam (associacao significativa) com a infeco por HIV 3.1.2.3. Correlacionar os nveis de globulinas, das protenas totais e da Velocidade de Sedimentao com os nveis de CD4 e da carga viral em indivduos infectados com o HIV e em TARV. 3.1.2.4. Estabelecer uma curva de variao das globulinas e do ndice globulina / Albumina com as variaes da carga viral em indivduos infectados pelo HIV.

3.2. Resultados esperados

Com o presente estudo pretende-se encontrar os seguintes parmetros alternativos, Globulinas, Protenas totais e a Velocidade de Sedimentao como marcadores de infeco por HIV e da progresso da doena para o diagnstivo presumptivo do HIV e para a monitoria da infeco visto esses marcadores serem de execuo tcnica relativamente simples e disponveis em maior nmero de Unidades Sanitrias em comparao os testes para monitorizao de CD4 e carga viral; por poderem permitir uma seleco mais apurada de indivduos com indicao de fazerem o teste em de HIV, reduzindo de se constrangimentos psico-sociais desnecessrios indivduos

submeterem ao teste de HIV; e finalmente por serem mais baratos que

xxi

qualquer dos actuais testes de HIV, de contagem de clulas CD4 e de carga viral no mercado.

CAPTULO 3 METODOLOGIA DO ESTUDO

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3.1. Descrio do local de estudo

O Estudo foirealizado na regio Centro de Moambique onde as provncias de Sofala com 23% (17%-33%), Manica com 16% ; (10%-23%), so das mais afectadas (Mozambique Country Report, 2008). Sero estudados no total 235 individuos (Sofala= 46 e 88 pacientes respect. e Manica 38 e 63 pacientes)

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Plano de recolha de dados

Os individuos para a primeira amostra foram obtidos a partir do GATVs (actualmente ITSs) e da segunda amostra dos pacientes em TARV nos Hospitais das Provincias de Manica e Sofala. Foi feita colheita de sangue em 3 tubos, Um com Citrato e dois tubos secos (2.5 ml cada) para anlise de carga viral e CD4 e para anlise de globulinas, protenas totais e Velocidade de Sedimentao

Recolha e anlise de dados

Foram calculadas duas amostras para este estudo. A primeira amostra para verificar a a presena desses parmetros (globulinas, protenas totais e Velocidade de Sedinmentao) em indivduos infectadpos com o vrus de HIV ser obtida a partir da populao em idade sexual ser calculada usando a frmula de clculo de amostra para populaes grandes, com o p=16% (com base nos dados do CNCS/MISAU, 2007) e esperando que os que vo recusar o teste sero cerca 25%, justificando desse modo o uso do fator de correco de 0.75. A segunda amostra ser na base da populao seropositiva em tratamento em Moambique (p=28%; MISAU, 2007). Usar-se- a mesma frmula sem a taxa de correco esperando que todos os seropositivos colaborem na realizao dos testes de verificao da progresso da doena pois far parte do controlo da sua doena. Vai ser um teste no momento da incio do estudo e seis meses depois volta-se a fazer os mesmos testes aos mesmos indivduos e vais se comparar a variao do CD4, carga Viral e as Variaes da globulinas, Protenas totais e Velocidade de Sedimentao. Espera-se uma perda de cerca de 20% por abandono do tratamento, morte e outros factores.

Critrios de incluso dos participantes

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Indivduos que aceitaram entrar para o estudo Pacientes HIV+ confirmado laboratriamente para a segunda amostra Estar a a fazer teraputica Aantiretroviral (TARV) h mais de 3 meses num centro de tratamento antiretroviral em Moambique ou num hospital dia (para a seg. Amostra) Ter um exame de clulas CD4 e carga viral antes do incio do tratamento para a seg. Amostra) Consentimento do paciente Ter 18 anos ou mais de idade

Critrios de excluso
Recusa de preencher o formulrio ou de participar no estudo. No ter um exame de CD4 e carga viral altura do nicio da teraputica ARV para a segunda amostra Estar a fazer a teraputica antiretroviral h menos de trs meses para a segunda amostra Ter menos de 18 anos de idade Os que tiverem interrompido a medicao no ltimo ms seja por conselho mdico ou por sua iniciativa ou ainda por diversos factores para a segunda amostra Os pacientes que estejam a depender inteiramente doutras pessoas para a administrao da medicao Os que estiverem internados seja por outras doenas associadas ou com outras doenas como a Tuberculose, doena Renal e Linfodenopatia generalizada.

Plano de processamento e anlise de dados

Os dados foram armazenados e processados usando o SPSS 15.0. Varaveis como os nveis de globulinas, protenas totais e Velocidade de Sedimentao sero correlacionados com a infeco pelo HIV xxiv

Diferena das mdias: teste T student OR para variaveis como HIV/ Globulinas, VS e PT e CD4/ Globulinas, VS e PT Diferena das propores: teste Qui quadrado; Regresso logstica: medir os nveis e a gravidade da doena; Para todos testes estatsticos com distribuio bicaudal o P<0,05(IC=95%).

Consideraes ticas e legais

O estudo foi aprovado pelo Comit Nacional de Biotica para a Sade (CNBS) e pela Direco do Ministrio da Sade (anexos 1 e 2) Todos os integrantes do estudo foram informados que eram livres de recusar entrar para o estudo e fazer o teste apesar dos benefcios que tambm foram explicados de conhecerem o seu estado serolgico no caso dos doentes recutados nas ITSs. Os procedimentos da colheita de sangue foram explicados detalhadamente aos doente assim como a sua importncia para os doentes e para o estudo Para todos os doentes foi obtido um consentimento informado por escrito que foi lido e assinado igualmente por cada doente. Houve garantia de confidencialidade .

Avaliao de um Teste positivo para HIV e resultado baixo de CD4

xxv

Todas os pacientes foram dados a conhecer os seus resultados logo aps a testagem de HIV antecedida de um pr-aconselhamento no dia da colheita de sangue. Aos pacientes que foram fazer a contagem das clulas de foi lhes dado a conhecer o resultado na visita seguinte que efectuaram com o seu mdico pois uma cpia ficou no seu processo individual.

Limitaes do estudo
Uma das limitaes do estudo foi a impossibilidade de realizar os testes de Carga Viral, porque pura e simplesmente no estavam disponveis e a outra limitao importante foi a dificuldade de estabelecer com preciso o diagnstico das outras doenas que que podem apresentar padres elevados dos nossos marcadores em estudo como o Mieloma mltiplo, a Sarcoidose, a Colicistite Obstrutiva crnica, Cirrose heptica, Lpus Eritematoso Sistmico, Artride reumatide crnica, na maior parte dos Cancros j estabelecidos e com outros sintomas sistmicos (Tietz, 1976). Outra limitao importante o no fraccionamento da classe das globulinas em beta e gamma

CAPTULO 4 RESULTADOS
______________________________________________________________________________ 4.1. Caractersticas scio-demogrficas da populao do estudo xxvi

Foram estudados no total 235 individuos das Provncias de Sofala e Manica, Centro de Moambique. As caractersticas scio-demogrficas da populao de estudo esto sumarizadas na Tabela n 1 (abaixo).

Tabela n 1: Caractersticas scio-demogrficas dos pacientes includos no estudo.

xxvii

Caractersticas Scio-Demogrficas
Gnero: Masculino Feminino 20 21-30 31-40 41-50 51-60 61 Provincia de Sofala Provincia de Manica Provincial de Sofala (total) Masculino Feminino Provincial de Manica (total) Masculino Feminino Provincial de Sofala (total) Seropositivos Seronegativos Provincial de Manica (total) Seropositivos Seronegativos

Freq.
124 111 6 59 136 27 6 1 134 101 134/235 70 64 101/235 54 47 134/235 88 46 101/235 63 38

%
52.8 47.2 2.6 25.1 57.9 11.5 2.6 .4 57.0 43.0 57.0 52.2% 47.8% 43.0% 53.5% 46.5% 57.0 65.7% 34.3% 43.0% 53.5% 37.6%

Grupos etrios (em anos):

Local de Residncia:

Distribuiao por sexo / Local de residncia:

Infeco por HIV / Local de residncia:

M-46 F-42 M-24 F-22 M-34 F-29 M-20 F-18

Desse Universo a Provncia de Sofala apresentava 57% dos pacientes ou seja 134 pacientes sendo desses, 34.3% (46) pacientes HIV negativos e 65.7% (88) sero-negativos. A Provncia de Manica apresenta 43% dos pacientes ou seja 101 pacientes, sendo que desses 37.6% (38) so sero-negativos e 62.4% (63) sero-positivos. A idade da populao em estudo variou de 18 a 65 anos. A mdia das idades foi de 34.26 anos, a mediana de 34 anos e o desvio padro de 6.9 anos. Dessa populao 52.8% (124) foram do sexo masculino 47,2%e do sexo feminino. Desses indivduos, 57.9% (136 indivduos) tinham entre 31 a 40 anos com a faixa de 21 a 30 anos aquela que vem asseguir com 25.1% da populao em estudo. Do total dos indivduos 84 ou seja 35,7% eram Sero-negativos para a Infeco por HIV, enquanto que 151(64,3%) eram Sero-positivos para a Infeco pelo HIV, sendo que desses, 80 eram do sexo masculino e 71 do sexo feminino. Dos

xxviii

indivduos sero-negativos para a Infeco pelo HIV 44 eram do sexo masculino e 40 do sexo Feminino.

(Grfico a alterar) Figura n ..

Desse indivduos dos Seronegativos Sofala apresentava 46 indivduos e Manica 38, enquanto que os Seropositivos, Sofala tinha 88 e Manica 63 segundo Figura ...... Figura..

xxix

Os valores de CD4 observados dessa populao foram dividos de acordo com a classificao da OMS em 3 grupos, ou seja de 0-200 cel/mm, de 200-350 e de 350 em diante. Porm para outro estudo mais aprofundado e comparativo, e igualmente tambm para efeitos de clculo de OR e RR com a infeco por HIV e com o valor das globulinas, foi feita uma outra diviso em dois grupos de 0250 e 250 cel/mm em diante. Seguindo a Classificao da OMS, apenas 32 indivduos estudados ou seja 13,6%, sendo 16 masculinos e 16 femininos, apresentavam valores de CD4 abaixo e at 200 clulas por milmetro cbico; 26 indivduos ou seja 11,06% do total dos indivduos sendo 12 do sexo masculino e 14 do sexo feminino apresentavam valores de CD4 entre 200-350 cel/mm. E finalmente 177 indivduos ou seja 75,3% - mais de um tero dos indivduos sendo 96 indivduos de sexo masculino e 81 indivduos do sexo feminino, apresentavam valores de CD4 acima de 350 clulas por mm cbico.

Figura n ..

xxx

Figura n .. E as Provncias apresentam a distribuio segundo a figura

C 4C d atego rizado
0 a 200 201 a 350 + 351 P show counts ies

Figura n .. Porm quando subdividos os valores de CD4 da populao em estudo em at 250 cel/mm e de 250 cel/mm em diante encontramos 20% da populao ou

xxxi

seja 47 indivduos sendo 23 do sexo masculino e 24 do sexo feminino com valores at 250 cel/mm e 80% dos indivduos ou seja, 188 participantes sendo 101 do sexo masculino e 87 do sexo feminino apresentavam valores acima de 250 clulas de CD4 por milmetro cbico. Figura n .. Desses a Provncia de Sofala tinha a seu cargo, 15 indivduos do sexo masculino com CD4=<250, e 55 do sexo masculino com CD4>250 cel/mm e a Provncia de Manica tambm do sexo masculino com 8 indivduos com CD4=<250 e 46 indivduos com valores de CD4>250. No sexo feminino a provincia de Sofala apresentava igualmente 15 indivduos com CD4=<250 e 49 com CD4>250 enquanto a Provncia de Manica apresentava por sua vez 9 indivduos com valores de CD4=<250 e 38 indivduos com valores de CD4 maior de 250 cel/mm. Figura n ..

Quanto ao valor das Protenas Totais, 19,1% ou seja 45 indivduos sendo 26 do sexo masculino e 19 do sexo feminino, apresentavam valores de Protenas Totais at 80 g/dl, enquanto que os restantes 80,9% ou seja 190 indivduos sendo 98 do sexo masculino e 92 do sexo feminino apresentavam valores acima de 80 g/dl de PT.

Figura n ..

xxxii

Tabela n 2. Distribuio dos pacientes das 2 provncias estudadas por sexo em relao ao valor da Globulinas, das Proteinas Totais e da Velocidade de Sedimentao

Local de Residencia
Provincia de Sofala

Sexo dos pacientes Masculino Feminino Total

Globulinas Ate 35 23 28 51 21 19 40 Mais 35 47 36 83 33 28 61 Total 70 64 134 54 47 101

Provincia de Manica

Masculino Feminino Total

Proteinas Totais Mais de Ate 80 80 Provincia de Sofala Masculino Feminino Total Provincia de Manica Masculino Feminino Total 10 12 22 16 7 23 60 52 112 38 40 78

Total 70 64 134 54 47 101

Veloc de Sedimentao Mais de Ate 30 30 Provincia de Sofala Masculino Feminino Total Provincia de Manica Masculino Feminino Total Total Geral 39 34 73 36 29 65 31 30 61 18 18 36

Total 70 64 134 54 47 101 235

xxxiii

Segundo mostra a Tabela n 2, do total desses pacientes a Provncia de Sofala apresentava 10 indivduos do sexo masculino e 12 do sexo feminino com valores de PT at 80 g/dl e 60 indivduos do sexo masculino e 52 do sexo feminino com valores de PT acima de 80, enquanto que a provincial de Manica apresentava 16 indivduos do sexo masculino e 7 do sexo feminino com valores de PT at 80 g/dl e 38 indivduos do sexo masculino e 40 do sexo feminino com valores de PT acima de 80 g/dl, Segundo a Tabela 2 Ainda na Tabela 2 apresentam-se os valores de distribuio da velocidade de Sedimentao dos indivduos estudados, onde 58,7% ou seja 138 indivduos sendo 75 do sexo masculino e 63 do sexo feminino apresentavam valores at 30 ml/hora enquanto que 41,3% ou seja 97 individuos sendo 49 dos exo masculino e 48 do sexo feminine, apresentavam valores de Velocidade de Sedimentao acima de 30 ml/hora. Quanto s Globulinas 91 indivduos ou seja 38,7% (sendo 44 do sexo masculino e 47 do sexo feminino) apresentavam valores at 35 g/dl enquanto 144 indivduos ou seja 61,35, sendo 80 do sexo masculino e 64 do sexo feminino apresentavam valores de Globulinas acima de 35 g/dl. E no concernente s Provincias, a Provncia de Sofala apresentava 51 (38%) indivduos com valores de globulinas at 35 g/dl e 83 (62%) com valores acima de 35 g/dl, enquanto a Provncia de manica apresentava 40 (39,6%) indivduos com globulinas at ao valor de 35 g/dl e 61 (60,4%) indivduos com valores de globulinas acima de 35 g/dl (tabela n 2) Figura n .. A Tabela n 3 abaixo, sumariza os resultados encontrados na busca de associaes entre o resultado da Seropositividade pelo HIV e os resultados de dados scio-demogrficos apresentados acima. Assim, aps a realizao dos testes estatsticos, verifica-se uma associao fortemente significativa para a relao entre a Seropositividade para o HIV e os

xxxiv

valores de Globulina, Proteinas Totais e os Valores da Velocidade de Sedimentao (p =< 0.01). De destacar ainda a associao significativa com os valores de CD4 para este estudo e para idade, subdivida em 2 grupos aleatrios apenas para efeitos de estudo.

Tabela n 3: Parmetros scio-demogrficos avaliados no estudo (Total da populao estudada)

HIV HIV positivo 80 (64,5) 71 (64,0) 120 (59,7) 31 (91,2) 41 (45,1) 110 (76,4) 36 (80,0) 115 (60,5) 54 (39,1) 97 (100) 32(100) 119 (58,6) 47 (100) 104 (55,3)
3

Parmetros scio-demogrficos avaliados Masculino Feminino <=40 >41 <=35 >35 <=80 >81 <=30 >31 CD4 > 200 clulas/mm3 CD4 200 clulas/mm CD4 > 250 clulas/mm3 CD4 250 clulas/mm3

HIV negativo 44 (53,5) 40 (36,0) 81 (40,35) 3 (8,8) 50(54,9) 84 (23,6) 9 (20,0) 75 (39,5) 84 (60,9) 00 (0,00) 00 (0,0) 84 (41,4) 00 (00,0) 84 (44,7)

OR (95% IC)

Valor de p

Sexo Idadea Globulinas Proteinas Totais Veloc de Sediment CD4 CD4

pressuposto;

1,02 (0,58-1,81) 0,14 (0,03-0,81) 0,25 (0,14-0,46) 2,61 (1,13-6,20) 0,00 (0,00-0,03) Indefinido Indefinido

0,93 0,00 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00

Notas: a. A subdiviso em estes dois grupos etrios foi por convenincia e no se baseia em qualquer outro

4.2. Resultados da provncia de Sofala A provincia de Sofala contibuiu para o presente estudo com 57% da populao em estudo ou seja 134 individuos, dos quais 52,2% do sexo masculino ou seja 70 indivduos e 64(47,8%) do sexo feminino. Do total dos individuos dessa Proivncia, 46 (34,3%) dos indivduos eram HIV negativos e 88 (65,7%) eram HIV positivos (46 do sexo masculino e 42 do sexo

xxxv

feminino), sendo que dos Sero-negativos para o HIV 24 eram dos sexo masculino e 22 indivduos do Sexo Feminino. Dos indivduos dessa Provncia, 16,4% (22 indivduos, 11 do sexo masculino e 11 do sexp feminino)) apresentavam valores de CD4, igual ou abaixo de 200 cel/mm, 10,5% (140 apresentavam valores de CD4 de 200-350 cel/mm e 73,1%, perfazendo 98 indivduos, sendo que 51 do sexo masculino e 47 do sexo feminino, apresentavam valores de CD4 superior a 350 cel/mm. Se o estudo dos valores de CD4 fosse subdivido em duuas categorias, uma at 250 cel/mm e outra superior a 250 cel/mm, o padro de distribuio era semelhatne com os valores acima de 350 cel/mm, pois mais de 2/3 concretamente 77,6% (108 indivduos) situavam-se nos valores acima de 250cel/mm de CD4. Figura n ..

As Protenas Totais um outro parmentro que foi estudado em particular para os indivduos da provncia de Sofala, tendo se encontrado que 16,4% (22 indivduos, sendo 10 do sexo masculino e 12 do sexo feminino) apresentavam valores igual ou inferior a 80 g/dl e 83,6% correspondente a 112 indivduos (60 do sexo masculino e 52 do sexo feminino) tinham nveis de Proteinas Totais acima de 80 g/dl. Figura n ..

O Parmetro Velocidade de Sedimentao foi dividido em igual ou inferior a 30 e superior a 30 ml/h. 54,5 e 45,5% apresentaram valores igual ou inferior a 30 e superiores a 30 ml/h respectivamente, correspondente a 73 e 61 indivduos.

xxxvi

No parmetro Globulinas, 38% dos indivduos (51, sendo 23 do sexo masculino e 25 do sexo feminino) apresentaram valores de Globulinas at 35 g/dl e 62%, ou seja 83 indivduos, sendo 47 do sexo masculino e 36 do sexo feminino, apresentaram valores acima de 35 g/dl.

Tabela n 4: Parmetros scio-demogrficos avaliados no estudo (por Provncias)

HIV HIV positivo 46 (65,7) 42 (65,6) 34 (63,0) 29 (61.7) 30(100,0) 58(55,8) 17(100) 46(54,8) 20(39,2) 68(81,9) 21(52,5) 42(68,9) 17(77,3) 71(63,4) 19(82,6) 44(56,4) 27(37,0) 61(100,0) 27(41,5) 36(100) HIV negativo 24 (34,3) 22 (34,4) 20 (37,0) 18 (38,3) 00 (00,0) 46(44,2) 00 (00,0) 38(45,2) 31(60,8) 15(18,1) 19(47,5) 19(31,1) 5(22,7) 41(36,6) 4(17,4) 34(43,6) 46(63,0) 0(00) 38(58,5) 00(00) 1,06 (0,44-2,56) 0,89 OR (95% IC)

Parmetros scio-demogrficos avaliados Sofala/Sexo Masculino Feminino Masculino Manica/Sexo Feminino CD4 > 250 clulas/mm3 CD4 250 clulas/mm3 CD4 > 250 clulas/mm3 CD4 250 clulas/mm3 Globulinas /Sofala Globulinas / Manic Prot Totais /Sofala Prot Totais / Manic Veloc Sed / Sofala Veloc Sed / Manic <=35 >35 <=35 >35 <=80 >81 <=80 >81 <=30 >31 <=30 >31

Valor de p 0,99

1,00 (0,46-2,18)

CD4/Sofala CD4 /Manica

Indefinido Indefinido 0,14 (0,06-0,34) 0,50 (0,20-1,23) 1,96 (0,62-6,61) 3,67 (1,04-14,15) 0,00 (0,00-0,05) 0,00 (0,00-0,11)

0,00 0,00 0,00 0,09 0,21 0,22 0,00 0,00

xxxvii

Na Tabela n 4 se apresentam resultados obtidos por Provncia dos principais parmetros estudados, semelhante a tabela 3 que era com a populao Total esta segmenta as subpopulaes por Provncias - para observar se existia ou no associao estatsticamente significativa entre estes e a Seropositividade para o HIV. Assim, aps a realizao dos testes estatsticos, verifica-se uma associao fortemente significativa para a relao entre a Infeco pelo HIV e os valores de Globulinas para a provncia de Sofala e os valores de Velocidade de Sedimentao para as duas Provncias (p =< 0.01).

4.3. Resultados da provncia de Manica Quanto a provincia de manica foram estudados 101 indivduos correspondente a 43% do total dos pacientes estudados nas 2 provncias, sendo o 53,5% do sexo masculino ou seja 54 indivduos e 47(46,5%) do sexo feminino. Desses individuos 38 (37,6%) dos indivduos eram HIV negativos, sendo 20 do sexo masculino e 18 do sexo feminino e 63 (62,4%) eram HIV positivos (46 do sexo masculino e 42 do sexo feminino). Com valores de CD4 at 200 cel/mm foram encontrados 9,9% dos indivduos, ou seja 10 indivduos, sendo 5 masculino e 5 femininos, com valores de CD4 201-350 cel/mm, 12 indivduos ( com 4 masculinos e 8 femininos) e mais de 2/3 dos indivduos com valores de CD4 acima de 350, ou seja 79 indivduos (45 do sexo masculino e 34 do sexo feminino), correspondendo exactamente a 78,2% da populao dessa Provncia. Na categoria at 250 cel/mm foram encontrados 16,8% dos indivduos e tal como nos resultados dessa categoria da provncia de Sofala mais de 2?3 dos indivduos apresentou valores acima de 250 cel/mm, ou seja 83,2%, correspondente a 84 indivduos (46 masculinos e 38 femininos)

xxxviii

Nas Protenas Totais 22,8% (22 indivduos tinham valores iguais ou inferiores a 80g/dl e 77,2% correspondente a 78 indivduos (35 masculinos e 40 femininos) apresentavam valores acuima de 80 g/dl. Figura n ..

Na Velocidade de Sedimentao 64,4% da populao dessa Provncia (65 indivduos) apresentava valores abaixo ou igual a 30 mm/h e 35,6% (36 indivduos, 18 masculinos e igual nmero de femininos) tinham valores acima de 30 ml/h. Nas Globulinas, 39,6% dos indivduos (40, sendo 21 do sexo masculino e 19 do sexo feminino) apresentaram valores de Globulinas at 35 g/dl e 60,4%, ou seja 61indivduos, sendo 33 do sexo masculino e 19 do sexo feminino, apresentaram valores acima de 35 g/dl. Tabela n 5: Parmetros achados dos indivduos testados por sexo
Pacientes HIV negativos (n= 84) Homens Mulheres Mdia de Idades Provincia de Sofala Provincia de Manica Globulinas=< 35 (%)a Globulinas>35 (%) CD4=< 200 (%) CD4>200 (%) Prot Totais=<80 (%) Prot Totais>80 (%) VS =<30 (%)a VS =<30 (%)
a

HIV positivos (n= 151) Homens Mulheres

24 (28,6%) 20 (23,8%) 19 (22,6%) 25(29,8%) 0 44 (52,4%) 4 (4,7%) 40 (47,6%) 44 (52,4%) 0

22 (26,2%) 18 (21,4%) 31 (36,9%) 9 (10,7%) 0 40 (47,6%) 5 (6,0%) 35 (41,7%) 40 (47,6%) 0

46 34 25 55 16 64 22 14 31 49

(30,5%) (22,5%) (16,6%) (36,4%) (10,6%) (42,4%) (14,6%) (9,3%) (20,5%) (32,5%)

42 29 16 55 16 55 58 57 23 48

(27,8%) (19,2%) 10,6%) (36,4%) (10,6%) (36,4%) (38,4%) (37,8%) (15,2%) (31,8%)

. Estatisticamente significativa para O teste de Qui-quadrado (Correlao de Pearson) e para a Correlao de

Spearman e para todos os outros tipos de Associaes

O Cruzamento desses dados acima apresentados mostra uma relao de variao semelhante com a Variao da infeco nos Indivduos e a Variao dos parmetros estudos, como os valores das Globulinas e da Velocidade de

xxxix

Sedimentao que apresentam uma Correlao fortemente significativa (p=0,00) com a variao do estado serolgico do indivduo (Tabelas n 3, 4 e 5) e ainda na Tabela 5 uma relao estatsticamente significativa entre a variao do estado serolgico com as Protenas Totais.

Tabela n 6: Parmetros scio-demogrficos avaliados no estudo com cruzamento entre CD4 e os parmetros em estudo
Valor de CD4 CD4= <200 16 (13,0) 16(14,4) 25 (12,4) 7 (20,6) 0 (0,00) 32 (22,2) 0 (0,00) 32 (16,8) 0 (0,00) 32 (33,0) CD4 >200 108 (87,0) 95 (86,6) 176 (87,6) 27 (79,4) 91(100) 112 (77,8) 45(100) 158 (83,2) 138 (100) 65 (67,0) OR (95% IC)

Parmetros scio-demogrficos avaliados Masculino Feminino <=40 >41 <=35 >35 <=80 >81 <=30 >31

Valor de p

Sexo Idadea Globulinas Proteinas Totais Veloc de Sediment

pressuposto;

0,88 (0,39-1,97) 0,55 (0,20-1,55) 0,00 (0,00-0,19) 0,00 (0,00-0,56) 0,00 (0,00-0,07)

0,73 0,20 0,00 0,03 0,00

Notas: a. A subdiviso em estes dois grupos etrios foi por convenincia e no se baseia em qualquer outro

Desse modo igualmente os testes de ANOVA mostram uma significncia estatstica muito forte entre o Teste de HIV e as Globulinas, Segundo mostra a figura.

xl

ANOVAb Model 1 Regression Residual Total Sum of Squares 2.413 30.115 32.528 df 1 233 234 Mean Square 2.413 .129 F 18.667 Sig. .000a

a. Predictors: (Constant), Globulinas b. Dependent Variable: Teste de HIV Coefficientsa Standardized Unstandardized Coefficients Model 1 (Constant) Globulinas B 1.720 .001 Std. Error .035 .000 .272 Coefficients Beta t 48.664 4.321 Sig. .000 .000

a. Dependent Variable: Teste de HIV

O mesmo quando se cruzam as Proteinas Totais e a Velocidade de Sedimentao com a Variao do estado Serolgicco de HIV. Tabela.
ANOVAb Model 1 Regression Residual Total Sum of Squares 2.080 30.447 32.528 df 1 233 234 Mean Square 2.080 .131 F 15.920 Sig. .000a

a. Predictors: (Constant), Proteinas Totais b. Dependent Variable: Teste de HIV

Coefficientsa Standardized Unstandardized Coefficients Model 1 (Constant) Proteinas Totais a. Dependent Variable: Teste de HIV B 1.663 .001 Std. Error .049 .000 .253 Coefficients Beta t 33.928 3.990 Sig. .000 .000

xli

E igualmente quando cruzamemos a Seropositividade do Teste de HIV com a Velocidade de Sedimentao, os testes de significancia mostram p p=0,00, uma forte correlao estatstica
ANOVAb Model 1 Regression Residual Total Sum of Squares 5.240 27.288 32.528 df 1 233 234 Mean Square 5.240 .117 F 44.743 Sig. .000a

a. Predictors: (Constant), Veloc de Sediment b. Dependent Variable: Teste de HIV Coefficientsa Standardized Unstandardized Coefficients Model 1 (Constant) Veloc de Sediment B 1.666 .003 Std. Error .034 .000 .401 Coefficients Beta t 49.491 6.689 Sig. .000 .000

Quando cruzados esses parmetros entre si, por exempo para verificar se as Globulinas acompanham a Variao de CD4 e se ao nvel estatstico existe alguma significncia, verificamos uma relo estatstica fortemente significativa tambm entre o valor de CD4 e as globulinas tendo a ressaltar a Curva da de Correlao Linear das globulinas, apresentada na figura Tabela

xlii

abaixo.

Por outro lado o cruzamento entre as Globulinas, as Proteinas Totais e a Velocidade de sedimetao com os valores de CD4 mostram uma associaao estatstica fortemente significativa (p=<0,01), Segundo as Figuras, , e

xliii

Correlations Cd4 Categorizado Cd4 Categorizado Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Globulinas Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). 235 -.638** .000 235 235 1 Globulinas -.638** .000 235 1

Nas Trs figuras abaixo se mostram a distribuio dos valores das Globulinas, das Protenas Totais e da Velocidade de Sedimentao dos Indivduos estudados em relao aos valores de CD4, ou seja agrupando os valores de CD4 em trs grupos segundo a classificao da OMS e enunciados acima (de 0200,; de 201-350 e de 351 para diante). Estas distibuies mostram um cruzamento dessa variveis e mostram estas figuras onde se agrupam ou se se situam ou se concentram os valores dos pacientes da Globulinas, das proteinas Totais e da VS, de acordo com os diferentes valores de CD4 que esses individuos possuem. E tornna-se ainda facil perceber que quanto maior for o valor das Globulinas menor o valor de CD4, idem para as Protenas Totais e para a Velocidade de Sedimentao.

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xlv

CAPTULO 5 DISCUSSO DOS RESULTADOS

______________________________________________________________________________ O presente estudo tinha como objectivo identificar se as Globulinas, as Protenas Totais e a Velocidade de Sedimentao podem ser usados para uma rpida avaliao de indivduos que precisam ser testados para o teste de HIV, ou seja marcadores que possam identificar a presena do vrus de HIV nos pacientes a testar; e tinha por outro lado o objectivo de identificar se esses mesmos marcadores biolgicos (as Globulinas, as Protenas Totais e a Velocidade de Sedimentao) que so mais baratos na prctica clnica diria pelo tempo que levam a executar, custos de reagentres e custos de pessoal para o seu manuseio (Pascale et al, 1997), mais simples de manejar e mais acessveis na prctica clnica diria que os actuais testes de CD4 e de carga Viral podem ser usados para a monitoria dos pacientes seropositivos para o

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HIV assim como para os doentes em Tratamento Antiretroviral Altamente Actica (HAART) ou TARV (Terapia Antiretro-viral). Este estudo tendo sido realizado apenas em duas Provncias Moambicanas no pode ser extrapolado para toda a populao Moambicana, porm constitui uma importante base de partida da avaliao da utilidade desses marcadores no restreio de indivduos que precisem ser testados para a presena do vrus de HIV e na variao dos valores de CD4 e da Carga viral dos indivduos infectados pelo HIV no pas. E esses marcadores apontaram importantes modificaes com a variao do estado Serolgico dos Indivduos em relao ao vrus de HIV e tiveram igualmente variaes quando variavam os valores de CD4 e da carga Viral dos indivduos infectados pelo vrus de HIV. Estes marcadores so um auxlio na rpida avaliao dos indivduos que possam ter o vrus de HIV (Manavi et al, 2006) e como referido, so uma alternativa ao uso dos testes CD4 e da Carga Viral para o monitoramento da Infeco pelo HIV em doentes j infectados pelo vrus de HIV e para o monitoramento para o Tratamento antitretroviral (de Wolf et al, 1997 e Rodriguez et al, 2006). Muitos autores vem estudando alternativas aos testes de CD4 e da Carga viral para o monitoramneto da Infeco e do Tratamento antiretroviral (Mellanen et al, 2001; Qvarnsttrm et al, 2007; Gupta S, 2004; Polo et al, 1999; Peretz et al, 2004, Renny et al, 2002 e Bardeguez et al, 1999) assim como para encontrar alternativas de melhor seleco para quem vai ou deve ser testado para o HIV, utilizando um teste ou conjunto de testes ou sintomas como marcadores de Infeco pelo HIV (Manavi et al, 2006). Plantier et al, 2003, fez um estudo da quantificao do RNA plasmtico viral de diferentes estirpes virais como um marcador de prognstico da progresso da doena e para a monitorizao da eficcia da Terapia anti-retroviral. Apesar de usar tecnologias caras, inacessveis aos nossos meios de pases subdesenvolvidos como Moambique, como o PCR usando a transcriptase

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reversa (RT-PCR), a anlise com deteco colorimtrica (Roche), Hibridizao de DNA com amplificao do sinal (Bayer) e outros mtodos, ele eos colegas desenvolveram um mtodo que classificaram de mais simples que os existentes nesse momento e mais rpido. E este um exemplo da constante busca pelos investigadores de mtodos mais simples, baratos e mais acessveis sem descurar a eficcia dos mesmo. Mellanen et al, 2001 desenvolveu um estudo de seguimento que tinha como objectivo detectar as Concentraes de IgaA salivar, IgG, IgM, Albumina e Proteinas Totais salivares e determinar a sua variao nas diferentes fases de Infeco pelo HIV e os resultados mostraram que as concentraes desses marcadores se apresentavam muito elevados na Infecco pelo HIV sendo um aumento estatsticamente significativo com excepo do aumento da IgM. Diz o estudo que as concentraes das proteinas Totais salivares, da IgG e da IgM mostraram um tendncia de crescimento com a severidade da Infeco pelo HIV e que estes constituintes foram por outro lado correlacionados com com o decrscimeo da contagem das clulas CD4. O estudo foi feito durante dois anos e aps este perodo estes parmetros se encontravam ainda extremamente altos nos pacientes HIV-positivos. Polo et al, num estudo publicado em 1999, investigou a Correlao do aumento das concentraes plasmticas de um conjunto de protenas (CC-chemokines RANTES, macrophage Inflamatory Protein MIP-1 e MIP-1 ) produzidas pelas clulas CD8+ como potentes factores naturais anti-HIV na supresso da replicao viral ao vivo (Cocchi et al, 1995) e a progresso da doena SIDA. E verificaram que o aumento das proteinas RANTES um um marcador preditivo da rpida progresso da doena SIDA independentemente da taxa do declneo das clulas CD4 do sangue perifrico. Por outro lado Holme et al, 1998, identificou um aumento in vivo de de activao de plaquetas em pacientes assimtomticos infectados por HIV que representa um papel importante na elevao da Velocidade de Sedimentao, que se encontra elevada em pacientes seropositivos para o HIV assim como

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pela produo do Fibrinognio uma protena plasmtica importante para a coagulao do sangue e que tambm a responsvel pelo aumento dessa mesma Velocidade de Sedimentao observada no s em indivduos infectados com o vrus de HIV, assim como para outras doenas como as doenas inflamatrias e crnicas. Num outro estudo, publicado em 2004, Gupta descreve diversos marcadores associados com a progresso de HIV com maior destaque para as protenas antigeno p24, o anticorpo p24, o RNA viral, a contagem das clulas CD4 e CD8 e com maior destaque a Beta 2-microglobulina (2-m). A 2-microglobulina uma proteina de 11kDa que aparece na superfcie de muitas clulas nucleadas (Dar & Singh, 1999; Fauci As & Lane, 1998; Quim & Benson, 1994 e NICD-AIDS, 1992). Esta protena que uma imunoglobulina, pode ser medida a partir do soro plasmtico e da urina e as suas concentraes podem ser correlacionadas com o grau da progresso da doena SIDA e aparecem altisimas as concentraes dessa protena na fase aguda da Infeco, descem e depois voltam elevadas durante a Infeco. Apesar de aparecerem concentraes elevadas dessa Imunoglobulina em alguma enfermidades caracterizadas com uma activao linfoctica e/ou destruio linfoctica como nas Sndromes proliferativas, doenas auto-imunes, algumas infeces virais, na Tuberculose, na infeco pelo Citomegalovrus e na doena renal, com infeco pelo muitos estudos so unanimes em afirmar e mostram que altas concentraes de 2-m em pessoas HIV so predictores do aparecimento ou prognosticam o aparecimento da doena SIDA (Moss et al, 1988; Hofmann et al, 1990 e Anderson et al, 1990) e Hoffman et al 1990, ainda refere o mais importante na nossa clnica e avaliao laboratorial, que essas altas concentraes de 2-m em pessoas com infeco pelo HIV predizem subsequentemente o declnio das clulas CD4. Estes achados sugerem que que as alteraes da concentrao da 2-m ocorrem muito cedo antes da sero-converso e antes das alteraes da contagem das clulas CD4.

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No estudo de Fauci As & Lane, 1998 34% dos pacientes com valores de 2microglobulina (2-m)>3,8 g/ml desenvolveram SIDA num periodo de 3 anos comparados com apenas 7% dos pacientes com nveis de 2-m<2, 9 g/ml. Num outro estudo de coorte de So Franscisco, Burcham et al, 1991 encontrou que pacientes com nveis de 2-m abaixo de 3mg/ml, entre 3-5 mg/ml e acima de 5 ml tiveram em trs anos, uma taxa de progresso de SIDA de 12%, 33% 3 69% respectivamente. E conclui, segundo Lifson et al, 1992, num artigo publicado no Lancet que as concentraes de 2-microglobulina (2-m) aparecem como um marcador de progresso da doena independente da contagem de CD4 e da contagem do antgeno p24. Bardeguez et al, 1999 num estudo que tinha como ttulo Efeito da infeco pelo HIV nos nveis plasmticos da Beta 2-microglobulina em mulheres grvidas verificou que o avano da Doena SIDA est associado a uma activao generalizada do Sistema imune e a uma elevao dos nveis plasmticos da 2-microglobulina em mulheres grvidas comparadas com as mulheres sero-negativas grvidas, como tinham concluido igualmente Lifson et al, 1992 e Fahey el al, 1990 , mas em pacientes no grvidas. Encontraram no estudos que a Infeco pelo HIV pode ser fortemente correlada com com o aumento da 2-microglobulina. E contrariamente a contagem das clulas CD4 (outro marcador importante na progresso da doena) a gravidez per si, no influencia a concentrao plasmtica dos nveis da 2-microglobulina (Biggar et al, 1989), porque no foi encontrada uma diferena significativa nos nveis plasmticos de 2-microglobulina em mulheres grvidas e no grvidas. E no h igualmente uma variao dos nveis de 2-microglobulina com a idade gestacional e no foram encontradas diferenas durante a gravidez e no psparto. E esta contatao importante para o nosso estudo visto que um dos parmetros utilizados aumenta com a gravidez no caso concreto da Velocidade de Sedimentao e os nveis da 2-microglobulina podem fazer a distino

entre um aumento dos partros qu se deve a gravidez ou pela presena de infeco pelo Hiv ou pela progresso da doena SIDA. Costataram ainda que a elevao das concentraoes plasmticas da 2microglobulina precede uma perda muito acentuada de clulas linfocticas CD4 e um aumento da Carga viral nas mulheres infectadas pelo vrus de HIV (Salazar-Gonzalez, 1989). E essas constataes diz o estudo potencializam o potencial uso dos nveis da 2-microglobulina em adio com a contagem das clulas CD4 para monitorizar a progresso da doena SIDA em em mulheres grvidas infectadas pelo HIV. E como referido nesse estudo de Bardeguez et al, 1999 que a gravidez no era factor que influenciava os nveis da 2-microglobulina e se observou tambm noutros estudos em pacientes de ambos os sexos e em mulheres no grvidas (Lifson et al, 1992 e Fahey el al, 1990), essas concluses so consistentes com os nossos achados do total das Globulinas na Infeco pelo HIV e na progresso da doena apesar de no ter sido fraccionada as Globulinas para a medio dos nveis plasmticos de apenas uma fraco destes, a 2microglobulina. A associao da 2-microglobulina foi estudada tambm num outro estudo e dessa vez com a mortalidade em mulheres africanas infectadas com HIV em Kigali no Ruanda (Kerlikowske, et al, 1994). Nesse estudo verificou-se que atlas concentraes de 2-microglobulina estavam fortemente associadas com a mortalidade nas mulheres seropositivas pelo HIV. Tambm Pascale et al, 1997 foi um dos investigadores estudou tambm a utilidade da 2-microglobulina, da Imuglobulina IgA, das protenas p24, da contagem total dos linfcitos e da contagem das clulas CD4 como marcadores da progresso da doena SIDA em indivduos infectados pelo HIV. Verificou nos seus resultados um decrscimo da contagem total dos linfcitos e das clulas linficitrias CD4 em particular, quando a doena SIDA progride, com uma Correlao positiva entre a contagem total dos linfcitos e a contagem das

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clulas linfocitrias CD4 como tinham evidenciados tambm outros estudos como os de Fahey et al, 1990, Horsburg et al, 1994, Stapran & Feinberg, 1995 e Zabay et al, 1995 . Verificou uma diferena estatsticamente significativa dos nveis sricos de IgA em indivduos infectados e no infectados pelo HIV e encontro uma significativamente forte Correlao negativa entre a contagem das clulas CD4 e as concentraes plasmticas da Imunoglobulina IgA. Como sugerido pelo Gregory, 1994 este achado pode estar associado com a activao so Sistema policlonal Imune. Verificou tambm um aumemto das proteina p-24 consistente com os nossos achados do aumento das protenas Totais comparado com os pacientes Sero-negativos para o HIV. Verificou tambm este estudo de pascale et al, 1997 que o aumento dos nveis plasmticos da 2-microglobulina foram progressivas desde a fase precoce da infeco (assimptomtica) ate a fase tardia, a fase da doena SIDA. Primeiro, uma diferena significativa foi obtida entre pacientes infectados e no infectados e Segundo foram obtidas tambm diferenas estatisticamente significativas wentre diferentes estgios de Infeco pelo HIV num mesmo indivduo, em particular nas fazes assimptomticas e na fase da doena SIDA. Uma significativa entre correlao os valores estatstica das negativa forte foi igualmente da 2observada concentraes plasmticas

microglobulina e da contagem das clulas linfocitrias CD4. Pascale refere que nveis acima de 4 mg/l providencia um valor preditivo de 81% na Identificao correcta de que um paciente possa ter infeco pelo HIV no seu estudo tanto quanto os estudos de Fauci As & Lane, 1998 e o estudo de Burcham et al, 1991 que mostrou que pacientes com nveis acima de 5 ml tiveram em trs anos, uma taxa de progresso de SIDA 69%. Isto mostra a utilidade de medico desse parmetro para a identificao de pacientes que possam ter infeco pelo HIV para melhor testagem como demonstrado no nosso estudo assim como tambm tem uma extrema utilidade na monitorizao da progresso da doena sSIDA e no sucesso do tratamento

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antiretrioviral, tanto na presena como na ausncia dos testes de contagem das lulas linfocticas CD4. Um outros aspecto enunciado no estudo de Pascale et al, 1997 que nos faz sugerir o uso desses parmetros o custo dos testes. Com o fraccionamneto das Globulinas (que mais barato ainda) em microglobulinas, o custo de um Teste de 2-microglobulina no seu Pas (Panam qu tem algumas semelhanas coo o nosso pas) custa $8 a $15, contra $50 a $150 de um teste de contagem de CD4 e $75 a $150 de unma Crga Viral ou seja 10 vezes mais barato, alm de no nosso caso estar disponvel at h um ano em apenas 4 das 11 capitais provnciais do pas, sem contar com os distritos onde totalmente inacessvel. Associa-se a isso as dificuldades de reagentes e a dificuldade da tcnica ao contrrio da simples medio das Globulinas que at pode ser feito pela subtrao do valor das Proteinas Totais com a Albumina, um teste comum na prctica clnica diria em Moambique. E ainda testes como a deteco dos nveis de 2-microglobulina pode ser realizado sem electicidade, usando a imunodifuso radial, e pode por outro lado reduzir os testes de contagens de CD$ de pacientes de 3 em 3 meses ou de 6 em 6 meses para 12 a 12 meses, ou seja apenas uma vez por ano, com reduo sobremaneira de recursos de at cerca de 80% dos gastos financeiros. Contudo, apesar da bastante evidncia noutras partes do globo, este estudo o primeiro no nosso meio e sugerimos para melhor aplicabilidade, que mais estudos deveriam ser feitos para sustentar os nossos achados e melhor evidncia.

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CAPTULO 6 CONCLUSES E RECOMENDAES

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6.1 Concluses
A necessidade de poupar tempo e recursos tanto materiais como humanos, em testar a presena do vrus de HIV em indivduos que realmente precisam ser testados devido tambm aos grandes constrangimentos psicolgicos que um teste de HIV traz para o indivduo e para a famlia ao testar todos os indivduos, uma das maiores barreiras da massificao das Testagens Voluntrias para o HIV e consequente uma das grandes barreiras para diminuir ou estancar do alastramento da doena (de Wolf, 1987). Por outro lado os altos custos dos testes de monitoria do tratamento antiretroviral, nomeadamente os Testes de CD4 e de Carga Viral e a sua escassez no pas e as grandes dificuldades financeiras e de recursos humanos para se estender para zonas recnditas de pases Subdesenvolvidos (Peters et al, 2008) como Moambique fazem repensar numa estratgia, mais simples e mais barata para assegurar o sucesso do TARV nessas regies e o seguimento desse doentes. Assim, o foco do presente estudo era identificar se os marcadores biolgicos, as Globulinas, o as Protenas de HIV, Totais e a Velocidade de Sedimentao indicao de psico-sociais possibilitavam uma seleco mais apurada de indivduos com fazerem teste reduzindo constrangimentos

desnecessrios em indivduos de se submeterem ao teste de HIV e ganho de tempo e recursos para o pessoal de Sade em pr-aconselhamento; e verificar igualmente se esses marcadores, as Globulinas, as Protenas Totais e a Velocidade de Sedimentaoque na prctica clnica so mais mais baratos, mais simples e mais acessveis que os testes de Cd4 e de carga Viral, na rotina clnica e laboratorial e que so acessveis na maior parte das Unidades Sanitrias, podem ser usados para a monitoria da progresso da doena e para a monitoria do Tratamento anti-retroviral. liv

Foram estudados os marcadores Globulinas, as protenas Totais e a Velocidade de Sedimentao que foram Correlacionadas com a variao Serolgica do teste de HIV para encontrar uma indicao de realizao de um teste de HIV nuns indivduos e no noutros e foram igualmente estes marcadores Correlacionados com o valor de CD4 para verificar a sua utilidade em ser usado como marcador de progresso de doena SIDA (Erikstrup et al, 2007). Os resultados encontrados mostram que os parmetros estudados no seu conjunto As Globulinas, as Protenas Totais e a Velocidade de Sedimentao se alteram com a mudana do estado Serolgico para o HIV dos indivduos e estes mesmos parametros igualmente variam com a alterao dos valores de CD4

6.2 Recomendaes

CAPTULO 8 CAPTULO 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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ANEXOS

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