Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Viso Geral
Protemica
Mtodo novo de identificao e quantificao
absoluta global de protenas
Validao do mtodo
Comparao com AQUA
Introduo
A disponibilidade de dados de
quantificao absoluta de protenas so
de grande importncia na compreenso
da biologia de sistemas por dois
grandes motivos:
1. Participao nos sistemas biolgicos
2. As concentraes proteicas determinam a
taxa de adaptao de processos celulares
Introduo
Padro Ouro para quantificao
absoluta:
Western Blot
Introduo
Metodologia de quantificao absoluta
(AQUA)
Nessa metodologia so utilizados peptdeos
sintticos marcados.
Determinada pela adio (concentrao
conhecida) de peptdeos sintticos marcados
na amostra que permitem calcular a
quantidade de peptdeos no marcados
(endgenos) com base no espectro dos
respectivos peptdeos marcados
Metodologia AQUA
Metodologia AQUA
Limitaes
A disponibilidade e os custos ($$$) para
encomendar os peptdeos sintticos
um fator limitante.
Invivel para abordagens de
quantificao e identificao
globais/larga escala
Contexto
Necessidade de desenvolvimento de
novas abordagens de quantificao
absoluta que permitam expandir a
quantificao (escala global) e que
sejam label free (menor custo)
Objetivo Protemico
Quantificar de modo absoluto o
maior nmero possvel de protenas
expressas no citoplamas de Bacillus
subtilis com o mtodo LC/MS
Objetivo Cientfico
Validar um novo mtodo
independente de dados LC/MS, na
quantificao de protenas de B.
subtilis em diferentes condies de
cultivo.
Mtodos de identificao de
peptdeos
AQUA
Dependente de Aquisio de Dados (DDA)
Mtodos de identificao de
peptdeos
Alternativo ao AQUA:
MS-Hi3 DIA
Estratgia Hi3: Aps a identificao dos
peptdeos utilizando o mtodo DIA, feita a
comparao das intensidades mdias de
sinal dos trs peptdeos mais intensos de
uma protena com uma protena padro
digerido internamente
MSHi3
AQUA
Fonte da amostra
Bacillus subtilis cepa BSB 168T +
Condio S
Condio CH
10 g/L
Caseinhydrolysate
3,9 g/L Acido Lglutmico
1,3 g /L de L-alanina
1,5 g/L de L-asparagina
1,4 g/L de KH2PO4
1,4 g/L de NH4Cl
0,1 g/L Na2SO4,
0,1 g/L de NH4NO3
0,1 g/ L de MgSO4
0,02 g/L CaCl2
0.075 g/L de MnSO4,
FeCl3 0,001 g/L
Metodologia
Cultura de B.
subtilis
Meio S
Meio CH
Cultura de B.
subtilis
Meio CH
Meio S
Peptideos
marcados
Coluna de
C18
Coluna de
C18
Tripsina
Tripsina
Metodologia
DDA
LC/SRM
6 protenas
4000 QTRAP
4 protenas
TSQ VANTAGE
AQUA
DIA
LC/MS
Hi3
Synapt G2
Metodologia
Tempo total da corrida
4000 QTRAP: 1620 min -> 27 hrs
TSQ VANTAGE: 1440 min -> 24 hrs
Synapt G2: 4770 min -> 79,5 hrs
Mtodo de nalise
4000 QTRAP:MultiQuant 1.2
TSQ VANTAGE: Pinpoint 1.0
Synapt G2: MassLynx V4.1
Resultados
3 replicatas tcnicas para cada 3
replicatas biolgicas
Protenas identificadas em pelo menos 3
replicatas
FDR: 0,8 para condio S
0,4 para condio CH
Identificao
Condio S
de 1079
protenas
Condio
CH
23%
67%
10%
88% Citoplasma
8% Membrana
4% Extracelular
Limitao do mtodo
259 genes essenciais -> nmero de
cpias elevado
192 quantificados absolutamente
Protenas essenciais no quantificadas
podem ser divididos em dois subgrupos.
Protenas de baixo peso molecular
Protenas de membrana
Menor probabilidade de gerar peptdeos por
digesto trptica, que se encaixam na janela
analtica do espectrmetro de massa
Impactos fisiolgicos
Condio S
Glicose como fonte de carbono
Condio glicoltica
Sntese de aminocidos
Condio CH
Aminocidos como fonte de carbono
Condio Gliconeognica
Degradao de aminocidos
Volume celular 1,94X maior do que em S
Condio S
Condio CH
35 protenas com
51 protenas com
abundancia maior
abundancia maior
do que 10.000 m/c
do que 10.000 m/c
Metabolismo do
Degradao de
carbono
aminocidos
Sntese de
Gliconeognese
aminocidos
Maquinaria de
traduo
Chaperonas
127 protenas expressas
diferencialmente
Fator de transcrio
AHRC
Cobertura das
vias metablicas
Sntese diminui
50x
Degradao
aumenta 20x
Reprime a expresso
de genes
que
Regulao
codificam
pspara a
sntese
de arginina
traduciona
Induz a degradao
l
de arginina.
Promotor ativado
por ROCR
expresso de
proteinas da via da
degrao da
arginina
Condio S
N
m/c
Condio CH
Mas...
Como explicar que protenas cujos
genes esto num mesmo operon
pode apresentar nveis de expresso
(nmero de molculas por clula) to
diferentes?
Regulao
PsTranscricion
al
Concluses
Identificao de 1079 protenas
~40% de cobertura de sequncia (utilizando os 3
peptdeos)
~40% de cobertura do proteoma citoslico predito
Concluses
O mtodo aplicado MS-Hi3 para a
quantificao absoluta de protenas contribuiu
para a anlise de biologia de sistemas por:
Aprimorar o conhecimento de modelos dinmicos
com base na concentrao de protenas
Permite a deteco de novos mecanismos de
regulao (Ps-Transcricionais)
Capaz de inferir o custo real de protenas em
diferentes processos (inclusive de vias metablicas)
Tornar possvel avaliar a distribuio dos recursos
celulares
Concluso
O artigo traz um novo mtodo (MSHi3)
DIA
Validado
MS-Hi3 > AQUA
Figuras
http://
www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/mass-spectrometry/
protein-aqua/protein-aqua-strategy.html
http
://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40051/title/Movin
g-Target
/
http://
www.nature.com/nmeth/journal/v10/n1/abs/nmeth.2309.html