PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

INTRODUÇÃO
 Constituição e estrutura das PROTEÍNAS
 Constituição
 Aminoácidos (aa) com elevada massa molar
(> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos,
apenas 20 constituem as proteínas.
 Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela
cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou
básico do aa em solução.
 Estrutura (quatro níveis) :
 Estrutura primária: refere-se à sequência dos
aminoácidos na cadeia linear peptídica.
 Estrutura secundária: refere-se ao grau de
ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São
estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.
 Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial
obtido pelas dobraduras e enrolamentos da
estrutura secundária. Envolve a otimização de
várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e
de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre
vários grupos na estrutura da proteína.

As estruturas secundária e terciária conferem

à proteína a sua estrutura tridimensional.

 Estrutura quaternária: envolve a associação de

subunidades terciárias de proteínas. Para sua
estabilização concorrem ligações iônicas, pontes
de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes
bissulfeto e interações hidrofóbicas.
 Representação esquemática das estruturas
das proteínas

Estrutura
Estrutura Estrutura Estrutura quaternária
primária secundária terciária
Princípios de Solubilidade
 Solubilidade: resultado global das interações
atrativas e repulsivas entre moléculas do
solvente e do soluto;
 É favorecida quando há interações repulsivas
entre moléculas de soluto e atrativas entre
moléculas do soluto e do solvente;
 Interações entre soluto e solvente são não
covalentes => interações eletrostáticas e forças
de Van der Waals;
 Interações eletrostáticas: base da solubilidade de
moléculas polares neutras e com cargas em
solventes polares;
 Solubilidade de Proteínas
Determinam a solubilidade

Regiões
Hidrofóbicas
(Apolares)
Regiões Hidrofílicas
(Polares)

Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e

lipídeos conferem diferentes solubilidades às
proteínas.
 pH: grande influência => altera o grau de
dissociação dos grupamentos;

Carga total zero leva a um aumento da

agregação devido à menor repulsão.

perfis de solubilidade em diferentes valores de pH

O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo

ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor
de pH no qual a proteína possui carga global
igual a zero.
 pH e distribuição de cargas:

+ + - -

pI

De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterando-

se as propriedades do meio por mudanças na
força iônica e no pH, por adição de solventes
orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-
se a solubilidade das proteínas.
 Desnaturação X Precipitação

 A desnaturação compreende a destruição da

estrutura terciária de uma molécula de proteína e a
formação de cadeias polipeptídicas ao acaso.
- as variáveis pH, temperatura e solventes
orgânicos, dependendo dos valores, causam
desnaturação das proteínas.

 A precipitação compreende a modificação da

estrutura tridimensional da molécula de proteína.
- as mesmas variáveis, dependendo dos valores,
causam apenas a precipitação das proteínas.
 PRECIPITAÇÃO
Uso: purificação de proteínas de diferentes fontes
 Precipitados: agregados protéicos de moléculas de
diferentes tamanhos;
 Precipitação: operação na qual uma perturbação,
química ou física, em uma solução, promove a
formação de partículas insolúveis;
 Remoção do precipitado: separação sólido-líquido;
 Tradicionalmente usada também como etapa de
concentração;
 Etapa preliminar em diversos procedimentos de
purificação;
 Pode se empregada como etapa única;
 Vantagens:

 Facilidade de operação
 Equipamentos relativamente simples
 Facilidade de ampliação de escala
 Grande número de agentes precipitantes
(sendo muitos de baixo custo ou usados em
concentrações pequenas)
 As técnicas de precipitação se dividem
basicamente em dois grupos:

 Redução da solubilidade da molécula alvo

pela modificação da solução:
 Adição de sais (sulfato de amônio) em altas
concentrações, de solventes orgânicos
(etanol, éter e acetona) e de polímeros não-
iônicos (polietilenoglicol).

 Redução da solubilidade por alterações da

molécula alvo:
 Mudança da carga das proteínas (adição de
ácidos e bases), uso de precipitantes
aniônicos ou catiônicos.
A precipitação deve permitir que a
conformação adequada da proteína seja
recuperada, para que esta possa
“exercer” sua função bioquímica após o
processo.
PRECIPITAÇÃO POR SAIS

 Neutralização das cargas superficiais com

redução da camada de hidratação

=> agregação dos resíduos hidrofóbicos

 Salting-out: adição de sais que promovem o

aprisionamento de moléculas de água, e o
consequente consumo das moléculas de água
nas regiões hidrofóbicas. Estas, expostas, se
interagem e se agregam.
 Região
Hidrofóbica
(Apolar)
Regiões Hidrofílicas
(Polares)
Sais mais adequados são aqueles que
apresentam elevada solubilidade em água.

Os mais usados são:

citrato de sódio
sulfato de sódio
sulfato de amônio
 Salting-in: em baixa concentração de sais
ocorre a indução de interações iônicas e
agregação das moléculas de proteína.

Globulinas se precipitam sob força iônica baixa

Método mais comumente usado para

separação de proteínas é o da adição de sais
neutros (salting out)
Esquema explicativo da precipitação por salting-in.
 Primeira descrição quantitativa do salting out foi
feita por Cohn, em 1925:

log S =  - KS ( I )
Onde:
S = solubilidade da proteína (mol/L)
I = força iônica do meio (mol/L)
 = constante que representa a solubilidade da
proteína quando I = 0 (mol/L)
KS = constante de salting out

Misturas de proteínas não obedecem à equação!

PRECIPITAÇÃO POR SOLVENTES

 A solubilidade das proteínas varia com a

distribuição dos resíduos hidrofílicos e
hidrofóbicos na superfície da molécula;
 Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e
outros compostos são usados como
precipitantes desde o início do século XIX;
 Aplicação clássica: fracionamento das proteínas
do plasma sanguíneo por etanol frio (Método de
Cohn)
MECANISMO

 Principal efeito:  da constante dielétrica do meio

- Agregação de
+ Região
+
Hidrofóbica
proteínas por
-
+ interações
+ Solvente
-- eletrostáticas entre
- Orgânico
- superfícies com
+
cargas de sinal
+ oposto em meio
- + -
-
- -
- aquoso contendo
+ - ++ + solvente orgânico.
- + - -
-
+ -
SOLVENTES

 Devem ser miscíveis em água e não reagir

diretamente com as moléculas
 Mais usados: metanol, etanol e acetona;
 Outros: n-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e
outros álcoois, éteres e cetonas;
 VARIÁVEIS QUE AFETAM O PROCESSO
 Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a
xxxxxxxxxxxxxxxxxdesnaturação
< 0º C pode garantir que
xxxxxxxxxxxnão haja desnaturação
Adição do solvente  temperatura
=> deve ser lenta e sob refrigeração

 Concentração de sais:  concentrações

dificultam interações eletrostáticas =>
dificuldade de precipitação =>  % solvente

 pH: próximo ao pI favorece a precipitação

 PRECIPITAÇÃO FRACIONADA

 Meios a serem purificados, em geral, constituem misturas

 A Precipitação fracionada corresponde à precipitação em
duas ou mais etapas
 Na primeira removem-se proteínas indesejáveis menos
solúveis e, na(s) seguinte(s), precipitam-se uma ou mais
moléculas-alvo
 Tem aplicação industrial para purificação;
 Na precipitação fracionada em geral varia-se a
concentração do agente precipitante, mas também pode-
se variar outros fatores;
 Os estágios são chamados de “cortes” (em geral, dois);
 30% v/v

50% v/v

Representação teórica dos perfis de solubilidade de uma

molécula de interesse e outras presentes no meio, em
concentrações crescentes de precipitante.
 pH 4,6

100

80
% Recuperação

xilanase
60
beta-xilosidase
proteínas totais
40

20

0
0 20 40 60 80 100
% etanol (v/v)

Recuperação (%) das enzimas: xilanase (),

-xilosidase () e proteínas totais ().
Parâmetros de Avaliação
 Recuperação de proteínas totais:
 Rp = teor de proteínas após precipitação x 100
teor de proteínas inicial
 Recuperação de atividade:
 Ra = atividade após precipitação x 100
atividade inicial

 Aumento de pureza:
 AP = atividade específica após precipitação
atividade específica inicial
Resultados obtidos após precipitação fracionada com etanol das
enzimas xilanase, -xilosidase e proteínas totais.
-xilosidase
Amostra RP1 RA2 AP3
(%) (%)
Inicial - - 1,0
20% etanol 71 8 0,1
60% etanol 12 74 5,9
80% etanol 18 6 0,4
Xilanase
Amostra RP RA AP
(%) (%) (AEf/AEini)
Inicial - - 1,0
20% etanol 71 6 0,1
60% etanol 12 7 0,6
80% etanol 18 81 4,4

1Recuperação de proteínas totais; 2Recuperação de

Atividade; 3Aumento de pureza.
PRECIPITAÇÃO POR POLÍMEROS

PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar,

neutro e miscível em água, disponível em diversos graus
de polimerização;
 Em geral,  proporções de polímero (15 a 30%);
 4000 g/mol ou mais são os mais eficientes
 Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso;
 Concentração do polímero depende do tamanho da
molécula a ser precipitada, da massa molar do
polímero e da concentração da proteína;
 Remoção do polímero: ultrafiltração, diálise, adição
de etanol.
 Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em
água; usados devido ao baixo custo e pouca
concentração residual;
 Policátion polietilenoimina e poliânion ácido
poliacrílico
 Mecanismo: agregação à proteína (floculação)
ou eletrostático (neutralização de cargas);

PRECIPITAÇÃO POR VARIAÇÃO DA TEMPERATURA

 Mecanismo: 1) diminuição: redução na solubilidade;
2) aumento: desnaturação => exposição de grupos
hidrofóbicos que interagem e formam complexos
insolúveis;
PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA
 Resulta da atração eletrostática das proteínas
quando estas estão em pH próximo a seu pI;
 Método bastante simples: ajuste do pH

 Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima

=> precipitação isoelétrica, por interação entre
as zonas hidrofóbicas;
 Vantagem: baixo custo

 Desvantagem: possibilidade desnaturação

 Obs: Método útil para precipitar proteínas

indesejáveis e otimizar outros tipos de
precipitação;
Outros tipos de precipitação
 Por afinidade: uso de interações específicas e
seletivas da molécula-alvo com algum ligante;
 Ex.:Cibracon blue em metilmetacrilato para
purificar lactato desidrogenase.

 Por íons metálicos: íons metálicos polivalentes

podem ser usados eficientemente na precipitação:
manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco e
cádmio.
 Mecanismo: mudanças do pI e formação de
ligações cruzadas com outras proteínas.
Principais métodos de precipitação de proteínas
Precipitante Princípio Vantagens Desvantagens
Sais neutros Interações - Uso universal - Corrosivo
(salting-out) hidrofóbicas pela - Baixo custo - Liberação de
redução da camada de amônia em pH
hidratação da proteína alcalino

Polímeros não- Exclusão da proteína - Uso de - Aumento da

iônicos da fase aquosa pequenas viscosidade
reduzindo a quantidades de
quantidade de água precipitante
disponível para a
solvatação da proteína
Calor interações - Baixo custo - Risco de
hidrofóbicas e - Simples desnaturação
interferência das
moléculas de água nas
ligações de hidrogênio,
Polieletró- Ligação com a molécula - Uso de - Risco de
litos de proteína atuando pequenas desnaturação
como agente floculante quantidades de
precipitante
Precipitação Neutralização da carga - Uso de - Risco de
isoelétrica global da proteína pela pequenas desnaturação
alteração do pH do meio quantidades de
precipitante
Sais Formação de complexos - Uso de - Risco de
metálicos pequenas desnaturação
quantidades de
precipitante
Solventes Redução da constante - Facilidade de - Risco de
orgânicos dielétrica do meio reciclagem desnaturação
aumentando as - Facilidade na de proteínas
interações eletrostáticas remoção do - Inflamável e
intermoleculares precipitado explosivo