Cromatografia: Princípios e

Teoria
Definição da IUPAC (International Union of Pure and Applied
Chemistry):
Cromatografia é um método físico de separação no qual os
componentes da amostra a serem separados distribuem-se entre
duas fases: uma fase estacionária (parada) e uma fase móvel,
que flui em uma direção definida
Pure and Applied Chemistry 65(4) (1993) 819-872

As separações ocorrem com base nas diferentes velocidades de

migração dos componentes da amostra na fase móvel
 Cromatografia - Histórico
1904 – O botânico russo Tswett separa constituintes coloridos de
folhas passando o extrato destas por uma coluna recheada com
carbonato de cálcio.
Tswett cunhou o termo cromatografia = cor + grafia
 Cromatografia - Histórico
1941 – os ingleses A.J.P. Martin e R.L.M. Synge separaram ácidos
monoamino monocarboxílicos em coluna de silica contendo
adsorvidos alaranjado de metila e clorofórmio – introduzindo a
cromatografia de partição líquido-líquido – receberam o prêmio
Nobel de Química em 1952 (Biochem J. 35 (1941) 91) .
1950 – A.J.P. Martin e A.T. James demonstraram a cromatografia
de partição gás-líquido (Biochem. J. Proc. 48(1) vii)
Década de 1960 - 1970 – Desenvolvimento instrumental da
cromatografia a líquido (HPLC)
Século XXI – Grande desenvolvimento de materiais para colunas em
cromatografia a líquido – surge o UHPLC
Hifenação com espectrometria de massas se torna comum (apesar do
custo ainda elevado)
Cromatografia: Princípios e Teoria
Dois tipos principais de cromatografia:
Cromatografia planar ou cromatografia em coluna

Cromatografia planar (ou cromatografia em camada delgada)

 Cromatografia: Princípios e Teoria
Cromatografia em coluna
Cromatografia a gás: separa componentes gasosos baseando-
se em processos de adsorção ou partição do analito com a fase
estacionária (líquida ou sólida) e na volatilidade dos analitos.
Ponto de ebulição do analito também é importante

Cromatografia a líquido: separa os analitos dissolvidos em uma

fase móvel líquida por diversos processos de interação dos
analitos entre a fase estacionária e a fase móvel. Dentre este
processos pode-se mencionar: interação hidrofóbica ou hidrofílica
(partição), adsorção, troca iônica, exclusão por tamanho e modos
mistos de interação.
Classificação das Técnicas
Cromatográficas

1- cromatografia de adsorção
2- cromatografia de partição (interação
hidrofóbica ou hidrofílica)
3- cromatografia de troca iônica
4- cromatografia de exclusão
1- Cromatografia de adsorção:
Fase estacionária é um sólido onde os componentes da amostra são
adsorvidos. A fase móvel pode ser um líquido (cromatografia líquido–
sólido) ou um gás (cromatografia gás-sólido). Os componentes distribuem-
se entre as duas fases por uma combinação de processos de
adsorção/dessorção.
2- Cromatografia de Partição
Fase estacionária é um líquido imobilizado sobre um sólido inerte. A fase
móvel pode ser um líquido ou um gás.
Cromatografia de fase normal – uma fase estacionária polar (ex: metanol
sobre sílica) é usada com uma fase móvel apolar (ex: hexano) – compostos
polares são retidos mais tempo na fase estacionária e os componentes
apolares passam direto junto com a fase móvel.
Cromatografia em fase reversa – uma fase estacionária apolar é usada com
uma fase móvel polar – compostos apolares são retidos mais tempo na fase
estacionária e compostos polares são rapidamente eluídos com a fase móvel

Componentes da amostra são ABSORVIDOS na fase estacionária

ABsorção x ADsorção
 3- Cromatografia de Troca Iônica

Fase estacionária: Fase estacionária:

Trocador aniônico fraco: aminas secundárias Trocador catiônico fraco: carboxílicos
Trocador aniônico forte: aminas quaternárias Trocador catiônico forte: sulfônicos
 4 – Cromatografia de Exclusão
A fase estacionária tem estrutura similar a peneira e separa
os componentes da amostra com base no tamanho das
moléculas

Moléculas maiores são eluídas mais rapidamente da coluna e moléculas

menores penetram nos poros da fase estacionária, ficando mais tempo
retidas.
Classificação das técnicas
cromatográficas
Princípios das Separações Cromatográficas

Separações em
condições diferentes
 Princípios das Separações Cromatográficas

 
Xm Xs
= atividade de X na fase estacionária
= atividade de X na fase móvel
  𝑎 𝑋𝑒 𝐶𝑒
𝐾 𝑐= ≈ Ce e Cm são as concentrações de X nas fases
𝑎 𝑋𝑚 𝐶𝑚
estacionária e móvel, respectivamente

Kc depende da temperatura, da composição química do

analito, da fase estacionária e da fase móvel.
Quanto maior o valor de Kc para um dado componente, mais
fortemente este composto é retido pela fase estacionária
Princípios das Separações Cromatográficas

• As bandas (regiões da fase móvel que contém os

analitos) alargam conforme deslocam-se ao longo da
coluna.

• A substância que se move mais lentamente apresenta o

maior alargamento da banda

• Determina-se a concentração das substâncias a partir

do sinal gerado por um detector apropriado colocado
na saída da coluna.
 Velocidade de migração dos solutos
tR = tempo de retenção
wb = largura de pico nas
mesmas unidades de tR
t’R = tempo de retenção
ajustado
tM= tempo do volume morto
- tempo que o componente
não retido leva para sair da
coluna
Velocidade linear média de Velocidade linear média da fase
migração do soluto: móvel:
 Velocidade de migração dos solutos
Relação entre a vazão volumétrica (F, cm3/s) e a velocidade
linear
2
 = velocidade linear da fase móvel (cm/s)
 𝐹=𝜇 𝐴 =𝜇 𝜋 𝑟 A = área da seção transversal da coluna (cm2)
Para uma coluna recheada (empacotada)
𝐹=𝜇
  𝐴 =𝜇 𝜀 𝜋 𝑟 2  
=fração de volume da coluna disponível
para o líquido (porosidade)
Relação entre a velocidade migração e a constante de distribuição
=𝜇
  × 𝑓𝑟𝑎 çã 𝑜 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑛𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚 ó 𝑣𝑒𝑙

CM e CE são as concentrações nas fases móvel e estacionária

VM e VE são os volumes das fases móvel e estacionária
 Velocidade de migração dos solutos
 =

KC
  1
=𝜇
𝑉𝐸
1+ 𝐾 𝐶
𝑉𝑀
O fator de retenção para um soluto X é definido
como:
 𝑘 = 𝐾 𝐶 , 𝑋 𝑉 𝐸 Como obter kX de um cromatograma?
𝑋
𝑉𝑀
  =𝜇 1  =
 𝑋
1+𝑘 𝑋

𝑡  𝑀 +𝑡 𝑀 𝑘 𝑋 =𝑡 𝑅 , 𝑋  𝑘 = 𝑡 𝑅 , 𝑋 −𝑡 𝑀
𝑋
𝑡𝑀
 Fator de Retenção em Cromatografia
ou Fator de Capacidade (k)

tR  tM t R '
k 
tM tM

k descreve a velocidade com que um soluto migra através da

coluna. Se k < 1 o analito é eluído tão rapidamente que difculta
a determinação do tempo de retenção. Se k ~ 20 – 30 os tempos
de eluição são demasiadamente longos. Idealmente 1<k<5.
Velocidades Relativas de Migração: o
Fator de Separação ()

k B (t R ) B  t M
 
k A (t R ) A  t M

kB e kA são os fatores de retenção dos compostos A e B

contidos na amostra, sendo A o composto que elui mais
rapidamente da coluna. Portanto,  é sempre maior que 1.
 Alargamento das bandas e
eficiência da Coluna
Uma banda de um soluto invariavelmente se expande quando
percorre o sistema cromatográfico, da injeção até a detecção,
passando pela coluna. A banda emerge no detector, idealmente,
com uma distribuição gaussiana, com desvio padrão s e
variância s2.

A variância observada é a soma das variâncias de todos os

mecanismos que ocorrem:

 obs
2
  12   22   32   42  ....    i2

i corresponde aos diversos processos que provocam a dispersão

das moléculas do analito entre a injeção e a detecção
Alargamento das bandas e eficiência da Coluna

A variância da distribuição
é uma medida da
eficiência da coluna

Na distância de L+1
estão contidas 34% das
moléculas do analito

  eficiência da coluna
A
é definida como:

H = altura de prato
 Alargamento das bandas e
eficiência da Coluna
Se a banda ou pico cromatográfico
apresenta distribuição gaussiana:
2
 tR 
N  16
w 

 b 
N= Número de pratos de
uma dado componente da
amostra
tR = tempo de retenção
wb = largura de pico nas
©Gary Christian,
Analytical Chemistry,
mesmas unidades de tR
6th Ed. (Wiley)
 Alargamento das bandas e
eficiência da Coluna
Altura dos Pratos (H)
L
H
N
L = comprimento da coluna

Quanto menor H mais estreitos serão os picos, melhor será

a resolução da mistura e mais eficiente será a separação
Fatores que afetam a eficiência
da coluna
 Alargamento na coluna
Caminhos múltiplos na coluna

• Velocidade linear de fluxo não afeta o alargamento de bandas ou a

altura de prato devido a existência dos caminho múltiplos
• Quanto menor o tamanho das partículas e quanto maior sua
homogeneidade, menor é o alargamento
 Alargamento na coluna
Difusão longitudinal

2 Dm L
  2 Dm t 
2

x

 2 2 Dm
HD  
L x

Dm = coeficiente de difusão do soluto m

t = tempo para o soluto percorrer a coluna
L = comprimento do coluna
m x= velocidade linear de fluxo
HD = altura do prato em função da difusão longitudinal
 Alargamento na coluna
Termo de resistência à transferência de massa
2k d2
Ce 
3( k  1) 2 De

1  6k  11k 2 r 2
Cm 
24( k  1) 2 Dm

C = coeficiente de transferência de massa

k = fator de retenção
d = diâmetro da partícula
r = raio da coluna
De e Dm = coeficientes de difusão na fase
estacionária e móvel
 Alargamento na coluna
Termo de resistência à transferência de massa

Altura do prato
decorrente do tempo de
equilíbrio finito

H  C x  (C e  Cm )  x
 Eficiência em Cromatografia
Equação de van Deemter
B
H  A  C  = velocidade média do fluxo (cm s-1)

A= “eddy diffusion” relacionado com a difusão
devido a caminhos alternativos das moléculas
entre as partículas da fase estacionária.
A  dp (diâmetro de partícula)

B = difusão longitudinal ou molecular

B  DM (coeficiente de difusão)

C = termo de transferência de massa entre

as duas fases 2
1 dp
C
6 DM
 Equação de van Deemter
B Em uma otimização busca-se
H  A  C
 minimizar H

B- difusão molecular –
diminui com velocidades
maiores de fluxo
C – termo de transferência de
fase – aumenta com aumento da
velocidade de fluxo

A – é minimizado com
partículas pequenas e
uniformes
 RESOLUÇÃO (Rs)

  2(𝑡 𝑅𝐵 −𝑡 𝑅𝐴 )
𝑅 𝑠=
(𝑤 𝑏𝐴 + 𝑤𝑏𝐵 )

Rs mínima para fins

quantitativos = 1,5
- 0,1% de
sobreposição entre os
picos
tRA tRB
 Resolução
Efeito do fator de retenção e coeficiente de seletividade

  √ 𝑁 𝛼 −1 𝑘𝐵
𝑅 𝑠=
4 (
𝛼 )( 1+𝑘 𝐵 )
Número de pratos para atingir a resolução desejada:
2 2
  𝛼 1+𝑘 𝐵
2
N =16 𝑅 𝑠 ( 𝛼−1 )( 𝑘𝐵 )
Efeito da resolução no tempo de retenção:

 ( 𝑡 ) = 16 𝑅𝑠 𝐻
2
𝛼 2
( 1+𝑘 𝐵 )3
𝑅 𝐵
𝜇 𝛼 −1 ( ) (𝑘 𝐵)
2
O problema geral da resolução
O problema geral da resolução

Aumentar N, aumenta resolução

Aumentar k, aumenta tempo de

retenção e alarga os picos

Aumento de  aumenta resolução

Na prática varia-se o tamanho da coluna

para alterar N e a composição das fases
móvel e estacionária para alterar k ou 
O problema geral da resolução
Em cromatografia de fase reversa,
diminuir a concentração do
modificador orgânico (MeOH)
aumenta o fator de retenção
 RESUMO
• O que é cromatografia?
• Como os compostos são separados em uma coluna
cromatográfica?
• Diferentes tipos de cromatografia (adsorção, partição, troca iônica,
exclusão, etc..).
• Fator de Retenção
• Fator de separação
• Eficiência de uma coluna
• Número de pratos
• Equação de van Deemter

• Resolução cromatográfica