PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CLNICA MDICA

E CINCIAS DA SADE DISSERTAO DE MESTRADO

Comparando os efeitos da utilizao da Papana e dos cidos Graxos Essenciais - AGE em leses cutneas: estudo experimental.

GRAZIELA HAX

Porto Alegre 2009

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PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CLNICA MDICA E CINCIAS DA SADE DISSERTAO DE MESTRADO

Comparando os efeitos da utilizao da Papana e dos cidos Graxos Essenciais - AGE em leses cutneas: estudo experimental.
GRAZIELA HAX

Dissertao apresentada como requisito para obteno do grau de Mestre em Cincias da Sade, pelo programa de Ps-Graduao em Cincias de Sade da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, rea de Concentrao em Clnica Cirrgica. Orientador: Prof. Dr. Jefferson Braga da Silva

Porto Alegre 2009

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DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO NA PUBLICAO (CIP) H411c Hax, Graziela Comparando os efeitos da utilizao da papana e AGE em leses cutneas: estudo experimental / Graziela Hax. Porto Alegre: PUCRS, 2009. xiv; 63 f.: il. graf. tab. Orientao: Prof. Dr. Jefferson Lus Braga da Silva. Dissertao (Mestrado) Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Curso de Ps-Graduao em Medicina e Cincias da Sade. rea de Concentrao: Clnica Cirrgica. 1. CICATRIZAO DE FERIDAS. 2. COLGENO. 3. PAPANA. 4. FIBROBLASTOS. 5. CIDOS GRAXOS ESSENCIAIS. 6. PELE/leses. 7. MODELOS 8. RATOS WISTAR. 9. IMUNOISTOQUMICA. 10. ESTUDO ANIMAIS. COMPARATIVO. I. Silva, Jefferson Lus Braga da. II. Ttulo. C.D.D. 617.14 C.D.U. 616.5-003.93:547.962.9(043.3) N.L.M. WR 102
Rosria Maria Lcia Prenna Geremia Bibliotecria CRB 10/196

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Dedicatria Dedico este trabalho a meu marido Mauro e a meu filho Tyago.

AGRADECIMENTOS A Deus, por tudo. Ao professor Dr. Jefferson Braga Silva pela oportunidade e os ensinamentos. Ao Professor Dr. Vinicius Duval da Silva, patologista do laboratrio de patologia da PUCRS, pela colaborao nas peas para o estudo histopatolgico e pelos ensinamentos do manuseio com as lminas. Muito obrigada pela oportunidade. Ao Prof. Joo Feliz Duarte de Moraes, coordenador do departamento de estatstica da PUCRS, pela elaborao da anlise estatstica e por suas palavras de sabedoria e carinho. Jamais esquecerei. Ao programa de Ps graduao em Cincias da Sade da Faculdade de Medicina da PUCRS, meu muito obrigada. sempre amiga Patrcia Sesterheim, biloga, pelo belo trabalho durante a realizao dos experimentos e tambm pela doura com que sempre me atendeu. Ao tcnico em histologia Tiago Giuliani por sua notvel competncia e presteza. Muito obrigado pelo trabalho que fez ao realizar de forma cuidadosa e exemplar o preparo de todo material histolgico e imunoistoqumico e principalmente pelo aprendizado que me proporcionou. sempre amiga e colega Aline Custdio por me ajudar e acompanhar fielmente em toda a realizao desta pesquisa. Jamais esquecerei todo o teu empenho, este mrito tambm seu. amiga e colega Janete Urbanetto, por ser uma grande incentivadora, pelo seu empenho, pelo exemplo de profissionalismo, pela amizade, pela compreenso, pelo sorriso que tanto nos incentiva, minha eterna gratido. sempre amiga e colega Marlina Cunha Tosta, minha primeira incentivadora em iniciar esta jornada, pela amizade, companheirismo, meu eterno obrigado. s sempre amigas e colegas Ana, Ktia, Elaine e Raquel por terem toda a pacincia comigo e por acreditarem em mim.

Ao laboratrio de Patologia da PUCRS, pela receptividade e confiana por parte de todos os profissionais. Ao Laboratrio de habilidades mdicas, na pessoa de Gilmar, pela receptividade, por me proporcionar o desenvolvimento prtico do experimento, pelos cuidados e carinho com os animais, agradeo muito.

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Ao acadmico de medicina Matheus Paganella, pelo belo trabalho que apresentou ao capturar as imagens e realizar a contagem de material imunohistoqmico. Obrigado pelo sorriso acalentador. A meus avs Nrcio e Arabella por serem exemplo de uma famlia correta e feliz. Nunca esquecerei o que fizeram por mim. A meus pais Aida e Breno por me incentivarem em todos os momentos de minha vida e nunca me julgarem. O meu amor por vocs incondicional. A meu irmo Breno por ser um exemplo de irmo e profissional. O teu amor pelo trabalho e pela vida o que faz com que eu nunca desista de tentar ser uma pessoa cada vez melhor. A meus sogros, Ivani e Mauro pelo apoio e incentivo constantes e tambm por acreditarem em mim. A meu filho Tyago pela inocncia, bondade e pela pacincia que teve comigo nos momentos de maior tenso. Eu te amo. Tu s a luz da minha vida. A meu marido Mauro pelo incentivo e confiana dirios. No sei o que seria deste trabalho se eu no tivesse o teu ombro sempre a meu lado. Eu te amo. Serei sempre grata. Aos funcionrios da Ps graduao da Medicina da PUCRS, pelo carinho e receptividade. Aos funcionrios da Biblioteca da PUCRS, em especial a bibliotecria Rosria, pelo carinho e receptividade. A meus queridos companheiros de trabalho nas reas que realizo Coordenao Assistencial, peo desculpas se no estive to presente quanto deveria e agradeo a todos por sempre me apoiarem e entenderem este momento. Aos amigos e colegas de jornada na ps-graduao, pelo apoio, dias e horas inesquecveis nestes anos. Aos ratos utilizados neste estudo, meu respeito e agradecimento. s pessoas que direta ou indiretamente contribuiram para a realizao deste estudo.

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RESUMO

Conforme Mandelbaum, 2003 a cicatrizao envolve muitos eventos e situaes, exigindo conhecimento bsico de diversas reas, portanto uma atuao multidisciplinar se faz necessria para uma boa evoluo da leso. O reparo do tecido se d atravs de duas formas: pela regenerao da atividade funcional do tecido ou pela cicatrizao. Esta pesquisa trata-se de um estudo experimental tendo por finalidade comparar os efeitos da papana 2%, AGE e soro fisiolgico quando utilizados em leses cutneas circulares com dimensionamento de dois centmetros de dimetro e espessura total no dorso de ratos da linhagem EPM-I Wistar. Utilizou-se doze ratos machos divididos em trs grupos: C1 (grupo AGE), C2 (grupo controle) e C3 (grupo papana), todos submetidos a trocas dirias de curativos aps limpeza com soluo de gua bidestilada. Com base nos resultados obtidos verificamos que o produto AGE, durante o perodo de sete dias, no favoreceu a expresso de fibroblastos, o que pode ser explicado pela intensa aderncia da gaze de algodo no leito da leso, prejudicando, assim, o material histolgico analisado por imunoistoqumica. Nesta mesma fase, em relao ao colgeno, observamos que o tratamento com papana 2% apresentou seu menor pico quando comparado aos outros tratamentos, o que pode ser atribudo a seu efeito potencialmente sulfdrico, realizando assim um desgaste nas fibras colgenas. Conforme o mtodo estatstico utilizado, ANOVA, constatou-se no haver diferena significativa entre os tratamentos propostos nesta pesquisa.

DESCRITORES: Cicatrizao de feridas; colgeno; papana; fibroblastos; cidos Graxos Essenciais; pele; modelos animais; ratos Wistar; imunoistoqumica; Estudo comparativo

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ABSTRACT

According to Mandelbaum, 2003, healing involves many events and situations, requiring basic knowledge of different fields. Thus, multidisciplinary action is needed for the lesion to heal well. Tissue repair occurs in two ways: by the regeneration of functional activity of the tissue or by healing. This research is an experimental study aiming at comparing the effects of 2% papain, AGE and saline solution when used in circular skin lesions 2cm in diameter, with full thickness on the dorsum of EPM-I Wistar rats. Twelve male rats were used, divided into three groups: C1 (AGE group), C2 (control group) and C3 (papain group), all of them submitted to daily dressing changes after cleaning with bidistilled water solution. Based on the results obtained, we found that the product AGE, during the seven-day period, did not favor fibroblast expression, which can be explained by the intense adherence of cotton gauze to the lesion bed, thus impairing the histological material analyzed by immunohistochemistry. During the same phase, as regards collagen, we observed that treatment with 2% papain was at its lowest peak when compared to the other treatments, which can be attributed to its potentially sulfidric effect, thus wearing down the collagen fibers. According to the statistical method used, ANOVA, it was found that there was no significant difference between the treatments proposed in this research.

KEY WORDS: Scar healing ; collagen; papain; fibroblasts; AGE; skin; animals model; Wistar rats; immunohistochemistry; comparative study

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Foto confeco das leses cutneas ............................................................. 21 Figura 2 - Foto das leses cutneas ............................................................................................................................ 22 Figura 3 - Foto da mensurao das leses com paqumetro ......................................... 23 Figura 4 - Foto da evoluo das leses ................................................................................................................... 29 Figura 5 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com soro fisiolgico............................................................................................. 30 Figura 6 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com soro fisiolgico............................................................................................. 30 Figura 7- Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com soro fisiolgico..................................................................................................... 31 Figura 8- Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com soro fisiolgico..................................................................................................... 31 Figura 9 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com soro fisiolgico ..................................................................................... 32 Figura 10- Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com AGE.............................................................................................................. 32 Figura 11 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com AGE.............................................................................................................. 33 Figura 12 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com AGE...................................................................................................... 33 Figura 13 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com Papana ......................................................................................................... 34

Figura 14 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana ......................................................................................................... 34 Figura 15 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana ......................................................................................................... 35 Figura 16 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com Papana ................................................................................................. 35 Figura 17 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com AGE.............................................................................................................. 36 Figura 18 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com AGE...................................................................................................... 36 Figura 19 Quantificao de colgeno por unidade de rea / AGE.............................. 37 Figura 20 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com soro fisiolgico............................................................................................. 37 Figura 21 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com soro fisiolgico ..................................................................................... 38 Figura 22 - Quantificao de Colgeno por unidade de rea / Controle........................ 38 Figura 23 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com papana 2%. Picrosrius ................................................................................ 39 Figura 24 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com papana 2% Picrosrius ................................................................................. 39 Figura 25 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com papana 2%. Picrosrius ........................................................................ 40 Figura 26 - Quantificao de Colgeno por unidade de rea / Papana ......................... 40 Figura 27 - Quantificao de Colgeno por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos ................................................................................................... 41

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Figura 28 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com AGE............................................................ 42 Figura 29 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com AGE ............................................................. 42 Figura 30 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com AGE ................................................. 43 Figura 31 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com Soro Fisiolgico ......................................... 43 Figura 32 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Soro Fisiolgico ........................................... 44 Figura 33 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com Soro Fisiolgico............................... 44 Figura 34 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com Papana ....................................................... 45 Figura 35 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana......................................................... 45 Figura 36 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com Papana............................................. 46 Figura 37- Quantificao de fibroblasto por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos ................................................................................................... 46

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Quantificao de Colgeno por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos ................................................................................................... 41 Tabela 2 - Quantificao de fibroblasto por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos ................................................................................................... 47

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LISTA DE ABREVIATURAS

AGE DAB FGFr g HE MG ml TA UI

cidos graxos essenciais Diaminobenzidina Growth Factor Fibroblast Gramas Hematoxilina eosina Miligramas mililitros Temperatura ambiente Unidade Internacional

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SUMRIO
1 INTRODUO ..............................................................................................................1 2 REFERENCIAL TERICO ...........................................................................................4 2.1 Anatomia e fisiologia da pele...................................................................................4 2.2 A Fisiologia da Cicatrizao de Feridas...................................................................6 2.2.1 Introduo: ........................................................................................................6 2.2.2 Cicatrizao de feridas ......................................................................................6 2.2.3 Fase inflamatria...............................................................................................7 2.2.4 Fase proliferativa-nesta fase ocorre ..................................................................8 2.2.5 Fase de maturao .............................................................................................9 2.3 Fatores Locais e Sistmicos que podem influenciar no processo cicatricial ...........9 2.3.1 Relacionados ao agente lesivo ..........................................................................9 2.3.2 Relacionadas ao hospedeiro ..............................................................................9 2.3.3 Relacionados ao tratamento tpico da leso ...................................................10 2.4 Produtos para o tratamento de feridas ....................................................................11 2.4.1 Histrico..........................................................................................................11 2.4.2 Caractersticas dos principais recursos disponveis para auxiliar na cicatrizao de feridas ....................................................................................12 2.4.3 Novas tecnologias no tratamento de feridas ...................................................13 3 OBJETIVOS .................................................................................................................17 3.1 Objetivo Geral ........................................................................................................17 3.2 Objetivos Especficos.............................................................................................17 4 MATERIAL E MTODOS ..........................................................................................18 4.1 Parecer tico ...........................................................................................................18 4.2 Material ..................................................................................................................19 4.2.1 Animais utilizados e cuidados dispensados ....................................................19 4.3 Mtodos..................................................................................................................20 4.3.1 Fotografias ......................................................................................................20 4.3.2 Tcnica operatria...........................................................................................20 4.3.3 Tratamentos institudos ...................................................................................22 4.3.4 obteno de amostras das feridas ....................................................................23

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4.3.5 Preparo histolgico e imunohistoqumico.......................................................24 4.3.6 Anlise das imagens........................................................................................26 4.3.7 Programas utilizados .......................................................................................27 4.3.8 Testes Estatsticos Aplicados ..........................................................................27 5 RESULTADOS.............................................................................................................28 5.1 Avaliao macroscpica das feridas cutneas........................................................28 5.2 Avaliao histolgica .............................................................................................30 5.3 Avaliao Imunoistoqumica .................................................................................42 6 DISCUSSO ................................................................................................................48 7 CONCLUSO ..............................................................................................................54 8 REFERNCIAS............................................................................................................55 ANEXOS .........................................................................................................................58 Anexo 1 Testes estatsticos .......................................................................................59 Anexo 2 Banco de Dados..........................................................................................61 Anexo 3 Ofcio de aprovao do Comit de tica....................................................62 Anexo 4 Comprovante do envio do artigo original...................................................63 Anexo 5 Artigo original enviado a revista AMRIGS................................................65

Introduo

1 INTRODUO

O tratamento de feridas variou durante sculos com o objetivo de melhores resultados cicatriciais em menor tempo possvel. Em uma reviso de literatura, Andrade1 descreve que j na pr-histria vrios agentes como extratos de plantas, gua, neve, gelo, frutas e lama eram aplicados sobre as feridas. Na Mesopotmia, elas eram lavadas com gua ou leite e o curativo era realizado com mel ou resina. L de carneiro, folhas e cascas eram utilizadas para sua cobertura. Os egpcios concluram que as feridas fechadas cicatrizavam mais rpido, por isso utilizavam tiras de pano para sua cobertura. A introduo das armas de fogo nas guerras europias no sculo XIV levou ao surgimento de um novo tipo de ferida de cura mais difcil. O avano da qumica levou a descoberta de compostos de cloro e iodo que foram utilizados para a limpeza do material e da pele nos sculos 18 e 19.2 Uma ferida representada pela interrupo da continuidade de um tecido corpreo, em maior ou menor extenso, causada por qualquer trauma fsico, qumico, mecnico ou desencadeada por uma afeco clnica, que aciona as frentes de defesa orgnica contra o ataque.3

Introduo

Para obteno da evoluo adequada de qualquer tipo de ferida se faz necessrio o conhecimento do processo cicatricial. A cicatrizao envolve muitos eventos e situaes, exigindo conhecimento bsico de diversas reas, portanto uma atuao multidisciplinar se faz necessria para uma boa evoluo da leso. O reparo do tecido se d atravs de duas formas: pela regenerao da atividade funcional do tecido ou pela cicatrizao.4 O tratamento e o uso de curativos em uma variedade de leses apresenta grande desafio para os profissionais envolvidos. A seleo do curativo complexa, e as decises frequentemente precisam ser modificadas, baseadas nas condies das leses. Segundo Rogenski,5 existe atualmente em todo mundo, grande tendncia para o aproveitamento de recursos naturais na teraputica, por apresentarem vantagens econmicas, serem eficientes e apresentarem poucos efeitos nocivos sade. A papana e o AGE so uma dessas alternativas naturais e vm sendo utilizados com grande xito em vrias instituies hospitalares para o tratamento dos mais diversos tipos de feridas. A papana uma enzima derivada do vegetal Carica papaya, que tem a propriedade de decompor substncias proticas. Como efeito teraputico, apresenta caractersticas bactericida/bacteriosttico, antiinflamatrio, debridante qumico e bioestimulante, promovendo alinhamento das fibras colgenas evitando a formao de quelides.6

Introduo

cidos graxos essenciais (AGE) so lipdios insaturados ricos em cido linolico. Apresentam poder quimiottico para leuccitos, promovem proliferao e mitose celular. Tem ao estimulante para desbridamento autoltico. Com base deste conhecimento e por utilizar estes dois produtos na prtica diria do tratamento de leses cutneas de pacientes internados no HSL PUCRS, foi que surgiu por parte da autora o interesse em comparar a eficcia de cada um desses produtos, quando utilizados em leses semelhantes, realizadas no dorso de ratos da linhagem Wistar EPM 1 com peso e idade iguais, para que, aps a concluso do experimento possamos indicar com segurana qual produto apresenta melhor resultado cicatricial.

Referencial Terico

2 REFERENCIAL TERICO

2.1 Anatomia e fisiologia da pele A pele o maior rgo do corpo. Sendo a maior interface entre o corpo e o ambiente, adaptada para servir a muitas funes diferentes. Ela est constantemente relacionada com atividades biolgicas e bioqumicas. A pele composta de duas camadas primrias. A camada externa, a epiderme, uma camada epitelial. A camada interna, a derme, uma camada de tecido conjuntivo. A epiderme ligada derme pela camada basal. A rea entre a epiderme e a derme possui interdigitaes que evitam o descolamento das duas durante tenses externas.7 A epiderme composta de vrias camadas. O estrato crneo, camada fina e mais externa da epiderme, composto de clulas desvitalizadas e queratinizadas. seca, impermevel a gua e rica na protena protetora chamada queratina. As camadas seguintes da epiderme (estrato lcido, estrato basal, estrato granuloso e estrato germinativo) contm clulas. A epiderme uma camada protetora que proporciona uma barreira a leses, contaminao e luz. Ela tambm evita a desidratao dos tecidos

Referencial Terico

subjacentes, retm fluidos e nutrientes dentro da pele e produz melanina, a qual responsvel pela cor da pele.7 A derme composta primariamente de tecidos conjuntivos fibrosos de colgeno e elastina. Estas fibras esto entremeadas dentro de uma matriz de polissacardeos e proporcionam fora e elasticidade a pele. Os folculos pilosos, glndulas sebceas e glndulas sudorparas esto contidos na derme. Uma rede de linfticos, vasos sanguneos e terminaes nervosas cutneas suprem os anexos da pele.7 A derme produz plos, regula a temperatura do corpo, abriga receptores sensoriais, supre nutrientes, oxignio e sintetiza vrias substncias qumicas. Ela composta por fibroblastos, colgeno, substncia matricial e protenas de elastina. Abaixo da derme h tecido conjuntivo frouxo e tecido adiposo, chamados de camada subcutnea. Ela proporciona isolamento, suporte e amortecimento para a pele e outros tecidos, a fim de suportar tenses e presses. Ela tambm armazena energia para a pele. Abaixo desta camada, esto localizados fscia e msculos que proporcionam amortecimento adicional por sobre as estruturas sseas.

Referencial Terico

2.2 A Fisiologia da Cicatrizao de Feridas

2.2.1 Introduo:

A reparao tecidual um processo complexo, pelo qual todas as feridas cicatrizam na mesma seqncia de eventos, incluindo induo ao processo inflamatrio agudo pela prpria leso, regenerao de clulas parnquimatosas, migrao e proliferao do tecido cognitivo, sntese de protenas, remodelao do tecido cognitivo e componentes parenquimatosos, colagenizao e aquisio de fora tensional.8

2.2.2 Cicatrizao de feridas

O processo fisiolgico de reparao tecidual pode ser dividido em trs fases: inflamatria, proliferativa e remodeladora. Estes trs estgios duram perodos de tempo variveis, o que exige do profissional que atua nesta especialidade do cuidado ao ser humano um conhecimento profundo, de forma a adequar sua avaliao e conduta, proporcionando a facilitao deste processo.

Referencial Terico

2.2.3 Fase inflamatria

A resposta inflamatria uma reao local no especfica leso do tecido e/ou invaso bacteriana. uma parte importante dos mecanismos de defesa do corpo, e fase essencial do processo de cicatrizao. Os sinais de inflamao foram descritos pela primeira vez por Celsus no sculo primeiro da era crist, como vermelhido, calor, dor e inchao.9 Esta fase tem as funes de ativar o sistema de coagulao, promover o debridamento da ferida e defesa contra microrganismos. composta por trs outras fases que ocorrem quase que simultaneamente: Fase tromboctica - a hemostasia a primeira resposta leso e se caracteriza pela vasoconstrio. Os trombcitos so responsveis pela agregao plaquetria e ativao da cascata de coagulao. Fase granuloctica nesta fase os granulcitos liberam enzimas proteolticas mediadoras (colagenases, elastases e hidrolases cidas); H aumento do fluxo sanguneo (vasodilatao); perda de lquidos, protenas e clulas pelos capilares (produo de exsudato); ocorre a quimiotaxia (atrao de macrfagos) e a fagocitose (os neutrfilos e macrfagos digerem as bactrias e restos celulares). Fase macrofgica nesta fase h o incio da reparao, onde os macrfagos secretam proteases, fatores de crescimento e substncias vasoativas que do

Referencial Terico

continuidade ao processo de debridamento e exercem a funo de controle central das fases de cicatrizao subsequentes.

2.2.4 Fase proliferativa-

Granulao a formao de um tecido novo composto de capilares, colgeno e proteoglicans. A formao de capilares nesta fase resulta da liberao de fatores angiognicos secretados pelos macrfagos que estimulam a proliferao de clulas endoteliais dos vasos sanguneos. Nesta fase h produo de colgeno pelos fibroblastos. Segundo Simes e col.,10 o fibroblasto pode ser considerado uma clula adaptativa, podendo realizar vrias funes como uma clula reguladora devido dupla funo de sntese e reabsoro de colgeno, mantendo o equilbrio quantitativo e qualitativo desta protena. Epitelizao nesta fase as principais prioridades so a formao de um tecido conjuntivo novo e epitelizao. Ela caracteriza-se pela reduo da capilarizao e aumento do colgeno.

Referencial Terico

2.2.5 Fase de maturao

Nesta fase ocorre a remodelao do colgeno e reduo da capilarizao. A cicatriz torna-se mais clara e plana.

2.3 Fatores Locais e Sistmicos que podem influenciar no processo cicatricial

O perodo cicatricial depende de vrios fatores locais e sistmicos que podem influenciar prejudicialmente o processo cicatricial.

2.3.1 Relacionados ao agente lesivo

A. Extenso da leso: tamanho, quantidade, penetrao, potencial de produo de doena do agente invasor. B. Durao e persistncia da leso: durao da exposio ao agente lesivo, corpos estranhos resistentes a digesto pelas enzimas orgnicas.

2.3.2 Relacionadas ao hospedeiro

A. Fatores locais: desvitalizao e necrose tecidual, infeco, corpo estranho, hematoma, edema, seroma e tenso na linha de sutura.

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B. Fatores sistmicos: m oxigenao e baixo suprimento de sangue, doenas metablicas, desnutrio, deficincias de vitaminas e de protenas, uso de drogas citotxicas, corticides ou anti-inflamatrios e idade.

2.3.3 Relacionados ao tratamento tpico da leso

- Utilizao de sabes para limpeza: estas substncias possuem grupos hidroflicos e lipofilicos que diminuem a tenso superficial das clulas e afetam a permeabilidade da membrana celular. - Utilizao de solues anti-spticas: nas concentraes clnicas, estes solues so txicas para as clulas envolvidas no processo de cicatrizao. Sua capacidade bactericida comprometida na presena de exsudato e est diretamente relacionada a concentrao que, quanto mais elevada, maior a capacidade de citotoxidade. - Indicao de coberturas inadequadas; - Tcnica incorreta para execuo de curativos;

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2.4 Produtos para o tratamento de feridas

2.4.1 Histrico

As medicaes tpicas tm sido usadas atravs de sculos para uma variedade de razes reais ou imaginrias, de expulsar maus espritos ou evocar o pus laudanoso at promover a cicatrizao. Na histria antiga, o tratamento de feridas mudava a cada teoria em voga. Em uma reviso de literatura, Andrade1 descreve que j na pr-histria vrios agentes como extratos de plantas, gua, neve, gelo, frutas e lama eram aplicados sobre as feridas. Na Mesopotmia elas eram lavadas com gua ou leite e o curativo era realizado com mel ou resina. L de carneiro, folhas e cascas de rvores eram utilizadas para suas coberturas. Os egpcios concluram que uma ferida fechada cicatrizava mais rpido do que aberta, por isso utilizavam tiras de pano para manter unidas as margens da leso. Hipcrates sugeria que as feridas contusas fossem tratadas com calor e pomadas para promover a supurao, remover material necrtico e reduzir a inflamao. No incio da era crist, Celsus preconizava o fechamento primrio das feridas recentes e debridamento das contaminadas para posterior sutura. A introduo de armas de fogo nas guerras europias no sculo 14 levou ao surgimento de um novo tipo de ferida, de cura mais difcil, e Ambroise de Par na renascena reformulou seu tratamento. O avano da qumica levou a descoberta de composto de cloro e iodo que foram utilizados para limpeza de material e da pele nos

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sculos 18 e 19. Mais recentemente, as infeces, tratamento de leses tem apresentado melhores resultados medida que as decises vo sendo cada vez mais baseadas em evidncias cientficas.

2.4.2 Caractersticas dos principais recursos disponveis para auxiliar na cicatrizao de feridas

Dealey9 refere que as qualidades de um produto eficaz para o tratamento de feridas, ou seja, as caractersticas do curativo ideal, so as seguintes: - Manter a umidade na interface da ferida/curativo- em um ambiente mido as clulas epiteliais conseguem deslizar pela superfcie da leso, alm disso, o ambiente mido intensifica os processos autolticos naturais, decompondo o tecido necrtico e tambm proporciona reduo da dor no local da ferida, porque as terminaes nervosas no sofrem ressecamento. - Permitir troca gasosa - a cobertura dever ser permevel suficiente para permitir a entrada de oxignio suficiente para a realizao do processo de mitose e excreo de gs carbnico. - Remover excesso de exsudato - embora a superfcie da ferida deva permanecer mida, a umidade excessiva causa macerao do tecido da pele circundante.

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- Iseno de partculas txicas - pesquisas usando feridas experimentais em modelos animais demonstraram que os anti-spticos tm efeitos txicos, os quais precisam ser ponderados em relao s vantagens obtidas em seu uso. - Isolamento trmico - para que as clulas realizem mitose necessrio que o leito da ferida mantenha temperatura entre trinta e seis e trinta e sete graus. Toda vez que o leito for resfriado, ou seja quando ocorre a utilizao de solues geladas na leso h um retardo no processo de cicatrizao desta ferida. - Ser impermevel bactrias - todos curativos devem possuir alguma propriedade antibacteriana. Alguns deles tm elementos constituintes que so bactericidas, enquanto outros criam uma barreira entre a ferida e o ambiente. - Permitir a remoo sem causar trauma - se um curativo for de fcil remoo, ele provavelmente no causar leso aos tecidos recm-formados na ferida e tampouco ser doloroso para o paciente.

2.4.3 Novas tecnologias no tratamento de feridas

Abaixo esto enumeradas as principais categorias de coberturas para feridas disponveis no Brasil: - cidos Graxos Essenciais (AGE) - encontram-se nesse grupo, trs sub-grupos: derivados do cido linolico, derivados do cido linolico com lanolina e derivados do

Referencial Terico

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cido ricinolico da mamona. Tm ao sobre a membrana celular, aumentando sua permeabilidade, promovem mitose e proliferao celular, estimulam a neoangiognese, apresentam quimiotaxia para leuccitos, facilitam a entrada de fatores de crescimento, auxiliam o desbridamento autoltico e possuem ao bactericida para S. ureos. - Alginato de clcio - so fibras de no tecido, impregnadas de alginato de clcio e sdio, extradas de alga marinha Laminaria. Indicado para o uso em feridas superficiais, com perda parcial de tecido ou leses cavitrias, altamente exsudativas. Auxilia o desbridamento autoltico, diminui o exsudato e o odor da ferida. - Anti-spticos e degermantes - indicados para remoo de resduos como fezes, restos de coberturas e desodorizao. Agem limpando as reas prximas da ferida pela ao detergente, desodorizante e mecnica. Mantm o pH natural, controlam a colonizao bacteriana e podem auxiliar na reduo do odor. - Carvo ativado e prata - utilizado para feridas infectadas, exsudativas, superficiais ou profundas, ftidas. Remove o excesso de exsudato da ferida por adsoro, bactericida, diminui o odor, pode ser utilizado juntamente com o AGE. - Filmes semipermeveis - pelcula de poliuretano utilizada em feridas secas, queimaduras, como cobertura secundria e proteo de reas de risco lesional. So permeveis ao oxignio e vapor mido. - Hidropolmeros - almofadas compostas de hidropolmeros. Indicado para feridas exsudativas, limpas. Mantm meio mido e auxiliam o desbridamento autoltico. Removem o excesso de exsudato e reduzem o odor da ferida.

Referencial Terico

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- Hidrogel - so gis transparentes utilizados para a remoo de tecido desvitalizado, queimaduras de primeiro e segundo graus, reas doadoras e receptoras de enxertos. Mantm o meio mido ideal, favorece a angiognese e promovem o desbridamento autoltico. - Hidrocolides - so coberturas que contm gelatina e pectina em seu interior. Utilizadas em feridas secas com ou sem necrose. Auxiliam o desbridamento autoltico e estimilam a angignese. Podem ser usados com AGE. - Enzimas Proteolticas - Apresentam-se sob a forma de p, pomadas ou cremes, utilizadas em muitos tipos de curativos. Entre as enzimas mais utilizadas podemos citar a colagenase, a fibrinolisina e a papana. A colagenase e a fibrinolisina so enzimas que agem de forma seletiva, promovendo o desbridamento enzimtico de forma suave, sobre os tecidos desvitalizados. A papana uma enzima proteoltica, constituda por um conjunto de proteases sulfdricas, extradas da planta carica papaya. Sua utilizao em feridas tem sido amplamente estudada por pesquisadores quanto a sua ao e ao estabelecimento de protocolos para sua aplicao em diversos tipos de leses. Pode ser manipulada ou encontrada comercialmente. Indicado seu uso para todas as fases do processo cicatricial, para uso em feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou sem necrose. Normalmente so indicadas nas concentraes de 2% (feridas com tecido de

Referencial Terico

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granulao), 4% a 6% (exsudato purulento) e 10% (tecido necrtico). Promove desbridamento qumico, granulao e epitelizao, estimula a fora tnsil das cicatrizes. - Curativo com gaze simples- as maiores vantagens dos curativos de gaze so seu baixo custo, a facilidade de uso e o fato de estarem disponveis na maioria das instituies. Tm pouca capacidade de absoro do exsudato, exigem trocas freqentes, precisam de cobertura secundria e fixao e podem provocar macerao das reas adjacentes, devido a extravasamento de lquidos. - Curativos de Gaze no aderente- h dois tipos de gaze no aderente: o impregnado e o no impregnado. As gazes impregnadas podem ser com petrolato, PVPI, com AGE e com aloe Vera. As gazes no impregnadas tem funo de absorver exsudato. Evitam aderncia do curativo ferida, evitando a dor durante a troca. Indicadas em queimaduras superficiais, reas cruentas, ps-traumas, feridas com formao de tecido de granulao. - Matriz de regenerao drmica- derivada da polimerizao do colgeno e glicosaminoglicanos, promove crescimento celular e sntese de colgeno. indicada para feridas limpas e queimaduras. - Colgeno biolgico- partculas hidroflicas de colgeno de origem bovina. Indicado para feridas em qualquer fase do processo de cicatrizao, podendo ser usado em feridas infectadas ou colonizadas. Remove o excesso de exsudato, diminui a inflamao local e o edema e acelera o processo cicatricial.

Objetivos

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3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

O objetivo deste estudo encontra-se em comparar os efeitos da utilizao de papana, AGE e soro fisiolgico em leses cutneas no dorso de ratos da linhagem EPMI Wistar.

3.2 Objetivos Especficos

Verificar a concentrao de colgeno e fibroblastos presentes nas feridas de ratos, no terceiro, stimo e dcimo-quinto dias da cicatrizao durante a teraputica com papana, AGE e soro fisiolgico. Analisar a concentrao de colgeno e fibroblastos presentes nas feridas tratadas com Papana, AGE e soro fisiolgico.

Material e Mtodos

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4 MATERIAL E MTODOS

4.1 Parecer tico

Este estudo foi aprovado em vinte e trs de maro de dois mil e sete, pelo Comit de tica em Pesquisa da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do sul, protocolo 06/03433. Todos os procedimentos adotados, durante as tcnicas, envolvendo os animais, esto de acordo com o que preconiza o Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (CPEA) do Centro de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CDCT) da Fundao Estadual de Produo e Pesquisa em Sade (FEPPS) do Rio Grande do Sul.

Material e Mtodos

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4.2 Material

4.2.1 Animais utilizados e cuidados dispensados

Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizados doze ratos heterognicos da linhagem EPM-I Wistar criados e mantidos, sob condies do biotrio convencional, na Coordenao de Produo e Experimentao Animal (CPEA) do Centro de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CDCT) da Fundao Estadual de Produo e Pesquisa em Sade (FEPPS) do Rio Grande do Sul. Todos animais utilizados foram machos entre oito e dez semanas de idade. Antes e durante a fase experimental, estes animais receberam como alimentao rao balanceada padro para roedores, gua ad libitum e foram mantidos em gaiolas individuais, devidamente identificadas com fotoperodo de doze horas claro e doze horas escuro (06:00/18:00), no laboratrio de Cirurgia Experimental da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, sob condies de biotrio convencional. Os animais foram distribudos por sorteio em trs subgrupos de acordo com o perodo de observao (3, 7 e 15 dias de ps operatrio), com quatro animais em cada subgrupo.

Material e Mtodos

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4.3 Mtodos

4.3.1 Fotografias

As fotografias foram registradas com uma mquina fotogrfica digital Sony DSC W5, 5,1 megapixels e utilizou-se flash para todas elas, mesmo diante de luz artificial (lmpadas fluorescentes 6400K, intensidade de X lux). As fotos foram tiradas a uma distncia de cinquenta centmetros com lente de macro, em ngulos variados.

4.3.2 Tcnica operatria

Os ratos foram, depois de pesados, pr-medicados com sulfato de atropina, na dose de 0,44mg/100g por via subcutnea, aps anestesiados com soluo final de Cloridrato de Xilazina 2% (Rompun, Bayer Animal Health) e Cloridrato de Ketamina 10% (Dopalen, Agribrands Brasil ltda.) diludos a 2mg/ml e 10mg/ml de soluo salina (Alcon, Alcon Labs. do Brasil ltda.-8ml/0,9%) respectivamente. Houve administrao de uma dose nica de 0,2ml para cada 100g de peso corporal por via intraperitoneal, suficiente para abolir a dor e realizar o procedimento em tempo hbil. Aps anestesia, os ratos foram posicionados em decbito ventral horizontal em mesa apropriada e realizada tricotomia em regio dorsal com lmina. Seguida de antisepsia com lcool etlico 70%.

Material e Mtodos

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Para demarcao da pele a ser retirada, utilizou-se caneta hidrogrfica de cor azul marinho e aps com uso de tesoura cirrgica foram excisados trs fragmentos cutneos de dois centmetros de dimetro, no centro da rea epilada, at a exposio da fscia muscular dorsal. A hemostasia foi realizada por compresso digital, utilizando-se gaze esterilizada.

Figura 1 Foto confeco das leses cutneas

Material e Mtodos

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Figura 2 Foto das leses cutneas

4.3.3 Tratamentos institudos

As coberturas foram aplicadas sobre as trs leses. Assim as leses foram denominadas C1, C2 e C3 (seguindo o sentido crnio-caudal, respectivamente) onde: - C1 recebeu gaze de algodo embebida com cidos Graxos Essenciais (VDeclair, Neve LTDA, Brasil) base de leo de girassol, composto por cido linoleico, cido cprico, vitamina A, vitamina E . - C2 recebeu gaze de algodo embebida em soluo salina 0,9%, pois representou o grupo controle. - C3 recebeu gaze de algodo embebida em soluo de papana a 2% (Papana 6.000 UI/mg, Wall-Indl, Brasil). Para obteno desta soluo diluiu-se um grama de p de papana em cinquenta mililitros de gua Bidestilada.

Material e Mtodos

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As coberturas foram ocludas com gaze de algodo seca e fixadas a pele com cobertura adesiva estril (IV fix, 3M do Brasil). Os animais foram mantidos em suas gaiolas e seus curativos trocados a cada vinte e quatro horas. Por ocasio da troca dos curativos, as leses foram medidas e fotografadas.

Figura 3 Foto da mensurao das leses com paqumetro

4.3.4 obteno de amostras das feridas

A coleta de amostras das feridas, no primeiro grupo, foi realizada no terceiro dia aps a realizao das leses. Os animais foram posicionados em decbito ventral, anestesiados com soluo final de Cloridrato de Xilazina 2% (Rompun, Bayer Animal Health) e Cloridrato de Ketamina 10% (Dopalen, Agribrands Brasil ltda.) diludos a 2mg/ml e 10mg/ml de

Material e Mtodos

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soluo salina (Alcon, Alcon Labs. do Brasil ltda.-8ml) 0,9ml administrados respectivamente. Houve administrao de uma dose nica de 0,2ml para cada 100g de peso corporal por via intraperitoneal, suficiente para abolir a dor e realizar o procedimento em tempo hbil. Foi feita bipsia incisional da ferida, por exciso da rea total da leso e aps eutansia do animal biopsiado, com injeo de 0,2 ml de quetamina no pericrdio. As amostras de feridas foram colocadas em frascos de formol a 10%, identificados e armazenados. Este processo repetiu-se no stimo dia aps realizao das feridas, no segundo grupo e no dcimo quinto dia, no terceiro grupo.

4.3.5 Preparo histolgico e imunohistoqumico

Os fragmentos biopsiados nos terceiro, stimo e dcimo quinto dia foram fixados em formol a 10% e encaminhados para o processamento histolgico convencional constando de desidratao com lcool, diafanizao em Xilol e incluso em parafina. Os blocos foram cortados em micrtomo rotativo com cortes de cinco micrmetros de espessura e submetidos colorao com Hematoxilina e Eosina (HE), Picrosrius (para visualizao e quantificao do colgeno sob luz polarizada) e imunohistoqumica para quantificao da expresso de FGFr (Growth Factor fibroblast), permitindo a avaliao da quantidade de colgeno.

Material e Mtodos

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Para confeco, as lminas foram incubadas em estufa histolgica por uma hora, seguido de desparafinizao em Xilol (duas trocas de cinco minutos) lcool absoluto (cinco trocas de dois minutos). Para a confeco do HE utilizou-se Hematoxilinatrans, por um minuto, e Eosina, por quatro minutos, seguido de desidratao em lcool, clarificao em Xilol e montagem das lminas em meio sinttico (Blsamo do Canad). Para preparo do Picrosrius, aps desparafinizao, as lminas foram incubadas por uma hora em Soluo de picrosrius, lavadas abundantemente em gua corrente, incubadas por dois minutos em Soluo Light green 0,5%, para colorao do contraste e secas em estufa histolgica, at completa secagem. Aps, foram montadas em meio sinttico (Blsamo do Canad). Para realizao da imunohistoqumica, aps desparafinizao utilizou-se a tcnica de imunoperoxidase. Foi realizada recuperao antignica em tampo Tris/Edta pH 9,0 por quarenta minutos, seguidos de trs lavagens de cinco minutos com soluo tampo PBS. Aps, fez-se o bloqueio de Peroxidase Endgena utilizando-se gua Oxigenada 3% diluda em metanol e incubado por trinta minutos em temperatura ambiente. Seguido disso, foram realizadas trs lavagens de cinco minutos com Soluo tampo PBS. Para o bloqueio de ligaes inespecficas e reduo do background (colorao de fundo), utilizou-se leite em p desnatado a 5% em Soluo tampo PBS por trinta minutos, seguidos de trs lavagens de cinco minutos com Soluo tampo PBS.

Material e Mtodos

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O anti-corpo Anti-FGF (Goot polyclonal Igg, Santa Cruz Biotechnology, SC 1884 ) foi diludo 1:200 UI e incubado overnight a 5C. Como anti-corpo secundrio utilizou-se Rabbit (anti-goat Igg HRP Conjugate, Invitrogen, Carls bad, CA) diludo 1:200 e incubado por uma hora em temperatura ambiente, seguido de trs lavagens de cinco minutos com Soluo tampo PBS. A reao imunohistoqumica foi revelada com cromgeno DAB

(Diaminobenzidina, Dako, Carpinteria, USA) por dez minutos e lavados em gua destilada. Foi contracorado com hematoxilina trans por um minuto, incubado por trinta segundos em soluo de Hidrxido de Amnia 0,5%, lavado em gua corrente, desidratado em lcool etlico e Xilol e montado em meio sinttico (Blsamo do Canad).

4.3.6 Anlise das imagens

Foi utilizado microscpio Zeiss Axioskop 40 com ptica planeofluar e aumento de 400X, acoplado a sistema de captura de imagem e anlise Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, EUA). As contagens foram realizadas por mtodo planimtrico (Gundersen, HJ et al.), sendo os resultados expressos em rea de fibrose (quantificao de colgeno por colorao de picrosrius sob luz polarizada e proliferao tecidual (FGFR por reao imunoistoqumica por micrmetros quadrados e a intensidade de colorao por densidade ptica integrada.

Material e Mtodos

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Foi realizada tambm a contagem das reaes imunohistoqumicas por tcnica de anlise de imagem digital (sistema Image Pro Plus 6.0, Media Cybernetics, EUA), permitindo a avaliao estatstica dos resultados por mtodos paramtricos.

4.3.7 Programas utilizados

Excel- utilizado para digitao dos dados SPSS 12.0 Programa utilizado para realizar as anlises

4.3.8 Testes Estatsticos Aplicados

Anlise de varincia com medidas repetidas. Foi considerado significativamente estatstico um valor de p<0.05.

Resultados

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5 RESULTADOS

5.1 Avaliao macroscpica das feridas cutneas

Durante o experimento, as feridas cutneas de todos os animais no apresentaram sinais de infeco. Os exames macroscpicos e fotogrficos dirios demonstraram reduo do dimensionamento da rea lesada, no sendo encontrado diferena significativa entre os tratamentos estabelecidos. As feridas apresentaram bordas arredondadas e bem definidas durante o tratamento ao qual foram expostos, diferindo o grupo controle somente na presena maior de crosta, o que se identifica nas figuras das leses do stimo e dcimo quinto dia. Tambm foi identificado aderncia da gaze no leito da ferida no grupo AGE ocasionando trauma no tecido cicatricial presente a cada troca de curativos.

Resultados

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Dias

AGE

Controle
(soro fisiolgico)

Papana

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Figura 4 Foto da evoluo das leses

Resultados

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5.2 Avaliao histolgica

Figura 5- Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com soro fisiolgico. A amostra apresenta-se com tecido de reparo, recoberta por crosta. Colorao HE e aumento de 50x. (seta azul indica crosta)

Figura 6 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com soro fisiolgico. A amostra apresenta-se com importante infiltrado inflamatrio, edema associado e presena de crosta. Colorao HE e aumento de 50x. (seta verde indica infiltrado inflamatrio; seta preta indica edema).

Resultados

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Figura 7- Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com soro fisiolgico. A amostra apresenta-se com reduo do edema e recoberta por crosta. Colorao HE e aumento de 50x. (seta azul indica crosta).

Figura 8- Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com soro fisiolgico. A amostra apresenta-se com edema. Colorao HE e aumento de 50x. (seta preta indica edema)

Resultados

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Figura 9 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com soro fisiolgico. A amostra apresenta-se com presena de crostas e epitelizao. Colorao HE e aumento de 100x. (seta roxa indica epitelizao).

Figura 10- Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com AGE. A amostra apresenta-se com importante infiltrado inflamatrio, edema associado e presena de crosta. Colorao HE e aumento de 50x. (seta azul indica crosta; a seta verde indica infiltrado inflamatrio)

Resultados

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Figura 11 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com AGE. A amostra apresenta-se com importante infiltrado inflamatrio, edema associado, presena de crosta e angiognese. Colorao HE e aumento de 50x. (seta branca indica angiognese; seta preta indica edema; seta azul indica crosta; seta verde indica infiltrado inflamatrio).

Figura 12 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com AGE. A amostra apresenta-se com crosta e epitelizao. Colorao HE e aumento de 100x. (seta roxa indica epitelizao).

Resultados

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Figura 13 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com Papana. A amostra apresenta-se com infiltrado inflamatrio, edema intenso associado e angiognese. Colorao HE e aumento de 50x. (seta preta indica infiltrado inflamatrio).

Figura 14 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana. A amostra apresenta-se com crosta e angiognese. Colorao HE e aumento de 50x. (seta azul indica crosta).

Resultados

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Figura 15 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana. A amostra apresenta-se com infiltrado inflamatrio, angiognese, edema associado e epitelizao. Colorao HE e aumento de 50x (seta branca indica angiognese; seta preta indica edema).

Figura 16 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com Papana. A amostra apresenta-se com evidente epitelizao. Colorao HE e aumento de 50x. (seta roxa indica epitelizao)

Resultados

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Figura 17 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com AGE. Picrosrius 50x. (seta preta indica a expresso de fibras colgenas por unidade de rea).

Figura 18 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com AGE. Picrosrius 50x. (seta preta indica a expresso de fibras colgenas por unidade de rea).

Resultados

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Observa-se nas figuras 17 e 18 um visvel aumento nas fibras colgenas, o que ir se comprovar no grfico abaixo:
Quantificao de colgeno por unidade de rea / AGE
85.000 84.500 Colgeno 84.000 83.500 83.000 82.500 82.000 81.500 3 7 Tempo (Dias) 15 Colgeno

Figura 19 Quantificao de colgeno por unidade de rea / AGE

Figura 20 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com soro fisiolgico. Picrosrius 50x. (seta preta indica a expresso de fibras colgenas por unidade de rea).

Resultados

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Figura 21 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com soro fisiolgico. Picrosrius 50x. Observa-se nas figuras 20 e 21 um decrscimo da rea de fibras colgenas sob luz polarizada.

Quantificao de Colgeno por unidade de rea / Controle

86.000 84.000 Colgeno 82.000 80.000 78.000 76.000 74.000 3 7 Tempo (Dias) 15 Controle (Soro Fisiolgico)

Figura 22 Quantificao de Colgeno por unidade de rea / Controle

Resultados

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Figura 23 - Microscopia da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com papana 2%. Picrosrius. Aumento de 50x.

Figura 24 - Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com papana 2% Picrosrius. Aumento de 50x.

Resultados

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Figura 25 - Microscopia da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com papana 2%. Picrosrius. Aumento de 50x.

Quantificao de Colgeno por unidade de rea / Papana

88.000 86.000 84.000 82.000 80.000 78.000 76.000 74.000 72.000 70.000 3 7 Tempo (Dias) 15

Colgeno

Colgeno

Figura 26 Quantificao de Colgeno por unidade de rea / Papana Na tabela acima observa-se um decrscimo de fibras colgenas na fase inflamatria(7 dias) e um aumento na fase de maturao(15 dias).

Resultados

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Colgeno
88.000 86.000 84.000 82.000 80.000 78.000 76.000 74.000 72.000 70.000 3 7 Tempo (dias) AGE Controle (Soro Fisiolgico) Papana 15

Figura 27 - Quantificao de Colgeno por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos

Valores (colgeno)

Tabela 1- Quantificao de Colgeno por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos

COLGENO Tratamento AGE Tempo (dias) 3 Mdia

84.403 82.570 84.545 85.371 82.286 78.424 86.624 75.614 82.142

Desvio Padro
3.364 7.127 2.417 3.364 7.127 2.417 3.364 7.127 2.417

95% Intervalo de Configurao

Mnimo
76.794 66.449 79.077 77.761 66.164 72.956 79.014 59.492 76.674

Mximo
92.013 98.692 90.012 92.981 98.408 83.891 94.233 91.736 87.609

Controle

Papana

15

Resultados

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5.3 Avaliao Imunoistoqumica

Figura 28 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com AGE (seta vermelha indica citoplasma do fibroblasto).

Figura 29 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com AGE (seta vermelha indica citoplasma do fibroblasto).

Resultados

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Figura 30 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com AGE (seta vermelha indica citoplasma do fibroblasto).

Figura 31 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com Soro Fisiolgico (seta vermelha indica expresso do citoplasma do fibroblasto por unidade de rea).

Resultados

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Figura 32 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Soro Fisiolgico (seta vermelha indica expresso de citoplasma do fibroblasto por unidade e rea).

Figura 33 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com Soro Fisiolgico (seta vermelha indica expresso de citoplasma do fibroblasto por unidade de rea).

Resultados

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Figura 34 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no terceiro dia de tratamento com Papana (seta vermelha indica expresso de citoplasma do fibroblasto por unidade de rea).

Figura 35 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana (seta vermelha indica expresso de citoplasma do fibroblasto por unidade de rea).

Resultados

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Figura 36 - Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no dcimo quinto dia de tratamento com Papana (seta vermelha indica expresso de citoplasma do fibroblasto por unidade de rea).

Fibroblastos
4.000 3.500 Valor (Fibroblasto) 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 500 0 3 7 Tempo (dias) AGE Controle (Soro Fisiolgico) Papana 15

Figura 37- Quantificao de fibroblasto por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos

Resultados

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Tabela 2 - Quantificao de fibroblasto por unidade de rea na utilizao dos trs tratamentos FIBROBLASTOS Tratamento AGE Tempo (dias) 3 Mdia
2.607 0.901 3.393 1.737 2.752 1.437 2.211 2.905 2.741

Desvio Padro
0.497 0.718 0.680 0.497 0.718 0.680 0.497 0.718 0.680

95% Intervalo de Configurao

Mnimo
1.484 -0.722 1.854 0.613 1.128 -0.102 1.087 1.281 1.202

Mximo
3.371 2.525 4.932 2.860 4.375 2.975 3.334 4.528 4.280

Controle

Papana

15

Discusso

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6 DISCUSSO

Qualquer perda de continuidade das partes moles, com ou sem comprometimento das funes locais, seja recente ou no, com cicatrizao imediata ou crnica, uma ferida e o corpo inicia sua reparao imediatamente aps o dano. 2 A cicatrizao constitui fenmeno qumico, fsico e biolgico, possuidora de vrias fases que se superpem e se relacionam reciprocamente, constituindo um processo harmnico, nico e contnuo. 11 Das fases de cicatrizao destaca-se a de fibroplasia notada quarenta e oito horas aps a execuo da leso, caracterizada pela invaso de fibroblastos que se multiplicam, proliferam e passam a secretar as protenas caractersticas do tecido em reparao. 12 O fibroblasto produz a substncia fundamental amorfa-mucopolissacardeos envolvidos com a produo e orientao das fibras colgenas bem como o tamanho. Este estudo se props a comparar o uso de papana e AGE na cicatrizao de feridas, tendo como base do estudo a proliferao de fibroblastos, sendo estes as clulas

Discusso

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responsveis pela formao de colgeno e da matriz extracelular presente no tecido conjuntivo. A opo em se usar o soro fisiolgico (C2) como controle do processo cicatricial foi para ter-se um grupo sem qualquer interferncia medicamentosa. O rato foi o modelo experimental mais conveniente, devido ao seu tamanho e fcil disponibilidade. Skottner e cols,13 em modelo experimental, estudando a cicatrizao de feridas, observaram que em ratos normais a cicatrizao se completava com dezesseis dias. Com relao a avaliao histolgica e imunoistoqumica foram observados no terceiro dia de processo cicatricial grande infiltrado inflamatrio associado a edema importante na aplicao dos tratamentos propostos. Presena de crosta evidenciada no uso de AGE e soro fisiolgico. Com o uso do produto papana 2% encontramos uma maior quantificao de colgeno conforme grfico 3. Stimo dia: foi observado no local da leso reduo do edema, angiognese, presena de crosta e discreta epitelizao apresentando uma queda na concentrao de colgeno, o que desfavoreceu a ao dos trs tratamentos, sendo que o tratamento com papana 2% apresentou menor concentrao de colgeno nesta fase. Conseqentemente observou-se um aumento na expresso de fibroblastos com os tratamentos papana 2% e soro fisiolgico, sendo identificado o pico mximo nesta fase. Verificando ento que o tratamento com papana 2% apresentou maior concentrao de fibroblastos, diferindo do tratamento com AGE onde evidenciou-se um decrscimo importante dos mesmos. Acredita-se que esse achado esteja relacionado a intensa aderncia da gaze de algodo

Discusso

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com AGE no leito da leso, pois durante o processo de trocas dirias de curativos observou-se retiradas da crosta e inmeros traumas em tecido vivel, prejudicando o processo de reparao tecidual., Estes resultados coincidem com os achados de Neto et al,14 no qual, em relao aos fibroblastos, a anlise estatstica (ANOVA) mostrou, para os tratamentos com soro fisiolgico e papana, que os valores sofreram a partir do terceiro dia um aumento, com pico no stimo dia de ps-operatrio. A partir de ento um decrscimo significativo no dcimo quarto dia. Logo ao stimo dia, ele atingiu o mximo em quantidade e aps esse perodo de reparao tecidual a ferida foi preenchida por fibras colgenas quando o nmero de fibroblastos concomitantemente diminuiu. Conforme lvares,15 citado por Neto,14 foi encontrado resultados semelhantes a essa relao inversamente proporcional entre fibroblastos e fibras colgenas. Dcimo quinto dia: Foi observado nesta fase que ocorreu um aumento da epitelizao e conseqentemente de fibras colgenas, conforme apresentado no grfico 4, e beneficiando os tratamentos com AGE e papana 2% e que pode ser comparado a avaliao macroscpica no quadro de fotos da figura 3 (presena da fase de maturao). No grupo controle podemos observar a presena de crosta e reduo da concentrao de colgeno em relao aos outros tratamentos, principalmente com a fase anterior, pois o seu pico foi no terceiro dia e a partir da apresentou um decrscimo continuo. Com relao ao fibroblasto, ainda no grupo controle, observamos que os valores sofreram um decrscimo apresentando pico mximo no stimo dia e voltando a cair no dcimo quinto dia. Comparando aos outros produtos, tambm apresentou uma concentrao menor, o

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que acaba contrariando a relao inversamente proporcional entre fibroblastos e colgeno. Analisando os grficos 4 e 5, com relao entre a proporo de fibras colgenas e fibroblastos, observamos nos tratamentos com soro fisiolgico e AGE que os resultados encontrados, no coincidem com os achados presentes na literatura j citados anteriormente. Conforme Magalhes et al16 em estudo semelhante realizado em ratos, utilizando AGE, foi observado que este composto no acelerou de forma significativa o processo de reparao tecidual por segunda inteno quando comparado com soro fisiolgico e sulfato de Neomicina. Concordando com estes achados, Arajo et al17 comprovou microscopicamente em estudo experimental em ratos que os tratamentos com Agarol e Triglicerdeos de cadeia mdia(produto constituinte do AGE) no influenciaram o processo cicatricial no terceiro e dcimo quarto dia de ps operatrio e ainda demonstrou uma diminuio da neo vascularizao, comparado aos grupos soro e Agarol (composto de leo mineral, fenolftalena e gar-gar), levando a acreditar que o mesmo retardou o processo de cicatrizao. Sendo esta constatao bastante contraditria no que diz respeito ao conceito literrio deste produto, uma vez que o mesmo indicado com o objetivo de acelerar a mitose celular, estimular a angiognese e ser quimiottico para as clulas envolvidas em todo o processo de reparo tecidual. Ento fazemos a pergunta: ser que em estudos em humanos esta resposta tem sido significativamente satisfatria? Deixa-se em aberto este questionamento j que em

Discusso

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modelos experimentais no encontramos diferenas estatisticamente significativas quando comparados com outros produtos. Seguindo esta linha de raciocnio iremos agora, com base nas pesquisas existentes, discutir a ao da papana encontrada em nosso estudo. Temos a papana como uma enzima bastante estudada e utilizada como desbridante qumico 18,19,20,21,22 ou seja um potente efeito sulfdrico que garante sua ao efetiva quando utilizada em material desvitalizado ou necrtico, porm poucos so os estudos que visam comprovar seu efeito estimulador da cicatrizao, tanto no perodo inflamatrio quanto proliferativo.5,23 Ento surge o questionamento, sendo esta enzima amplamente utilizada com propsito desbridante e apresentando respostas significativas, dever ela ser usada em tecidos sadios, sem a presena de necrose? J que no trabalho de Flindt,24 citado por Monetta,23 fez referncia da existncia de uma antiprotease plasmtica e alfa- umantitripsina, identificando que a existncia desta substncia no tecido sadio justifica a ao da papana nos tecidos que no possuem esta antiprotease, tais como no tecido necrosado e nos microorganismos. Para uma melhor compreenso dos resultados obtidos em nosso estudo, houve uma busca nos sites de pesquisa, tais como SCIELO, MEDLINE, LILACS, sobre pesquisas comparativas entre papana e AGE, para que pudssemos enriquecer nossa discusso, porm nenhum resultado foi encontrado. Quando avaliado estatisticamente pelo mtodo paramtrico, Anlise de Varincia com medidas repetidas, tendo como teste de esfericidade um p<0,05, temos na presente pesquisa que no houve diferena significativa entre os tratamentos utilizados. Este

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resultado pode estar relacionado ao tamanho da amostra, pois conforme Freiman et al25 citado por Paes26 em uma reviso de setenta e um artigos com resultados sem significncia estatstica, concluram que mais do que ausncia de significncia, havia incapacidade em detectar diferenas. Esta incapacidade o baixo poder que est diretamente relacionado com o tamanho da amostra. Deste modo, mostra-se importante que seja dado continuidade a esta pesquisa.

Concluso

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7 CONCLUSO

Com base nos resultados obtidos verificamos que o produto AGE, durante o perodo de sete dias no favoreceu a expresso de fibroblastos, o que pode ser explicado pela intensa aderncia da gaze de algodo no leito da leso, assim prejudicando o material histolgico analisado por imunoistoqumica. Nesta mesma fase, em relao ao colgeno observamos que o tratamento com papana 2% apresentou seu menor pico quando comparado aos outros tratamentos, o que pode ser atribudo a seu efeito potencialmente sulfdrico, realizando assim um desgaste nas fibras colgenas. Conforme o mtodo estatstico utilizado, ANOVA com medidas repetidas, constatou-se no haver diferena significativa entre os tratamentos propostos nesta pesquisa, no podendo ser indicado com segurana qual dos trs tratamentos apresenta melhor eficcia.

Referncias

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8 REFERNCIAS
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26. Paes AT. Einstein. Educ Contin Sade. 2008; 6:153-4.

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ANEXOS

Anexos

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Anexo 1 Within-Subjects Factors Measure Colgeno Tempo 1 2 3 1 2 3 Dependent Variable t3diasc t7diasc t15diasc t3diasf t7diasf t15diasf

Between-Subjects Factors trat 1 2 Value Label AGE Controle (soro fisiolgico) Papana N 4 4 4

Fibroblasto

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Tests of Between-Subjects Effects Transformed Variable: Average Source Intercept trat Error Measure Colgeno Fibroblasto Colgeno Fibroblasto Colgeno Fibroblasto Type III Sum of Squares 244680.283 190.125 37.082 2.486 741.389 17.729 df 1 1 2 2 9 9 Mean Square 244680.283 190.125 18.541 1.243 82.377 1.970 F 2970.265 96.518 .225 .631 Sig. .000 .000 .803 .554 Noncent. Parameter 2970.265 96.518 .450 1.262 Observed a Power 1.000 1.000 .075 .125

a. Computed using alpha = .05

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Anexo 2 Banco de Dados BANCO DE DADOS - Pesquisa comparativa entre Papana e AGE
Variveis Tempo Grupo 1 Rato 3 dias 2 Rato 3 Rato 4 Rato 1 Rato 7 dias 2 Rato 3 Rato 4 Rato 1 Rato 15 dias 2 Rato 3 Rato 4 Rato Colgeno-Picrosrius Controle Papana 91,462633 79,341129 86,15562 84,524132 74,463361 86,06334 83,198705 85,417528 82,35758 76,34104 76,835376 78,160187 93,702609 84,0028 85,17867 83,610198 93,298232 80,292397 40,582143 88,282652 84,425365 81,172548 83,392005 79,576788 Fibroblastos-FGFr Controle Papana 0,371050 1,580179 2,2699895 8 2,678743 5 3,2098395 1,8206953 AGE 3,0444648 2,5944785 0,0789781 0,4839333 0,442349 2,5999063 2,400446 3,7482947 2,4650782 4,9581168 0,4215986 2,4352493 4,4836916 2,15104 0,7623378 3,6094169 4,290084 1,7851563 4,0638116 1,4792912 2,568432 3,225014 7 0,135556 7 0,112482 9 2,599906 3 2,898768 6 2,745375 3 2,427805 3 4,500069 7 1,289864 4

AGE

83,767782 93,270501 88,990895 71,583815 84,243873 83,578701 83,739049 78,719741 90,28733 80,020853 76,208259 91,662234

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Anexo 3 Ofcio de aprovao do Comit de tica

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Anexo 4 Comprovante do envio do artigo original

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Anexo 5 Artigo original enviado a revista AMRIGS Comparando os efeitos da utilizao da Papana e do AGE em leses cutneas: Estudo experimental 1 Jefferson Braga Silva2, Graziela Hax3, Janete de Souza Urbanetto4, Aline Custdio5, Vincius Duval da Silva6, Patrcia Sesterheim7

Resumo: A cicatrizao envolve muitos eventos e situaes, exigindo conhecimento bsico de diversas reas, portanto uma atuao multidisciplinar se faz necessria para uma boa evoluo da leso. Esta pesquisa trata-se de um estudo experimental tendo por finalidade comparar os efeitos da papana 2%, AGE e soro fisiolgico quando utilizados em leses cutneas com dimensionamento de 2 cm de dimetro e espessura total no dorso de ratos da linhagem EPM-I Wistar. Utilizou-se 12 ratos machos divididos em trs grupos: C1 (grupo AGE), C2 (grupo controle) e C3 (grupo papana), todos submetidos a trocas dirias de curativos. Com base nos resultados obtidos verificamos que o produto AGE, durante o perodo de sete dias no favoreceu a expresso de fibroblastos, o que pode ser explicado pela aderncia da gaze de algodo no leito da leso, assim prejudicando o material histolgico analisado. Nesta mesma fase, em relao ao colgeno, observamos que o tratamento com papana 2% apresentou seu menor pico quando comparado aos outros tratamentos, o que pode ser atribudo a seu efeito sulfdrico, realizando assim um desgaste nas fibras colgenas. Conforme o mtodo estatstico utilizado, ANOVA com medidas repetidas, constatou-se no haver diferena significativa entre os tratamentos propostos. DESCRITORES: modelo experimental; cicatrizao; papana; AGE; colgeno; fibroblastos Abstract:The healing involves many events and situations, requiring basic knowledge of different fields. Thus, multidisciplinary action is needed for the lesion to heal well. Tissue repair occurs in two ways: by the regeneration of functional activity of the tissue or by healing. This research is an experimental study aiming at comparing the effects of 2% papain, AGE and saline solution when used in circular skin lesions 2cm in diameter, with full thickness on the dorsum of EPM-I Wistar rats. Twelve male rats were used,
Estudo realizado no laboratrio de habilidades mdicas da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul 2 Professor do Ps graduao em Cincias da sade da Pontifcia Universidade catlica do Rio Grande do sul 3 Mestranda do Ps graduao em cincias da sade 4 Professora da graduao em enfermagem da Pontifcia Universidade catlica do Rio Grande do Sul 5 Enfermeira da unidade de internao do Hospital So Lucas da Pontifcia Universidade catlica do Rio Grande do Sul 6 Professor do Ps graduao em Cincias da sade da Pontifcia Universidade catlica do Rio Grande do sul 7 Biloga e doutoranda do Ps graduao em cincias da sade da Pontifcia Universidade catlica do Rio Grande do sul
1

Anexos

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divided into three groups: C1 (AGE group), C2 (control group) and C3 (papain group), all of them submitted to daily dressing changes after cleaning with bidistilled water solution. Based on the results obtained, we found that the product AGE, during the seven-day period, did not favor fibroblast expression, which can be explained by the intense adherence of cotton gauze to the lesion bed, thus impairing the histological material analyzed by immunohistochemistry. During the same phase, as regards collagen, we observed that treatment with 2% papain was at its lowest peak when compared to the other treatments, which can be attributed to its potentially sulfidric effect, thus wearing down the collagen fibers. According to the statistical method used, ANOVA, it was found that there was no significant difference between the treatments proposed in this research. KEY WORDS: Experimental model; healing; Wistar rats; collagen; fibroblasts Introduo: O tratamento de feridas variou durante sculos com o objetivo de melhores resultados cicatriciais em menor tempo possvel. Em uma reviso de literatura , Andrade(1992) descreve que j na pr-histria vrios agentes como extratos de plantas, gua, neve, gelo, frutas e lama eram aplicados sobre as feridas. Na Mesopotmia, elas eram lavadas com gua ou leite e o curativo era realizado com mel ou resina. L de carneiro, folhas, cascas eram utilizadas para sua cobertura. Os egpcios concluram que as feridas fechadas cicatrizavam mais rpido, por isso utilizavam tiras de pano para sua cobertura. A introduo das armas de fogo nas guerras europias no sculo 14 levou ao surgimento de um novo tipo de ferida de cura mais difcil. O avano da qumica levou a descoberta de compostos de cloro e iodo que foram utilizados para a limpeza do material e da pele nos sculos18 e 192. A cicatrizao envolve muitos eventos e situaes, exigindo conhecimento bsico de diversas reas, portanto uma atuao multidisciplinar se faz necessria para uma boa evoluo da leso. O reparo do tecido se d atravs de duas formas: pela regenerao da atividade funcional do tecido ou pela cicatrizao3. OO tratamento e o uso de curativos em uma variedade de leses apresenta grande desafio para os profissionais envolvidos. A seleo do curativo complexa, e as decises freqentemente precisam ser modificadas, baseadas nas condies das leses. Segundo Rogenski, 1998 existe Atualmente em todo mundo, grande tendncia para o aproveitamento de recursos naturais na teraputica, por apresentarem vantagens econmicas, serem eficientes e apresentarem poucos efeitos nocivos a sade. A papana e o AGE so uma dessas alternativas naturais e vm sendo utilizados com grande xito em vrias instituies hospitalares para o tratamento dos mais diversos tipos de feridas. A papana uma enzima derivada do vegetal Carica papaya, que tem a propriedade de decompor substncias proticas. Como efeito teraputico apresenta caractersticas bactericida/bacteriosttico, antiinflamatrio, debridante qumico e bioestimulante promovendo alinhamento das fibras colgenas evitando a formao de quelides5. cidos graxos essenciais(AGE) so lipdios insaturados ricos em cido linolico . Apresentam poder quimiottico para leuccitos, promovem proliferao e mitose celular e tem ao estimulante para desbridamento autoltico. Atravs deste conhecimento e por utilizar estes dois produtos na prtica diria do tratamento de leses cutneas de pacientes internados no HSL PUCRS foi que surgiu por parte da autora o interesse em comparar a eficcia de cada um desses produtos

Anexos

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quando utilizados em leses semelhantes, realizadas no dorso de ratos da linhagem Wistar EPM 1 com peso e idade iguais, para que aps a concluso do experimento possamos indicar com segurana qual produto apresenta melhor resultado cicatricial quando utilizado em leses com caractersticas semelhantes quelas aplicadas nos animais deste estudo. Mtodos: Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizados 12 ratos heterognicos da linhagem EPM-I Wistar criados e mantidos, sob condies do biotrio convencional, na Coordenao de Produo e Experimentao Animal (CPEA) do Centro de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CDCT) da Fundao Estadual de Produo e Pesquisa em Sade (FEPPS) do Rio Grande do Sul. Todos animais utilizados foram machos entre 8 e 10 semanas de idade. Antes e durante a fase experimental, estes animais receberam como alimentao rao balanceada padro para roedores, gua ad libitum e foram mantidos em gaiolas individuais, devidamente identificadas com fotoperodo de 12 horas claro e 12 horas escuro (06:00/18:00), no laboratrio de Cirurgia Experimental da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, sob condies de biotrio convencional. Os animais foram distribudos por sorteio em trs subgrupos de acordo com o perodo de observao( 3, 7 e 15 dias de ps operatrio), com quatro animais em cada subgrupo. FotografiasAs fotografias foram registradas com uma mquina fotogrfica digital Sony DSC W5, 5,1 megapixels e utilizou-se flash para todas elas, mesmo diante de luz artificial (lmpadas fluorescentes 6400K, intensidade de X lux). As fotos foram tiradas a uma distncia de 50 centmetros com lente de macro, em ngulos variados. Tcnica operatriaOs ratos foram, depois de pesados, pr-medicados com sulfato de atropina, na dose de 0,44mg/100g por via subcutnea, aps anestesiados com soluo final de Cloridrato de Xilazina 2% (Rompun, Bayer Animal Health) e Cloridrato de Ketamina 10% (Dopalen, Agribrands Brasil ltda.) diludos a 2mg/ml e 10mg/ml de soluo salina (Alcon, Alcon Labs. Do Brasil ltda.-8ml/o,9) respectivamente. Houve administrao de uma dose nica de 0,2ml para cada 100g de peso corporal por via intraperitoneal, suficiente para abolir a dor e realizar o procedimento em tempo hbil. Aps anestesia, os ratos foram posicionados em decbito ventral horizontal em mesa apropriada e realizada tricotomia em regio dorsal com lmina. Seguida de antisepsia com lcool etlico 70%. Para demarcao da pele a ser retirada, utilizou-se caneta hidrogrfica de cor azul marinho e aps com uso de tesoura cirrgica foram excisados trs fragmentos cutneos de dois centmetros de dimetro, no centro da rea epilada, at a exposio da fscia muscular dorsal. A hemostasia foi realizada por compresso digital, utilizando-se gaze esterilizada. Tratamentos institudosAs coberturas foram aplicadas sobre as trs leses. Assim as leses foram denominadas C1, C2 e C3 (seguindo o sentido crnio-caudal, respectivamente) onde: - C1 recebeu gaze de algodo embebida com cidos Graxos Essenciais( VDeclair, Neve LTDA, Brasil) base de leo de girassol, composto por cido linoleico, cido cprico, vitamina A, vitamina E .

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- C2 recebeu gaze de algodo embebida em soluo salina 0,9%, pois representou o grupo controle. - C3 recebeu gaze de algodo embebida em soluo de papana a 2%(Papana 6.000 UI/mg, Wall-Indl, Brasil). Para obteno desta soluo diluiu-se um grama de p de papana em cinquenta mililitros de gua Bidestilada. Os animais foram mantidos em suas gaiolas e seus curativos trocados a cada 24 horas. Por ocasio da troca dos curativos, as leses foram medidas e fotografadas. Obteno de amostras das feridasA coleta de amostras das feridas, no primeiro grupo, foi realizada no terceiro dia aps a realizao das leses. Os animais foram posicionados em decbito ventral, , anestesiados com soluo final de Cloridrato de Xilazina 2% (Rompun, Bayer Animal Health) e Cloridrato de Ketamina 10% (Dopalen, Agribrands Brasil ltda.) diludos a 2mg/ml e 10mg/ml de soluo salina (Alcon, Alcon Labs. Do Brasil ltda.-8ml/o,9) respectivamente. Houve administrao de uma dose nica de 0,2ml para cada 100g de peso corporal por via intraperitoneal, suficiente para abolir a dor e realizar o procedimento em tempo hbil. Foi feita bipsia incisional da ferida, por exciso da rea total da leso e aps eutansia do animal biopsiado, com injeo de 0,2 ml de quetamina no pericrdio. Este processo repetiu-se no stimo dia aps realizao das feridas, no segundo grupo e no dcimo quinto dia, no terceiro grupo. Preparo histolgico e imunohistoqumicoOs fragmentos biopsiados nos terceiro, stimo e dcimo quinto dia foram fixados em formol a 10% e encaminhados para o processamento histolgico convencional constando de desidratao com lcool, diafanizao em Xilol e incluso em parafina. Os blocos foram cortados em micrtomo rotativo com cortes de 5 micrmetros de espessura e submetidos colorao com Hematoxilina e Eosina ( HE ), Picrosrius ( para visualizao e quantificao do colgeno sob luz polarizada ) e imunohistoqumica para quantificao da expresso de FGFr ( Growth Factor fibroblast), permitindo a avaliao da quantidade de colgeno. Anlise das imagensFoi utilizado microscpio Zeiss Axioskop 40 com ptica planeofluar e aumento de 400X, acoplado a sistema de captura de imagem e anlise Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, EUA). As contagens foram realizadas por mtodo planimtrico ( Gundersen, HJ et al.), sendo os resultados expressos em rea de fibrose (quantificao de colgeno por colorao de picrosrius sob luz polarizada e proliferao tecidual (FGFR por reao imunoistoqumica por micrmetros quadrados e a intensidade de colorao por densidade ptica integrada. Foi realizada tambm a contagem das reaes imunohistoqumicas por tcnica de anlise de imagem digital ( sistema Image Pro Plus 6.0, Media Cybernetics, EUA), permitindo a avaliao estatstica dos resultados por mtodos paramtricos. Testes Estatsticos AplicadosAnlise de varincia com medidas repetidas . Foi considerado significativamente estatstico um valor de p<0.05. Resultados:Avaliao macroscpica das feridas cutneas: Durante o experimento, as feridas cutneas de todos os animais no apresentaram sinais de infeco. Os exames macroscpicos e fotogrficos dirios demonstraram

Anexos

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reduo do dimensionamento da rea lesada, no sendo encontrado diferena significativa entre os tratamentos estabelecidos.

Dias

AGE

Controle
(soro fisiolgico)

Papana

15

Figura 3

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Figura 4: Imunoistoqumica com marcador FGFr da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com AGE (seta vermelha indica citoplasma do fibroblasto)

Figura 5:Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com papana 2%.Picrosrius. Aumento de 50x.

Figura 6: Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com Papana. A amostra apresenta-se com infiltrado inflamatrio, angiognese, edema associado e epitelizao. Colorao HE e aumento de 50x(seta branca indica angiognese ; seta preta indica edema).

Anexos

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Figura 7:Microscopia da pele de um dos animais no stimo dia de tratamento com AGE. A amostra apresenta-se com importante infiltrado inflamatrio, edema associado, presena de crosta e angiognese. Colorao HE e aumento de 50x.( seta branca indica angiognese; seta preta indica edema; seta azul indica crosta; seta verde indica infiltrado inflamatrio) Grfico 1 Quantificao de Colgeno por unidade de rea
Colgeno 90.000 85.000 80.000 75.000 70.000 3 7 Tem po (dias) AGE Controle (Soro Fisiolgico) Papana 15

Grfico 2:Quantificao de fibroblasto por unidade de rea

Fibroblastos 4.000 3.000 2.000 1.000 0 3 7 Tem po (dias) AGE Controle (Soro Fisiolgico) Papana 15

Discusso: Com relao avaliao histolgica e imunoistoqumica foram observados no terceiro dia de processo cicatricial grande infiltrado inflamatrio associado a edema importante na aplicao dos tratamentos propostos. Presena de crosta evidenciada no uso de AGE e soro fisiolgico. Com o uso do produto papana 2% encontramos uma maior quantificao de colgeno conforme grfico 3. Stimo dia: foi observado no local da leso reduo do edema, angiognese, presena e crosta e discreta epitelizao apresentando uma queda na concentrao de colgeno, o que desfavoreceu a ao dos trs tratamentos, sendo que o tratamento com papana 2%

Valor (Fibroblasto)

Valores (colgeno)

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apresentou a menor concentrao de colgeno nesta fase. Conseqentemente observouse um aumento na expresso de fibroblastos com os tratamentos papana 2% e soro fisiolgico, sendo identificado o pico mximo nesta fase.Verificando ento que o tratamento com papana 2% apresentou maior concentrao de fibroblastos, diferindo do tratamento com AGE onde evidenciou-se um decrscimo importante dos mesmos. Acredita-se que esse achado esteja relacionado a intensa aderncia da gaze de algodo com AGE no leito da leso, pois durante o processo de trocas dirias de curativos observou-se retiradas da crosta e inmeros traumas em tecido vivel, prejudicando o processo de reparao tecidual. Estes resultados coincidem com os achados de Sanches Neto et al (1993), no qual em relao aos fibroblastos, a anlise estatstica (ANOVA), mostrou, para os tratamentos com soro fisiolgico e papana, que os valores sofreram a partir do terceiro dia um aumento, com pico no stimo dia de ps-operatrio. A partir de ento um decrscimo significativo no dcimo quarto dia. Logo ao stimo dia, ele atingiu o mximo em quantidade e aps esse perodo de reparao tecidual a ferida foi preenchida por fibras colgenas quando o nmero de fibroblastos concomitantemente diminuiu. Conforme Alvares (1972) citado por Sanches Neto (1993), foi encontrado resultados semelhantes a essa relao inversamente proporcional entre fibroblastos e fibras colgenas. No dcimo quinto dia foi observado nesta fase que ocorreu um aumento da epitelizao e conseqentemente de fibras colgenas conforme apresentado no grfico 4 e beneficiando os tratamentos com AGE e papana 2% e que pode ser comparado a avaliao macroscpica no quadro de fotos da figura 3 (presena da fase de maturao). No grupo controle podemos observar a presena de crosta e reduo da concentrao de colgeno em relao aos outros tratamentos, principalmente com a fase anterior, pois o seu pico foi no terceiro dia e a partir da apresentou um decrscimo continuo. Com relao ao fibroblasto, ainda no grupo controle, observamos que os valores sofreram um decrscimo apresentando pico mximo no stimo dia e voltando a cair no dcimo quinto dia. Comparando aos outros produtos tambm apresentou uma concentrao menor, o que acaba contrariando a relao inversamente proporcional entre fibroblastos e colgeno. Analisando os grficos 4 e 5, com relao entre a proporo de fibras colgenas e fibroblastos, observamos nos tratamentos com soro fisiolgico e AGE que os resultados encontrados, no coincidem com os achados presentes na literatura j citados anteriormente. Conforme Magalhes et al (2008 ) em estudo semelhante realizado em ratos, utilizando AGE foi observado que este composto no acelerou de forma significativa o processo de reparao tecidual por segunda inteno quando comparado com soro fisiolgico e sulfato de Neomicina. Concordando com estes achados, ARAJO et al(1999) comprovou microscopicamente em estudo experimental em ratos que os tratamentos com Agarol e Triglicerdeos de cadeia mdia(produto constituinte do AGE) no influenciaram o processo cicatricial no terceiro e dcimo quarto dia de ps operatrio e ainda demonstrou uma diminuio da neo vascularizao comparado aos grupos soro e Agarol(composto de leo mineral, fenolftalena e gargar), levando a acreditar que o mesmo retardou o processo de cicatrizao. Sendo esta constatao bastante contraditria no que diz respeito ao conceito literrio deste produto, uma vez que o mesmo indicado com o objetivo de acelerar a mitose celular, estimular a angiognese e ser quimiottico para as clulas envolvidas em todo o processo de reparo tecidual. Ento fazemos a pergunta, ser que em estudos em humanos esta resposta tm sido significativamente satisfatria? Deixa-se em aberto este

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questionamento j que em modelos experimentais no encontramos diferenas estatisticamente significativas quando comparados com outros produtos. Seguindo esta linha de raciocnio iremos agora, com base nas pesquisas existentes, discutir a ao da papana encontrada em nosso estudo. Temos a papana como uma enzima bastante estudada e utilizada como desbridante qumico(Starkov,1978; Udod, 1981;Wiseman,1980;Masini,1986;Hebda, 2001) ou seja um potente efeito sulfdrico que garante sua ao efetiva quando utilizada em material desvitalizado ou necrtico, porm poucos so os estudos que visam comprovar seu efeito estimulador da cicatrizao, tanto no perodo inflamatrio quanto proliferativo(Rogenski,1998; Monetta, 1987). Ento surge o questionamento, sendo esta enzima amplamente utilizada com propsito desbridante e apresentando respostas significativas, dever ela ser usada em tecidos sadios, sem a presena de necrose? J que no trabalho de Flindt(1978), citado por Monetta(1987), fez referncia da existncia de uma antiprotease plasmtica e alfa- umantitripsina, identificando que a existncia desta substncia no tecido sadio justifica a ao da papana nos tecidos que no possuem esta antiprotease, tais como no tecido necrosado e nos microorganismos. Para uma melhor compreenso dos resultados obtidos em nosso estudo, houve uma busca nos sites de pesquisa, tais como SCIELO, MEDLINE, LILACS, sobre pesquisas comparativas entre papana e AGE, para que pudssemos enriquecer nossa discusso, porm nenhum resultado foi encontrado. Quando avaliado estatisticamente pelo mtodo paramtrico, Anlise de Varincia com medidas repetidas, tendo como teste de esfericidade um p<0,05, temos na presente pesquisa que no houve diferena significativa entre os tratamentos utilizados. Este resultado pode estar relacionado ao tamanho da amostra, pois conforme Freiman et al(1978) citado por Paes(1998) em uma reviso de 71 artigos com resultados sem significncia estatstica, concluram que mais do que ausncia de significncia, havia incapacidade em detectar diferenas. Esta incapacidade o baixo poder que est diretamente relacionado com o tamanho da amostra. Deste modo mostra-se importante que seja dado continuidade a esta pesquisa. Concluso :Com base nos resultados obtidos verificamos que o produto AGE, durante o perodo de sete dias no favoreceu a expresso de fibroblastos. Nesta mesma fase, em relao ao colgeno observamos que o tratamento com papana 2% apresentou seu menor pico quando comparado aos outros tratamentos. Conforme o mtodo estatstico utilizado, ANOVA com medidas repetidas, constatou-se no haver diferena significativa entre os tratamentos propostos nesta pesquisa.

Referncias:

Andrade MNB, Seward R, Melo JRC. Curativos. Rev Med Minas Gerais. 1992;2:228-36.

2.

Blanes L. Tratamento de feridas. [acesso 2009 jul.13] Disponvel em www.bapbaptista.com/feridas_leila

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3.

Mandelbaum SH, Santis EPD, Mandelbaum MHS. Cicatrizao: conceitos atuais e recursos auxiliares: parte I. Anais Brs Dermatol. 2003;78:393-408.

4.

Rogenski NMB, Baptista CMC, Sofia MH. O uso da papana a 2% nas leses provocadas pele sndrome de fournier: a propsito de 14 casos. Revista Paulista de enfermagem, v.17, n.1/3, p.39-45, 1998.

5. 6.

Candido LC. Nova abordagem no tratamento de feridas, So Paulo: Senac; 2001. Sanches Neto R, Barone B, Teves DC, Simes MJ, Novo NF, Juliano Y. Aspectos morfolgicos e morfomtricos da reparao tecidual de feridas cutneas de ratos com e sem tratamento com soluo de papana a 2%. Acta Cir Bras. 1993;8:18-23.

7.

Alvares S. Contribuio para o estudo histomtrico e histoqumico do processo de reprovao de leses obtidas experimentalmente na pele de ratos albinos. So Paulo 1972. [tese] So Paulo(SP);USP;1972.

8.

Magalhes MSF, Fechine FV, Macedo RN, Monteiro DLS, Oliveira CC, Brito, GAC, et al. Effect of a combination of medium chain triglycerides, linoleic acid, soy lecithin and vitamins A and E on wound healing in rats. Acta Cir Bras [Internet].2008 jun[citado 2009 maio 22];23(3):262-9. Disponvel em: http://wwwi.scielo.br/scielo.php?script=sci@arttext&pid=s01028650200800030000&ing=en.doi:10.1590/s0102-86502008000300009.

9.

Arajo CFR, Souza F ZA, Greca FH, Guerreiro MH, CPM, Leite AL, Mansur AEC, et al. Efeitos do Agarol e do Trigliceril sobre a cicatrizao de pele:estudo experimental em ratos. Acta Cir Bras. 1998;13:232-7.

10.

Starkov GL, Osna AI, Rossinskii VI, Savinykh VI, Andreiuk VI. Papain as a therapeutic enzyme in medicine. Klin Med(Mosk). 1978;56:119-22.

11.

Udod VM, Storozhuk VT. Use of papain in treating suppurative postoperative soft tissue complication and diseases. Khirurgiia(Mosk), 1981;5:99-101.

12.

Wiseman A. Topics in enzyme and fermentation biotechnology. Chichester: Ellis Horwood; 1980.

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13.

Masini E, De Calamo MA. Uma forma de tratamento de leses cutneas com papana e sacarose. Rev Bras Clin. Ter. 1986; 15:245-8

14.

Hebda PA, LO C. The effects of active ingredients of standard debriding agents papain and colagenase on digestion of native and denatured collagenous substrates, fibrin and elastin. Wounds. 2001;13(5): 190-194.

15.

Monetta L. Uso da papana nos curativos feitos pela enfermagem. Rev Bras Enferm. 1987;40: 66-73.

16.

Flindt M. Health and safety aspects of working with enzimes. Process Biochem. 1978;13: 3-7.

17.

Freinman JA, Chalmers TC, Smith H, Kuebler RR. The importance of beta, the type II error, and sample size in the design and interpretation of the randomized controlled trial: survey of 71 negative trials. N Engl J Med. 1978;299:690-4.

18.

Paes AT. Einstein. Educ Contin Sade. 2008; 6:153-4.