BIOENSAIO COM

ARTEMIA SALINA
PARA DETECO DE TOXINAS EM ALIMENTOS VEGETAIS

ARMANDO GARCIA RODRIGUEZ, OLVIA MENDES TEIXEIRA, FERNANDA GOMES SALLES, JAQUELINNE PIRES VITAL, DENISE SILVA PEIXOTO

estudos, Goinia, v. 36, n. 5/6, p. 795-808, maio/jun. 2009.

Resumo: foi desenvolvido um mtodo alternativo para a deteco de cido ciandrico em mandioca e sementes de frutas, e glicoalcalides em batatas O efeito dose-resposta foi testado em cultivos de Artemia salina e o valor de LD50 foi calculado. O bioensaio mostrou uma elevada preciso e sensibilidade na determinao de cido ciandrico e glicoalcalides, alm de ser uma tcnica simples, rpida e econmica. Palavras-chave: toxicidade, alimentos, bioensaio

presena de compostos txicos naturais em alguns alimentos vegetais um fato relativamente comum que evidencia a necessidade de se dispor de tcnicas analticas eficientes na deteco de tais substncias, garantindo assim a qualidade dos produtos e a sade dos consumidores. Dentre as toxinas naturais mais freqentemente encontradas nos alimentos vegetais destacam os glicosdios cianognicos, e os glicoalcalides. Os glicosdios cianognicos so compostos precursores do cido ciandrico (HCN), altamente txico, presentes na mandioca e no caroo de frutas como pssego, ameixas, ce-

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rejas e outras (ARAJO, 2004). Quando a mandioca descascada e cortada em pedaos, ou quando o caroo de uma fruta e danificado ou quebrado, os glicosdios cianognicos entram em contato com duas enzimas (b-glicosidase e hidroxinitrilo liase) liberadas aps a ruptura das clulas, que catalizam a reao de formao do HCN. Por isso, aps o descasque, conveniente colocar os pedaos de mandioca na gua durante um intervalo de tempo para que acontea a reao de degradao enzimtica dos glicosdios cianognicos e o HCN liberado seja solubilizado na gua e portanto, eliminado do alimento. No caso das frutas, o perigo de intoxicao no devido ingesto das frutas frescas, onde o caroo geralmente fica intacto, e sim pelo processamento industrial (por exemplo, a fabricao de vinhos e licores) em que, durante o despolpe, o caroo pode resultar danificado e o suco ou o produto final podem conter quantidades significativas de HCN (FERNANDEZ; NOVELLI, 1997). A quantidade de HCN produzida depende da variedade do vegetal. A dose letal para seres humanos de 0,5 3,5mg/Kg de peso. Por exemplo, 100g de mandioca podem produzir at 40mg de HCN, valor prximo dose letal para um indivduo. Intoxicaes agudas pela ingesto de mandioca parecem ser freqntes, frente ampla utilizao desse tubrculo na alimentao do brasileiro em geral. No raro ouvir-se relatos de intoxicaes letais por cianeto, veiculado pela mandioca. Infelizmente, no se dispe de dados a respeito de tal incidncia (MDIO; MARTINS, 2000). Os glicoalcalides so substncias naturais com ao neurotxica, presentes em diversos alimentos de origem vegetal. No grupo dos glicoalcalides destacam a a-solanina e a achaconina, produzidas pelos tecidos dos vegetais da famlia das solanceas, principalmente batata, tomate e berinjela (ARAJO, 2004). Esses compostos so potentes inibidores da acetilcolinesterase na juno neuromuscular. A inibio dessa enzima provoca um acmulo da acetilcolina liberada pelas clulas nervosas, produzindo, assim, desordens intestinais e neurolgicas tais como tremores, espasmos musculares e, nos casos mais graves, at a morte do indivduo (FERNNDEZ; NOVELLI, 1997). Nas batatas, os glicoalcalides encontram-se localizados principalmente nas partes mais prximas casca e nos brotos e a sua concentrao aumenta significativamente nas

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batatas armazenadas na presena de luz e a temperaturas entre 8 e 15C. O teor de glicoalcalides nas batatas varia de 2 a 15mg/ 100 g, podendo atingir concentraes ainda maiores, de at 100mg/100 g. A concentrao letal para seres humanos de 40 45mg/100 g e o limite permitido para a comercializao de 20mg/100 g de alimento (MIDIO; MARTINS, 2000). Da mesma forma que outras toxinas naturais presentes nos alimentos, os glicosdios cianognicos, e os glicoalcalides so detectados e quantificados mediante tcnicas analticas de separao, como a cromatografia de camada fina, cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC), imunoensaio e ensaios enzimticos, nem sempre disponveis em laboratrios e centros de pesquisa de menor porte. J que essas toxinas afetam seres vivos, o uso das tcnicas de bioensaio apresentam-se como uma alternativa vivel, rpida e econmica. O mtodo de bioensaio mais usado no mundo inteiro para deteco de toxinas alimentares, o bioensaio com camundongos, baseado na injeo intraperitoneal de extratos, preparados a partir de amostras de alimentos e a observao dos sintomas da intoxicao, assim como o tempo de morte do animal, proporcional concentrao de toxina no extrato (AOAC, 1990). Alm de ser um mtodo muito impreciso, com diversas fontes de variabilidade que podem levar a falsos positivos e negativos, com seus conseqentes erros na interpretao dos dados, esta tcnica apresenta problemas ticos, devido ao elevado nmero de animais que necessrio sacrificar e que devem ser mantidos em condies adequadas nos biotrios. Por tudo isso, outros ensaios biolgicos envolvendo culturas de clulas e organismos inferiores tm sido desenvolvidos visando substituir as tcnicas com ratos e camundongos por novos mtodos mais rpidos, simples, sensveis e precisos. A tcnica de bioensaio que utiliza o microcrustceo Artemia salina tem superado amplamente o mtodo com camundongos, em termos de sensibilidade, preciso e simplicidade. muito usada em testes de ecotoxicologia, para a avaliao da toxicidade de efluentes e poluentes ambientais (PETERS et al., 1997) e mais recentemente foi comprovada tambm sua efetividade na deteco de toxinas produzidas por cianobactrias (GARCIA-RODRIGUEZ et al., 2004).

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O presente trabalho teve como objetivos: Montar e testar a eficincia de um mtodo alternativo de bioensaio com o micro-crustceo Artemia salina para a deteco rpida e eficiente de cido ciandrico e glicoalcalides em amostras de alimentos vegetais. Avaliar a toxicidade por cianeto e glicoalcalides em vegetais consumidos na cidade de Goinia, assim como em alguns dos seus derivados industrializados. Caracterizar parmetros toxicolgicos a partir da elaborao de curvas dose resposta. MATERIAIS E MTODOS Bioensaio com Artemia Salina A ecloso dos ovos de Artemia salina foi realizada em uma soluo de sal marinho 3,5%, sob iluminao e aerao constante, durante 48 horas. Aps esse tempo, os nauplios eclodidos foram separados com pipetas Pasteur e transferidos para tubos de ensaio, contendo 1mL de soluo de sal marinho, na quantidade de 10 exemplares por tubo. Nesses tubos foram posteriormente testados e avaliados os extratos obtidos das amostras de alimentos vegetais (GARCIA-RODRIGUEZ et al., 2004). Preparao das Amostras A efetividade do bioensaio com Artemia salina foi estudada mediante a avaliao do efeito txico dos extratos obtidos de amostras de mandioca e sementes de pssego, ameixa, cereja, jabuticaba, abacate e manga (para a deteco de cido ciandrico), e batata in natura e derivados industrializados de batata (para a deteco de glicoalcalides). As amostras foram coletadas em diferentes centros comerciais escolhidos aleatoriamente, registrando sempre a origem das mesmas e a data da colheita. cido ciandrico em mandioca: amostras de mandioca de 100 g, previamente descascadas, foram cortadas em pedaos pequenos com uma faca de ao inoxidvel e imediatamente submersos em 100 ml de gua destilada a temperatura ambiente, para evitar a inativao das enzimas responsveis pela degradao dos glicosdios cianognicos e facilitar a dissoluo do HCN

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produzido. As amostras foram filtradas com filtro Millipore de 0,45 ?m e congeladas at o momento dos testes. cido ciandrico em sementes de frutas: a polpa das frutas foi descartada e os caroos triturados com um martelo. 100 g das castanhas obtidas do interior dos caroos, foram colocadas em 100 ml de gua destilada a temperatura ambiente, para evitar a inativao das enzimas responsveis pela degradao dos glicosdios cianognicos e facilitar a dissoluo do HCN produzido. As amostras foram filtradas com filtro Millipore de 0,45?m e congeladas at o momento dos testes. Glicoalcalides em batata: os extratos foram preparados seguindo a metodologia descrita por Arajo (2004), baseada na extrao seletiva das toxinas, segundo a sua solubilidade. 100 g de polpa de batata ou 50g de casca foram submetidas extrao com uma mistura de metanol-clorofrmio (2:1) em um liquidificador e filtradas com papel-filtro Whatman No.1. Seguidamente o extrato ser concentrado em evaporador rotatrio, tratado consecutivamente com HCl e NH4OH e centrifugado a 4C. O precipitado dissolvido em gua destilada, foi utilizado nos testes de toxicidade.
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Testes de Toxicidade Aps a comprovao do efeito txico em testes preliminares (adio do extrato nas culturas de Artemia salina e observao da mortalidade das mesmas), os extratos concentrados obtidos sero adicionados, por triplicata, nos tubos de ensaio contendo os nauplios de Artemia salina, em concentraes decrescentes (trs tubos para cada concentrao) com vistas elaborao das curvas de toxicidade e o clculo da dose letal (DL100, DL 50) (GARCIARODRIGUEZ et al., 2004). Anlise e Interpretao dos Dados Vinte e quatro horas aps a aplicao dos extratos, o nmero de exemplares de Artemia salina vivos e mortos ou imobilizados, foi contado e a sobrevivncia calculada: M(%) = Nmero de organismos vivos x 100 Nmero total de organismos no tubo (10) 799

Para cada concentrao de extrato testada, foi calculado o valor mdio da mortalidade e do desvio padro. Com esses dados foram construdas as curvas de toxicidade (Mortalidade vs. Concentrao do extrato). O valor de DL100 (dose ou concentrao que provoca a morte de todos os exemplares no tubo) e DL50 (dose ou concentrao que provoca a morte de 50% dos animais testados) foi calculado mediante o ajuste logartmico das curvas de toxicidade, utilizando o programa Origin 5.0 RESULTADOS E DISCUSSO Deteco da Toxicidade por cido Ciandrico O efeito txico sobre os cultivos de Artemia salina foi analisado em extratos aquosos obtidos a partir de polpa de mandioca e sementes de pssego, ameixa, cereja, jabuticaba, manga e abacate. A figura 1 mostra uma curva de toxicidade obtida com extrato de polpa de mandioca e a comparao da mesma curva com o efeito dose resposta obtido aps o tratamento dos cultivos com cianeto de potssio, como padro.
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A
120

100

Sobrevivncia (%)

80

60

40

20

0 0 20 40 60 80 100 120

Concentrao do extrato (mg)

800

B
100 Sobrevivncia (%) 80 60 40 20 0 0,01 0,1 1 10 100 Concentrao (m g/m L)

Cianeto Mandioca

Figura 1: Efeito Dose-Resposta do Extrato de Polpa de Mandioca (A) e Superposio da Curva do Extrato Txico e do Padro de Cianeto de Potssio Puro (B)

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Como pode ser observado, o comportamento sigmide das curvas de toxicidade permite o ajuste logartmico das mesmas, facilitando o clculo da dose letal 50% (DL50), tanto do extrato txico quanto do padro da toxina. O valor DL50 expressa a concentrao do extrato ou do padro, necessria para provocar a morte de 50% dos exemplares de Artemia salina presentes em um cultivo. Portanto, para diferentes toxinas, quanto menor o valor de DL50 encontrado, maior ser o efeito txico da substncia correspondente. Para uma mesma toxina, um valor menor de DL50 representa uma concentrao maior da mesma na amostra analisada. Obtendo os valores de DL50 do padro (cianeto puro) e de um extrato vegetal, ou seja, a quantidade de padro e de extrato com o mesmo efeito txico no cultivo, foi possvel calcular a concentrao de cianeto no extrato, expressada como miligramas de toxina por 100 gramas de amostra mediante a relao: [cianeto] = DL50 (padro) / DL50 (extrato) x 100 Outro aspecto importante a ressaltar o fato das declividades de ambas as curvas serem semelhantes, o que sugere que o efeito

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txico encontrado nas amostras de mandioca efetivamente devido presena de cido ciandrico. Os valores de DL50 e concentrao de cianeto calculada so mostrados na Tabela 1. Um comportamento semelhante das curvas de toxicidade foi observado nos cultivos tratados com os extratos das amostras de sementes de pssego, ameixa, cereja, jabuticaba, abacate e manga, analisadas pelo mesmo mtodo. A figura 2 mostra a curva de toxicidade obtida com o extrato de semente de pssego e a comparao da mesma com a curva de toxicidade do cianeto puro. Como as curvas de toxicidade obtidas com as amostras de semente de ameixa, cereja, jabuticaba, abacate e manga apresentaram um comportamento muito semelhante ao da curva mostrada para o pssego, assim como declividades prximas da curva de cianeto puro, os grficos correspondentes s mesmas no so mostrados no presente trabalho. Os valores de DL50 e concentrao de cianeto para todas as amostras analisadas so mostrados na tabela 1. A
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110 100 90 80

Sobrevivencia (%)

70 60 50 40 30 20 10 0 -10 0 5 10 15 20 25 30 35

Concentraao do extrato (mg)

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100 Sobrevivncia (%) 80 60 40 20 0 0,01 0,1 1 10 Concentrao (m g/m L) 100 Cianeto Pssego

Figura 2: Curva de Toxicidade do Extrato de Semente de Pssego (A) e Comparao com a Curva Dose-Resposta do Cianeto de Potssio (B)
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A presena de cianeto na maioria das amostras de alimentos vegetais estudadas no surpreendente, desde que a mesma j foi descrita em trabalhos anteriores (FERNANDEZ, NOVELLI, 1997; ARAJO, 2004). A novidade apresentada no presente trabalho a comprovao da eficincia do bioensaio com Artemia salina na deteco dessa toxina, mostrando uma elevada sensibilidade e preciso.

Tabela 1: Valores de DL50 e Concentrao de Cianeto para todas as Amostras Analisadas

Amostra Cianeto de potssio (padro) Mandioca (polpa) Pssego (semente) Ameixa (semente) Cereja (semente) Jabuticaba (semente) Abacate (semente) Manga (semente) DL50 (mg/mL) 0,03 45,1 13,03 6,2 12,9 10,0 19,1 38,9 Concentrao de cianeto (mg/100 g) 97,0 338,0 710,0 233,0 440,0 230,0 113,0

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Deteco da Toxicidade por Glicoalcalides A presena de glicoalcalides foi testada em amostras de casca e polpa de batata in natura e tambm em produtos industrializados como batata frita e batata congelada para fritar. A figura 3 mostra as curvas de toxicidade obtidas aps o tratamento dos cultivos de Artemia salina com extratos de casca de batata, polpa de batata e batata frita industrializada (tipo chips). O extrato obtido a partir da amostra de batata congelada no provocou nenhum tipo de toxicidade nos cultivos de Artemia salina que apresentaram uma sobrevivncia de 100 em concentraes de extrato de at 4 g/mL.

100

80

Sobrevivncia (%)

60

40

20

0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

Concentrao do extrato (g/mL)

B
Sobrevivncia (%)

110 100 90 80 70 60 50 40 30 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

Concentrao do Extrato (g/mL)

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C
100 80

Sobrevivncia (%)

60

40

20

-20 2 3 4 5 6 7 8

Concentrao do Extrato (g/mL)

Figura 3: Curvas de Toxicidade Obtidas com os Extratos de Casca de Batata (A), Polpa de Batata (B) e Batata Frita Industrializada (C)

Todas as curvas apresentaram o comportamento tpico das curvas dose resposta, o que permitiu o ajuste logartmico das mesmas e o clculo do valor de DL50 para cada extrato, mostrados na tabela 2.
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Tabela 2: Valores de DL50 para as Amostras de Batata Analisadas

Amostra Casca de batata (in natura) Polpa de batata (in natura) Batata frita (chips) DL50 (mg/mL) 0,11 3,45 6,4

importante ressaltar que o valor de DL50 encontrado no extrato de casca de batata foi aproximadamente trinta vezes menor do que o valor correspondente ao extrato de polpa in natura. Segundo dados bibliogrficos (ARAJO, 2004) 80% do teor total de glicoalcalides nas batatas encontra-se localizado na casca, enquanto apenas 20% podem estar presentes na polpa. Esse fato confirma a eficincia e confiabilidade do mtodo de bioensaio com Artemia salina. Nos extratos de batata frita a toxicidade foi ainda menor (valor de DL50 maior), provavelmente porque, como acontece com a maioria dos produtos industrializados de batata, as fatias no so constitudas de batata natural e sim de polpa tratada mediante processo de extruso que elimina parte do teor de gua, podendo

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tambm reduzir o teor de glicoalcalides da polpa. provvel que por esse mesmo motivo, no tenha sido encontrada toxicidade nas amostras de batata congelada para fritar. Embora no tenha sido possvel utilizar padres de glicoalcalides puros para comparar a sua toxicidade com a das amostras de batata e calcular a concentrao de toxina nas mesmas, a semelhana entre as declividades das curvas obtidas, mostrada na figura 4, evidencia a presena da mesma toxina nos trs extratos. Todavia, a seletividade do mtodo de extrao utilizado na preparao dos extratos sugere que o efeito txico detectado nas amostras de batata seja devido presena de glicoalcalides.
100 Sobrevivncia (%) 80 60 40 20 0 0,01
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Casca Polpa Frita

0,1

10

Concentrao do extrato (g/mL)

Figura 4: Comparao da Declividade das Curvas Dose Respostas Obtidas com Casca de Batata, Polpa de Batata e Batata Frita Industrializada

CONCLUSO O cultivo de Artemia salina mostrou-se adequado como mtodo de bioensaio na caracterizao da toxicidade por cido ciandrico, e glicoalcalides, apresentando elevada preciso e sensibilidade, alm de ser uma tcnica rpida, simples e econmica. As curvas de toxicidade obtidas apresentaram o comportamento sigmide tpico das curvas dose resposta, permitindo o ajuste das mesmas e o clculo dos valores de dose letal 50% (DL50) para os diferentes extratos vegetais testados.

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Na deteco de cido ciandrico, a declividade das curvas obtidas com os extratos vegetais foi semelhante declividade da curva correspondente ao padro de cianeto de potssio puro, sugerindo que a toxicidade detectada nas amostras devida presena de cianeto, e permitindo a identificao e quantificao da toxina no alimento. Apesar da falta de padres para glicoalcalides, as curvas de toxicidade obtidas com os diferentes extratos de batata apresentaram declividades semelhantes das curvas do produto industrializado, sugerindo a presena da mesma toxina em todas as amostras. A seletividade do mtodo de extrao utilizado permite supor a presena de glicoalcalides na batata. Referncias
AOAC: Paralytic Shellfish Poison. Biological method. Final action. In: HELLRICH, K. (Ed.), Official Methods of Analysis. Association of Official Chemists, sec. 959.08. 15. ed. Virginia: Arlington, 1990. ARAJO, J. M. A. Qumica de alimentos: teoria e prtica. Viosa: Ed. da UFV, 1995.
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FERNNDEZ, M.T.; NOVELLI, A. Bioqumica de los alimentos. Dissertao (Master en Biotecnologa Alimentaria) Universidad de Oviedo, Espanha. 1997. GARCIA-RODRIGUEZ et al. Toxicidade por Microcystis sp. em Gois: Estudo dos efeitos txicos em camundongos e Artemias salinas. Estudos, Goinia, v. 31, n. 9, p. 1595-1606, 2004. MIDIO, A. F.; MARTINS, D. I. Toxicologia de alimentos. So Paulo: Varela, 2000. PETERS, E. C. et al. Ecotoxicology of tropical marine ecosystems. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 16, n. 1, p.12-40, 1997.

Abstract: an alternative bioassay method using the microcrustacean Artemia salina was developed to detect cyanic acid in cassava and fruit seeds, and glicoalcaloids in potatoes. Doseresponse effect was tested in Artemia salina cultures and LD50 value was calculated. This bioassay technique showed a very high precision and sensitivity when detecting cyanic acid and glicoalcaloids. It is also a very simple, rapid and economic method. Keywords: toxicity, food, bioassay 807

Agradecimentos
Ao CNPq, pela concesso das bolsas s alunas de iniciao cientfica que participaram deste trabalho. Todos os reagentes e materiais de laboratrio foram adquiridos com recursos da Pontifcia Universidade Catlica de Gois (PUC GO), aprovados pela Prope. Os resultados apresentados neste trabalho fazem parte dos projetos de pesquisa Aplicao das tcnicas de bioensaio na determinao de compostos txicos naturais em alimentos de origem vegetal e Avaliao da toxicidade por alcalides em alimentos vegetais mediante bioensaio com Artemia salina, cadastrados na Prope, que contaram com a participao das seguinteas bolsistas de iniciao cientfica e alunas do curso de Engenharia de Alimentos da PUC GO: Olvia Mendes Teixeira, Fernanda Gomes Salles, Jackeline Pires Vital e Denise Silva Peixoto, todas com bolsa PIBIC-CNPq, sob a orientao do Prof. Dr. Armando Garcia Rodriguez, da Coordenao de Qumica do Departamento de Matemtica e Fsica (MAF).

ARMANDO GARCIA RODRIGUEZ Doutor em Cincias Biolgicas pela Universidade de Oviedo (Espanha). Professor no Departamento de Matemtica e Fsica da PUC GO. Membro do Ncleo de Pesquisa em Qumica (NPQ) da PUC GO. E-mail: armando@ucg.br OLVIA MENDES TEIXEIRA FERNANDA GOMES SALLES JACKELINE PIRES VITAL DENISE SILVA PEIXOTO Bolsistas de iniciao cientfica (PIBIC). Alunas de Engenharia de Alimentos da PUC GO.

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