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ARTIGO ORIGINAL

O uso de uma nova ferramenta de amplificação para o

diagnóstico molecular de amostras difíceis
The use of a novel amplification tool for molecular diagnosis of challenging samples*
Fátima de Melo Azevedo1, Melissa Mitne2, Vanda Dolabela de Magalhães3

ABSTRACT INTRODUÇÃO
Objective: To obtain adequate amounts of starting material to be Uma questão fundamental no diagnóstico molecular
used in molecular diagnosis. Methods: Isothermal ramification é a detecção de seqüências específicas de DNA. A
amplification. Results: Water samples where Legionella spp was reação em cadeia de polimerase (PCR) tem sido
diluted and small amount of human DNA from HIV infected patients
extensamente usada para amplificar seqüências
were submitted to a new amplification technology (GenomiPhi®
kit). Those samples that were previously negative upon PCR
definidas, em laboratórios clínicos e de pesquisas(1). Na
became positive after the treatment. Conclusion: The new PCR convencional, primers específicos hibridizam-se
technology allows for molecular assays to be performed in samples com bases complementares na molécula-alvo,
of reduced volumes or low concentration. permitindo que as polimerases de DNA repliquem
exponencialmente o fragmento. Contudo, às vezes, o
Keywords: Legionella/isolation & purification; Legionella/growth material genético presente em amostras clínicas não
& development; Molecular diagnostic techniques/methods; HIV está disponível em quantidade e/ou qualidade
suficiente, impedindo a amplificação. As propriedades
da DNA polimerase isolada de um bacteriófago (Phi29)
RESUMO
foram exploradas visando superar essas limitações. Essa
Objetivo: Obter quantidades adequadas de material inicial para enzima é capaz de usar primers hexâmeros e suporta a
ser utilizado em diagnóstico molecular. Métodos: Amplificação
síntese por deslocamento de fita. A atividade
isotérmica e ramificada. Resultados: Amostras de água onde
Legionella spp se encontrava diluída e pequena quantidade de proofreading (correção de erros) da exonuclease 3’-5’
DNA humano extraído de paciente com infecção por HIV foram resulta em DNA amplificado com maior fidelidade
submetidas a uma nova tecnologia de amplificação (kit quando comparado à Taq DNA polimerase, a enzima
GenomiPhi®)). Essas amostras, que haviam apresentado resultado padrão usada na maioria das reações de PCR(2). Essa
negativo na PCR realizada anteriormente, tornaram-se positivas polimerase altamente processiva faz parte de um kit
após o tratamento. Conclusão: A nova tecnologia permite a comercial (GenomiPhi®, Amersham Biosciences) que
realização de ensaios moleculares em amostras de volume reduzido permite amplificação representativa de todo o genoma.
ou baixa concentração.
Nesse processo de amplificação, os primers
Descritores: Legionella/isolamento & purificação; Legionella/ hexâmeros hibridizam com o molde (template) em
crescimento & desenvolvimento; Técnicas de diagnóstico múltiplos pontos e a polimerização isotérmica tem
molecular/métodos; HIV início. À medida que a reação prossegue, uma nova
fita complementar é deslocada e gera um novo DNA
de fita simples. Essa fita fica então disponível para

* Trabalho apoiado pela FAPESP e pelo IEP - Instituto de Ensino e Pesquisa Albert Einstein.
* Trabalho financiado pelo CNPq Nº 522552/95-1 e pela FAPESP Nº 02/08460-6.
1
PhD, Centro de Pesquisa Experimental, Instituto de Ensino e Pesquisa Albert Einstein.
2
Centro de Pesquisa Experimental, Instituto de Ensino e Pesquisa Albert Einstein.
3
PhD, Centro de Pesquisa Experimental, Instituto de Ensino e Pesquisa Albert Einstein.
Endereço para correspondência: Vanda Dolabela de Magalhães - Instituto de Ensino e Pesquisa - HIAE - Av. Albert Einstein, 627/701 - Morumbi - CEP 05651-901 - São Paulo (SP), Brasil.
Tel.: (55 11) 3747-1343- Fax: (55 11) 3747-0208 - e-mail: vanda@einstein.br
Recebido em 11 de janeiro de 2004 - Aceito em 14 de fevereiro de 2004

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ligação pelos novos primers. Esse tipo de reação produz
uma estrutura ramificada. As repetições de priming e
deslocamento resultam em DNA amplificado de dupla-
fita de alto peso molecular (figura 1).
Descrevemos, a seguir, a utilização do kit
GenomiPhi ® para amplificação de amostras de
Legionella spp diluídas em água e HIV de amostras de
tamanho limitado. A primeira tentativa de amplificar
esses patógenos por PCR diretamente a partir das
amostras disponíveis falhou. Depois do material inicial
ser submetido ao GenomiPhi®, a PCR convencional
conseguiu amplificar os fragmentos esperados e
identificar ou caracterizar os patógenos.
1. Primers hexâmeros aleatórios hibridizam no molde
do DNA em vários sítios.
2. A polimerase Phi29 inicia a replicação em múltiplos
sítios do DNA linear desnaturado
simultaneamente.
3. À medida que a polimerização prossegue, o
deslocamento da fita do DNA de fita simples.
4. Primers adicionais ligam-se ao DNA de fita simples
recém-sintetizado.
5. A hibridação subseqüente e o deslocamento da fita
produzem grandes quantidades de DNA de fita
dupla de alto peso molecular.
Figura 1. Amplificação isotérmica por DNA polimerase Phi29.
MÉTODOS
Amplificação com GenomiPhi®: 1 µl de material inicial
foi acrescentado a 9 µl de solução-tampão para amostra
(fornecida com o kit) em um microtubo Eppendorf. A
amostra foi desnaturada a 95°C por 3 minutos e
resfriada com gelo. Nove microlitros de solução-tampão
de reação (fornecida) e 1 µl de Phi29 DNA polimerase
são acrescentados, mantendo-se o tubo no gelo. Após
a mistura, o tubo é incubado a 30°C por 16 a 18 horas.
A enzima é inativada por calor a 65°C por 10 min e o
DNA está pronto para outros ensaios.
PCR para Legionella spp: a amplificação de
Legionella spp foi obtida pelo método descrito(3). O
produto da amplificação, um fragmento de 386 bp da
subunidade 16S rRNA, foi digerido de modo
independente com duas enzimas de restrição, Xho I e
Hae III, resultando em padrões estriados específicos
que puderam ser atribuídos à L. pneumophila ou outras
espécies.
PCR para HIV: as regiões de transcriptase e protease
foram amplificadas em duas PCR consecutivas com dois
primers (nested-PCR). Vinte e cinco µl da mistura para
reação de amplificação continham solução-tampão 1
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X PCR (Amersham Biosciences), 0,5 µM de cada primer
(K1–5’CAGAGCCAACAGCCCCACCA e K2–5’
TTTCCCCACTAACTTCTGTATGTCATTGACA), 0,2
mM de cada dNTP e 2,5 U de Taq polimerase
(Amersham Biosciences). O molde do DNA foi
desnaturado a 94°C por 10 minutos e um total de 35
ciclos foi realizado, consistindo de 94°C por 45
segundos, 55°C por 45 segundos para hibridização dos
primers e 72°C para extensão durante 2 minutos. Após
o último ciclo, foi realizada uma extensão de 10 minutos
a 72°C. Um ou 2 µl da primeira PCR foram usados
para o ensaio aninhado (nested). Os primers DP16
(5’ CCTCAAATCACTCTTTGGCAAC) e G2
(5’GCATCHCCCACATCYAGTACTG) foram usados
para amplificar a região da protease e os primers F1
( 5 ’ GT T G A C T C A G AT T G GT T G C A C ) e F 2
(5’ GTATGTCATTGACAGTCCAGC) para a região da
transcriptase reversa. O segundo ciclo de PCR para
ambos os pares de primers não diferiu signi-
ficativamente do primeiro. Todas as amostras foram
analisadas em duplicata.
Eletroforese em gel de agarose: os produtos da
amplificação foram visualizados por transiluminação
UV de gel de agarose embebido em brometo de etídio
após eletroforese. A concentração do gel foi 2,5%, TAE
1X (40 mM Tris-acetato, pH 8,0, 1 mM EDTA) foi
usado como tampão e o estudo foi realizado a 6 V/cm.
Os resultados foram fotografados com um sistema
Polaroid.
Seqüenciamento: os amplicons foram purificados
com o kit de purificação GFX PCR DNA (Amersham
Biosciences) e quantificados após eletroforese em
agarose usando um padrão de massa. O
seqüenciamento foi realizado em um sistema capilar
MegaBace 1000 com o kit DYEnamic ET Terminator
Cycle Sequencing (Amersham Biosciences), seguindo
as recomendações do fabricante. A análise com o
BLAST foi realizada no site da NCBI (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov).
RESULTADOS
Pneumonia foi diagnosticada em um paciente
transplantado e o agente etiológico suspeito foi L.
pneumophila. O lavado broncoalveolar foi enviado para
análise e diagnóstico por biologia molecular. A PCR
foi positiva e a digestão do amplicon com enzimas de
restrição apropriadas identificou a L. pneumophila.
Como Legionella spp encontradas no abastecimento
de água foram relacionadas a casos de pneumonia em
pacientes imunocomprometidos (3), as investigações
epidemiológicas incluíram coleta de amostras de água
de chuveiros e pias de diferentes quartos. Também
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foram coletadas amostras dos reservatórios. A PCR foi
positiva apenas para a água do chuveiro do quarto do
paciente. Contudo, a quantidade de produto de
amplificação não era suficiente para novas análises. A
amostra original do chuveiro foi usada no kit
GenomiPhi ® e gerou uma grande quantidade de
amplicons, permitindo a análise de restrição e o
seqüenciamento. Além disso, amostras de água
coletadas em outros pontos (pias e reservatório)
também foram submetidas ao sistema GenomiPhi® e
resultaram em amplificação positiva de uma amostra
referente ao reservatório (figura 2). O seqüenciamento
dos produtos por PCR confirmou a presença de L.
pneumophila no lavado broncoalveolar e na água do
chuveiro do quarto do paciente. Na amostra do
reservatório, o seqüenciamento revelou a presença de
L. rubrilucens.
Como parte da Rede de Diversidade Genética Viral
(Viral Genetic Diversity Network), nosso laboratório
recebe DNA extraído de pacientes com HIV. É
esperado que amplifiquemos as regiões da transcriptase
reversa e da protease dos pró-vírus presentes nessas
amostras. O seqüenciamento dessas regiões identifica
possíveis genótipos resistentes. Algumas amostras
falharam sistematicamente na reação de PCR, muito
provavelmente devido à presença de substâncias
inibidoras ou a baixa carga viral. Nesses casos, a
quantidade de amostra que restou após muitas
tentativas de superar os problemas era muito pequena.
O uso do GenomiPhi ® resultou em amplificação
positiva e seqüenciamento bem-sucedido das regiões
escolhidas de amostras que haviam falhado
anteriormente.
1 2 3 4
1. PCR de Legionella spp de amostra de água do reservatório.
2. PCR de Legionella spp da mesma amostra de água do reservatório de
1, após uso do kit GenomiPhi®.
3. PCR de Legionella spp de amostra da água do chuveiro do paciente.
4. PCR de Legionella spp da mesma amostra do chuveiro do paciente após
uso do kit GenomiPhi®.
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose de Legionella de amostras de
água antes e depois do uso do kit GenomiPhi ®.
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DISCUSSÃO
Muitas análises genéticas usam PCR e é comum que
não haja amostras clínicas em quantidade adequada
para permitir múltiplos testes. Enquanto a PCR
aleatória em geral produz DNA de peso molecular
relativamente baixo, a ação da DNA polimerase Phi29
produz fragmentos cujo comprimento varia entre 5 e
50 kb. O material amplificado é representativo de todo
o genoma e a informação é preservada, pois pouca ou
nenhuma mutação é permitida pela atividade de
proofreading da enzima.
Além do uso aqui descrito, a amplificação por
ramificação isotérmica foi usada para fornecer
densidade adequada de DNA isolado de algumas
centenas de células em matrizes para hibridização
genômica comparativa(4). A análise dos polimorfismos
de um único nucleotídeo (Single Nucleotide
Polymorphism ou SNP) também consome grande
quantidade de DNA devido ao número de SNPs no
genoma humano. Nessas duas abordagens, menor
exatidão é observada quando o aporte de DNA não é
adequado.
CONCLUSÃO
GenomiPhi® é uma ferramenta potente para fornecer
DNA suficiente para a realização de diferentes estudos
de interesse clínico e para pesquisas quando os
materiais iniciais têm quantidade reduzida.
AGRADECIMENTOS
Gostaríamos de agradecer à Amersham Biosciences por
fornecer o kit GenomiPhi® mesmo antes de ele ser
comercializado.
REFERÊNCIAS
1. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al. Primer-
directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science. 1988; 239(4839):487-91.
2. Blanco L, Bernad A, Lazaro JM, Martin G, Garmendia C, Salas M. Highly
efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical
mode of DNA replication. J Biol Chem. 1989; 264(15):8935-40.
3. Jonas D, Rosenbaum A, Weyrich S, Bhakdi S. Enzyme-linked immunoassay
for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in bronchoalveolar fluid. J
Clin Microbiol. 1995; 33(5):1247-52.
4. Lage JM, Leamon JH, Pejovic T, Hamann S, Lacey M, Dillon D, et al. Whole
genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using
hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome
Res. 2003;13(2):294-307.