Scientia Agricola

Print ISSN 0103-9016

Sci. agric. (Piracicaba, Braz.) vol.52 no.2 Piracicaba May/Aug. 1995

doi: 10.1590/S0103-90161995000200030

ARTIGOS

Cultura de apices caulinares de Musa sp. var. Ma: estabelecimento, micropropagao e enraizamento in vitro

Shoot tip culture of Musa sp. var. Ma: establishment, micropropagation and rooting

E.T. DominguesI; A. Tulmann NetoII; B.M.J. MendesII

I

Centro de Citricultura Sylvio Moreira - IAC, C.P. 04 - CEP: 13.490-970 - Cordeirpolis, SP II Centro de Energia Nuclear na Agricultura CENA/ USP - C.P. 96 - CEP: 13.400-970 - Piracicaba, SP

RESUMO Atravs de vrios experimentos objetivou-se estudar as melhores respostas da variedade de banana " Ma" s tcnicas de cultura de tecidos no que se refere ao tipo e dimenses dos explantes e ao meio de cultura para obteno de uma maior taxa de multiplicao in vitro. Os pices caulinares utilizados como explantes foram obtidos em cinco diferentes maneiras. Observou-se que os pices caulinares com 0,7 cm de dimetro basal por 1 cm de comprimento, dos quais foram retiradas as bainhas foliares, apresentaram maior nmero de brotos. O meio liquido com agitao foi o em que se observou um maior estmulo na brotao, superando o meio semi-slido e o meio liquido sem agitao. A concentrao de BAP testada que permitiu a obteno de um maior nmero de brotos foi de 5.0

mg.l-1. Para o enraizamento, a concentrao de 0,1 mg.l -1de ANA e AIB foi a mais adequada. Descritores: bananeira, pices caulinares, micropropagao, enraizamento

ABSTRACT The response of banana shoot tips var. "Ma", were accessed for different micropropagation conditions such as media composition and explant type. Shoot tip apices were extracted in five different ways. Shoot tips without immature leaves with 0.7 cm in diameter and 1.0 cm in lenght, tended to produce a larger number of developing buds. The number of buds developed was higher in shoot tips grown in liquid media with agitation than in semi solid media. Shoot tips grown in static liquid media had the lowest number of buds developed. The lowest concentration of the growth regulator BAP to produce a higher number of buds was 5.0 mg.l-1. For rooting, the best concentration of NAA and IBA was 0.1 mg.l-1. This concentration rooted plants hi two weeks. Key words: banana, shoot tip apices, micropropagation, rooting

INTRODUO
A bananeira uma cultura de vital importncia para milhes de pessoas no mundo todo, seja como fonte de alimentao direta ou como fonte de divisas. A produo mundial alcana aproximadamente 71 milhes de toneladas por ano (FAO, 1991). A micropropagao da bananeira pode contribuir para uma melhora da sanidade e uniformidade do material cultivado em campo, bem como para a propagao de clones que apresentem melhores caractersticas agronmicas (CRONAUER et al. 1984). Alm disso tem se apresentado como uma ferramenta til para o melhoramento gentico desta cultura atravs de induo e explorao da variao somaclonal espontnea ou induzida atravs de mutagnicos qumicos ou fsicos (NOVAK et al. 1987) O presente trabalho foi realizado com a finalidade de se conhecer melhor as respostas da var.

"Ma" s tcnicas de cultura de tecidos, no que se refere ao melhor tipo de explante, meio de cultura e condies mais adequadas para uma maior taxa de multiplicao in vitro.

MATERIAL E MTODOS
Plantas jovens de banana "Ma", com aproximadamente quatro meses, foram coletadas em campo, recebendo cortes no pseudocaule aproximadamente 20 cm acima do rizoma sendo lavadas em gua, eliminando-se a terra e as razes. A seguir, as bainhas foliares que ainda restaram no pseudocaule, foram retiradas gradativamente, ao passo que o rizoma sofreu cortes sucessivos, at que o explante adquiriu 2,5 cm de dimetro e 5 cm de comprimento, mantendo em seu interior o pice meristemtico intocado. Estes explantes foram imersos em lcool 95GL por 5 minutos, para a esterilizao e quebra da tenso superficial, logo aps foram transferidos para soluo de hipoclorito de sdio (produto comercial 2,5% cloro ativo) diludo na proporo 1:3, por 20 minutos em agitador, para completar a esterilizao superficial. A seguir foram enxaguados em cmara assptica por 4 vezes com gua destilada autoclavada. Aps este tratamento, com o auxlio de bisturi, foram deixados no explante apenas 3 ou 4 primordios foliares recobrindo o meristema apical, ficando o explante com aproximadamente 2,0 mm de dimetro. Nestas condies os explantes foram inoculados em meio de cultura ML semi-slido ou lquido, contendo sais minerais de MURASHIGE & SKOOG (1962) (MS), macro e micronutrientes, vitaminas de MOREL & WETMORE (1951) (MW), suplementado com 5,0 mg.l -1 de BAP, 3% sacarose, pH 5,7 e 6,5 g.l-1 de gar. Os pices caulinares foram incubados em sala de crescimento com temperatura controlada (26C 2C) e sob fotoperodo de 16 horas de luz (30 W/m2). As trocas de meio foram realizadas a cada 15 dias. Esta primeira etapa permitiu a multiplicao vegetativa do material, para utilizao nas demais etapas deste trabalho. Parte destas plantas foram utilizadas para determinar a taxa de brotao de pices caulinares extrados de cinco diferentes maneiras, como ilustra a Figura 1:

1. pice caulinar com 0,7 cm de dimetro basal por 1 cm de comprimento, contendo o meristema apical mais gemas laterais sem a remoo das bainhas foliares e que sofreu dois cortes perpendiculares longitudinalmente at a altura do meristema. Estes cortes foram realizados para quebrar a dominancia apical. 2. pice caulinar com 0,7 cm de dimetro basal por 1 cm de comprimento, contendo o meristema apical mais gemas laterais sem a remoo das bainhas foliares. 3. pice caulinar com 0,7 cm de dimetro basal por 1 cm de comprimento que sofreu remoo das bainhas foliares, contendo no entanto, o meristema apical mais as gemas laterais. 4. pice caulinar com 0,7 cm de dimetro basal por 1 cm de altura, contendo apenas as gemas laterais, urna vez que a que determinava a dominncia apical foi removida. 5. pice caulinar com 0,1 - 0,2 cm de dimetro, compreendendo a regio meristemtica contendo 2-3 primrdios foliares. Cada um dos tratamentos (tipos de explantes obtidos em cmara de fluxo laminar) contou com 15 repeties, sendo cada parcela representada por um pice caulinar inoculado individualmente em Erlenmeyer de 250 ml em meio de cultura Ml lquido e levados para sala de crescimento e mantidos sob agitao (65 rpm) A avaliao foi realizada atravs da contagem do nmero de brotos aps 30 dias. Com a finalidade de se comparar as respostas dos pices caulinares quando inoculados em meio semi-slido ou em meio lquido (com e sem agitao) para o estmulo das brotaes em pices caulinares de bananeira "Ma", utilizou-se 48 plantas estabelecidas in vitro, das quais foram extrados os pices caulinares com aproximadamente 0,7 cm de dimetro basal por 1,0 cm de altura. Foram inoculados em meio Ml semi-slido, lquido com agitao e lquido sem agitao O delineamento adotado foi o inteiramente casualizado, com 16 repeties, sendo cada

parcela representada por um pice caulinar inoculado individualmente em Erlenmeyer de 250 ml. Devido a controvrsias existentes na literatura especfica, sobre as melhores concentraes de BAP a serem utilizadas para a micropropagao da bananeira e devido haver respostas diferenciadas entre variedades distintas de Musa, como observado em BANERJEE & DE LANGHE (1985), GUPTA (1986), GODINHO (1987), LAMEIRA (1987), foi realizado experimento para determinao das melhores concentraes de BAP para a induo de brotaao em bananeira "Ma". O experimento, em delineamento inteiramente casualizado, contou com 8 tratamentos (0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,0 e 17,5 mg.1-1) e 16 repeties, sendo cada parcela representada por dois pices caulinares. Os explantes utilizados para este experimento foram obtidos a partir de 128 plantas cultivadas in vitro com aproximadamente 7,0 cm de altura e 0,7 cm de largura basal. Em cmara assptica, foi realizado corte da parte area 1 ,0 cm acima do rizoma com o auxlio de pina e bisturi flambados, retirando-se possveis razes. Os explantes foram inoculados em meio de cultura M1, isento de ftoreguladores, com as diversas concentraes de BAR Foram a seguir levados para sala de crescimento. O delineamento adotado foi o inteiramente casualizado e a avaliao foi realizada atravs do peso e do nmero de brotos emitidos aps 45 dias. Uma vez que existem autores que recomendam a utilizao de reguladores de crescimento (auxinas) para a induo do enraizamento em Musa e outros que dispensam a sua utilizao, realizou-se experimento para a determinao dos melhores reguladores de crescimento e concentraes adequadas a serem utilizados para o enraizamento de plntulas de bananeira "Ma". Para tanto, foram usadas 130 plntulas, com aproximadamente 3,5 cm de altura, originadas do cultivo in vitro e que ainda no estavam enraizadas. Os reguladores de crescimento testados foram as auxinas AIA, AIB e ANA, sendo que as plntulas foram inoculadas individualmente em tubos de ensaio contendo 25 ml de meio Ml, sem a presena de citocininas, com as auxinas citadas nas concentraes de 0; 0,1; 0,5; 1,0 e 5,0 mg.l -1 e 1,5 g.1-1 de gel (phytagel-Sigma) e mantidas em sala de crescimento. O delineamento foi inteiramente casualizado com cinco tratamentos (doses) e 10 repeties (1 plntula por repetio). A avaliao foi feita atravs do nmero de razes e comprimento do sistema radicular aps 14 dias da inoculao. Aps as plntulas atingirem 6-9 cm, foram levadas para casa de vegetao, onde foram aclimatadas em sacos plsticos de 10 x 12 cm, contendo mistura autoclavada de terra argilosa, matria orgnica e areia nas propores de 1:1:1, respectivamente. As

mudas foram colocadas dentro de cmara mida durante 4 dias. Aps este perodo, foram retiradas e mantidas dentro de casa de vegetao. As anlises estatsticas foram realizadas atravs de anlises de varincia e foi utilizado o teste de Tukey para os dados de contagem transformados segundo e atravs de equaes de regresso, quando necessrio.

RESULTADOS E DISCUSSO
Os pices caulinares inoculados, que a princpio possuam a colorao creme, adquiriram a colorao verde aps uma semana, CRONAUER & KRIKORIAN (1984) tambm observaram estas alteraes, porm, no presente trabalho, os explantes apresentaram leve escurescimento devido a oxidao superficial dos mesmos, a qual, no chegou a prejudicar o seu desenvolvimento. Durante os primeiros vinte dias ocorreu entumescimento dos explantes, que cresceram diametralmente. Aps 25-35 dias de cultivo iniciaram-se as brotaes que atingiram em mdia 5-6 brotos por explante em 45 dias de cultivo. Com relao capacidade de brotao de pices caulinares extrados de diferentes maneiras, aps um ms, os resultados podem ser vistos na TABELA 1. Em alguns casos, houve tendncia para a formao de plntulas nicas, sem brotaes laterais, isto ocorreu em alguns explantes pertencentes ao tipo 2. O tratamento que diferiu estatisticamente, apresentando o maior nmero mdio de brotos foi o de nmero 3, isto , os pices caulinares que sofreram a retirada das bainhas foliares e que continham o pice caulinar apical mais as gemas laterais.

NOVAK et al. (1987) utilizaram explantes que correspondem ao tipo 5 com a finalidade de induo de mutaes. No presente

trabalho, este explante apresentou tendncia para menor mdia iniciai de brotao (1,31 brotos em mdia), provavelmente devido a menor reserva nutricional contida e a maior possibilidade de estresse ambiental a que esto sujeitos devido ao seu pequeno tamanho. Porm este tipo de explante, quando originado diretamente de plantas do campo, minimiza a possibilidade de presena de vrus e outros patgenos segundo GUPTA (1986). Para trabalhos de pesquisa que visem maior taxa de multiplicao in vitro, o presente trabalho sugere a utilizao de pices caulinares do tipo 3, porm, os pices caulinares sem bainha foliares requerem maior trabalho para sua obteno. Para fins de micropropagao pode-se recomendar tambm o tipo 1, que aps o tipo 3, foi o que apresentou a tendncia de uma maior produo de brotos e alm disto exige menor trabalho para extrao. Vrios autores, assim como MURASHIGE (1974) recomendam cuidado na escolha do estado fsico do meio de cultura, uma vez que a taxa e o padro de crescimento e morfognese podem ser afetados A TABELA 2 apresenta as mdias de brotos obtidos a partir do cultivo in vitro de pices caulinares da var. Ma em meio semi-slido, lquido com agitao e lquido sem agitao durante 20 dias.

O meio lquido com agitao e o meio semi-slido foram os tratamentos que apresentaram maiores mdias (1,56 e 1,20 brotos, respectivamente) quando comparadas com o meio lquido sem agitao (0,49 brotos) Neste ltimo caso a falta de aerao do meio lquido sem agitao deve ter provocado a reduo na capacidade de brotao dos explantes, tal suposio concorda com MURASHIGE (1974) quando afirma que os explantes submergem quando em meio lquido estacionrio prejudicando a troca gasosa. O meio lquido apresentou mdia ligeiramente superior (no significativa) ao meio semi-slido, tal tendncia j havia sido observada por CRONAURER & KRIKORIAN (1984), porm, o meio lquido possui o inconveniente de no permitir uma boa sustentao para os explantes. Este meio pode ser usado para o

cultivo de pices caulinares muito pequenos, os quais sofrem mais com a dessecao, e inicialmente, no necessitam ser sustentados em posio fixa. Deve-se evitar a utilizao do meio lquido sem agitao, uma vez que, como sugerem os dados da TABELA 2 e de outros autores, como MURASHIGE (1974), a oxigenao fator importante para uma boa taxa de brotao. Como no houve diferena significativa entre os meios semislido e lquido para o cultivo de pices caulinares, sugere-se a utilizao dos semi-slidos, devido a maior facilidade de manuseio, e dispensa da utilizao de agitadores. Com relao influncia das concentraes de BAP na brotao de pices caulinares, os pesos mdios e o nmero mdio de brotos por tratamento aplicado, esto apresentados na TABELA 3. Nota-se que, em geral, na avaliao atravs de pesagens, a testemunha sem BAP apresentou o menor peso mdio (4,66 g). Quando se avaliou atravs da contagem do nmero de brotos, a testemunha e o tratamento com 2,5 mg/L apresentaram as menores mdias e a concentrao de 5,0 mg.l -1 de BAP, o maior valor, que entretanto no diferiu estatisticamente das outras concentraes.

Avaliando-se as mdias dos nmeros de brotos para as diferentes concentraes de BAP, observa-se que at 5,0 mg/l, houve uma tendncia para um aumento progressivo na formao de brotos nos pices caulinares medida que se elevou a concentrao do regulador de crescimento (BAP), ocorrendo, posteriormente, uma tendncia queda e estabilidade. GODINHO (1991), apesar de trabalhar com plantas de bananeira in vivo, tambm observou que com a adio de BAP, ocorria uma elevao na induo de novos brotos at certo ponto (10,0 mg.L1). Estes dados correspondem ao observado no

presente trabalho quando analisamos os dados de peso e nmero de brotos atravs das curvas de regresso, quando a concentrao de 10,0 mg. l-1 correspondeu ao ponto de mxima resposta, para as duas variveis analisadas e, 5,0 mg.1-1 foi a menor concentrao utilizada que produziu brotao satisfatria (Figura 2).

GUPTA (1986) recomendou a utilizao do BAP, nas concentraes de 0,7 a 5,0 mg.l-1, como citocinina indutora de brotaes in vitro em Musa. J LAMEIRA (1987) trabalhando com outras variedades de bananeira, recomendou a utilizao da concentrao de 2,5 mg.l-1 de BAP. Para a var. Ma a concentrao de 2,5 mg.l-1 parece desaconselhvel, pois produziu nmero relativamente baixo de brotos e no foi capaz de impedir o estmulo ao enraizamento, o qual uma vez iniciado reduz a formao de novos brotos. J a concentrao de 5,0 mg.l-1 parece ser a menor a permitir que os pices caulinares respondam com maior intensidade ao estmulo da brotao, no havendo enraizamento para trocas de meio a cada 25 dias. Pelos resultados observados na TABELA 3, o nmero crescente de brotos produzidos at a concentrao de 5,0 mg/L permite recomendar a utilizao de concentraes maiores do que 2,5 e menores do que 5,0 mg/L de BAP para a micropropagao da variedade Ma. Esta faixa deve ser suficiente para uma brotao adequada, impedindo o enraizamento (indesejvel nesta fase) e reduzindo os riscos da ocorrncia de variao

somaclonal que doses maiores poderiam acarretar. No se conhece ao certo todos os fatores que induzem a variao somaclonal, provavelmente, em bananeira, os principais fatores sejam a instabilidade gentica dos tecidos somticos, a presena de gemas adventcias formadas nos tecidos do rizoma, independentemente da presena de calos, e a taxa de repicagens in vitro e julga-se que os componentes do meio de cultura tambm influenciem neste processo, como os reguladores de crescimento em elevadas concentraes. SOUZA et al., (1994) observaram que plntulas de bananeira que passaram por sete subcultivos em meios contendo 7,5 e 10 mg/L de BAP apresentaram maiores freqncias de clulas com adio de cromossomos e reduo no nmero de clulas normais em relao a plntulas com menos tempo de cultivo ou em meios com menores concentraes de BAP. NOVAK (1991) atribui a trs principais causas o aparecimento de variao somaclonal durante a micropropagao de Musa: alteraes genticas j existentes nos tecidos dos explantes, variaes induzidas pela ao de mutagnicos do meio de cultura e variao devido ao estresse induzido pelas condies de cultivo. Portanto, at que existam evidncias que comprovem que nveis elevados de BAP no contribuem para aumento da variao somaclonal na var. "Ma", deve-se evitar altas concentraes. Com relao s melhores concentraes de auxinas para o enraizamento, foram anotados o comprimento mdio (TABELA 4) e o nmero mdio das razes (TABELA 5). Quanto ao comprimento das razes, observou-se de modo geral que, com exceo do IBA e NAA para a menor concentrao (0,1 mg/ L), medida que aumentaram as concentraes, houve uma tendncia diminuio do comprimento. Houve uma tendncia a aumento no nmero mdio de razes com as menores concentraes (0,1 e 0,5 mg/L). Os dados referentes ao nmero de razes tambm esto representados na Figura 3.

Levando-se em conta estes dois parmetros, pode-se recomendar para esta variedade a concentrao de 0,1 mgL de NAA ou IBA para o enraizamento. LAMEIRA (1987) trabalhando com outras variedades de bananeira, sugeriu a utilizao de 5 mg/L de IBA, o que, como se observou, no necessrio para a var. Ma. De fato, as plantas originadas do tratamento com 0,1 mg/L foram capazes de produzir enraizamento satisfatrio aps 1 ou 2 semanas e foram tranferidas aps 14 a 20 dias para casa de vegetao. As plntulas, possuindo de 6 - 9 cm de altura, apresentaram boa resposta ao transplante, sendo que as perdas foram mnimas (3 - 5%), em casa de vegetao, quando originadas de

enraizamento realizado em meio slido ou semi-slido. As perdas, no entanto, elevaram-se para 20% quando as plntulas foram obtidas do cultivo em meio lquido, observando-se o ataque por microorganismos na regio do colo das plantas. Uma provvel explicao para este fato que as plantas desenvolvidas em meio lquido sejam mais tenras e permitam mais facilmente o ataque de microorganismos do solo. CRONAURER & KRIKORIAN (1984) aps enraizarem plantas em meio semi-slido, aclimataram as mesmas em recipientes com vermiculita e mantiveram sob nebulizao por 10 a 14 dias, aps o que puderam ser transferidas para casa de vegetao. Para o presente trabalho foram utilizados mistura de solo, como substrato, composto de solo argiloso, estreo e areia, na proporo de 1:1:1 e os resultados foram favorveis, e no foram necessrios mais do que 4 - 5 dias sob nebulizao, para a transferncia para a casa de vegetao. Recomenda-se, ento, a passagem de brotos originados do cultivo em meio lquido para o meio slido ou semi-slido durante a fase de enraizamento de modo a garantir maior vigor para as plantas antes da aclimatao em casa de vegetao. Pode-se utilizar solo como substrato, e de preferncia utilizar nebulizao nos primeiros 4 - 5 dias de aclimatao, evitando-se porm que o solo fique encharcado.

CONCLUSES
1. O tipo de pice caulinar em que se obteve o maior nmero de brotos foi o que sofreu a remoo das bainhas foliares. 2. Para a micropropagao da bananeira pode-se utilizar meio lquido sob agitao ou meio semi-slido. 3. O tratamento de 5,0 mg.1-1 de BAP, foi a menor concentrao testada que induziu uma taxa de brotao satisfatria durante o cultivo de pices caulinares de bananeira "Ma". 4. Para a induo do enraizamento em plntulas de bananeira "Ma" in vitro, recomendase a utilizao de 0,1 mg.l-1 de AIB ou ANA, em meio semi-slido, na ausncia de citocinina. A utilizao destes reguladores de crescimento nestas concentraes permite o enraizamento das plntulas de bananeira, as quais aps aproximadamente 20 dias podem ser transferidas para a casa de vegetao.

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Recebido para publicao em 21.06.94 Aceito para publicao em 25.08.95

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