Os mtodos imunolgicos desenvolvidos para quantificar a concentrao de antgenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se tcnicas

padronizadas para pesquisa e aplicaes clnicas. ntre esses mtodos, um dos mais usados o !"#$ % nz&me-lin'ed immuno sorbent assa&(. )esse mtodo, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, covalentemente ligada a um anticorpo especfico que recon*ece um antgeno alvo. #e o antgeno estiver presente, o comple+o anticorpo-enzima ir, ligar-se a ele e a enzima catalisar, a reao. nto, a presena de produto colorido indica a presena de antgeno. -rata-se de um mtodo eficiente pois permite detectar quantidades de protena da ordem de nanogramas %./-0 g(. )o !"#$, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade. 1entre os diversos tipos de !"#$, destaca-se o !"#$ #$)12345 . )esse mtodo, o anticorpo de um antgeno particular , inicialmente, adsorvido no 6ell. 1epois, o antgeno %soro, urina ou outra soluo contendo o antgeno( adicionado e se liga ao anticorpo. 7inalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado 8 enzima adicionado. )esse caso, a intensidade da reao proporcional 8 quantidade de antgeno presente. !ogo, permite mensurar at pequenas quantidades de antgeno.

[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freem n nd !om" ny, #$$$%, ". &'#.(

9uanto ao mtodo de revelao, pode ser direto ou indireto. )o primeiro, a enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo, enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo. O !"#$ constitui a base do teste para infeco por 5":. )esse teste, protenas virais %os antgenos( adsorvem nos ;poos< %6ells( da placa de !"#$. m seguida, adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos antgenos. 7inalmente, anticorpos ligados 8 enzima ligam-se aos anticorpos *umanos, propiciando a reao enzim,tica com mudana de cor.

[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freem n nd !om" ny, #$$$%, ". &'#.(

EQUIPAMENTOS NECESSRIOS:
PLACA DE ELISA

htt")**+++., llisto.si.-sherb., ).$.$*iml/$#*im 0es*elis /.1"0

 PIPETAS AUTOMTICAS

htt")**+++.1 els .,om*im 0enes*"i"et &.1"0

htt")**" ndor .l b0eminis.,om).7$7*im 0es* .8#$$9-l.1"0

LEITOR DE ELISA 2eitor de "l , s 3245A

2eitor de tir s 3245A

htt")**+++.r,l,omer,i l.,om.br*dr 6e*i$$4.1"0

htt")**+++.l b0eminis.,om*"-bli,id d*l 9te,ni, 9elis .htm

LAVADOR AUTOMTICO DE PLACAS

htt")**+++.l b0eminis.,om*"-bli,id d*l 9te,ni, 9elis .htm

CUIDADOS:

1ata de validade e estocagem dos REAGENTES =rocessamento e estocagem das AMOSTRAS vitar contaminao e espuma no PREPARO DE SOLUES CALIBRAO de pipetas e demais aparel*os LIMPEZA

PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUCHE:

1O ANTICORPO

ANTGENO DA 2O ANTICORPO AMOSTRA

ANTICORPO LIGADO

MUDANA DE COR

A;A<TA;O ;3) htt")**+++.med4yo-. t*l borbef-nde*te,hni6en*en=yme*eli= .0if

4oloca-se, na placa de !"#$, soluo tampo contendo o primeiro anticorpo com concentrao con*ecida e suficiente para adsorver nos ;poos< %;6ells<( da placa. m geral, a soluo saturada. !avam-se os ;poos< com tampo de lavagem, de forma a retirar o tampo, mas dei+ar o anticorpo aderido 8 placa. $diciona-se soluo contendo protena de alto peso molecular, como a >#$ %$lbumina de #oro >ovino(, com o ob?etivo de bloquear as ,reas onde os anticorpos no aderiram na placa %stios inespecficos(.

htt")**+++.iitri.or0*5er:4mm-nolo0y.shtml

 @ealiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAO da placa est, cumprida. "ncubao com as amostras %solues teste com antgenos em concentrao descon*ecida devem ser adicionadas 8 placa( )ova lavagem e o antgeno que reagiu com o anticorpo previamente aderido 8 placa tambm permanecer, aderido. =or outro lado, os antgenos no ligados sero removidos. "ncubao com segundo anticorpo, seguida de lavagem. "ncubao com terceiro anticorpo anti-espcie con?ugado a uma enzima, como a peroxidase. #egue-se outra lavagem. $dio de substrato para revelao. -rata-se de um substrato incolor que, quando ativado pela poro enzim,tica do ligante, produz um produto final corado. $ mudana de cor pode ser lida diretamente em aparel*o apropriado. m geral, bloqueia-se a reao para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapal*e a leitura do teste. $lm de bloquear a reao, possvel adicionar um ,cido que provoque mudana para uma cor cu?a absorbAncia mel*or detectada pelo leitor de !"#$.

htt")**+++."ositi:ehe lth.,om*"ermit*Arti,les* !olon>#$He lth* br h m'#.htm htt")**+++.netri .,o.-6*im 0es*elis #.1"0

OBSERVAES IMPORTANTES
m geral, faz-se uma CUR A PADRO! preenc*endo B ;poos< de uma fileira com concentraes crescentes e

con*ecidas de antgeno. $ curva serve como padro de comparao para deduzir as quantidades de antgenos nas solues-testes. O gr,fico fornecido por um programa prprio para a leitura de !"#$.
3@3A<2O ;3 !BRCA <A;RDO

htt")**+++.shib y 0i.,o.1"*<rod?3*"rod9 6rie?#&&.htm

2m outro controle feito o TESTE BRANCO! que consiste na adio somente do tampo com o ob?etivo de avaliar se *ouve contaminao durante o e+perimento. O teste deve ser feito em DUPLICATA o" TRIPLICATA, servindo de controle para os erros de manuseio. $ mdia dos resultados deve ser avaliada e se *ouver diferena significativa, o e+perimento deve ser repetido. PROCESSAMENTO DA AMOSTRA# se a amostra for sangue, deve-se centrifugar, col*er o plasma ou soro, diluir e analisar. 4lulas em cultura devem ser trituradas, o tampo deve ter p5 adequado, substAncia detergente%para

lisar a membrana( e inibidores de proteases. 1epois, centrifuga-se e col*e-se o sobrenadante para an,lise.