Hidrlise da Sacarose Catalisada pela Invertase AutoImobilizada em Clulas Intactas de Cladosporium cladosporioides.

Ana Cludia Santana de Almeida1, Luciares Costa de Ara o1, Csar Au!usto "oraes de Abreu1, "aria Alice de Andrade #omes Lima1, "aria de Los An!eles $erez %ernandez $al&a1'
Universidade Federal de Pernambuco Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal 5 !" 5#1 Campus Universit$rio %eci&e PE E'mail( anacsa(c&es)'!ov'br
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*+S,"A enzima invertase (E.C. 3.2.1.26 - D-fructofuranosidase) catalisa a hidrlise da sacarose roduzindo uma mistura e!uimolar de "licose e frutose denominada a#$car invertido. % fun"o Clados orium clados orioides ossui invertase em sua constitui#&o' sendo interessante o uso dessa (iomassa como su orte de imo(iliza#&o natural ara tal enzima. % resente tra(alho teve or o()etivo determinar as condi#*es o eracionais timas da invertase auto-imo(ilizada' (em como seus ar+metros cin,ticos (- . e /m01). 2ara a avalia#&o dos ar+metros o eracionais foi realizado um lane)amento fatorial com leto 2 3. As vari0veis estudadas foram a tem eratura' o 3 e a a"ita#&o' e' como res osta' foi monitorado o ercentual de hidrlise. 2ara a determina#&o dos ar+metros cin,ticos foram realizados testes em (atelada nas condi#*es o eracionais timas. As condi#*es esta(elecidas ara o rocesso de hidrlise foram tem eratura de 64oC' 3 6 e so( a"ita#&o de 154 r m. A invertase auto-imo(ilizada a resentou um -. de 167'63 "89 e /m01 de 4':17 "89.min. I./*-0,12) sacarose * o ado+ante natural tradicionalmente usado na alimenta+,o humana por conta do seu sabor agrad$vel- valor nutritivo e baixo custo de produ+,o. Uma de suas &ontes naturais mais importantes * a cana'de'a+/car- contendo at* # 0 de sacarose em peso 123)4E% 5 678)7D9- 1::5;. ) hidr<lise da sacarose gera uma mistura e=uimolar de &rutose e glicose denominada a+/car invertido- =ue possui maior poder edulcorante- * mais &acilmente incorporado em preparos industriais e possui maior valor agregado =ue a sacarose. 6o >rasilcu?a capacidade produtora de sacarose * reconhecida internacionalmente- os estudos no sentido de viabili@ar economicamente a produ+,o de a+/car invertido tAm sido insipientes. 6o entanto- torna'se interessante a pes=uisa para a sua obten+,o a partir da sacarose de cana devido ao baixo valor de mercado deste produto. Bidr<lises $cidas e en@im$ticas tAm sido identi&icadas como vias =umicas e bio=umicas de convers,o de sacarose 1dissacardeo; em glicose e &rutose 1monossacardeos sol/veis;. ) acide@ gerada na hidr<lise $cida pode ser devida C a+,o direta de um $cido 1hidr<lise homogAnea; ou C libera+,o de BD de uma resina catiEnica 1hidr<lise heterogAnea;. ) hidr<lise $cida homogAnea * um processo econEmico- onde a escolha do $cido depende de sua compatibilidade com o produto &inal- por*m os xaropes assim obtidos s,o altamente coloridos devido Cs condi+Fes dr$sticas de rea+,o 1pB e temperatura; 1CB9U 5 G)H9IH8J- 1::K;. Por outro lado- o meio $cido promovido pela resina catiEnica pode causar perda de a+/car por

degrada+,o do mesmo- levando C &orma+,o do hidroximetil &ur&ural 1BLF; e por conse=MAncia- desenvolvimento de cor no xarope. ) hidr<lise en@im$tica catalisada pela invertase produ@ um alto grau de hidr<liseoriginando um produto de alta =ualidade com baixos teores de cin@as- cor e BLF 1%9D%72UEH et al.' # ;. 9 &ator limitante para a utili@a+,o da hidr<lise en@im$tica em escala industrial tem sido o elevado custo da invertase =ue est$- sobretudo- associado ao baixo rendimento obtido nos processos de extra+,o e puri&ica+,o desta en@ima. Por*m- de acordo com a literatura- a invertase produ@ida pelo microrganismo n,o * liberada para o meio- &icando retida no espa+o peripl$smico da c*lula 13UC)%767 et al.' # ;. 6este contexto- a utili@a+,o de biomassa do &ungo Clados orium clados orioides como suporte natural para invertase 1auto'imobili@a+,o; apresenta'se como uma tecnologia de baixo custo e com bons resultados- principalmente por o&erecer grande estabilidade operacional C en@imapossibilitando contnuas reutili@a+Fes sem perda signi&icativa de atividade. 9 bioprocesso de produ+,o de a+/car invertido- assim como =ual=uer processo biotecnol<gico- * muito complexo devido ao grande n/mero de vari$veis envolvidas. Portanto- um meio de cultura balanceado- ?untamente com valores <timos de temperatura- pBagita+,o e aera+,o s,o necess$rios para se alcan+ar boa produtividade 1>)73EJ 5 9337H1:NO;. Um recurso utili@ado em estudos =ue envolvem di&erentes vari$veis * a t*cnica de plane?amento &atorial =ue permite correlacionar as vari$veis independentes com as dependentes atrav*s de um n/mero mnimo de ensaios. ) metodologia do plane?amento &atorial associada a an$lise de super&cie de resposta * uma &erramenta &undamentada na teoria estatstica- &ornecendo in&orma+Fes con&i$veis do processo- minimi@ando o empirismo =ue envolve t*cnicas de tentativa e erro 1>9P et. al.- 1:!N;. )trav*s dessa t*cnica de plane?amento de experimentos * possvel avaliar a in&luAncia das vari$veis independentes nas vari$veis de respostas- bem como as intera+Fes entre ambas. ) partir da an$lise da variQncia pode'se obter um modelo probabilstico ade=uado =ue correlacione as respostas em &un+,o das vari$veis independentes- o =ue permite determinar os valores destas- otimi@ando o desempenho do bioprocesso 1%9D%72UEH et. al.- 1::N;. Desta &orma- este trabalho teve como ob?etivo empregar a metodologia do plane?amento &atorial de experimentos de modo a determinar as condi+Fes <timas para a hidr<lise en@im$tica da sacarose- utili@ando'se a en@ima invertase auto'imobili@ada na massa celular do &ungo Clados orium clados orioides' e a partir deste- determinar os parQmetros cin*ticos 8 L e IL$x. "A/+*IAL + "3/-0-S Licrorganismos e condi+Fes de cultura Foi utili@ada a linhagem Clados orium clados orioides U%L "KK1- pertencente C cole+,o do Departamento de Licologia da Universidade Federal de Pernambuco. )s culturas &oram conservadas sob re&rigera+,o- em meio sint*tico >D) 1>atata Dextrose Rgar; contendo 1gS3; glicose- # - e $gar- 15- - e repicadas a cada K dias- podendo ser visuali@adas em sua &orma &ungi&orme na Figura 1). Para o crescimento do &ungo- &oram inoculados cerca de 1 O esporos em erlenmeTers de #5 m3 contendo 1 m3 de meio semi'sint*tico C@apecU- cu?a composi+,o * 1gS3;( 6a69 KK- V 8Cl- -5V LgH9".!B#9- -5V FeH9".!B#9- - 1V 8#BP9"- 1- V Hacarose- K - . 9 &ungo cresceu sob agita+,o constante de K rpm- C temperatura ambiente 1#NW# XC;- durante # 1vinte; dias. 9 processo de crescimento &oi acompanhado por medidas de pB e testes de pure@a =uanto a contaminantes microbianos- atrav*s de observa+Fes microsc<picas. ) agita+,o aplicada permitiu a &orma+,o de ellets com diQmetro m*dio de -1K# mm- =ue

podem ser visuali@ados na Figura 1>. Yais ellets &oram utili@ados como suportes da en@ima usada como biocatalisador no processo de hidr<lise.

Figura 1) ' Clados orium clados orioides em sua &orma &ungi&orme

Figura 1> ' Clados orium clados orioides em sua &orma Zpelleti@ada[

4ariveis A!ita9:o pH

9timi@a+,o do Processo de Bidr<lise 9s experimentos de hidr<lise en@im$tica &oram reali@ados em sistema descontnuo- com e sem agita+,o- utili@ando'se como substrato solu+Fes de sacarose 1concentra+,o de 5 gS3; preparadas em tamp,o acetato de s<dio -1L- pB " e O. Para os testes de hidr<lise- Kg de c*lulas na &orma de ellets &oram incubadas em erlenmeTers de 5 m3 contendo K m3 das solu+Fes de sacarose e submetidas aos ensaios do plane?amento &atorial por 1N minutos. Para a otimi@a+,o do processo de hidr<lise da sacarose &oi utili@ado um plane?amento &atorial completo em trAs nveis 1#K;- totali@ando N ensaios- em duplicata- reali@ados de &orma aleat<ria. )s vari$veis estudadas &oram a temperatura- o pB e a agita+,o- cu?os nveis est,o apresentados na Yabela 1.

.5veis

In)erior 6 -7 Sem
5 In)erior 6-7

Superio

Yabela 1 6veis das vari$veis estudadas no plane?amento &atorial # K aplicado C hidr<lise en@im$tica da sacarose.

4ariveis A!ita9:o 6A7, rpm pH /emperatura 6/7, oC

.5veis Superior 687 1! O !

Com ;

< "

o => %edutores Yotais 1glucose D /emperatura meio da E=ua+,o 6 1- C7 onde \)%Y] * a concentra+,o de )+/cares
&rutose; e H * a concentra+,o inicial de sacarose- ambas em gS3.
0 de Bidr<lise = \)%Y] x1 H

9s experimentos &oram monitorados atrav*s da porcentagem de hidr<lise- calculada por

?>

11;

) dosagem dos a+/cares redutores 1glucose e &rutose; &oi reali@ada pelo m*todo do D6H 1Rcido Dinitrossaliclico;. 9 procedimento utili@ado * uma varia+,o do m*todo original 1L733E%- 1:5:;. De acordo com esse m*todo- os a+/cares redutores redu@em o D6H- gerando complexos de colora+,o alaran?ada- os =uais podem ser =uanti&icados por espectro&otometria a 5" nm. ) constru+,o de uma curva'padr,o contendo glicose permite associar a absorbQncia C concentra+,o dos produtos da rea+,o de hidr<lise 1%7>E7%9- 1::!;.

Estudos Cin*ticos ) cin*tica da invertase auto'imobili@ada &oi analisada segundo o m*todo das velocidades iniciais de rea+,o- de acordo com o modelo cin*tico de Lichaelis'Lenten- a partir do =ual &oram determinados os parQmetros cin*ticos IL$x e 8L- nas condi+Fes <timas do experimento. Como a invertase apresenta'se auto'imobili@ada no &ungo- &oi necess$rio determinar a concentra+,o de massa &/ngica =ue otimi@a o processo de hidr<lise. Em estudos pr*viosconstatou'se =ue a melhor concentra+,o de trabalho * de 1 gS3. 9s testes cin*ticos &oram reali@ados em sistema descontnuo- sob as condi+Fes <timas obtidas no plane?amento &atorial reali@ado. Para isso- a en@ima auto'imobili@ada &oi incubada em di&erentes concentra+Fes de sacarose 1# - " - O - N - 1 - # - K - " - 5 e O gS3; durante K 1trAs; horas. ) cada # minutos &oram coletadas amostras para a dosagem de )%Y. ) velocidade da rea+,o para cada experimento &oi calculada utili@ando'se a E=ua+,o #- na =ual I * a velocidade da rea+,o- em gS3.minV \)%Y] * a concentra+,o de a+/cares redutores &ormada durante a hidr<lise da sacarose- em gS3 e t * o tempo de rea+,o- em minutos.
I=

[ )%Y]
t

1#; *+S,L/A0-S + 0ISC,SS2-

9timi@a+,o do Processo de Bidr<lise ) Yabela # apresenta as condi+Fes dos ensaios de hidr<lise para o plane?amento &atorial #^bem como os resultados obtidos em termos da porcentagem de hidr<lise. De acordo com essa tabela- para a reali@a+,o do ensaio 1- por exemplo- utili@ou'se as vari$veis do processo 1agita+,o- pB e temperatura; em seus nveis in&eriores 1con&orme Yabela 1;- obtendo'senestas condi+Fes- um percentual m*dio de hidr<lise de K5-1O. Da mesma &orma- no ensaio N=uando &oram utili@ados os nveis superiores das vari$veis- obteve'se :"-1!0 de hidr<lise.
Yabela # Latri@ do plane?amento &atorial #^ analisando'se o e&eito da agita+,o- do pB e da temperatura 10;

+nsaio 1 # K " 5 O ! N

A ' D ' D ' D ' D

pH ' ' D D ' ' D D

/ ' ' ' ' D D D D

Hidrlise6@7 KK-5# KO-N "K-K5 "!-!K O5-#1 !1-!! !!-#K N1-O "#-#O KN-:N "5-5" "!-!K :1-"" N!- ! :5-N1 :K-5K

"dia 6@7 K5-1O "5-5" ON-": !:-"# " -O# "O-OK N:-#O :"-1!

9s e&eitos principais de cada vari$vel do processo e a=ueles resultantes da intera+,o entre elas &oram calculados utili@ando'se o soft;are <tatistic for =indo;s vers,o 5. . 9s resultados est,o apresentados na Yabela K. De acordo com esta tabela- todas as vari$veis s,o signi&icativas e possuem e&eitos positivosou se?a- para as condi+Fes estudadas- os nveis superiores destas vari$veis &avorecem a hidr<lise.

Yabela K E&eitos calculados para o plane?amento &atorial #K

+)eitos "dia !lobal +)eitos principais )gita+,o 1); pB Yemperatura 1Y; +)eito de intera9:o de dois )atores )gita+,o x pB )gita+,o x Yemperatura pB x Yemperatura +)eito de intera9:o de trAs )atores )gita+,o x pB x Yemperatura
_Ialores signi&icativos 1:50 de con&ian+a;

+stimativa erro padr:o O#-"1 W -!K_ N- O W 1-"O_ " -N" W 1-"O_ 1 -5# W 1-"O_ ' -1" W 1-"O ' #-5: W 1-"O !-#" W 1-"O_ ' -"1 W 1-"O

Pela an$lise dos e&eitos apresentados na Yabela K- nota'se =ue aumentando'se o pB de " para O- ocorre um aumento m*dio de " -N"0 no percentual de hidr<lise. 7sto sugere =ue as en@imas microbiol<gicas s,o mais ativas no intervalo de pB =ue viabili@a a c*lula e- no caso da invertase auto'imobili@ada em c*lulas de Clados orium clados orioides- a atividade m$xima ocorre com pB em torno de O- como pode ser observado na Figura #)- onde se analisa o percentual de hidr<lise em &un+,o do pB e da agita+,o. Da mesma &orma- =uando a temperatura passa de 5 oC para ! oC- h$ um aumento m*dio do percentual de hidr<lise de 1 -5#0. 6o entanto- aumentando'se a temperatura acima deste valor- observa'se um decr*scimo na atividade- o =ual est$ associado C redu+,o da estabilidade da en@ima devida C desnatura+,o proteica. De acordo com a super&cie de resposta da Figura #>- nota'se =ue a temperatura <tima de hidr<lise * de ! `C. Quanto C agita+,o- observa'se =ue o sistema agitado aumenta a atividade em cerca de N0uma ve@ =ue ocorre um aumento na super&cie de contato l=uido's<lido- o =ue redu@ as resistAncias C trans&erAncia de massa. 6o entanto- a agita+,o durante a rea+,o de hidr<lise apresenta menos in&luAncia =ue as demais vari$veis estudadas.

38,305 43,641 48,976 54,311 59,647 64,982 70,317 75,653 80,988 86,323 above

42,41 48,013 53,617 59,22 64,824 70,427 76,031 81,635 87,238 92,842 above

Figura #) ' Per&il da porcentagem de hidr<lise em &un+,o do pB e da )gita+,o

Figura #> ' Per&il da porcentagem de hidr<lise em &un+,o do pB e da Yemperatura

Para a invertase da levedura <accharom>ces cerevisiae &oi determinado o pB <timo no intervalo de K.5 a O. - dependendo da concentra+,o de substrato e dos tampFes utili@ados 1H7L796EHCU et. al.- 1:N!V a7HEL)6 5 a99Da)%D- 1:!5;- ?$ para a invertase do &ungo As er"illus ni"er' em pB ".!- a temperatura <tima encontrada &oi 55`C 1L96H)6 5 C9L>%EH- 1:N";. Estes resultados demonstram =ue h$ di&erentes pB para cada invertase- dos

di&erentes microrganismos =ue a produ@em. ) temperatura =ue otimi@a o processo de hidr<lise * &un+,o do tipo de en@ima e das condi+Fes experimentais- tendo sido reportados valores no intervalo de "5 a !K`C 1>E%2)L)HC9 et. al.- # V a7HEL)6 5 a99Da)%D1:!5;. Determina+,o dos ParQmetros Cin*ticos 18L e Im$x; 9s parQmetros cin*ticos da rea+,o en@im$tica &oram calculados pela lineari@a+,o de 3inebeaver'>urU para o modelo cin*tico de Lichaelis'Lenten. ) partir dos valores estimados pela regress,o linear da curva 1SI em &un+,o de 1SH- apresentada na Figura Kobteve'se para a en@ima auto'imobili@ada- um 8L de 1"5-OK gS3 1"#OmL; e um IL$x de -:15 gS3.min. 9 valor de 8L encontrado &oi maior =ue a=ueles encontrados na literatura para a invertase livre 1#"mL ;)82c3 et. al.- # 1V 1"OmL; Y)6%7HEIE6- ).- # 1V 1##!mL; %U>79 et. al.- # #;. Esta mudan+a na a&inidade da en@ima pelo substrato * provavelmente causada pela menor acessibilidade do substrato ao stio ativo da en@ima auto'imobili@ada. Quanto ao valor de IL$x- este * menor =ue a=ueles encontrados nos trabalhos citados para a en@ima livre. 6o entanto- os valores de 8L e IL$x para a invertase livre e auto'imobili@ada est,o na mesma ordem de grande@a- indicando =ue a &un+,o cataltica desta en@ima n,o * pre?udicada por este m*todo de imobili@a+,o- al*m de poder ser utili@ada in/meras ve@esmantendo os padrFes de =ualidade e =uantidade.

10
-1 1/V(g/L.min)

y = 159,23x + 1,0934

8 6 4 2 0 0 0,01 0,02 0,03 1/S (g/L) -1 0,04 0,05 0,06

Figura K 3ineari@a+,o de 3inebeaver'>urU para a invertase auto'imobili@ada

C-.CL,SB+S Com base nos resultados obtidos- conclui'se =ue o plane?amento &atorial condu@iu C identi&ica+,o das vari$veis de maior in&luAncia no processo de hidr<lise da sacarose por via en@im$tica. ) condi+,o operacional estabelecida como <tima &oi temperatura de ! `C- pB O e sob agita+,o moderada- condi+,o concordante com os trabalhos citados na literatura- =ue utili@am agita+,o in&erior a K rpm- pB de "-5 a O e temperaturas em torno de O `C. Quanto C cin*tica aplicada C invertase auto'imobili@ada no &ungo Clados orium clados orioides- observa'se =ue o modelo cin*tico de Lichaelis'Lenten representa satis&atoriamente o comportamento apresentado por esta en@ima. Quando comparado com os valores encontrados na literatura para a invertase sol/vel- veri&ica'se =ue o valor de 8 L obtido para a en@ima auto'imobili@ada * maior. Este &ato pode estar relacionado com a resistAncia ao transporte de massa imposta pela estrutura celular- o =ue n,o ocorre com a invertase sol/vel. )pesar das limita+Fes di&usivas impostas pela estrutura celular- esta atua como um suporte de imobili@a+,o da en@ima- =ue parece melhorar a estabilidade operacional da invertase- o =ue ?usti&ica o uso da c*lula no lugar da invertase sol/vel em biorreatores industriais.

*+%+*C.CIAS DIDLI-#*E%ICAS
)Ugdl- H.V 8a+ar- J.V Deni@li- ).V )rica- L.J. 1# 1;- BTdrolTsis o& sucrose bT invertase immobili@ed onto novel magnetic polTvinTlalcohol microspheres. ?ood Chemistr>- v.!"- #N1'#NN. >aileT- G.E.V 9llis- D.F. 11:NO;- @iochemical En"ineerin" ?undamentals. # ed. Hingapure- Lc2rab'Bill >ooU CompanT. >ergamasco- %.V >assetti- F.G.V Loraes- F.F.V 4anin- 2.L. 1# ;- Characteri@ation o& &ree and immobili@ed invertase regarding activitT and energT o& activation. @iochemical En"ineerin" Aournal- v. # - 11#K'11#:. >ox- 2. E. P.V Bunter- a. 2. 5 Bunter- G. H. 11:!N;- <tatistics for E1 erimenters . 6eb JorU- Gohn aileT 5 Hons. Chou- C.C. 5 GasovsUT- 2.). 11::K;- )dvantages o& Ecosorb YL precoats in li=uid sugar production. Bnternational <u"ar Aournal- v. :5- n. 11KN- p. "#5'"K . 2la@er- 6. e 6iUaido- B. 11::5;- Licrobial >iotechnologT( Fundamentals o& )pplied LicrobiologT. # ed. 6eb JorU- a.B. Freeman and CompanT. 3ucarini- ).C.V Pessoa'Gr- ). e Iitolo- L. 1# ;- Iariabilidade na determina+,o da constante cin*tica de Lichaelis'Lenten da invertase presente em c*lulas de <accharom>ces cerevisiae. BnC DBBB <B.2E<B% FACB%FA9 DE ?EG.EFHAIJE<- N- Yeres<polis- >rasil. Liller- 2.3. 11:5:;- Use o& dinitrosalicTlic acid reagent &or determination o& reducing sugar. Anal>tical Chemistr>- v. K1- n. K- p. "#O'"#N. Lonsan- P.V Combres- D. 11:N";- )pplication o& immobili@ed invertase to continuous hTdrolTsis o& concentrated sucrose solutions. @iotechnolo"> and @ioen"ineerin"- v. #"- K"!'K51. 6eto- >.>.V Hcarminio- 7.H.V >runs- %.E. 11::5 )' 2lane)amento e %timiza#&o de E1 erimentos. Campinas( Editora da Unicamp- #::p. 1s*rie manuais;. %ibeiro- %.%. 11::!;- Caracteri@a+,o cin*tica da invertase imobili@ada em Dobex 1PN'5 . Disserta#&o de .estrado- Faculdade de CiAncias FarmacAuticas da UHP- H,o Paulo- >rasil. %odrigues- L. 3.V 8alil- H. G.V Laugeri- F. 11::N;- Plane?amento Fatorial e ZHcreening Design[ como &erramenta para 9timi@a+,o de Processos >io=umicos. BnC DBB <B.2E<B% FACB%FA9 DE ?EG.EFHAIJE<' UberlQndia>rasil. %odrigues- L.I.6.V %odrigues- %.).F.V Herra- 2.E.V )ndrietta- H.%.V Franco- Y.Y. 1# ;- Produ+,o de xarope de a+/car invertido obtido por hidr<lise heterogAnea atrav*s de plane?amento experimental. CiKncia e Hecnolo"ia dos Alimentos- v.# - n. 1. %ubio- L.C.V %unco- %.V6avarro- ).%. 1# v. O1- O 5'O :. #;- 7nvertase &rom a strain o& Ghodotorula "lutinis. 2h>tochemistr>-

Himionescu- C.V Popa- L.V Dumitriu- H. 11:N!;- 7mmobili@ation o& invertase on the Dia@onium Halt o& "')mino >en@oTlcellulose. @iotechnolo"> and @ioen"ineerin".- v. #:- KO1'KO5. Yanriseven- ). 1# 1;- 7mmobili@ation o& invertase bithin calcium alginate gel capsules. 2rocess @iochemistr>v. KO- n. 11-1 N1'1 NK.e aiseman- ).V aoodbard- G. 11:!5;- 7ndustrial Jeast 7nvertase Htabili@ation. 2rocess @iochemistr>- v. 1 - #"'K .