SaBios: Rev. Sade e Biol., v.7, n.1, p.91-98, jan./abr.

, 2012 ISSN:1980-0002

Ar tigo Completo

ANLISE DO POTENCIAL MUTAGNICO DA SEIVA DA CASCA DE Croton lechleri (Mll. Arg), NO ESTADO DE RONDNIA, AMAZNIA OCIDENTAL
Fabiane Fo , Renato Andr Zan , Filomena Maria Minetto Brondani , Leandro Jos 4 5 Ramos , Dionatas Ulises de Oliveira Meneguetti
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R S!"# No estado de Rondnia muitas plantas so usadas na Medicina popular para o tratamento de enfermidades, dentre elas a espcie Croton lechleri, conhecida na regio como sangue-de-drago, produtora de ltex cuja composio qumica rica no alcalide taspina, reconhecido por sua ao antiinflamatria, analgsica e cicatrizante. O presente estudo objetivou analisar a mutagnicidade do extrato metlico de C. lechleri (sangue-de-drago), por meio do teste de microncleo em Allium cepa. Para tanto, utilizou-se de uma pesquisa descritiva-exploratria com abordagem qualitativa. Os resultados obtidos mostraram que, em concentraes 0,1 mL, 0,3mL e 0,6mL, no ocorrero atividades mutagnicas, j na concentrao de 1mL, esta atividade foi observada, alertando quanto ao uso indiscriminado de fitoterpicos. relevante ressaltar que as concentraes estudadas so diludas em 50ml de H2O, j quando absorvidas por humanos ser diluda na corrente sangunea que de aproximadamente 5000ml, sendo indicado testes em animais para melhor compreenso dos efeitos mutagnicos desse extrato vegetal.

$alavras-%&ave: Mutagenicidade; Croton lechleri; Microncleo; Allium cepa.

ANALYSIS OF MUTAGENIC POTENTIAL OF THE SAP FROM THE BARK OF CROTON LECHLERI (Mll. Arg) ON STATE OF RONDONIA, WESTERN AMAZON
'BS(R')( Many plants are used in popular medicine to treatment of several illnesses in Rondonia State, including Croton Lechleri species. C. lechleri is known in the region as blood-of-dragon and it produces latex which is rich in taspina alkaloid, recognized by its anti-inflammatory, analgesic, and healing actions. This research aimed to study the mutagenicity of C. lechleri (blood-ofdragon) methyl extract by micronucleus test in Allium cepa. The results showed that at concentrations of 0.1 mL, 0.3 mL and 0.6 mL, mutagenic activity was not observed. Mutagenicity was present in concentration of 1.0 mL. Thus, it alerts about risks of indiscriminate use of herbal medicines. It is important to note that the tested concentrations are diluted in 50ml of H2O, although, when absorbed by humans it will be diluted in bloodstream (approximately 5000ml). Thus, animal testing is indicated to better understand the mutagenic effects of this plant extract.extract.

*e+,ords: Mutagenicity; Croton lechleri; Micronucleus; Allium cepa.

1Graduada em Qumica, pela Faculdade de Educao e Meio Ambiente (FAEMA). 2 Qumico, Mestre em Qumica, ocente (FAEMA. ! Qumica, Mestre em "iolo#ia E$perimental, %oordenadora do %urso de Qumica da FAEMA.& Fisioterapeuta, Mestrando em "iolo#ia de A#entes 'n(ecciosos e )arasit*rios, ocente da FAEMA. + "i,lo#o, Mestre em Gen-tica e .o$icolo#ia Aplicada, ocente da FAEMA.

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INTRODUO
Por muito tempo, as plantas medicinais e seus extratos constituram a maioria dos medicamentos, sendo somente no sculo XIX que os qumicos comearam a questionar sobre as verdadeiras propriedades dos extratos obtidos de fontes vegetais, sendo aos poucos a utilizao dos mesmos substitudos por substncias ativas isoladas (1). Cerca de 70-95% da populao mundial ainda depende de medicamentos tradicionais para a ateno bsica em sade, mesmo sem a investigao cientfica necessria para fornecer a evidncia de sua segurana e eficcia (2). Uma grande parte da composio qumica das plantas de uso medicinal ainda desconhecida pela cincia, e dados recentes afirmam que cerca de 99% das plantas medicinais endmicas do Brasil ainda no tm seus princpios ativos identificados (3), o que representa um grande potencial farmacolgico e econmico a ser explorado, tornando-se imprescindvel avaliao das potencialidades qumicas das plantas brasileiras, em especial as espcies vegetais da regio amaznica (4), onde a grande maioria dessas plantas no foram estudadas do ponto de vista qumico e outras ainda nem foram catalogadas pela cincia (5). Algumas dessas plantas que apresentam propriedades medicinais podem conter substncias txicas, o que torna errado o conceito de que plantas so medicamentos naturais, portanto livres de efeitos txicos, sendo assim, tornando-se necessrio o conhecimento cientfico das caractersticas de determinadas plantas, bem como o seu potencial mutagnico, uma vez que as plantas vm sendo usadas como fitoterpicos sem nenhum conhecimento dos seus efeitos em longo prazo, podendo ocasionar possveis consequncias a quem faz uso das mesmas (6). A triagem de extratos de plantas da Amaznia visando procura de produtos naturais bioativos para ensaios biolgicos simples ir estabelecer um modelo para novas investigaes nesse campo para preservar, estudar e explorar racionalmente o bioma amaznico do Estado de Rondnia (7), sendo necessria a avaliao do potencial mutagnico para aumentar a segurana no uso feito pela populao (8).

Na Amaznia, existem inmeras espcies de plantas que possuem propriedades medicinais (9). A famlia Euphorbiaceae umas das maiores das Angiospermae, com cerca de 300 gneros e aproximadamente 7.500 espcies, dentre suas espcies se destaca a espcie C. lechleri, conhecida como sangue-de-drago, sua rvore pode chegar at 20m de altura (10). A espcie C. lechleri utilizada como planta medicinal h sculos pelas comunidades indgenas da Amaznia, sua casca produz um ltex viscoso cor de sangue, conhecido por este motivo como sangue-dedrago. A planta apresenta tambm outros nomes vernaculares como sangue-de-drago e sangue-de-drago (no Brasil), sangre-de-grado (na Bolvia, Peru e Equador). Com fins teraputicos para a cura de diversas enfermidades por apresentar: atividade antiinflamatria, cicatrizante de feridas, antidiarrica, analgsica bucal e para a cura de lceras estomacais (11). Diversos compostos qumicos so extrados da C. lechleri, seus principais princpios ativos so o 3',4-O-dimetilcedrusina, que atua sobre os radicais livres e a taspina, um alcalide incomum com uma estrutura dilactone com um tomo de nitrognio no includo em um anel heterocclico (12), e apresenta atividades antiinflamatrias, antibiticas e cicatrizantes (13, 14, 15, 16), j os compostos fenlicos como, a proantocianidinas, diterpenos, catequinas, epicatequina, galocatequina e epigalocatequina, so conhecidos como potentes inibidores da toxina da clera (17), porm poucos so os estudos realizados para deteco da ao mutagnica do extrato dessa planta. Os efeitos mutagnicos podem ser observados por meio da formao de microncleos, que so pequenos corpos contendo cidos desoxirribonucleicos (DNA), localizados no citoplasma, resultantes de quebras cromossmicas, formando fragmentos acntricos, ou com sequncias de cromossomos inteiros que no se prendem ao fuso mittico e dessa forma, no chegam aos plos das clulas durante a mitose ou a meiose (18). Um cromossomo inteiro ou fragmento cromossmico acntrico no se integra ao novo ncleo (por no estar unido), este tambm pode constituir um pequeno ncleo individual, chamado de microncleo (19), (Figura 1).
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lechleri (sangue-de-drago), por meio do teste de microncleo em A.cepa.

MATERIAL E MTODOS
OBTENO DO EXTRATO As cascas da planta em estudo foram obtidas na chcara 36, situada na RO 257, Km 12 no municpio de Ariquemes no Estado de Rondnia (RO), Brasil, na data de 16/03/2011, sendo encaminhadas para o Laboratrio de Farmacognosia da Faculdade de Educao e Meio Ambiente (FAEMA) no Municpio de Ariquemes, RO. As cascas foram cortadas em tamanhos pequenos, para aumentar a superfcie de contato, em seguida deixadas em contato com o solvente em um becker pelo perodo de dois dias. O solvente utilizado foi o lcool metlico, devido as suas caractersticas de polaridade, possibilita a extrao de um maior nmero de compostos, o qual foi armazenado em recipiente fechado em temperatura ambiente at o momento dos ensaios posteriores. Para a obteno de um extrato puro, foi realizada a evaporao do solvente, sendo utilizado Evaporador Rotativo (Q344B- QUIMIS). ANLISE MUTAGNICA Foram utilizados exemplares de A. cepa, de tamanho pequeno, uniforme, de mesma origem, no germinados e saudveis, adquiridos no mercado municipal do Municpio de Ariquemes, Rondnia, Brasil, tendo incio no dia 29/04/2011 e trmino no dia 07/05/2011. Os bulbos foram postos a germinar, por um perodo de seis dias a temperatura de 25C, em frascos apropriados, com a parte inferior mergulhada em soluo contendo 50mL de gua destilada e o extrato vegetal em teste, em cinco concentraes diferentes, com 10 repeties cada. O primeiro experimento contendo apenas gua destilada, os seguintes 0,1mL; 0,3mL; 0,6mL e 1mL de extrato da planta (Figura 2).

Figura 1. Formao de microncleos em clulas eucariticas (Imagem: Dionatas Ulises de Oliveira Meneguetti). O teste de microncleos detecta mutagnese em organismos eucariotos do tipo clastognese, aneugnese e danos no fuso mittico. Os microncleos so identificados em qualquer tipo de clula, podendo os microncleos serem avaliados para diagnstico de doenas hematolgicas em clulas epiteliais da boca, do trato urinrio e tambm monitorar ambientes atravs de testes com roedores e plantas (20). Para que o microncleo seja visualizado necessria uma diviso celular aps a ocorrncia mutagnica, sendo necessrio fazer o cultivo celular, ou usar clulas que esto se multiplicando constantemente, como a medula ssea e razes (21). O sistema de teste de microncleo em razes da espcie Allium cepa (cebola), definido como sendo um dos melhores para estudos de monitoramento ambiental e mutagnicidade de plantas medicinais, por sua sensibilidade e exatido, e, porque as razes da A. cepa possuem processo de diviso celular similar aos do homem (22). Na regio do vale do Jamar, que abrange o municpio de Ariquemes, RO, o mtodo utilizando razes da A. cepa, foi adaptado para aplicabilidade em estudos ambientais e farmacolgicos, sendo o mesmo descrito por Meneguetti et al., 2011 e publicado no congresso da Sociedade Brasileira de Mutagnese Carcinognese e Teratognese Ambiental (SBMCTA) (23). O presente estudo objetivou analisar a mutagnicidade do extrato metlico de C.

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Figura 2. eminao de Allium cepa em e!trato de C. lechleri (Imagem: Dionatas Ulises de Oliveira Meneguetti). Quando as razes atingiram o comprimento de 0,5 a 3cm, foram coletadas para anlise de microncleos, lavadas em gua destilada, hidrolisadas com HCl a 1mol/L por 10 minutos em banho-maria a 60C e aps, sendo os tubos de ensaio resfriados em gua corrente. Aps a lavagem dos meristemas hidrolisados em gua destilada foram feitos esfregaos em duas lminas para todas as concentraes, totalizando 100 lminas e aps 30 minutos de secagem as lminas foram coradas com o Kit Pantico Rpido LB que composto de trs recipientes: o primeiro com triarilmetano a 0,1%, o segundo com xatenos a 0,1% e o terceiro com tiazinas a 0,1%, sendo as lminas mergulhadas 10 vezes em cada recipiente com submerso de 1 segundo de durao na sequncia acima descrita. Posteriormente, as lminas foram lavadas em gua destilada e secas temperatura ambiente. Em cada repetio das doses, foram preparadas duas lminas com um total de 100, sendo 20 para cada dose. A avaliao das lminas consistiu na observao da presena de microncleos em 1.000 clulas em interfase por bulbo em microscopia ptica, com objetiva de 40x e ocular de 10x tendo um aumento de 400x (Figura 3). Para a anlise estatstica foi utilizada varincia (ANOVA), teste no-paramtrico TUKEY, utilizando o Software Graphad PRISM 5.0.

RESULTADOS E DISCUSSO
EXTRATO Aps a retirada do solvente (lcool metlico), com o uso de evaporador rotativo a uma temperatura constante de 60C, sendo esse processo repetido por trs vezes para obter o mximo possvel de extrato puro, obteve-se uma quantidade de 63,5 g de extrato a partir de uma quantidade de 356,4 g da casca da planta estudada, tendo um rendimento de 17, 8 % de extrato puro. O liquido obtido aps todo o processo de rotaevaporao era viscoso e de cor vermelho escuro. MICRONCLEO Os resultados obtidos por meio da anlise mutagnica do extrato da seiva da C. lechleri, esto representados na (Tabela 1). Tabela 1. )mero e mdia de microncleo% em A. cepa a cada #$$$ clulas "or l*minas e tratamentos.

Figura 3. Microncleo em clula de Allium cepa e!"osta (ocular: #$!% o&'etiva ($!) (Imagem: Dionatas Ulises de Oliveira Meneguetti). /a"ios0 1e2. /a3de e "iol., 2.4, n.1, p.51657, 8an.9abr., 2:12 ;ttp099<<<.re2ista.#rupointe#rado.br9sabios9

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Observando os dados da tabela acima, nota-se a presena de 5,7 microncleos por lminas no controle, contendo H2O, mostrando que o mesmo est dentro da normalidade. Para os tratamentos contendo 0,1mL, 0,3mL, 0,6mL, de extrato obteve-se respectivamente 7,4; 7,35 e 12,25 microncleos por 1.000 clulas (p>0,05), no havendo significncia estatstica dos mesmos em relao ao controle negativo, no aumentando assim, a probabilidade de ocorrncia de mutagenicidade pelo uso dos mesmos nas respectivas doses (Figura 4). A no ocorrncia de mutagenicidade provocada pelo extrato de C. lechleri, foi observada em estudo realizado com teste Ames/Salmonella, onde nenhuma atividade mutagnica foi encontrada, mostrando ainda efeitos inibitrios s atividades mutagnicas do 2-aminoantraceno e 2-nitrofluorene (24), mostrando que essa planta possui baixa toxidade, sendo a mesma tolerada para estudos clnicos (16), e ainda apresenta atividade com propriedades anti-tumoral e antimutagnica, podendo inibir a proliferao de clulas leucmicas nos humanos (9, 16, 24, 25, 26, 27). J para o tratamento, contendo 1mL do extrato o ndice de microncleo por 1.000 clulas foi de 39,7 sendo (p<0,001) obtendo-se uma alta significncia estatstica (figura 4), mostrando que a dose de 1mL aumenta significativamente o potencial mutagnico. Esse potencial mutagnico j foi relatado em estudo realizado por meio do teste Salmonella/microssoma, onde foi detectado mutaes do tipo: substituio de pares de base, reverses e frameshift (28).

contraceptivo do ltex indicada uma gota em gua morna durante a menstruao ou dois dias depois (30,31), alm de serem relatadas indicaes de curandeiros da cidade de Iquitos, Peru, e suas respectivas formas de preparao e doses a serem administradas pelas mulheres, mencionando que o ltex pode ser tomado nas seguintes formas: seis gotas dissolvidas em uma colherada de gua, em jejum, um dia antes e um dia depois da menstruao; tambm na forma de banhos, colocando-se uma colher de ltex em litro de gua, depois de cada relao sexual; em jejum, pode-se tomar, no quarto dia da menstruao, por dez dias consecutivos, cinco gotas de ltex em uma colher de gua tbia (32). Mesmo antes de se conhecer os efeitos mutagnicos dessa planta, o uso da mesma j era desaconselhvel por via interna em casos de gravidez e lactao, (33), sendo tambm alertado que o ltex usado em excesso, causa queimadura nos tecidos (32). relevante ressaltar que as concentraes estudadas acima so diludas em 50mL de H2O, j quando absorvidas por humanos ser diluda na corrente sangunea que de aproximadamente 5.000mL, alm da ao fisiolgica humana que pode atuar de maneira diferente, e devido a isso so indicados testes em animais para melhor compreenso dos efeitos mutagnicos desse extrato vegetal.

CONSIDERAES FINAIS
Constatou-se que o extrato da seiva da casca de C. lechleri em concentraes de 0,1mL, 0,3mL, 0,6mL para 50mL de H2O, no tem ao mutagnica, no entanto, o resultado obtido com o uso da concentrao de 1mL, demonstrou um alto ndice de microncleos, o que evidencia o potencial mutagnico desta espcie. Entretanto, faz-se necessrio estudos que avaliem os riscos-benefcios da utilizao do extrato de C. lechleri em longo prazo, alm disso, vale ressaltar que estes resultados so preliminares e futuros estudos precisam ser realizados para investigaes mais conclusivas dos efeitos mutagnicos dessa espcie em animais.

Figura 4. Mdia de nmeros de microncleo encontrados em #$$$ clulas de A. cepa% "or dosagem em amostra de e!trato de C. lechleri. +igni,icativo "ara --- (./$% $$#). Esses dados so preocupantes visto que na regio amaznica so recomendadas doses progressivas de 30 gotas ao dia para o tratamento de tumores (29), j para o efeito

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-abiane -:o, Rena;o 'ndr< 2an, -ilo=ena "aria "ine;;o Brondani, 3eandro 4os< Ra=os, 0iona;as !lises de #liveira "ene>?e;;i Endereo para correspondncia: Fabiane Fo A enida Machadinho! n" #.$#%! &etor ' Ari(uemes)*+ ,'-,$)'$. E)mail: bia)#/0hotmail.com

*ecebido em 1/2.,21.33 *e isado em 3$2.%21.33 Aceito em .123121.33

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