Separao de purificao de produtos biotecnolgicos

1. Introduo
As biomolculas de interesse podem ser cidos orgnicos, antibiticos,
polissacardeos, hormnios, aminocidos, peptdeos e protenas.
Etapas:
1) Clarificao: separao das clulas e seus fragmentos do meio de cultivo. A
remoo de slidos suspensos, constitudos de clulas integras e seus
fragmentos, reduz a turbines do meio. Pode ser feita: Centrifugao, Filtrao,
Filtrao tangencial, Floculao.
2) Rompimento celular: quando o produto est dentro da clula. A molcula alvo
liberada com todas as molculas intracelulares. Homogeinizao, Ultra- som,
Moinho de bolas, rompimento qumico ou enzimtico
3) Purificao de baixa resoluo: separao da molcula alvo de molculas com
caractersticas muito diferentes (gua, on, cidos nuclicos, lipdeos).
Purificao de alta resoluo compreende a separao de classes de molculas
com caractersticas fsico- qumicas semelhantes (como outras protenas).
4) Tratamentos finais: H produtos cuja aplicao no requer elevado grau de
pureza, de modo que operaes cromatogrficas no so necessrias, e a
simples concentrao do meio suficiente.
O aumento no numero de etapas do processo de purificao, assim como o
rendimento de cada etapa, influencia no rendimento do produto final
2. Rompimento celular
Com os avanos das tcnicas de recombinao de DNA, varias molculas
intracelulares tem sido sintetizada a partir de procariotos e eucariotos. Consideraes:
tamanho da clula, tolerncia a tenses de cisalhamento, necessidade de controle de
temperatura, custo e rendimento do processo.
Clulas envolvidas s por membranas celulares, como clulas de animais, so
frgeis e rompidas facilmente sob baixas tenses. Alm de poderem ser rompidas por
variao da presso osmtica do meio, adio de detergentes ou aplicao de ultra
som. Por outro lado, h clulas com parede celular robusta, caso das microbianas e o
rompimento mais difcil. As bactrias gram positivas possuem parede mais rgida que
as gram negativas. Leveduras possuem paredes celulares ainda mais rgidas.
Os mtodos de rompimento podem ser mecnicos (Homogeinizador de alta
presso, moinho de bolas, prensa francesa e ultra- som) , no mecnimos (choque
osmtico, congelamento e descongelamento, aquecimento, secagem) , qumicos (
lcalis, solventes, detergentes, cidos) e enzimticos (lise enzimtica, inibio da
sntese da parede celular). A parede celular pode ser completamente rompida ou o
suficiente para liberar a molcula alvo. Aps o rompimento os compostos indesejados
(biomolculas e fragmentos celulares) devem ser removidos por processos de filtrao,
centrifugao, precipitao ou extrao liquido- liquido.
2.1 Rompimento mecnico (Prensa Francesa)

2.1.1 Homogenizador a alta presso (Prensa Francesa)
Homogeinizador a alta presso: constitudo de pistes projetados para aplicaes a
altas presses, forando a passagem da suspenso celular por um orifcio estreito
seguida da coliso com uma superfcie rgida e imvel em uma cmera a alta presso.
A reduo instantnea da presso e o impacto provocam o rompimento celular sem
danificar clulas. Esses equipamentos so indicados para romper bactrias e leveduras,
e no para fungos filamentosos (bloqueiam a vlvula de descarga). Porm esse tipo de
rompimento causa o aumento da temperatura do meio e por isso, o equipamento
deve ter um sistema de refrigerao, principalmente quando a molcula
termosensvel. A quantidade de clulas rompidas proporcional a presso de
alimentao (5000 a 20000 psi). Para aumentar a eficincia pode- se recircular o
material (aumenta o custo, gera fragmentos bem menores, pode- se degradar a
molcula).
As condies de crescimento influenciam a eficincia. Clulas E. Coli cultivadas em
meio sinttico so rompidas em condies mais brandas do que as cultivadas em meio
complexo (pode oferecer nutrientes essenciais para a sntese da parede celular).
Crescimento rpido ( alto) gera clulas com paredes celulares menos robustas.
2.1.2 Moinho de bolas
constitudo por uma cmera cilndrica fechada, horizontal ou vertical, um sistema
de refrigerao e um eixo que gira em alta rotao. Nessa cmera so adicionados
esferas de vidro e clulas em suspenso. Ocorre atrito entre esferas e as clulas o que
causa o rompimento celular. As condies de rompimento so facilmente controlveis
e a eficincia depende:
i) da geometria da cmera: cmeras horizontais proporcionam maior
eficincia;
ii) da velocidade: quanto maior a velocidade mais rpido o rompimento;
iii) do tipo de agitador: o que transfere mais energia o mais eficiente;
iv) do tamanho das esferas: bactrias requerem 0,1mm e leveduras 0,5mm.
Quanto menor o dimetro melhor a eficincia;
v) da carga das esferas: as esferas devem ocupar de 80 a 85% do volume da
cmera horizontal e 50 a 60% do volume da cmera vertical. Carga muito
pequena no proporciona coliso e carga muito grande faz que esferas
colidam com esferas;
vi) da concentrao celular: 30 a 50% do volume da cmera;
vii) da velocidade de alimentao: a frao de clulas rompidas diminui com o
fluxo de alimentao, pois diminui o tempo de residncia no rompedor;
viii) da temperatura: recomenda- se o rompimento entre 5 e 15 graus, para os
moinhos de bolas devem possuir mantas de resfriamento

2.1.3 Ultra- som
O rompimento por ultra- som ocorre quando ondas sonoras so convertidas em
vibraes em um meio liquido, gerando bolhas pequenas, as quais entram em colapso
com o passar do tempo, gerando impacto e rompimento celular. Mtodo muito
utilizado em escala de laboratrio e invivel em grande escala. A energia ultra- snica
gerada por um aparelho chamado sonicador e transmitida por uma sonda. O aumento
da temperatura deve ser controlado.
2.2 Rompimento no mecnico
Choque osmtico, congelamento/ descongelamento, termlise
2.2.1 Choque osmtico
Para o rompimento celular em meio com alta presso osmtica, as clulas devem
ser mantidas por 30 min em meio cuja concentrao de sacarose seja de 20%,
separadas por centrifugao e ressuspendidas em gua destilada a 4 graus. O choque
no rompe a clula integralmente mas propicia uma permeabilidade seletiva, onde
algumas protenas podem ser liberadas para fora da clula. Essa tcnica reduz a
quantidade de contaminantes para ser retirado em tcnicas posteriores. Muito
indicado para gram- negativas (parede celular mais sensvel).
2.2.2 Congelamento/ descongelamento
A clula passa por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, com isso,
h formao de grandes cristais de gelo que perfuram a clula e liberam a molcula
alvo. Indicado para rompimento de patgenos. No indicado para a obteno de
biomolculas sensveis. Estoca- se clulas a -27 graus por 7 dias (demorado).
2.2.3 Termlise
A suspenso celular pode ser aquecida em banho termostatizado, com injeo de
vapor direto. Processo amplamente utilizado em larga escala, para o rompimento de
algas, fungos filamentosos, leveduras e bactrias.
2.3 Rompimento qumico

2.3.1 lcalis
Rompimento celular com adio de lcalis (Amonia e hidrxido de sdio)
recomendado quando a biomolcula alvo estvel a pH bsico. Geram poluentes.
Ajusta- se o pH bsico e depois de um tempo reduz o pH para cido e centrifuga o
homogeinizado.
2.3.2 Detergentes
Os detergentes dissociam protenas e lipoprotenas das paredes celulares,
provocando poros ( ou rompendo toda a camada) por onde a molcula alvo liberada.
Ex: SDS. Desvantagem: podem formar espumas que desnaturam protenas.
2.3.3 Solventes
Solventes podem ser utilizados como desidratantes qumicos das clulas. Podem
ser etanol, metanol, acetona. A protena sai junto com a gua de dentro da clula?
2.3.4 Lise enzimtica
As enzimas so capazes de hidrolisar as paredes de clulas microbianas (substrato
das enzimas). Esse mtodo de rompimento utilizado quando a molcula alvo
sensvel a temperatura, tenso de cisalhamento, presso gerada pelos mtodos
mecnicos. Fatores que devem ser considerados: se h presena de inibidores, se h
possibilidade de fazer reciclo da enzima e a resistncia da enzima ao tratamento
macanico (caso em que a lise enzimtica se associada com rompimento mecnico).
Variveis como pH, temp, concentrao celular etc devem ser observados. Grande
vantagem: alta especificidade para degradao da parede celular e associao com
mtodos mecnicos. Enzimas especficas podem ser usadas para liberar molculas de
interesse. Uma desvantagem pode ser o custo da enzima, alm da variao do estado
fisiolgico do microrganismo que interfere na eficincia do rompimento.
2.4 Preservao da biomolcula alvo
A molcula alvo deve ficar ativa, portanto deve- se adicionar inibidores de
proteases para impedir a degradao da molcula alvo. Alm disso, a liberao de
cido nuclicos e protenas estruturais aumentam a viscosidade do meio, por isso,
adio de nucleases e proteases e alterao no pH podem melhorar as caractersticas
do meio, desde que no destruam a molcula de interesse.
3. Filtrao e Centrifugao
A clarificao, processo de separao das clulas e seus fragmentos do meio de
cultivo, pode ser realizada por filtrao convencional, a centrifugao e separao por
membranas.
3.1 Filtrao
A filtrao convencional aplica-se a grandes volumes de suspenses diludas de
clulas. Bolores so separados normalmente por filtrao, pois possuem baixa
densidade o que impede a descida na centrifugao. O processo de filtrao
descrito pela Lei de Darcy:
V= kP/ l, onde v velocidade superficial, k permeabilidade do leito, P
diferena de presso, viscosidade do liquido e l espessura do leito.
Auxiliares de filtrao atuam reduzindo a compressibilidade e a compactao da
torta de filtro, aumentando a permeabilidade do leito. Normalmente usa- se perlita ou
terra diatomcea (plantas aquticas sedimentadas), que podem ser adicionadas
suspenso inicial ou depositada como uma fina camada no meio filtrante. Esses
auxiliares reduzem o entupimento do filtro devido a penetrao de clulas e de
fragmentos de clulas nos poros. Os poros tem dimetro de 10 a 1000m, e o
dimetro de bactrias e fungos de menos de 10m, ou seja, no necessrio adio
de auxiliares de filtrao para esses organismos. No podem ser adicionados quando
se deseja obter um produto intracelular. Pq?
Desvantagens: a molcula alvo pode se ligar irreversivelmente ao auxiliar, o tempo
de filtrao aumenta (pois a viscosidade aumenta).
Ex: Filtro rotativo a vcuo
3.2 Centrifugao
No processo de centrifugao clulas em suspenso em um meio lquido
sedimentam por ao da gravidade. Muito utilizada para bactrias e leveduras (na
filtrao podem causar entupimento). Para se fazer ampliao de escala deve- se
manter o produto Fc*t (fora * tempo).

Auxiliares de centrifugao podem ajudar na agregao das clulas microbianas
com base nas caractersticas inicas da superfcie, aumentando a densidade dos
slidos suspensos, o que resulta em uma maior velocidade de centrifugao. Esse
processo pode ser obtido por ajuste de pH (reduz a carga superficial das clulas
resultando em partculas maiores e mais densas) ou adio de eletrlitos (reduz a
repulso eletrosttica entre as clulas favorecendo a reunio delas) suspenso.
4. Separao por membranas
Os produtos obtidos e desejveis dos mostos fermentados muitas vezes se
encontram em baixas concentraes. Alm disso, os mostos apresentam diversas
molculas como slidos suspensos ou coloidais, fragmentos de microrganismos e de
clulas, solutos extracelulares (protenas, Ac. nuclicos, etc) e produtos do
metabolismo da clula (cidos orgnicos, antibiotiocos) alm dos diferentes nutrientes
presentes no meio (sais, aucares). As dimenses dessas substancias variam de
nanmetros para milmetros. Portanto, processos de separao por membranas tende
separar os produtos biotecnolgicos.
A aplicao mais imediata de membranas em processos biotecnolgicos o
processo do mosto fermentado, tanto para recuperar clulas quanto para obteno de
mosto clarificado. Assim, quando o produto de interesse a clula ou um produto
intracelular, como uma protena, a separao das clulas do meio de fermentao
pode corresponder primeira etapa de recuperao do produto, seguida de uma
lavagem e purificao da protena. Os processos de microfiltrao, ultrafiltrao ,
nanofiltrao e a osmose reversa so solues para esse tipo de separao, uma vez
que so processos de baixo consumo energtico e eliminam custos de armazenamento
e do tratamento do auxiliar de filtrao (serio problema enfrentado por industrias que
ainda usam filtros rotativos).
A grande vantagem dos processos de separao por membranas vem sido
adotadas com o objetivo de melhorar a eficincia dos processos bioqumicos, seja pela
esterilizao continua do meio de cultura e do ar na alimentao, seja pela remoo
continua dos produtos, nos chamados biorreatores membrana , ou seja, a reao e a
separao ocorrem simultaneamente. Outras vantagens so: economia de energia,
especificidade, separao de termolbeis (sempre a T ambiente), facilidade de
operao e de amplificao de escala.
Existem membrana sintticas e inorgnicas, podendo ser densas ou porosas. Os
parmetros das membranas porosas so distribuio de tamanho dos poros,
porosidade superficial e espessura. Os parmetros para as membranas densas so as
caractersticas fsico-qumicas do polmero usado e a espessura do filme polimrico.
Ambas levam em considerao a permeabilidade a gases e lquido e a capacidade
seletiva. A fora que move as molculas atravs da membrana so:
= diferena de potencial qumico, diferena de concentrao (c) e diferena de
presso(p, pi)
E = diferena de potencial eltrico
Nos processos que envolvem membranas porosas a capacidade seletiva est
relacionada ao tamanho do poro e das especies presentes. Ex: microfiltrao,
ultrafiltrao, nanofiltrao e dilise. Nos processos que envolvem membranas densas
a capacidade seletiva depende da afinidade das diferentes espcies com o material da
membrana e da difuso destas pelo filme polimrico. EX: osmose inversa,
pervaporao, permeao de gases.
4.1 Filtrao tangencial
Na filtrao tangencial , a soluo de alimentao escoa em paralelo superfcie da
membrana, enquanto o permeado transportado transversalmente a esta. A
polarizao menor do que na filtrao convencional, e o seu efeito ainda
dimunuido com o aumento da velocidade de escoalmente da alimentao.
O coeficiente de rejeio R mede a capacidade seletiva da membrana:
R=1-Cp/Co onde Cp a concentrao da espcie no permeado e Co a
concentrao da espcie na alimentao.
Se R = 0, Cp= Co, a membrana no apresenta nenhuma capacidade seletiva para a
espcie, toda a espcie est passando.
Se R=1, Cp=0, a espcie no est presente no permeado, a membrana seletiva
para a espcie.
4.2 Microfiltrao

i) Poros 0,05 e 5m;
ii) Filtra partculas em suspenso ar/ aquoso;
iii) Permevel aos compostos solvel;
iv) Filtrao estril de ar e lquidos.

4.3 Ultrafiltrao

i) Poros 1 a 500nm;
ii) Retm macromolculas em soluo;
iii) Caracterizada por massa molar limite (o limite de reteno de uma
membrana de filtrao definido como o valor da massa molar de uma
macromolcula rejeitada pela membrana);

4.4 Nanofiltrao

i) 300 e 2000 Da
ii) Obteno de gua potvel
iii) Concentrao de antibiticos a partir de mostos fermentados

4.5 Osmose inversa

i) Membrana permevel apenas ao solvente ( anisotrpica densa)
ii) Dessalinizao de guas marinhas e salobras
iii) Concentrao de suco de frutas e antibiticos

4.6 Diafiltrao
um modo alternativo de operar sistemas de micro, ultra e nanofiltrao e mesmo
osmose inversa. Um processo de purificao a volume constante. A operao consiste
em adicionar, continuamente, solvente puro ou soluo tampo, em vazo equivalente
a vazo do permeado que sai do sistema. Dessa forma se elimina componentes de
menor tamanho ou de menor massa molar.
4.7 Fluxo do permeado, polarizao de concentrao e fouling
O fluxo do permeado depende da permeabilidade da membrana, a medida que o
tempo passa vai ocorrendo o fenmeno de polarizao de concentrao, em que a
membrana se torna cada vez mais impermevel. A limpeza da membrana cessa esse
fenmeno. O processo de fouling quando ocorre possveis alteraes nas membranas
provocadas pelas espcies qumicas presentes na soluo. Essas alteraes podem ser
parcialmente ou totalmente irreversveis: adsoro, entupimento de poros por
molculas ou partculas em suspenso e depsito na superfcie da membrana de
espcies presentes (macromolculas ou sais). O fluxo dado por:
J=P/ Rt Rt=Rm+Ra+Rb+ Rg+Rpc
Onde: Rm=resistncia da membrana, Ra = adsoro, Rb = bloqueio dos poros, Rg =
camada de gel, Rpc=polarizao da concentrao.
5. Precipitao
Precipitados de protenas so agregados de protenas insolveis grandes o
suficiente para serem observados a olho nu e sedimentam sob valor de fora
centrfuga relativamente baixa. Em alguns casos a precipitao pode atuar como etapa
nica de purificao dependendo do grau de pureza desejado. Precipitao
facilmente adaptada para larga escala, pode- se realizar o processo de maneira
continua e a disposio de precipitantes muito grande, sendo que muitos deles so
de baixo custo. Uma das maneiras de se precipitar protenas reduzir a sua
solubilidade da protena por alteraes no solvente, por exemplo, pela adio de sais
como sulfato de amnio, solventes orgnicos (etanol, ter, acetona). Outra maneira
diminuir a solubilidade da protena por alterao na prpria protena, como a mudana
de carga por adio de cidos, bases, precipitantes catinicos ou aninicos.
5.1 Principios de solubilidade
A solubilidade de uma protena favorecida quando as interaes entre as
molculas de soluto so repulsivas e as interaes do soluto com as molculas do
solvente so atrativas. Com isso, uma molcula pode se tornar insolvel por qualquer
perturbao que resulte em diminuio das foras atrativas com o solvente, ou ento,
em um aumento com as interaes atrativas entre as molculas de soluto. De modo
geral o solvente sempre aquoso e as propriedades do meio podem ser alteradas por
mudanas na fora inica, no pH, na adio de solventes orgnicos combinados com
variao na temperatura, que causam alterao na solubilidade da protena. A
solubilidade de protenas influenciada pela temperatura. Todas as formas de
interaes no covalentes, com exceo das hidrofbicas so inversamente
proporcionais a temperatura. As foras das interaes hidrofbicas aumentam com a
temperatura.
A desnaturao de uma protena compreende a perda da estrutura terciria e a
formao de cadeias polipeptdicas ao acaso. Em soluo essas cadeias polipeptdicas
se misturam e formam agregados reunidos fsico ou ainda, quimicamente, por ligaes
dissulfeto. A solubilidade reduzida em virtude da exposio de resduos hidrofbicos
internos. A simples remoo do desnaturante no garante a reconformao adequada
da molcula. Porm a aplicao da precipitao s vivel quando a conformao
adequada da protena recuperada aps o processo, uma vez que sua funo deve ser
mantida
A precipitao de produtos microbianos um dos mtodos mais tradicionais de
concentrao e purificao. Porm, no proporciona elevada capacidade de
purificao quando a operao conduzida em apenas uma etapa. Dessa forma, a
precipitao normalmente empregada nas etapas iniciais do processo. Alm disso, a
solubilizao de protena precipitadas pode ser dimensionada de modo a reduzir o
volume inicial, e portanto, aumentar a concentrao. Portanto, a precipitao pode
preceder processos de alta resoluo como a cromatografia.
Em soluo aquosa a precipitao pode ocorrer com o aumento (salting out) ou
diminuio (salting in) da concentrao de sais, com adio de solventes orgnicos,
polieletrlitos, polmeros no inicos, calor e ajuste de pH.
5.2 Precipitao por sais
A precipitao por sais ocorre por neutralizao das cargas superficiais da protena
e reduo da camada de hidratao, favorecendo a agregao de resduos
hidrofbicos. A adio de concentraes de sal (salting out) resulta em aprisionamento
da molculas de gua pela solvatao dos ons , dessa forma, as regies hidrofbicas
da protena ficam expostas e elas interagem e agregam entre si. Imagine uma soluo
aquosa de protena qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro. A gua,
que apresenta um grande poder de solvatao, passa a interagir com as duas espcies:
as protenas e os ons provenientes da dissociao do sal. Porm, as molculas de gua
apresentam maior tendncia de solvatao de partculas menores (nesse caso, os
ons). As molculas de gua, ocupadas em sua interao com os ons, "abandonam" a
estrutura protica. Como conseqncia, temos: maior interao protena-protena,
diminuio da solubilidade em meio aquoso e, conseqentemente, precipitao da
protena. O aumento ta temperatura favorece a precipitao de protenas por salting
out, mas o processo conduzido normalmente a 4 graus para evitar a desnaturao.
Quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma soluo contendo
protenas, as cargas provenientes da dissociao do sal passam a interagir com as
molculas proticas, diminuindo a interao entre elas. Conseqentemente, temos um
aumento da solubilidade da protena no meio aquoso. A esse fenmeno d-se o nome
de "salting-in". Em baixas concentraes de sais (baixa fora inica), a solubilidade em
geral aumenta, pois os ons salinos tendem a se associar s protenas contribuindo
para uma hidratao e/ou repulso entre as molculas, aumentando a solubilidade
salting in.
5.3 Precipitao por solventes orgnicos
A solubilidade de protenas em solventes orgnicos varia de acordo com as
distribuies dos resduos hidrofbicos e hidroflicos na superfcie da molcula. Esses
grupamentos interagem com ons, outras protenas e molculas de solventes de forma
a controlar a transferncia da protena alvo para a fase slida (precipitado) ou para a
fase liquida (sobrenadante).
Alcois, acetona, steres so utilizados para precipitar protenas desde 1907,
porm desconhecia- se o efeito desnaturante desses solventes. Normalmente deve- se
realizar o processo a baixas temperaturas para evitar esse efeito desnaturante. Umas
das vantagens do uso de solventes sua volatilidade que permite pronta recuperao
e reciclagem ao processo, alm de possuir propriedades bactericidas. Os solventes
podem ser removidos facilmente do precipitado, por secagem a vcuo em baixa
temperatura.
O solvente usado deve ser totalmente solvel em gua, no reagir de modo direto
com a protena e ter um forte efeito precipitante. Quanto maior a cadeia aliftica
maior a desnaturao. A adio de solventes orgnicos causa gerao de calor e por
isso, deve ser lenta e sob resfriamento. A precipitao de protenas de carter cido
pode ser melhorada pela adio de ons metlicos bivalentes , como o clcio e o
magnsio que formam complexos com a protena reduzindo a carga global e
favorecendo a agregao. Ctios como Zn e Ca formam complexos com as protenas,
recurso usado para precipitar protenas muito solveis em solventes orgnicos. O pH
em torno do PI pode favorecer a precipitao, reduzindo a concentrao de solvente
necessria. Em valores de pH maiores ou menores que o PI os parmetros polares das
protenas ficam maiores e ento essas biomolculas tendem a ficar mais solveis,
mesmo que relativamente desidratadas, devido as foras de repulso.
5.4 Precipitao por polmeros
5.4.1 Polietileno glicol
Polietireno glicol (PEG) um polmero de alta massa molar, neutro e miscvel com
gua, disponvel em altos graus de polimerizao. As precipitaes so conduzidas em
baixas concentraes de PEG, faixa na qual as solues no so muito viscosas e
muitas protenas precipitam. A operao realizada sem resfriamento. O mecanismo
de precipitao entendido como de excluso da protena do meio aquoso. A
concentrao de PEG necessria depende do tamanho da protena e da massa molar
do polmero e inversamente proporcional a concentrao de protena. O PEG pode
ser removido por mtodos de ultrafiltrao, adio de etanol.
5.4.2 Polieletrolitos
Os polieletrlitos so polmeros inicos solveis em gua que tem sido utilizado
devido a seu baixo custo e a reduo de resduos, uma vez que a precipitao ocorre
em baixas concentraes. Os mais usados so o PEI e PAA. O uso de polieletrlitos
restrito pois a protena e o polmero devem ter cargas opostas. Por isso, deve- se
operar longe do PI da protena.
5.5 Precipitao pela temperatura
A variao da temperatura causa precipitao da protena de duas formas: 1) sua
diminuio provoca reduo na solubilidade de protenas e sais; 2) seu aumento causa
desnaturao de protenas (perdendo sua estrutura terciaria e expondo os grupos
hidrofbicos para formar grupos insolveis).
5.6 Precipitao isoeltrica
A precipitao isoeltrica resulta na atrao eletrosttica das protenas quando
estas se encontram prximas do ponto isoeltrico, pois a repulso eletrosttica entre
as molculas mnima. um dos mtodos mais simples executado simplesmente pelo
ajuste do pH prximos ao PI. Quando os valores de pH do meio esto acima do PI da
protena, a superfcie est com carga negativa, ocorrendo repulso eletrosttica; o
mesmo ocorre quando o pH do meio est abaixo do PI da protena, a superfcie est
com carga positiva, ocorrendo repulso entre as molculas.
A precipitao isoeltrica mais expressiva para protenas com baixa constante de
hidratao ou com alta superfcie hidrofbica, como globulina e casena, que formam
agregados grandes. Protenas hidroflicas tm solubilidade grande no seu ponto
isoeltrico, e dificilmente precipitam pelo ajuste do pH.
Para ajustar o pH so utilizados cidos relativamente baratos, mas que podem
desnaturar irreversivelmente protenas. Isso pode ser evitado pelo uso de cidos com
ons estabilizantes, como acetato ou sulfato.
5.7 Precipitao por afinidade
Mtodos de afinidades so definidos como procedimentos que fazem usos de uma
interao especifica e seletiva com um ligante, geralmente um substrato ou um
inibidor se a protena um enzima. A precipitao por afinidade por ocorrer de duas
formas: na primeira pela ligao cruzada de protenas com ligantes, geralmente
corantes, com formao de um reticulo tridimensional; na segunda pela diminuio da
solubilidade de um polmero que possui um ligante de afinidade, reversivelmente
solvel insoluvel, por variao no pH, temperatura, concentrao de sal ou adio de
ons metlicos.
5.8 Precipitao por ons metlicos
Alguns ons monovalentes podem ser suficientes para a precipitao de protenas,
e so divididos em trs grupos: 1) Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Cd (todos 2+), se ligam
fortemente aos cidos carboxlicos ou a compostos nitrogenador. 2) Ca, Ba, Mg, Pb
(todos 2+), se ligam apenas a cidos carboxlicos e 3) Ag e Hg que se ligam fortemente
ao grupo suforil.
6. Extrao lquido- lquido (SDFA)
Esse mtodo se baseia na extrao de biomolculas em sistemas de duas fases
lquidas imiscveis, constitudas de uma fase aquosa e um solvente orgnico. A
extrao em SDFA aplicada a purificao de produtos obtidos em clulas animais,
vegetais e microbianas, extrao de vrus, organelas e cidos nuclicos e enzimas. Para
produtos que exigem alto grau de pureza a extrao em SDFA no suficiente e nesses
casos deve ser sucedida por uma ou mais etapas cromatogrficas.
A separao entre a molcula a ser purificada e os contaminantes decorre das
diferentes solubilidades apresentadas por esses solutos em cada uma das fases
aquosas. Esses sistemas so formados pela reunio de determinados polmeros,
polieletrlitos, ou ainda, polmeros em combinao com solutos de baixa massa molar,
em uma mesma soluo formando quatro grupos. Em um primeiro grupo podem ser
considerados os sistemas formados por dois polmeros no inicos (PEG/dextrana). Em
um segundo grupo tem-se um polieletrlito e um polmero no inico (sulfato
dextrana de sdio/polipropileno glicol). O terceiro grupo constitui 2 polieletrlitos
(sulfato dextrana de sdio/carboximetilextrana de sdio). O quarto grupo contitui um
polmero no inico e um composto de baixa massa molar (PPG/fosfato de sdio). Os
sistemas mais usados so os que possuem dextrana em uma das fases a qual fica no
fundo, enquanto o outro polmero se concentra no topo. Quando do emprego de sais
estes se concentram no fundo enquanto o polmero se apresenta no topo. Ambas as
fases, no entanto, apresentam os dois componentes, uma vez que se estabelece o
equilbrio entre elas.
6.1 Curva de equilbrio
O eixo y representa a composio em massa da molcula que apresenta maior
concentrao na fase de topo e o eixo x representa a composio da molcula de
maior concentrao na fase de fundo. Composies representadas por pontos acima
da curva levam a formao de duas fases e, abaixo da curva, de uma fase s. A
formao do SDFA depende, portanto, da concentrao dos componentes do sistema.
Os principais fatores que influenciam a posio do equilbrio em um SDFA so a
massa molar, o tipo de sal e a concentrao dos componentes.
O coeficiente de partio K uma grandeza adimensional que representa a relao
entre as concentraes da molcula de interesse na fase de topo e na fase de fundo,
no equilbrio:
K= Cti/Cfi onde Cti a concentrao do soluto i na fase e topo e Cfi a
concentrao do soluto i na fase de fundo.
6.2 Montagem do sistema
Coeficientes de partio significativamente distintos para a molcula de interesse e
para as demais molculas indicam ocorrncia de purificao. Quanto maior a
solubilidade dos solutos nas fases maior a concentrao nessas fases. Dessa forma,
caractersticas fsico- qumicas das protenas (hidrofobicidade, carga superficial e
massa molar) e da solulo (pH e fora inica) sero determinantes para o valor de K.
De modo geral, o valor de K diminui com o aumento da massa molar da protena. As
caractersticas hidrofbicas acentuaro o grau de separao e o aumento da pureza.
A diversidade de variveis que influem no coeficiente de partio das biomolculas
e rendimento da extrao sugere a adequao do emprego das tcnicas de
planejamento estatstico do experimento. Assim, por um moderado numero de
experimentos podem ser testados diferentes sistemas quanto ao tipo de componentes
formadores de fases, a massa molar do polmero, e o pH. Os experimentos so
preparados a partir de solues estoque, normalmente 50% (em massa) para a soluo
de PEG, 40% para os sais e 20 a 30% para a dextrana. Essas solues so pesadas na
quantidade necessria para se obter a concentrao desejada no sistema. A ordem de
adio dos componentes devido as suas densidades : soluo de Dx ou soluo de
PEG, soluo de sal e gua. Como a temperatura afeta a formao do sistema de fases
necessrio que as solues estoque j estejam na temperatura de trabalho antes do
preparo do sistema. Depois de preparado o sistema, ele deve ser agitado e em seguida
deixado em repouso para atingir o equilbrio. A separao das fases pode ser acelerada
por centrifugao (3 a 5 min).
6.3 Extrao repetida e clarificao
A aplicao repetida importante para a purificao da protena. Na primeira
aplicao, caso a protena migre para a fase de topo e alguns contaminantes para a
fase de fundo, adiciona- se uma soluo fase da molcula alvo tal que se forma uma
nova fase inferior, que resulte em aumento da pureza adicional em relao a primeira
etapa. Essa estratgia muito utilizada para purificao de meios complexos.
6.4 Reciclagem de polimeros e sais
A reciclagem necessria para a reduo do custo do processo e dos danos
causados do descarte dos sais empregados. Quando a fase de topo contem a molcula
alvo possvel recuperar o polmero pela induo de formao de uma nova fase de
fundo, na qual a molcula apresente maior solubilidade. Haver, todavia, perda da
molcula de interesse, dado que existe uma distribuio entre as fases. Pode se
tambm separar o polmero em relao aos demais solutos, por meio de cromatografia
de excluso molecular ou ultrafiltrao, ou ainda, pela precipitao da molcula alvo
ou com condies salinas desde que o polmero no precipite. A reciclagem do sal
tambm possvel por precipitao; pode- se resfriar a fase salina at que o sal
precipite.
6.5 Extrao baseada em afinidade
Para se aumentar o valor de K pode- se utilizar interaes por afinidade. O ligante
acoplado por ligao covalente ao polmero. O aumento da partio pela introduo
de um ligante acoplado ao polmero descrito pelo parmetro Kf:
Kf= K(peg ligante)/K (peg sem ligante) em que Kf= (KL)
n
, onde KL o coeficiente de
partio do ligante livre e N o nmero de stios de ligao disponveis no ligante
O rendimento terico de uma molcula alvo extrada na fase superior (Vs) ou na
fase inferior (Vl) e em uma nica etapa pode ser calculado por:
R (%)= 100/(1+ Vl(VVs* K))
O ligante pode ser uma substancia natutal (caros e desnaturam rapidamente) ou
uma substancia sintetizada. Ex: ligantes hidrofbicos, tiofilicos, metais, corantes,
cidos graxos, inibidores, anticorpos monoclonais,entre outros. A escolha do ligante
deve levar em considerao:
i) A constante de dissociao produto-ligante deve ser menor que 10-3M;
ii) Ligante deve ser estvel e especifico para a molcula alvo;
iii) Ligante no pode ser txico, deve ser barato e disponvel em grandes
quantidades.
Para a recuperao do polmero depois da extrao necessrio inicialmente
desfazer a interao entre o ligante e a molcula. Em geral so utilizados molculas
que competem com o produto pelo ligante ou com o ligante pelo produto. Muitas
interaes especificas podem ser rompidas por alterao de pH, porm deve- se estar
atento eventuais mudanas no produto biolgico. A seguir deve- se reciclar o
polmero para posterior utilizao. H vrias tcnicas. O PEG pode ser reciclado por
extrao com solventes orgnicos (etanol, clorofrmio), terminar!
7. Introduo Cromatografia
As operaes cromatogrficas tem como objetivo isolar e purificar o metablito de
interesse em relao aos demais, levando- o a pureza adequada a seu uso. A reduo
do volume do meio original relevante para a economia do processo, pois os mtodos
cromatogrficos, so na maioria, baseados em fenmenos adsortivos e assim, lentos e
dependentes de investimentos em materiais adsorventes.
A cromatrografia pode ser liquida ou gasosa. Na cromatografia liquida, ao solutos
so retidos em um leito de material poroso, por meio de fenmenos de adsoro
(qumica ou fsica), partio ou excluso molecular. A fase estacionaria pode ser
constituda por slica porosa, polmeros orgnicos sintticos, polmeros de
carboidratos. Esses ltimos se apresentam em partculas esfricas pequenas
embebidas no solvente, o qual constitui maior parte da fase estacionaria, denominada
gel. A posterior remoo gradual dos diferentes solutos se da por ao de uma fase
liquida eluente, a qual resulta na separao dos diferentes componentes do meio. A
ordem de grandeza da presso aplicada interfere na resoluo da separao dos
solutos. Assim, a presso baixa, mdia e alta associa- se a denominao baixa
eficincia, media eficincia e alta eficincia (HPLC). Um sistema cromatogrfico deve
conter tambm um detector o qual registra a presena de solutos no fluxo de sada.
Esse detector deve ser sensvel a molcula alvo. Assim, protenas, aminocidos,
policetideos, lipdeos e outros so detectados por medidas da absorbncia (UV) em
comprimento de onda definidos (ligaes peptidicas so detectadas em 215nm
enquanto aminocidos em 280nm). Um aumento na eficincia de deteco pode ser
alcanado pelo uso de detectores na absoro baseados na absoro por
fluorescncia.
Existem diferentes tipos de cromatografias, dentre eles cromatografia de excluso
molecular, baseada na separao de molculas em funo da massa molar e/ou do
volume efetivo da soluo; cromatografias de troca inica, interao hidrofbica,
afinidade e imunoafinidade, nas quais ocorrem adsoro de diferentes molculas
sobre a matriz e em seguida, desoro para a separao das molculas.
Um cromatograma um grfico que indica a presena dos diferentes solutos
presentes no eluente que sai da coluna (eixo y), em funo do tempo e do volume de
eluente que passou pela coluna (eixo x). A presena de solutos detectada por
medidas de absorbncia ou por indica de refrao. O volume que passa pela coluna at
o instante de sada de uma certa molcula o volume de reteno especifico daquela
molcula (Vr). Alternativamente, emprega- se o tempo de reteno, tr. O ponto mais
alto das curvas correponde ao instante de mxima concentrao da molcula no
eluente, o qual caracteriza o tr e o Vr. A eficincia da purificao pode ser avaliada de
acordo com o grau de separao das molculas, denominado Rs. Na separao de duas
molculas A e B, Rs determinado por:
Rs= (trb- tra)/ (1/2) * (WbA + WbB), onde WbB a distancia do pico b.
Para Rs<1 as molculas so incompletamente separadas, para Rs=1 as curvas se
tocam nas bases e para Rs>1 as molculas se encontram separadas. Todavia, pode
haver sobreposio de duas molculas em um mesmo pico, nesse caso embora Rs seja
elevado , a molcula alvo no ter sido purificada.
8. Cromatografia de Excluso molecular
Uma das caractersticas das protenas seu tamanho elevado, o que proporciona
um mtodo eficaz para a separao de protenas de acordo com sua massa molar, por
cromatografia de excluso molecular, tambm conhecida como cromatografia em gel.
Assim, uma mistura de protenas dissolvidas em soluo tamponante flui por gravidade
ou com auxilio de bombas, por uma coluna preenchida por esferas microscpicas de
material polimrico poroso , previamente equilibrado e lavado apenas com tampo.
Assim em uma coluna cromatogrfica, as molculas menores so as ultimas a sarem
da coluna. De maneira geral, quanto maior a coluna melhor a resoluo, entretanto
isso implica em longo tempo de separao e grande diluio da amostra.
A fase estacionaria utilizada normalmente consiste de gis hidroflicos reticulados
embebidos para amostras solveis em soluo aquosa, e de matrizes a base de
poliestireno para amostras no aquosas. Diversos fatores devem ser considerados
para a seleo da matriz de gel mais adequado, destacando- se as caractersticas da
matriz, como tamanho do poro, dimetro mdio e distribuio de tamanho de
partculas, densidade de empacotamento do gel na coluna, volume da amostra, vazo
do eluente, viscosidade da amostra e do tampo. Matrizes uniformes, com baixa
distribuio de tamanho de partculas, facilitam eluio de molculas em picos
estreitos. Deve- se tambm levar em conta , na seleo da fase estacionaria, a
estabilidade da matriz no solvente requerido como fase mvel e as condies de pH,
temperatura e salinidade empregada durante a separao, que devem ser compatveis
com as propriedades da protena de interesse. Os materiais empregados nas
cromatografias em gel devem ser inertes em relao a molcula de interesse.
Na cromatografia em gel um outro fator alm do tamanho intefere na eluio.
Protenas delgadas e longas so eluidas antes de protenas globulares de mesma massa
molar.
A alta resoluo na cromatografia em gel depende da aplicao de um pequeno
volume de amostra, pois quanto maior esse volume, maior o volume no qual esta ser
eluida. Tipicamente, o volume da amostra deve ser de 0,5 a 5 % do volume total do
leito. Volumes menores que 0.5% no se obtem um espalhamento aprecivel para o
processo e volumes acima de 5% as molculas devem ter grande diferena no
tamanho para serem separadas.
A amostra a ser injetada na coluna deve ser previamente clarificada por
centrifugao ou filtrao para evitar o deposito de partculas na coluna.
8.1 Curvas de cromatografia em gel
Vt = volume total da coluna (eluio de molculas menores que os poros)
V0= volume intersticial no meio poroso (eluio de grandes molculas)
Vs= volume de solvente que cabe dentro fase estacionaria do gel (elui
moleculas intermediarias)

Vs= Vt V0

8.2 Aplicaes de cromatografias de excluso molecular
- Dessalinizao
- Fracionamento de proteinas: Requer uso de gel com propriedades otimas, isto ,
alto volume de poros, poros com estreita distribuio de tamanhos e dimetros
adequados. Amostras com poucos componentes ou que tenham sido parcialmente
purificadas afim de eliminar componentes do mesmo tamanho apresentam
melhores resultados. A frao eluida no volume vazio apresentara menor fator de
diluio do que as fraes finais, que apresentam maior tempo de reteno na
coluna. Deve- se portanto, buscar o menor fator de diluio e o menor tempo
possvel.
-Determinaao de massas molares
-Determinao de tamanho de poros
- Separao empregando princpios mistos
9. Cromatografia de troca-inica
Trata- se de um mtodo simples, fcil ampliao de escala, alta resoluo, alta
capacidade de adsoro e verstil. Na troca inica h uma etapa de adsoro reversvel
de molculas de solutos eletricamente carregados a grupos com cargas opostas,
imobilizados em matriz slida. Os solutos adsorvidos so subsequentemente eluidos
aps serem trocados por outros ons, com o mesmo tipo de carga, porm com uma
maior afinidade pela fase estacionaria. Portanto, so os diferentes tipos de grau de
afinidade eletrosttica entre a fase estacionaria e os ons na fase mvel que regem
esse tipo de cromatografia.
Matrizes de troca inica que conte grupos positivamente carregados so aninicas,
matrizes catinicas so negativamente carregadas. Os contra-ons so ons de baixa
massa molar que se ligam a fase estacionaria ou as protenas solveis na fase mvel.
Para que a protena se ligue a fase estacionaria, os contra ons devem ser
eletrolicamente dissociados. Ctions H+ e Na+ so comumento encontrados em
trocados catinicos e anios Cl- e OH- so os mais utilizados em trocadores aninicos.
9.1 Escolha da matriz
Alguns critrios importantes devem ser considerados para a escolha da matriz:
i) Alta estabilidade mecnica
ii) Boa estabilidade qumica: resistente a esterilizao e sanitizao
iii) Alta capacidade de adsoro
iv) Tamanho do poro: deve permiti o acesso da biomolcula alvo ao sitio de
adsoro
v) Supericie da matriz: deve minimizar adsores no especificas que podem
entupir a matriz
vi) Tamanho da partcula
9.1.1 Celulose
Matriz muito hidroflica, porm instvel na presena de cidos minerais, lcalis e
agentes oxidantes . Operam em faixa de pH e 3 a 10. Sua capacidade de se ligar a
protenas alta, porm no propicia a interaes hidrofbicas ou no- inicas.
9.1.2 Agarose
um polissacardeo natural, complexo, obtido da purificao do Agar. A matriz
altamente porosa e com mnima adsoro no especifica.
Terminar

Ex de matrizes: celulose, agarose, dextrana e policrilamida.
Os grupos funcionais usados em trocadores podem ser fortes ou fracos,
dependendo dos valores de pKa dos grupos carregados. Os grupos fortes operam em
uma faixa maior de pH do que os grupos fracos. Portanto, na escolha do grupo
funcional o pH uma varivel importante. A fase mvel pode ser constituda por
solues acidas, bsicas ou tampes e adicionadas de sais neutros ou solventes
orgnicos com a finalidade de aumentar a seletividade.