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Inacio Alves, Aline; Quinto Teixeira, Luciano Jos; Henriques Saraiva, Sergio; de Souza Carneiro, Joel
Revalidao do mtodo titulomtrico para determinao do cido ascrbico
Revista Ceres, vol. 61, nm. 2, marzo-abril, 2014, pp. 155-161
Universidade Federal de Viosa
Vicosa, Brasil
Disponvel em: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=305230670001

Revista Ceres,
ISSN (Verso impressa): 0034-737X
ceresonline@ufv.br
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Revalidao do mtodo titulomtrico para determinao do cido ascrbico

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Revalidao do mtodo titulomtrico para determinao

do cido ascrbico
Aline Inacio Alves1, Luciano Jos Quinto Teixeira2, Sergio Henriques Saraiva3, Joel de Souza Carneiro4

RESUMO
Este estudo teve como objetivo revalidar o mtodo de determinao de cido ascrbico por titulometria, para ser
aplicado no laboratrio de Qumica de Alimentos, do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito
Santo. O processo de revalidao foi realizado por meio da avaliao de parmetros como linearidade, preciso
(repetitividade), exatido (teste de recuperao) e limites de deteco, considerando-se os critrios de aceitabilidade
determinados. A significncia adotada nos testes de hipteses foi de 5%. Foram realizadas anlises de coeficiente de
correlao linear simples (r), coeficiente de variao (CV) e a anlise de regresso. Os dados foram analisados, utilizando-se o pacote estatstico Statistica 7.0. O mtodo quantitativo por titulometria de cido ascrbico foi revalidado e
avaliado em amostras de cido ascrbico e suco de limo. Verificou-se que o mtodo est de acordo com os limites
regulamentados pelos rgos reguladores, sendo linear, repetitivo e com alta recuperao, apresentando um valor
mximo de 98 e mnimo de 94,82%, e um limite de deteco de 0,025 mg mL-1, no suco de limo.
Palavras-chave: titulao, validao intralaboratorial, anlise de alimentos.

ABSTRACT
Validation of the method for determination of ascorbic acid in lemon by titration
The present study aimed to revalidate the method for determination of ascorbic acid by titration to be applied in the
laboratory of Food Chemistry Centre of Agricultural Sciences, Federal University of Esprito Santo. The revalidation
process was carried out by evaluating parameters such as linearity, precision (repeatability), accuracy (recovery test)
and detection limits, considering the acceptability criteria determined. The level of significance in hypothesis testing
was 5%. Analyses included simple linear correlation coefficient (r), coefficient of variation (CV) and regression analysis.
The data were analyzed using the software Statistica 7.0. The quantitative method by titration of ascorbic acid was
revalidated and evaluated in samples of ascorbic acid and lemon juice. It was found that the same complies with the
limits established by regulatory agencies. The methods presented linear, repetitive and high recovery, with a maximum
value of 98% and a minimum of 94.82% and a detection limit of 0.025 mg ml-1 in the lemon juice.
Key words: titration, intralaboratory validation, food analysis.

Recebido para publicao em 27/03/2013 e aprovado em 25/10/2013.

1
Engenheira de Alimentos. Universidade Federal de Viosa, Campus Viosa, Avenida Peter Henry Rolfs, s/n, 36570-000, Viosa, Minas Gerais, Brasil. aline_inacio27@hotmail.com.
(autora para correspondncia).
2
Engenheiro de Alimentos, Doutor. Departamento de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Esprito Santo, CP 16, 29500-000, Alegre, Esprito Santo, Brasil.
luqteixeira@yahoo.com.br
3
Engenheiro de Alimentos, Doutor. Departamento de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Esprito Santo, CP 16, 29500-000, Alegre, Esprito Santo, Brasil.
shsaraiva@yahoo.com.br
4
Engenheiro de Alimentos, Doutor. Departamento de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Esprito Santo, CP 16, 29500-000, Alegre, Esprito Santo, Brasil.
joelcamilo@hotmail.com

Rev. Ceres, Viosa, v. 61, n.2, p. 155-161, mar/abr, 2014

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Aline Inacio Alves et al.

INTRODUO
A anlise de alimentos apresenta necessidade crescente de mtodos de ensaio que permitam atender aos
constantes avanos tecnolgicos na produo, processamento, embalagem e armazenamento de alimentos (Souza, 2007). Alm dessa questo, os laboratrios de anlises
necessitam demonstrar competncia tcnica para garantir
a qualidade dos ensaios que realizam (ISO, 2005), assegurando a confiabilidade e comparabilidade dos resultados
que emitem, os quais, na maioria das vezes, subsidiam
tomadas de deciso relativas a aspectos econmicos, de
sade pblica (Brasil, 2006) e de defesa do consumidor.
Os laboratrios que analisam alimentos seguem, via
de regra, normas de credenciamento estabelecidas por
rgos reguladores (Paschoal et al., 2008), os quais exigem que os mtodos utilizados para um determinado objetivo sejam validados e, ou, revalidados. Os estudos para
determinar os parmetros de validao devem ser realizados com equipamentos e instrumentos dentro das
especificaes (INMETRO, 2007) e aplicam-se a mtodos
no normalizados; mtodos criados ou desenvolvidos
pelo prprio laboratrio; mtodos normalizados, usados
fora do escopo para os quais foram concebidos, e ampliaes e modificaes de mtodos normalizados.
A validao assegura a especificidade, exatido e preciso de um ensaio analtico e estima a estabilidade do
material analisado, durante a estocagem e manipulao. O
mtodo de validao de anlises qumicas usado para
suprir a necessidade de mostrar a qualidade dessas anlises por meio de suas comparabilidade, rastreabilidade e
confiabilidade (Lavra et al., 2008) sendo que, para tanto,
deve apresentar seletividade, linearidade, preciso e exatido (Silva & Alves, 2006).
A validao de mtodos tem representado uma etapa
importante para os laboratrios de anlises de alimentos
e, consequentemente, um obstculo para a credibilidade
dos resultados emitidos (King, 2003). Todo mtodo, antes da sua utilizao, deve ser validado no laboratrio em
que ser aplicado, a fim de assegurar as condies mnimas de sua execuo com a confiabilidade requerida (Pereira et al., 2007).
A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas (Ribani et al., 2004). Ter um resultado obtido por um mtodo validado significa que o procedimento, que inclui desde as condies de operao do equipamento at toda a sequncia analtica, seja aceito como
correto (Silva & Alves, 2006).
Diante do exposto, este trabalho objetivou revalidar
o mtodo de determinao de cido ascrbico por
titulometria, para ser aplicado no laboratrio de Qumica
de Alimentos, do Centro de Cincias Agrrias, da Universidade Federal do Esprito Santo. O processo de
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revalidao foi realizado por meio da avaliao de

parmetros como linearidade, preciso (repetitividade),
exatido (teste de recuperao) e limites de deteco.

MATERIAL E MTODOS
Determinao de cido ascrbico
A determinao do teor de cido ascrbico foi realizada pelo Mtodo oficial 967.21, da Association of Official
Analytical Chemists (AOAC, 1998), o qual consiste em
reduzir uma substncia colorida, 2,6- diclorofenolindofenol,
em titulao com uma soluo contendo cido ascrbico,
sendo as solues preparadas pouco antes do uso e, o
cido ascrbico, preparado imediatamente antes do uso.

Revalidao
Os parmetros estudados para revalidao foram:
linearidade, exatido, preciso e limite de deteco, considerando-se os critrios de aceitabilidade determinados.
Adotou-se a significncia de 5% nos testes de hipteses.
Os dados foram analisados com o pacote estatstico
Statistica 7.0.

Linearidade
A linearidade do mtodo foi avaliada, utilizando-se
anlise de regresso linear e a anlise de correlao entre
a concentrao e o volume de titulao. O mtodo foi
baseado no apresentado pelo INMETRO (2007).
O coeficiente de correlao linear simples (r) e a anlise de regresso que representada por uma equao da
reta que relaciona as duas variveis:
y = a + bx

Eq. 1

em que: y = resposta (medida do volume do titulante); x =

concentrao de cido ascrbico; a = interseo com o
eixo y, quando x = 0; b = inclinao da curva analtica.
Foram testadas sete diferentes concentraes, de forma a se elevar a confiabilidade dos resultados obtidos para
esse parmetro. Para a anlise de linearidade do cido
ascrbico, foram utilizadas as concentraes de: 0,5; 1,0;
2,0; 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0 mg ml-1. Para o suco de limo, foram
utilizados: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 mL. O volume e a
concentrao foram determinados por testes preliminares.
Para determinar a quantidade de cido ascrbico, nas
amostras de suco de limo, realizou-se uma anlise de
regresso, relacionando-se o volume gasto de titulante
com a concentrao de cido ascrbico presente nas amostras analisadas. Foram realizadas trs repeties para cada
nvel de concentrao e volume.

Exatido
A determinao da exatido foi realizada por ensaio de
recuperao, a partir de anlises de amostras adicionadas

Revalidao do mtodo titulomtrico para determinao do cido ascrbico

de concentraes conhecidas de cido ascrbico, em trs
repeties.
A amostra fortificada foi preparada, utilizando-se soluo de suco de limo, com volume de cido ascrbico
pr-estabelecido na anlise de linearidade. As amostras
de suco de limo foram fortificadas com as seguintes concentraes do material analisado (cido ascrbico): 0,2;
0,5; 0,7; 1,0 e 2,0 mg mL-1.
A recuperao (R) foi calculada segundo a equao 2:
R (%) = ((C1-C2)/C3) X 100

Eq. 2

em que: C1 = concentrao do cido ascrbico na amostra fortificada, C2 = concentrao do cido ascrbico na

amostra no fortificada, C3 = concentrao do cido
ascrbico adicionado amostra fortificada. O mtodo foi
baseado no apresentado pelo INMETRO (2007).

Preciso
A preciso foi avaliada quanto repetitividade que foi
determinada pela anlise de sete repeties. As concentraes utilizadas foram: 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.mL-1 de cido ascrbico e 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mL de suco de limo.
O coeficiente de variao (CV), tambm conhecido
como desvio padro relativo (DPR), foi calculado pela
equao:
C.V = DPR = DP/CMD X 100

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sentou linearidade no intervalo das concentraes testadas, apresentando coeficiente de determinao (R2) de
0,999. Este parmetro indica baixa disperso do conjunto
de pontos experimentais e reduzida incerteza dos coeficientes de regresso estimados. Para Ribani et al. (2004),
quanto mais prximo de um o R2, maior a qualidade da
curva obtida e maior a confiabilidade dos mtodos analticos.
O mesmo comportamento foi observado para o cido
ascrbico, quantificado nas diferentes diluies do suco
de limo (Figura 1b), cujo modelo apresentou linearidade.
O coeficiente de correlao foi calculado, utilizandose o coeficiente de correlao linear simples a 5% de probabilidade. Nos dois casos, o valor do r foi superior a
0,99, demonstrando correlao entre o volume titulado e a
concentrao.
Estes resultados esto dentro dos limites impostos
pelas principais agncias reguladoras nacionais. A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - Anvisa, por meio da
sua resoluo 899 de 2003 (ANVISA, 2003), recomenda
um coeficiente de correlao igual a 0,99 para se considerar um mtodo como adequado, enquanto, o Instituto Na-

Eq. 3

em que: DP = desvio padro; CMD = concentrao mdia

determinada.

Limite de deteco
O limite de deteco foi estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes conhecidas e decrescentes do material analisado, at o menor nvel detectvel.
O procedimento foi realizado com base em Eurachem
Working Group (1998).
Foram analisados os seguintes volumes de suco de
limo: 2,5; 2,0; 1,5; 1,0; 0,5; 0,1; 0,09; 0,05; 0,03 e 0,01 mL,
com os quais foram calculadas as suas respectivas concentraes de cido ascrbico, obtidas na titulao. Os
resultados foram analisados para determinao do limiar
de perda de confiabilidade do mtodo, ou seja, do ponto
em que o mtodo passa a apresentar resultados no detectados para amostras. Nesse caso, o menor nvel de
concentrao estudado, no qual o material analisado foi
detectado para todas as repeties, foi considerado como
limite de deteco do mtodo.

RESULTADOS E DISCUSSO
Linearidade
Na Figura 1a, por meio da anlise de regresso, possvel observar que, para o cido ascrbico, o mtodo apre-

Figura 1. Modelo de regresso linear ajustado (A) para o cido

ascrbico; (B) para o cido ascrbico presente nas amostras de
suco de limo.

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cional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial INMETRO, admite a linearidade de um mtodo, desde
que este apresente valores de correlao acima de 0,90
(INMETRO, 2007).
Cardoso et al. (2010), trabalhando com a validao de
mtodos para determinao de resduos de agrotxicos
em tomate, encontraram coeficientes de determinao superiores a 0,95 e de correlao superiores a 0,98, aceitando-os como satisfatrios na indicao de linearidade para
os mtodos testados.
Vale ressaltar que, em qualquer tcnica instrumental, a
relao linear simples, descrita pela equao da reta, s
vlida em um determinado intervalo de concentraes da
espcie medida, no sendo possvel a extrapolao dos
resultados para valores que estejam fora desse intervalo.
Barros Neto et al. (2002) denominam este intervalo de
massas ou de concentraes, no qual se pode construir
uma curva analtica linear, de faixa linear dinmica, e afirmam que ele deve ser o mais extenso possvel, ou seja,
que a distncia entre os pontos (distncia nos valores de
concentrao) seja razovel.

co para determinao de cido snico, em lipossomas, encontraram repetitividade com coeficiente de variao de
1,96%.
Outros autores, como Roudaut (1998) e Schenck &
Lagman (1999), encontraram, para algumas amostras, variao superior a 5% (algumas atingindo valores de 23,7%).
Apesar disso, consideraram os seus mtodos precisos,
uma vez que obtiveram mdias de recuperao aparente
de amostra, superior a 90%, nveis dentro do recomendado pela Codex Alimentarius (Codex Alimentarius
Comission , 2003). Souza et al. (2007), porm, afirmam que
variaes nessa escala (CV>5%) comprometem significativamente o mtodo, uma vez que existe a possibilidade
de incorrer em erros, dada a sua baixa preciso.
Independentemente do critrio de aceitabilidade utilizado, os resultados obtidos neste trabalho so categricos quanto preciso do mtodo. Desde que se garantam as condies experimentais, os resultados apresentaro baixa variao, o que indica a adequao do mtodo para uso nas atividades de determinao de cido
ascrbico.

Preciso

Exatido

Para a preciso do mtodo, foi calculado o desvio padro e o desvio padro relativo de cada conjunto de determinaes, sendo os resultados obtidos expostos nas
Tabelas 1 e 2.
Os valores para o coeficiente de variao, tanto para o
mtodo utilizando cido ascrbico quanto para o mtodo
utilizando o limo, foram baixos, sendo o maior (4,98) observado para o volume de 2,0 mL de amostra de suco de
limo. Considerando-se o coeficiente de variao inferior,
de 5% de variao, apresentado pela RE 899 (ANVISA,
2003), esses resultados evidenciam a preciso dos mtodos com boa repetitividade, tanto utilizando-se o suco de
limo quanto o cido ascrbico na titulao. Siqueira-Moura
et al. (2008), em trabalho com validao de mtodo analti-

Os resultados obtidos na anlise de recuperao e as

respectivas concentraes de cido ascrbico adicionadas em uma base de suco de limo com concentrao
conhecida so mostrados na Tabela 3.
A percentagem de recuperao aceitvel depende da
concentrao e de requisitos do nvel de qualidade requeridos. No mtodo de titulometria para determinao
de cido ascrbico, obteve-se um nvel de recuperao
variando de 94,82 a 98%, em funo da concentrao de
cido ascrbico adicionado s amostras de suco de limo. Considerando-se que em anlises de alimentos, a
Food and Drug Administration (FDA) recomenda faixas
de 80 a 110% para concentraes do material analisado
acima de 0,1 mg kg-1 e de 60 a 100%, para concentraes

Tabela 1. Desvio padro e coeficiente de variao sob condies de repetitividade para o cido ascrbico
Concentrao (mg/mL)
0,5
1,0
1,5
2,0

Volume de titulante (mL)

Desvio Padro

Coeficiente de variao (%)

1,39
2,97
3,91
5,07

0,13
0,14
0,36
0,15

1,58
0,90
1,55
0,51

Tabela 2. Desvio padro e coeficiente de variao sob condies de repetitividade para o suco de limo
Suco de Limo (mL)
0,5
1,0
1,5
2,0

Volume de titulante (mL)

Desvio Padro

Coeficiente de variao (%)

7,93
15,44
23,11
29,27

0,049
0,090
0,049
0,069

0,96
2,30
1,64
4,98

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Revalidao do mtodo titulomtrico para determinao do cido ascrbico

TROCAR
MAIOR
OU
IGUAL
pelo
simbolo

abaixo de 0,1 mg kg-1 (Bruce et al., 1998), os resultados

obtidos neste trabalho confirmam a exatido do mtodo
utilizado.
Segundo Ribani et al. (2004), para recuperao, os intervalos aceitveis para anlise de resduos geralmente
esto entre 70 e 120%, com preciso de at 20%. Dependendo da complexidade analtica e da amostra, este valor
pode ser de 50 a 120%, com preciso de at 15%.
A European Commission (2002) determina faixas de
recuperao mdias, em anlises de resduos em alimentos, sendo de 50 a 120%, para nveis de recuperao
MAIOR OU IGUAL 1 g/kg, de 70 a 110%, para nveis de
concentrao > 1 g/kg a 10 g/kg e, de 80 a 11 0%, para
nveis de concentrao MAIOR OU IGUAL 10 g/kg.
Souza (2007), utilizando o mtodo de cromatografia
lquida de alta eficincia, para determinar semicarbazida
em amostras de pur de ma, refeio de carne e pudim
de arroz, encontraram mdias de recuperao variando de
93,8 a 107,2%; de 96,6 a 104,1% e de 87,8 a 112,9%, respectivamente.
Em um trabalho utilizando a metodologia LC-MS/MS,
para determinao simultnea das aflatoxinas AFB1, AFB2,
AFG1 e AFG2 em castanha-do-brasil, Teixeira (2008) encontrou recuperaes variando entre 92 e 100%, para amostras com um nvel de contaminao entre 1,2 e 11,5 g/kg.
Esse autor considera como melhor que o mtodo de
cromatografia de alta eficincia a metodologia avaliada, a
qual obteve valores de recuperao de 93, 97, 95, e 95%
para AFG1, AFB1, AFG2 e AFB2, respectivamente em
amostras de castanha-do-brasil.
Aldrigue (1998), avaliando diversos modos de se determinar cido ascrbico em polpa de acerola, concluiu
que o mtodo de Tilmans foi o que apresentou os melhores resultados, quando esses foram avaliados pela percentagem de recuperao. Para esse autor, o mtodo pode
ser considerado o mais eficiente para a determinao de
cido ascrbico em amostras de frutas. Oliveira et al. (2010),
entretanto, ressalvam que, apesar da eficincia, o mtodo
de Tilmans apresenta dificuldades quando so analisadas amostras de intensa colorao, como no caso de algumas frutas, geleias, sucos e outros. Isso se d, conforme Aldrigue (1998), pela colorao natural da amostra que
dificulta a visualizao do ponto final.
Tabela 3. Mdias de recuperao das concentraes de cido
ascrbico analisadas
Concentrao (mg/mL)
0,2
0,5
0,7
1,0
2,0

Recuperao (%)
95,00
98,00
97,85
96,76
94,82

Limite de deteco
Na Tabela 4, so apresentados os resultados detectados e no detectados, em funo do nvel de concentrao de material analisado. Em seguida, os dados da Tabela so analisados para determinao do limiar de perda de
confiabilidade do mtodo, ou seja, do ponto em que o
mtodo passa a apresentar resultados no detectados para
amostras adicionadas.
O limite de deteco foi determinado visualmente e,
dessa maneira, foi considerado como sendo o menor volume, que contm a menor concentrao da soluo que o
mtodo distingue, com segurana. Souza (2007) afirma que
no existe um mtodo timo para determinao de limites
de deteco, sendo aceitveis os mais diversos utilizados
com essa finalidade.
Pode ser observado, pelos dados obtidos, que o limite
de deteco de cido ascrbico encontra-se entre os valores de 0,037 a 0,025 mg/mL, sendo considerado como
limite de deteco para cido ascrbico, no suco de limo,
um volume de 0,09 mL, o que significa que, para volumes
inferiores a este, o mtodo no consegue identificar a presena do cido ascrbico na soluo. Paschoal et al. (2008)
afirmam que, em termos gerais, o limite de deteco indica
o limite em que a menor quantidade que pode ser detectada do material analisado, em uma amostra, embora essa
quantidade no possa ser quantificada.
Teixeira (2008) utilizou a anlise de cromatogramas,
para dar origem ao limite de deteco, que foi determinado pela visualizao da menor concentrao visvel
(detectvel) para cada aflatoxina, sendo de 0,263; 0,345;
0,241 e 0,254 mg/kg-1 de amostra para AFB1, AFB2, AFG1
e AFG2, respectivamente.
Os resultados apresentados encontram-se prximos
aos observados por diversos autores que realizaram avaliaes com vitaminas. Giacomini (2006), na deteco de
vitamina A em polivitamnicos, utilizando cromatografia,
encontrou o limite de deteco a partir da concentrao
Tabela 4. Resultados referentes anlise do limite de deteco
do material analisado detectado e no detectado
Suco Limo
(mL)
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,1
0,09
0,05
0,03
0,01

Volume de
titulante
(mL)

Concentrao de
cido ascrbico
(mg/mL)

6,1
5,03
3,9
3,0
1,3
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3

0,744
0,612
0,47
0,36
0,149
0,037
0,025
0,025
0,025
0,025

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Aline Inacio Alves et al.

de 0,47 mg/mL. De acordo com esse autor, o pico do

cromatograma da soluo de vitamina A destacou-se, situando-se a uma altura trs vezes superior da mdia das
oscilaes de rudo da linha de base cromatogrfica. Quian
& Sheng (1998), tambm estudando vitamina A, encontraram limite de deteco de 0,10 mg/mL em amostra de rao. Stefanon (2001), avaliando simultaneamente as vitaminas A, D3 e E, em multivitamnicos, encontrou limites
de deteco de 0,7 mg/mL, 0,11 mg/mL e 0,125 mg/mL,
respectivamente.

CONCLUSES
A revalidao da anlise mostrou-se bastante eficiente e til, por meio da avaliao do desempenho quanto
linearidade, preciso, exatido e limite de deteco.
A linearidade, para as concentraes de cido
ascrbico em suco de limo, apresentou coeficientes de
correlao dentro dos recomendados pelos principais rgos oficiais de regulamentao.
Os resultados evidenciaram a preciso do mtodo, com
boa repetitividade, considerando-se o limite de variao
regulado pela Anvisa. A exatido apresentou resultados
satisfatrios, dentro dos padres da FDA.
A revalidao da metodologia de determinao de cido ascrbico por titulometria confirmou ser, esta, uma tcnica precisa e confivel, com vantagens significativas na
determinao desse composto, assegurando a confiabilidade e comparabilidade dos resultados emitidos e permitindo que o laboratrio garanta sua competncia tcnica
e a qualidade dos ensaios que realiza.

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