Antimicrobial potential of metabolites extracted

from bacterial symbionts associated with marine

sponges in coastal area of Gulf of Mannar
Biosphere, India
S. Skariyachan, A. G. Rao, M.R. Patil, B. Saikia, V. Bharadwaj KN and J. Rao GS

Mestrado em Biologia Celular e Molecular 2014/2015

Laboratrio em Microbiologia
Professoras: Isabel Amorim; Olga Lage
Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - Joo Manuel Silva Rodrigues

Introduo
As esponjas marinhas albergam
diversos microrganismos at 40% do
contedo celular total

Endossimbiose entre microrganismos

e os seus hospedeiros digesto,
nutrio, estabilizao do esqueleto
e defesa qumica.

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Introduo

As esponjas marinhas so uma

fonte muito rica de metabolitos
secundrios bioactivos.
Os metabolitos isolados das
esponjas pertencem a uma mirade
de classes de compostos:
alcalides, politeres, terpenides,
pptidos, etc.
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Introduo
As regies costeiras da ndia tm uma ampla
diversidade em esponjas marinhas
Golfo de Mannar, Tamil Nadu, ndia

Gulf of Mannar Biosphere

Procura de metabolitos
bioactivos em esponjas
desta regio
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Captura das Esponjas

Captura com redes de pesca
de caranguejo

Sacos hermticos com gua

do mar; 4C
12h

Processamento das amostras

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Captura das Esponjas

Seis esponjas marinhas distintas
Cacaspongia spp.
Sigmadocia spp.
Callyspongia spp.
Dendrila spp.
Haliclona spp.
Gorgonid spp.

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Isolamento dos microrganismos

Lavagem das esponjas e homogeneizao das amostras

Diluio dos homogeneizados e inoculao em marine agar

24 horas

Contagem do nmero de CFU por grama de amostra

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Isolamento dos microrganismos

A maioria das bactrias eram bacilos ou cocos Gram-positivos
Isolamento seletivo das bactrias

MacConkey agar
TCBS agar
BTB lactose agar
Milk agar com cetrimida

Vibrio spp. encontrava-se presente em todas as amostra

Callyspongia spp. apresentava Pseudomonas spp.
Staphylococcus spp. presente em todas as amostras
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Teste preliminar de Bioactividade

Teste da bioactividade dos isolados por agar overlay method
MRSA
Proteus mirabilis
Klebsiella organismis
Salmonella typhi
Dois isolados com bioactividade
Callyspongia spp. MRSA
Haliclona spp. Salm. typhi
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Anlise bacteriolgica das estirpes

Testes bioqumicos

OsNitratos
metabolitos
Indole
Vermelho de metilobioactivos
Urease so de
Vogues Prauskauer
Catalase
natureza
extracelular
Citrato
Oxidase
Triple sugar iron
H2S
Hidrlise do amido

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Isolamento e purificao dos metabolitos

Crescimento dos isolados em marine broth e em
minimal essential media (agitao, a 35C)
7 dias

Centrifugao das culturas a 10000 x g

20 min

Recolha do sobrenadante

Separao lquido-lquido
com acetato de etilo

Recolha da fase orgnica

(armazenamento a 4C)

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Teste de Bioactividade
Teste de bioactividade dos extratos por mtodo de
difuso por poos (25 a 100 M)

MRSA
Salmonella typhi

Extratos com actividade antimicrobiana

Callyspongia
MRSA spp.
Callyspongia
spp. spp.
Pseudomonas
Haliclonaspp.
spp.Bacillus
Salm. typhi
Haliclona
spp.
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Anlise fitoqumica
Pseudomonas
spp.
Bacillus spp.
Meyer, Wagner
alcalides
Alcalides
Alcalides
Molisch carbohidratos
Quinonas
Quinonas
Libermann Burchard
esterides
Flavonil
glicsidos
Flavonil glicsidos
cido sulfrico
quinonas
Carbohidratos
Cloreto de ferroFlavanides
(III) - fenis
Biureto, Ninidrina, Bradford
- protenas Protenas
Lpidos
Testes para lpidos, -flavanides e flavonil glicsidos

plakorsin A
polytheonamide B

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Purificao e caracterizao dos metabolitos

Cromatografia em camada fina (acetato de etilo - hexano, 30:70)
Cromforo Pseudomonas spp.
Fluorforos Bacillus spp.

Eluio dos compostos para anlise

por espetrofotometria UV-Vis

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Purificao e caracterizao dos metabolitos

Espetrofometria UV-Vis
Cromforo pico aos 600 nm
Fluorforos picos aos 280 e
aos 320 nm

O composto cromforo
mais
Espectroscopia
FT-IR do cromforo
eficiente na inibio do
-OH, -CN,
e CO
crescimento
das -CH
estirpes
de teste

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Caracterizao molecular das bactrias

Anlise genmica sequenciao genes rRNA 16S
Primers universais:
16F - 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
16R - 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
Sequenciao dos amplificados:

Cromforo - Pseudomonas spp. RHLB12 (99% ID)

Fluorforo - Bacillus licheniformis T6-1 (96% ID)
KF225558.1 (GenBank)
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Em suma
Haliclona spp.

Callyspongia spp.

Bacillus licheniformis
T6-1

Salm. typhi

Pseudomonas spp.
RHLB12

MRSA

Identificao de dois compostos com potencial

farmacolgico contra bactrias patognicas
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Crticas ao artigo
Discusso dos resultados muito confusa
Falta de coerncia na citao das imagens ao longo do artigo

Anlise qumica e estrutural muito pobre

(Fase muito inicial do estudo?)

Caracterizao molecular programa de PCR

Poderiam ter feito anlise para genes que codificam NRPS, para
avaliar qual a natureza dos metabolitos bioactivos
Falta de uma concluso
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