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Práticas de Biologia Celular
Práticas de Biologia Celular
Caderno Didtico de
Biologia Celular
(BLG 138)
lgion Loreto
Departamento de Biologia -2005
Sumrio:
Pgina
Introduo
Primeira Parte
Uma breve reviso de Biologia Celular
12
16
24
Segunda Parte
Recomendaes de ordem geral a serem observadas no uso do Laboratrio.
27
29
40
41
42
Um pouco de fsico-qumica: pH
44
47
Fracionamento celular :
centrifugao.
49
cromatografia
51
eletroforese
53
54
57
59
60
61
62
65
65
INTRODUO
Biologia Celular (BLG 138) uma disciplina do primeiro semestre, e ministrada com duas
horas/aula (h/a) tericas e duas h/a prticas semanais.
Os principais objetivos da disciplina so o dar ao aluno:
-
uma viso atual da organizao e funcionamento celular, assim como o domnio dos
conceitos bsicos dessa rea do conhecimento;
uma viso histrica sobre as principais descobertas que levaram aos paradigmas atuais
dessas cincias;
O presente Caderno Didtico foi escrito para auxiliar a atingir os objetivos descritos acima.
Para tal, ele consta de duas parte:
1a) Uma breve reviso terica atualizada, porm escrita em nvel de ensino mdio. Este
texto servir de base para as primeiras semanas de aula terica que consistir de uma reviso
geral de Biologia Celular.
2a) Protocolos das aulas prticas. Estas atividades sero executadas durante as aulas
prticas e cabe ao aluno fazer o registro solicitado nos protocolos. Pensamos ser este material
uma posterior fonte de consulta para a execuo de atividades didticas.
O aprofundamento terico, que se seguir reviso apresentada na primeira parte deste
Caderno Didtico ser feito a partir da seguinte bibliografia:
CARVALHO, H.F. e RECCO-PIMENTEL, S.M. A clula 2001. Barueri,SP, Ed. Manole, 2001.
JUNQUEIRA , L.C. e CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 7a Ed. Rio de Janeiro,
Guanabara-Koogan, 2000.
DeROBERTIS, E.D.P. e DeROBERTIS, E.M.F. Bases da Biologia Celular e Molecular. 14 ed, Rio
de Janeiro, Guanabara-Koogan, 2003.
COOPER, G.M. A clula, uma abordagem molecular. 2 ed P. Alegre, Artes Mdicas, 2001.
ALBERTS, B. e colaboradores. Fundamentos da Biologia Celular. P. Alegre, Artes Mdicas,
1999.
ALBERTS, B. e colaboradores. Biologia Molecular da Clula. 4 ed. P. Alegre, Artes Mdicas,
2004.
qumicos,
por
isto
chamadas
de
mesmos
pelos
funcionamento
dos
seres
vivos,
podem
no
funcionamento
uma
chamados
de
B) cidos nuclicos
C) Protenas
D) Lipdios (gorduras)
As trs primeiras classes formam
MOLCULAS POLIMRICAS, isto , so
molculas compostas por unidades que se
repetem, denominadas MONMEROS.
2. As molculas orgnicas
Em
(tambm
acares ou carboidratos)
Glicdios
primeira
observao,
muito
orgnicas
complexos.
so
Suas
gigantescas
protenas.
Como
poderemos
estudar
as
protenas,
temos
uma
diversidade to grande ?
Esta tarefa, que aparentemente
impossvel, torna-se facilitada pelo fato de
compem
cada
classe
de
No
grupo
dos
glicdios,
principal
deles.
aproximadamente
os
30-
40
2.1 PROTENAS
As protenas so as molculas
responsveis pelo funcionamento da
clula.
Praticamente todas as atividades da
clula e, portanto, de um organismo so
executadas por protenas.
O
transporte
de
substncias
do
nosso
corpo
contra
os
uma
dessas
funes
dessa
protena.
conseqncia
da
uma
chamada de radical.
nova
protena
que
no
funcione
diferentes,
temos
uma
protena,
representa
estrutura
por
sua
como
terciria
vez,
de
aquela
sua
uma
que
forma
protenas
depende
da
seqncia
de
depende
aminocidos
que
da
seqncia
compe
de
protena
(estrutura primria).
A troca, acrscimo ou retirada de um
aminocido PODE ocasionar alteraes na
estrutura dessa protena, alterando sua forma
e, portanto, sua funo. A troca de um
aminocido na protena ribonuclease, por
exemplo,
aminocido
Figura 6. Estrutura secundria
terciria da mioglobina.
substituio
(treonina)
por
do
terceiro
uma
glicina
para
entender
de
aminocidos.
Imagine
uma
variam
de
protena
para
reaes
qumicas)
encaixar-se
Figura 8.
uma
alterao
no
formato
formando
tridimensional
tpica,
uma
ou
estrutura
seja
cada
ter
provocando
efeitos
apenas
menos drsticos,
uma
pequena
no hemoflica.
As
protenas,
enquanto
Enzimas
As enzimas formam uma classe
especial de protenas que tem como funo
Cada enzima especializada em
uma
reao
especfica.
recebe
nome
produzir.
As protenas presentes nos alimentos
Por
reao
de
SUBSTRATO.
Na enzima, existe uma regio que se
liga especificamente ao substrato e a esta
regio chamamos de STIO ATIVO. Assim,
aps a interao do substrato com o stio
que
promovem,
importantes
no
de um bife eram
msculo
da
vaca.
As
protenas
saindo
protenas
como
estranhas
ao
Por
por
exemplo,
colgeno
aproximadamente
3.000
10
O funcionamento de um organismo
depende de suas protenas.
pele,
absorvida
uma
como
poderia
molcula
de
ser
3.000
Caso
isso
acontecesse,
antgeno).
Os aminocidos so divididos em
tipo
nuclicos.
quantidade
de
de
molcula
orgnica,
os
cidos
protenas
2.2.CIDOS NUCLICOS
nitrogenada,
um
acar
(ribose
ou
essa
uma
protena
de
baixa
para obter as 56 g
de
protenas.
Figura 10. Nucleotdeo
11
desoxirribonuclico)
RNA
(cido
ribuclico).
originando
cpias
exatamente
iguais
molcula original.
2) Capacidade de conter a informao da
seqncia de aminocidos que compe as
protenas. As seqncias de nucleotdeos do
DNA determinam a estrutura primria das
protenas.
importantes.
Sempre
que
as guaninas.
traduzida
em
uma
seqncia
de
visto adiante).
2.3. GLICDIOS
Duas
propriedades
importantes
12
As
principais
funes
esto
glicose.
clula-clula
2.4. LIPDIOS
Os
lipdios
ou
gorduras
H vrias classes de
so a unidade
neutras
que
funcionam
como
reservas energticas.
Figura
14
-Exemplo
de
alguns
monossacardeos
b) Polissacardeos - so formados pela
unio
de
vrios
POLMEROS
DE
monossacardeos
(so
GLICOSE)
trs
Os
(reserva
de
energia
dos
os
fosfolipdios
os
triglicerdios.
Nesses
lipdios,
uma
das
13
amido em glicose.
Os fosfolipdios e esfingolipdios so
membrana
funo
como
desses aminocidos.
plasmtica.
por
exemplo
Outra
a
testosterona,
progesterona.
conceito
importante
para
bem
simples:
um
professor
presente
na
saliva
ter
macromolculas
apresentam
nova
propriedade
(capacidade
de
da
forma
esterioqumica
da
propriedade
nova
(capacidade
de
14
Os
ribossomos
so
estruturas
celular
automaticamente
elas
Muito
do
possuem
funcionamento
tambm
ESTRUTURAS
estruturas
supramoleculares
formadas
sub-unidades
do
SUPRAMOLECULARES.
Estruturas
as
por
so
vrias
montagem,
uma
PROPRIEDADE
nova
so
etc...
associarem,
estruturas
Estas
supramoleculares.
macromolculas,
formam
dada
pela
ao
se
mitocndria
que
totalidade
de
seus
apenas
por
um
ou
outro
estrutura
com
organizao
supramolecular.
15
UNIDADE II
A ORGANIZAO CELULAR
unidade
morfo-fisiolgica
dos
seres
uma
forma
geral,
quando
celular de um procarionte.
fazendo
as
trocas
citoplasma
contm
responsveis
clula
com
pelo
o
as
meio,
organelas
funcionamento
ncleo
controla
da
este
funcionamento.
aspectos importantes:
sculo
celular,
no
fornecemos
viso
da
do
funcionamento
quais
seriam
as
constituio
passado,
procariticas e eucariticas.
So quatro as partes essenciais que
podemos encontrar em toda clula:
celular
16
caracterstica
PERMEABILIDADE SELETIVA.
da
membrana
Informao gentica -
clula.
como,
quando
informao de
onde
montar
as
realiza
seletiva,
capazes
informao
de
gentica
transformar
em
metablica.
funo
temos
de
que
permeabilidade
estudar
como
maquinaria
esta
Os
lipdios
da
membrana
so
de
energia
(cidos
graxos
triglicerdios).
facilmente
nos
ser
reconhecidos
Enquanto
os
lipdios
Figura 18.
MEMBRANA CELULAR
O que delimita a clula do resto do
universo uma fina membrana LIPO-
Fosfolipdio
ou membrana celular.
A clula no pode se isolar do meio
17
da membrana
como
os
acares,
Modelo
do
MOSAICO
as
PROTENAS.
das
membranas
preponderantemente
apolares.
Desta
Como
forma,
As
dos
ficam
na
fosfolipdios
regio
interior
das
da
com
as
18
substncias
passam
pela
passar
fosfolipdios.
Figura
21-
Modelo
do
MOSAICO
diretamente
Para
estas
pelos
substncias,
Este
modelo
chamado
de
denominao
de
Mosaico
fixos
na
membrana,
podendo
forma:
a) OS FOSFOLIPDIOS atuam como uma
precisam
entrem.
2)
b)
AS
portes
PROTENAS
(tecnicamente
funcionam
chamados
como
de
passar
Transporte
pelas
protenas.
passivo
ou
Essa
difuso
uma
substncia
est
mais
passam as molculas;
so as elas que
Protenas
especficas,
CARREADORES,
chamadas
permitem
que
de
essas
19
aberturas
ou
canais
nas
prprias
protenas).
NA INTERNET:
Entenda melhor a membrana celular comparando-
com
bolhas
de
sabo:
www.sbbq.org.br/revista/artigo.php?artigoid=41
podemos
ver,
somente
especiais
podem
passar
pela
membrana.
Molculas
grandes
entram
na
clula
atravs
de
endocitose
(fagocitose
entram
passam
na
clula,
membrana
envolvidas em membrana.
mas
pois
no
entram
20
MAQUINARIA METABLICA
isto acontece?
uma
aceto-bactria
se
duas aceto-bactrias...
INFORMAO GENTICA
motivo
As
diferenas
que
ocorrem
no
qualquer
(celulose)
para
tivssemos
comer,
papel
acabaramos
Chamamos
de
maquinaria
metabolismo
as
captam
metablica
protenas
conjunto
celular).
da
de
Por
membrana
enzimas
exemplo,
que
determinada
nutriente.
molcula
informao
como
fonte
gentica
de
est
21
nuclicos.
Para
(procariticas
todas
ou
macromolcula
as
clulas
eucariticas),
informacional
a
DNA.
1)
genes
protenas.
A
informao
gentica
total,
So
que
codificam
transcritos
para
para
RNA
funcionais,
RNAs
molcula
de
comeando
DNA
em
cromossomo
que
uma
contnua,
extremidade
prolongando-se
do
que
desempenham
funes
miRNA.
sem
3) genes no transcritos. So
seqncias de DNA que, embora no sejam
recombinao,
de
diferentes
que
so
seqncias
telomricas,
proteo
das
seqncias
envolvidas
extremidades
na
dos
cromossomos...
nucleotdeos
este
de,
na
seqncia
de
nmero
bases
seria
desta
imensa
gentica,
nos
genes
dessa
bactria.
Estudos moleculares recentes tem
ampliado o conceito de gene: uma
22
23
tenha
necessrios
polipeptdios,
que
sntese
chamamos
uma
trinca
de
bases
que
seja
de
de
mRNA
dentro
do
ribossomo
> ribossomos
representadas
>RNAs transportadores
como
tendo
em
uma
transportam
mesmo
aminocido.
Por
estar
transportando
para
dentro
do
Montagem do ribossomo - a
sntese de protenas.
polipeptdica
nascente
(stio
P).
Crescimento
da
cadeia
24
polipeptdica.
RNA mensageiro.
comum
encontrar,
no
um
processo de traduo.
subunidade
mRNA,
menor
iniciando
pode,
ento,
se
novamente
um
mecanismos
de
fenilalanina),
com
Atravs
dos
lacto-bactria,
cadeia
aminocido.
ribossomo
se
desloca,
informao
contida
no
Unidade III
DA CLULA PROCARITICA PARA
A CLULA EUCARITICA.
Podemos dizer que uma bactria
um bom exemplo de uma clula mnima.
Vimos
anteriormente
membrana,
como
maquinaria
atuam
metablica,
chamado
de
SISTEMA
DE
ENDOMEMBRANAS;
d
Uma
rede
de
protenas
clula,
chamada
de
CITOESQUELETO.
informao
gentica
apresenta
dos
algumas
est
sempre
complexado
com
a molcula de DNA
26
Cromatina.
Conforme
m)
interfase.
formando
as
fibras
dos
mximo
de
dobramento,
que
que
teve
as
protenas
cidas
seqncia
de
bases
que
DNA
contm,
aproximadamente,
27
Ter
genomas
caracterstica
dos
organismos
grandes
uma
eucariotes.
apresentam
Esses
grandes
As
principais
vantagens
da
sistemas enzimticos;
as
reaes
qumicas,
do
sistema
de
endomembranas
Retculo endoplasmtico:
O
retculo
endoplasmtico
(pequenos
tubos)
cisternas
forma
clulas
todo
eucariticas
dividido
em
so
estruturas
cada
compartimento.
enzimas
especificas
reaes
qumicas
Alm
disso,
proporcionam
caractersticas
est
envolvido
em
tbulos,
SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS
As
de
tem a
as
do
dRetculo
endoplasmtico
rugoso-
que
do
foram
sintetizadas
retculo
pelos
endoplasmtico
28
para
participar
da
digesto
intracelular.
secreo
celular
tem
vrias
no
retculo
endoplasmtico
(amadurecimento)
ser
clula eucaritica:
produzidas
pelo
chamadas
vesculas
Complexo
de
Golgi,
secretoras,
sero
vescula
endoctica;
mv=
microvilosidade.
Lisossomos:
So vesculas que contm hidrolases
cidas (enzimas digestivas que atuam em pH
Secreo celular:
digesto intracelular.
29
Digesto intracelular:
vezes
lisossomo
primrio
nuclicos
seus
no
comer ).
respectivos
polissacardeos
monmeros,
em
ocorrendo
digesto
intracelular
tambm
atuam em conjunto.
Peroxissomas:
Os
precisamos
pequenas
enzimas
que
quebrem
peroxissomas
ou
vesculas
microssomas
de
forma
so
esfrica,
Os
(peroxidases,
da
vescula
fagocitose
ou
internalizar
endoctica,
carregam
catalases
OXIDASES
superoxido
ou
seja,
por
clula
vai
formas
dentro
de
pinocitose,
alimento
peroxissomas
ativas
do
oxignio
(RADICAIS
uma
gua
lisossoma
secundrio,
onde
ocorrer
oxigenada,
No
interior
de
chamada
de
reaes
tambm
nossas
qumicas
de
clulas,
milhares
esto
30
metablicas
produzem,
alguns
mais
(O2-).
superoxido
reativos,
como
DNAs,
as
nossas
clulas
estes
enzimas
radicais
so
livres.
Estas
armazenadas
nos
PEROXISSOMAS.
Crianas
que
nascem
com
um
CITOESQUELETO
Mitocndria:
Um
compartimento
citoplasmtico
mitocndria,
muito
uma
(organela)
importante
vez
que
a
este
movimentos
coordenados
dos
uma
energia
filamentosas
provinda
dos
alimentos,
complexa
rede
de
protenas
chamadas
de
Citoesqueleto:
rede
de
de
endomembranas
contm
dinmica,
reorganizando-se
bem
citomusculatura,
ser
chamado
de
j que responsvel
31
como em todos os
intracelulares,
tais
como
estacas ou colunas.
Os
DIVISES DO CITOESQUELETO:
microtbulos
citoplasmticos
classes
os
os
classes
desempenhadas na clula.
trs
microtbulos,
filamentos
de
os
componentes:
microfilamentos
intermedirios.
Essas
interior da
at seu destino.
MICROTBULOS
Alm
citoplasmtica,
formar
de
os
constituir
uma
microtbulos
rede
podem
ORGANELAS MICROTUBULARES.
32
so
clula
amebides).
at
outro,
estes
microtbulos
responsveis
Essa
por
funo
movimentos
executada
plos da clula.
FILAMENTOS INTERMEDIRIOS
movimentos
Os filamentos intermedirios so
organizao
sendo
microtbulos
apresentem
peculiar:
nove
pares
de
mais
importante
delas
QUERATINA.
Os
filamentos
filamentos
associam-se
intermedirios
a
protenas
da
Os microfilamentos so formados,
filamentos
intermedirios
so
mais
Figura 33 Microfilamentos
DO UNICELULAR AO PLURICELULAR
Durante o processo evolutivo, alguns
organismos tomaram o caminho de formar
colnias de muitas clulas. Posteriormente,
cada clula foi se especializando em uma
determinada funo. Este caminho levou ao
surgimento de seres pluricelulares.
A
rigor,
pluricelulares
todas
as
contm
clulas
a
dos
MESMA
maquinaria
metablica
de
uma
clula
33
medida
desenvolvimento
pluricelulares,
que
ocorre
dos
organismos
diferentes
genes
sero
um
diferenciao,
processo
chamado
de
34
www.sbg.org.br
35
36
1a Aula
37
observada. Em muitos aparelhos, a intensidade e qualidade da luz tambm pode ser controlada
atravs de um parafuso que permite subir ou baixar o condensador.
Duas lentes ou conjuntos de lentes permitem o aumento da imagem da preparao, so as
lentes oculares e as objetivas. As oculares, como o prprio nome diz, ficam prximas ao olho do
observador. J as objetivas ficam prximas ao objeto a ser observado. As objetivas so afixadas
em um sistema rotativo, o revlver, que permite que sejam trocadas com facilidade. Quanto maior
o tamanho da objetiva, maior o aumento que ele proporciona. As objetivas e oculares, trazem
escrito no seu corpo, vrias informaes e entre elas o seu valor de aumento. O aumento final
dado por um conjunto de lentes obtido multiplicando o aumento da objetiva pelo aumento da
ocular. Assim, se o aumento da objetiva de 10X e a ocular tambm de 10X o aumento final
de 100 vezes.
38
Procedimento:
1) Corte um pedao de jornal que contenha algumas letras, coloque sobre uma lmina e
leve ao microscpio.
2) Focalize algumas letras. O que acontece? Desenhe.
3) Mude as objetivas. O que acontece? Desenhe.
4) Pegue um fio de cabelo, coloque entre lmina e lamnula. Leve ao microscpio, observe
e desenhe.
Questes a serem respondidas:
1) Como se calcula a aumento final que estamos vendo em um microscpio?
2) Porque a imagem vista em um microscpio invertida?
3) O que microscopia de fluorescncia? Para que serve?
4) O que microscopia de contraste-de-fase? Para que serve?
5) Descreva o processo de focalizao de Khler
6) O que um estereomicroscpio?
7) O que microscopia eletrnica? Descreva o funcionamento de um microscpio eletrnico e
compare o seu funcionamento com o do microscpio ptico.
39
2a aula
40
PARA FAZER EM CASA (As questes e desenhos dessa atividade deve ser entregue junto com as
questes e desenhos da segunda aula)
Procedimento:
1) Em um recipiente com um pouco de azeite de cozinha (que um lipdio- portanto
apolar), coloque uma pitada de acar (que um glicdio). Mexa bem. O que aconteceu? Por que?
- Repita com sal de cozinha, o que aconteceu? Por que?
2) Em um recipiente, coloque um pouco de acetona ou ter ou gua-raz ou gasolina (todos
estes so solventes apolares). Coloque uma colher de acar. Agite. O que aconteceu? Por que?
- Repita com uma gota de azeite. O que aconteceu? Por que?
3) Em 3 recipientes, coloque:
no 1o: 1/2 de gua, 1/2 de azeite
no 2o: 1/2 de azeite, metade de detergente colorido (azul ou vermelho)
no 3o: 1/3 de gua, 1/3 de azeite e 1/3 de detergente colorido.
Agite os lquidos com uma colher e observe por 5 minutos ou mais. Descreva o
que aconteceu?
As membranas biolgicas so formadas, principalmente, por lipdios e protenas
anfipticas, ou seja, molculas com uma parte apolar (lipossolveis) e uma parte polar
(hidrossolvel) como os detergentes. Portanto so, hidrossolveis e lipossolveis ao mesmo
tempo.
41
Responda:
a) Faa um desenho de como so organizadas as molculas anfipticas de detergentes
em uma bolha de sabo.
b) Faa um desenho de como so organizadas as molculas de lipdios e protenas nas
membranas plasmticas (Consulte os modelos nos livros de Biologia Celular).
c) Que propriedades podemos esperar da Membrana Biolgica segundo o modelo do
Mosaico Fludo ?
d) Qual a funo dos lipdios (fosfolipdios) nas membranas biolgicas segundo o modelo
do M-F ?
e) Qual a funo das protenas nas membranas biolgicas segundo o modelo M-F?
3a Aula:
42
Material necessrio:
Lmina, lamnula, palito de fsforo, placa com bactrias, ala de platina, lamparina, lcool
70%, corante azul de metileno 0,05%, papel filtro, copo Becker 250 ml (ou vidro de Nescaf),
microscpio.
Procedimento:
1) Com uma ala de platina, encoste levemente em uma colnia de bactrias na placa de
Petri.
2) Esfregue a ala na lmina at espalhar bem as bactrias.
3) Fixe as bactrias pelo calor, passando a lmina na chama de uma lamparina, com as
bactrias voltadas para cima, tomando o cuidado para a lmina no aquecer demais (controle nas
costas da mo).
4) Com um palito de fsforo, raspe a bochecha, posteriormente,esfregue o palito em cima
da regio da lmina em que previamente foram colocadas as bactrias.
5) Fixe as clulas em lcool 70% por 1 minuto.
6) Coloque uma gota de corante (azul de metileno 0,3%) e espere 1 minutos.
7) Tire o corante, deixando passar um pequeno fluxo de gua, sob a torneira.
9) Cubra com lamnula, seque os lados da lmina e observe ao microscpio.
Questes a serem respondidas:
1) Compare as clulas procariotas e eucariotas (observe e desenhe):
a) Quanto ao tamanho - Faa um desenho com as relaes de tamanho, no esquecendo
de anotar o aumento usado.
b) Quanto forma.
c) Quanto presena de ncleo.
d) Porque fixamos as bactrias na chama ?
e) Qual a funo da fixao em lcool ?
f) Qual a funo de cada um dos componentes do corante?
2) Quais seres vivos chamamos de procariontes? Quais os que representam os
eucariontes?
3) Que outras diferenas existem entre as clulas procariotas e as eucariotas, mas que no
puderam ser vistas ao microscpio ptico? O que precisamos fazer para poder detectar estas
diferenas?
43
UM POUCO DE FSICO-QUMICA:
(as questes dessa atividade devem ser respondidas e entregues junto com as da 3a aula)
O que pH ?
INFORMAES TERICAS:
Muitas molculas esto continuamente formando ons. A gua, por exemplo, forma os ons
H+ e OH-, que permanecem por algum tempo nesta forma inica e voltam a se associar para
formar nova molcula de gua. A molcula de gua ao se dissociar, forma quantidades iguais de
ons H+ e OH- .
Algumas molculas formam quantidades desiguais de ons H+ ou OH-. Por exemplo:
a) HCl (cido clordrico) forma os ons H+ e Cl - . Sempre que a dissociao de uma molcula em
seus ons forma prtons H+, ela um CIDO.
b) NaOH (hidrxido de sdio) forma os ons Na+ e OH-. Sempre que a dissociao de uma
molcula em seus ons forma hidroxilas OH-, ela uma BASE.
O pH (potencial de Hidrognio) uma medida da quantidade de prtons H+ presentes em
uma soluo. Quanto mais prtons H+, mais cida a soluo. Quanto mais hidroxilas (OH-)
mais bsica, ou alcalina a soluo. A gua, como tem igual quantidade de H+ e OH- dita
NEUTRA.
Chamamos de ESCALA DE pH as variaes na quantidades de prtons H+, que varia de 1
a 14. As solues com pH abaixo de 7 so ditas cidas e as acima de 7 so as bsicas (alcalinas).
A gua tem pH 7,0.
cido
pH
Neutro
Base
8 9 10 11 12 13 14
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pH da soluo.
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I . Preparando a atividade:
Material Necessrio para Execuo do Experimento:
- Folhas de Repolho Roxo,
- cido actico (3%) ou vinagre
- Hidrxido de sdio (0,1 M), ou uma soluo feita com umas escamas de soda custica (2 ou 3)
em 10 ml de gua (+/- 3 colheres); em ltimo caso pode se usar leite de magnsia.
- Frascos incolores / transparentes para a visualizar as alteraes de colorao
- Conta-gotas ou pipetas (no mnimo um para cada soluo)
Preparo das SoluesA) Infuso de repolho roxo:
Picar bem 2 a 3 folhas de repolho roxo (correspondente a uma xcara), colocar em gua
fervente e esperar alguns minutos, para que a gua torne-se colorida.
PROCEDIMENTO:
1. Colocar, em quatro frascos transparentes um pouco da soluo de repolho roxo
2. Acrescentar algumas gotas de vinagre. Observe o que acontece.
3.
Acrescente agora algumas gotas de soluo de NaOH (ou soluo de soda custica).
4 a Aula
Material necessrio:
Lmina, lamnula, agulha hipodrmica descartvel, lmina de barbear, conta gotas, gua
destilada, soro fisiolgico (NaCl 0,9%), soluo hipertnica (soluo saturada de NaCl e/ou
acar); papel filtro, MO, luvas descartveis, gua sanitria, algodo, glicerina.
Procedimento:
1) Coloque uma gota de soro fisiolgico em duas lminas limpas (o uso de soro fisiolgico
e opcional, se a gota de sangue for de um volume razovel -uma gota grande- no se faz
necessrio o uso de soro fisiolgico).
2) Fazer um pequeno furo na ponta de um dedo, com uma agulha descartvel estril e
colocar uma gota de sangue sobre cada lmina (todas as agulhas devem ser dispensadas em um
frasco com uma soluo 20% de gua sanitria).
3) Cubra com lamnula e observe ao MO. Descreva e desenhe as hemcias.
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4) Em uma das lminas, com um conta-gotas coloque uma gota de uma soluo
hipertnica em um dos lados da lamnula e encoste um papel filtro do outro lado para substituir o
soro da lmina. Dessa forma, o papel filtro puxar um pouco do sangue da lmina e no outro lado,
um pouco da soluo hipertnica entrar em contato com as clulas sanguneas.
5) Observe ao MO, principalmente na regio da lmina onde as hemcias mais entraram
em contato com a soluo hipertnica que as hemcias murcharam, ficando crenadas.
6) Na outra lmina, repita o mesmo procedimento anterior, s que em vez de soluo
saturada, use gua destilada. Observe na regio da lmina onde as hemcias mais entraram em
contato com a soluo hipotnica que as clulas esto trgidas, quase estourando (e as vezes
realmente estouram).
Terminada esta parte da prtica, as lminas devem ser mergulhadas em uma soluo de
gua sanitria 20% (ou lcool 96 GL) por no mnimo 1/2 hora, para depois ser limpo e
reaproveitadas.
Cada aluno deve passar um algodo com lcool, na mesa e demais partes
manuseadas do microscpio.
1) O que osmose? quando ocorre?
2) Porque ocorre hemlise (as hemcias estouram) quando as colocamos em gua destilada?
3) Porque as hemcias ficam crenadas na presena de uma soluo hipertnica?
48
5a aula
FRACIONAMENTO CELULAR
O emprego do microscpio, seja o microscpio ptico ou eletrnico, geralmente fica restrito
descrio das estruturas celulares. Para o estudo da composio qumica dos componentes
celulares e interpretao das interaes entre estes componentes para explicar o funcionamento
celular, se faz necessrio o emprego de outras metodologias que no o uso do microscpio. O
estudo bioqumico dos componentes celulares requer a separao e o isolamento cuidadoso das
vrias organelas e macromolculas celulares. As 3 principais tcnicas usadas para isto so a
centrifugao, cromatografia e eletroforese.
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Procedimento:
Primeira parte: Observao de um corte transversal de folha de Tradescantia
1) com uma gilete afiada, corte transversalmente uma folha de Tradescantia, o mais fino
possvel.
2) Coloque o corte em uma lmina com uma gota de gua, cubra com lamnula e leve ao
microscpio.
3) Observe: a) que clulas tem pigmento roxo. Desenhe
b) Que clulas tem cloroplastos. Identifique os cloroplastos e desenhe.
Segunda Parte: Fracionamento por centrifugao.
1) Coloque 3 ml de soro fisiolgico em um gral;
2) Esmague nesta soluo 3 a 4 folhas de Tradescantia com um pistilo;
3) Coloque o lquido em um tubo de centrfuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar
fibras de celulose e restos de tecidos;
4) Transfira o sobrenadante para um novo tubo, e centrifugue por 5 minutos a 7.000 rpm.
6) Desenhe e descreva o que encontramos no tubo aps a centrifugao.
7) Passe o sobrenadante para um novo tubo.
8) Ressuspenda o precipitado com dois ml de soro fisiolgico.
9) Faa uma lmina com o sobrenadante e com o precipitado, observe ao microscpio e
desenhe.
10) Acrescente uma gota de SDS 1% ou detergente no tubo com lquido verde, agite por um
minuto.
11) Centrifigue os tubos, sobrenadante e o precipitado (agora ressuspenso) por 5 mim a 7.000.
12) Observe e desenhe o que encontramos nos tubos
13) Faa uma lmina com o precipitado do tubo verde.
Responda as questes:
1) Que mtodo usamos para romper as clulas, nesta prtica?
2) Porque usamos soro fisiolgico e no gua?
3) O que encontramos no sobrenadante aps a primeira centrifugao? E no precipitado?
4) Por que usamos o SDS?
5) Por que o sobrenadante agora verde e o precipitado incolor?
6) o que uma ultracentrfuga?
7) Faa um esquema de fracionamento celular, que voc poderia fazer se tivesse uma
ultracentrfuga, e desejasse fracionar hepatcitos nos seus vrios componentes.
6a aula
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Atividade experimental:
1- Coloque um pequeno pedao de esponja na ponta de uma pipeta Pasteur.
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2- Faa uma soluo de Slica gel em um copo volumtrico ou becker, usando gua de torneira
levemente acidulada com 1 gota de vinagre para cada 10 ml. Com um conta-gotas, coloque a
resina (slica gel) na coluna. A este procedimento chamamos empacotamento da coluna.
3- Em um gral, coloque uma folha de manto-de-viuva (Tradescantia), com umas gotas de guaacidulada e esmague com o pistilo.
4- Colocar aproximadamente um ml desse lquido na coluna
5- Com uma pipeta de Pasteur coloque gua na ponta superior da coluna e observe que um lquido
roxo comea a descer, enquanto uma camada verde se deposita na ponta superior da coluna.
Aps algum tempo comea a pingar uma soluo roxa (antocianina). Colete amostra desta fase.
6- Substitua o lquido que passa pela coluna, coloque etanol na parte superior da coluna e observe
que o pigmento verde comea a descer
7- Quando comear a pingar o pigmento verde, colete uma amostra deste.
Responda:
1) Faa um desenho esquemtico representando o experimento e explique-o.
2) Porque o pigmento roxo diludo primeiro na coluna?
3) Por que o pigmento verde fica retido no coluna enquanto estava passando gua pela coluna?
4) Por que ele desceu na presena de lcool?
5) Qual a localizao intracelular das antocianinas?
6) Qual a localizao intracelular das clorofilas?
7) Qual a solubilidade desses pigmentos?
Procedimento:
1) Pique uma cebola grande (250g) em pequenos pedaos (ou rale com um ralador). Faa uma
soluo misturando 10 ml de detergente de loua, 1/2 colher de sopa de sal e complete com gua
at 100 ml. Aquea a soluo at +/- 60oC e adicione esta mistura ao picadinho de cebola,
deixando 10 minutos em banho-maria a 60oC.
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2) Resfrie rapidamente a mistura colocando o recipiente em uma bacia contendo gua e gelo. Coe
a mistura em um filtro de papel para caf, aparando o filtrado em um vidro.
3) Adicione delicadamente lcool (gelado) no filtrado de cebola, deixando o etanol escorrer pela
parede do vidro. Observe a formao de fios esbranquiados que sobem para onde est o lcool.
Estes fios correspondem aos cidos nuclicos - DNA e RNA.
4) Voc pode retirar o DNA da soluo enrolando em um basto.
5) Deixe o basto secar ao ar e coloque o basto em um tubo com gua para re-dissolver o DNA.
Aplique este DNA no processo de eletroforese explicado a seguir.
ELETROFORESE
Molculas que possuem carga eltrica, como as protenas e os cidos nuclicos, podem
ser separadas por eletroforese. Eletroforese o movimento de molculas eletricamente carregadas
em um campo eltrico.
Geralmente, em um processo eletrofortico, as protenas ou cidos nuclicos so
colocadas a migrar sob um campo eltrico, no interior de um suporte gelatinoso (um gel) de
poliacrilamida, agarose ou amido.
A seguir ser apresentado o processo de eletroforese vertical para separao de protenas. O que voc
vir em aula ser eletroforese horizontal de cidos nuclicos, preste ateno na aula e faa as devidas
observaes das diferenas entre a tcnica descrita para protenas e a feita em aula para DNA.
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Atividade experimental:
1) Montar um gel de agarose 0,8% da seguinte forma:
Ferver em microondas 0,8 gramas de agarose, em 100 ml de uma soluo tampo (TAE) e
aps fundir a agarose, acrescentar 25 microlitros de Brometo de etdio. (usar luvas sempre que
usar esta droga, pois ela cancergena).
Colocar a agarose ainda quente em uma placa com um pente
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8a Aula
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corados torna possvel a visualizao da ciclose. Devemos lembrar que a ciclose o movimento do
citoplasma causado pela ao do citoesqueleto. Os cloroplastos so levados por essa corrente do
citoplasma.
Procedimento
1) Com o auxlio de uma pina ou gilete, retire uma folha de Elodea.
2) Em uma lmina para microscopia com uma gota de gua, coloque a folha de Elodea, por
sobre a gota.
3) Cubra com lamnula, e leve ao microscpio para observao.
4) Observe o tamanho e forma dos cloroplastos. Geralmente aps alguns minutos de
observao, podemos ver a ciclose. Descreva como a ciclose.
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Responda as questes:
1)
2)
3)
Por que a ciclose nas clulas da Elodea ocorrem no interior de toda a clula enquanto
na clula da Tradeschantia ocorre apenas dentro de estruturas que lembram canais?
9a Aula
57
prticas, vamos mencionar alguns aspectos importantes sobre a biologia e estrutura dos
Paramecium.
As espcies mais comuns de Paramecium possuem em torno de 0,5 mm de comprimento.
Os ciliados so excepcionais entre os eucariontes, uma vez que possuem no mnimo dois ncleos
com funes distintas. O macroncleo participa das atividades do dia a dia como crescimento,
metabolismo e reproduo. O microncleo permanece relativamente dormente at que a clula
entre em reproduo sexuada. Os Paramecium possuem dois tipos de reproduo; a) diviso
binria: em condies favorveis a clula se divide em duas. As duas novas clulas,
geneticamente idnticas, crescem rapidamente e voltam a se dividir. Mantendo as condies
favorveis estes organismos podem se dividir duas a trs vezes em um dia; b) conjugao: em
condies ambientais desfavorveis, dois indivduos de sexos diferentes entram em contato e
formam uma ponte citoplasmtica temporria, por meio da qual trocam microncleos.
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10a Aula
(aula demonstrativa).
Estruturas biolgicas grandes no podem ser vistas diretamente ao microscpio, por que a
luz no pode atravess-las. Precisamos, ento, fazer cortes o mais fino possvel, para que a luz
possa passar pelas estruturas, e assim ser visto ao microscpio. Para sofrer tais cortes, o material
deve ser fixado, emblocado em parafina ou outra resina e, imerso neste suporte, cortado em
pequenas "fatias", atravs de um aparelho chamado micrtomo. Posteriormente este material
corado e a lmina montada.
Nesta prtica, vamos visitar os laboratrios de anatomia vegetal do Dep. de Biologia, em
que lminas permanentes de vegetais so preparadas.
Preste ateno as explicaes (e faa as perguntas que achar necessrio) e
posteriormente responda as seguintes questes:
1) O que a fixao do material? Qual a funo da fixao?
2) lcool etlico, clorofrmio, formol, cido actico, cido pcrico, e cido smico so as
principais substncias usadas como fixadores. Quais so as principais caractersticas de cada um
destas quanto a sua capacidade de fixao?
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11a Aula
Procedimento:
1) Localize e desenhe as clulas nos tbulos de epiddimo.
2) Observe e desenhe a posio do ncleo.
3) Observe e desenhe a posio e a forma do complexo de Golgi.
Responda as questes:
1) Por que foi escolhido o epiddimo para observar o complexo de Golgi? Que outro tipo de
clula poderia ser usada?
2) Que mtodo de colorao foi usada e por que?
3) Como se forma o Complexo de Golgi?
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Procedimento:
Observe ao microscpio a regio entre as substncias branca e cinzenta, nela existem
alguns neurnios gigantes em que podemos ver perfeitamente o corpo celular (com ncleo), o
axnio e dendritos.
Responda:
1)Observe e desenhe estas clulas, suas partes, e descubra como so chamadas estas
clulas.
2)Qual a relao existente entre forma e funo nestas clulas?
12a Aula
actina e miosina, vo ocupar a maior parte da fibra muscular, constituindo estruturas especficas
das clulas musculares estriadas, que so os sarcmeros. Essas estruturas que do uma
aparncia estriada a essas clulas quando vistas ao microscpio.
Material necessrio:
Lmina, lamnula, agulha histolgica e lmina de barbear, abelhas (ou outro inseto grande),
soluo de verde Janus (0,7% em etanol 70%).
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Procedimento:
1) Com uma gilete, abra o trax de uma abelha, vespa ou outro inseto voador grande
(previamente morta em vapores de ter).
2) Com uma agulha histolgica retire algumas fibras musculares e transfira para uma
lmina com uma gota de corante.
3) Cubra com lamnula, deixe corar por 3 minutos, e observe ao microscpio.
Alguns questionamentos :
a) Como esto organizados os sarcmeros e como estes funcionam? (faa um desenho).
b) Quais as fases da contrao muscular?
c) Como est organizado o citoesqueleto em uma clula muscular lisa?
d) Relacione as regies estriadas que podemos ver nas fibras musculares com o sarcmero.
e) Qual a funo do Verde Janus?
13 a aula
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Quando as razes tiverem atingido pelo menos cinco milmetros podero ser facilmente
destacadas do bulbo, com auxlio de uma lmina de barbear, estilete ou mesmo agulha. No
necessrio deixar as razes crescerem mais do que os cinco milmetros, pois o material que nos
interessa est na ponta.
As pontas de raiz devem ser imediatamente fixadas em soluo de lcool e cido actico
(3:1). Essa soluo no dever ser estocada, recomenda-se que seja preparada no momento em
que vai ser usada.
O tempo mnimo que as pontas de raiz devem ficar no fixador duas horas, as vezes, se o
material fica muito tempo no fixador ocorre um amolecimento excessivo do tecido dificultando a
preparao da lmina.
Aps o tempo de imerso no fixador as pontas de raiz podem ser estocadas em lcool 70%
(de preferncia em refrigerador) ou ento preparadas para a observao das mitoses.
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uma boa colorao, desde que se espere no mnimo vinte minutos, antes de bater ou esmagar
o tecido.
Ao colocar a lamnula deve-se cuidar para deixar o menor nmero possvel de bolhas de ar
para que a observao do material no seja prejudicada.
Depois que o corante atuou sobre o tecido pode-se envolver a lmina com um papel filtro e
pressionar com o dedo polegar a regio onde est a lamnula. Esse movimento far com que o
tecido se espalhe pela lmina e seja possvel observar camadas de clulas isoladas. Nesses
grupos de clulas que ser possvel observa as mitoses. No se deve colocar uma quantidade
muito grande de tecido na lmina pois isso ira dificultar o espalhamento. Dois milmetros de ponta
de raiz produz material suficiente para observao.
Outra forma de realizar o espalhamento segurar a regio da lamnula com um papel
absorvente e bater com um lpis borracha ou com a ponta da tampa de uma caneta.
Aps o esmagamento do material, a lmina deve ser observada inicialmente em menor
aumento (x10), para que se localize rapidamente onde esto as clulas em diviso.
5. LAMINAS SEMI-PERMANENTES
As lminas que estiverem boas podem ser temporariamente conservadas (uma semana)
se forem vedadas com esmalte para unhas ou cola para cmera de pneu de bicicleta.
6. LMINAS PERMANENTES
As lminas semi permanentes podem ser transformadas em permanentes, para isso basta
remover o vedante (esmalte ou cola) e colocar as lminas no freezer at que seja possvel soltar a
lamnula.
Aps a remoo da lamnula, mergulhar rapidamente as lminas em alcool absoluto e
deixar secar. Colocar uma gota de Resina para microscopia (Permonte; Entelan ou Balsamo do
Canad) na regio onde est o material. Fechar com uma lamnula e deixar secar.
Procedimento:
1) Pegue uma raiz j fixada
2) Hidrlise: coloque as pontas de raiz em uma soluo 1N de HCl por 5 min.
3) Lavagem: deixe as razes em gua por 5 min.
4)Corte com uma gilete +/- 3mm da ponta da raiz, logo aps os 2 primeiros mm (coifa).
5) Coloque este material em uma lmina com uma gota de orceina actica, deixe corar por
5 minutos.
6) Cubra com uma lamnula, colocando a lmina entre papel higinico e aperte fortemente
para espalhar o material ( com o polegar).
7) Vede as bordas da lamnula com luto (ou esmalte de unha).
8) Observe ao microscpio.
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Questes:
a) Descreva e desenhe o que ocorre na: interfase; prfase; metfase; anfase; telfase.
b) O que uma clula 2n=16?
c) O que centrmero e qual sua funo?
d) O que so cromtides? o que representam?
Vvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvv
Biologia na cozinha.
A cozinha de nossa casa pode ser um excelente laboratrio. As experincias feitas nas 2a e 3a
aula so exemplos disso. Em grupos, a turma elaborar um experimento relacionado ao programa
de biologia celular e apresentar em aula em data a ser marcada.
Atividade 2:
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papel e com a participao dos alunos pedir que eles encontrem uma seqncia correspondente
ao stio de clivagem de uma enzima de restrio. Podemos pedir que os alunos cortem com
tesoura este stio e posteriormente o mesmo stio de um plasmdeo. Posteriormente podemos
simular como seria uma reao de ligao de todos esses fragmentos, e uma transformao
bacteriana com os plasmdeos gerados. Por fim podemos discutir conceitos como clonagem de
genes e bancos genmicos.
Apresentamos exemplos de alguns dos modelos que podem ser construdo na pgina
www.ufsm.br/auladebio
www.sbg.org.br
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA, UFPR. Bioqumica: aulas prticas. 5 ed.Curitiba, Ed. da
UFPR, 1997.
JORDO, B.Q e colaboradores. Prticas de Biologia Celular. Londrina, Editora UEL, 1998.
JUNQUEIRA, L.C.U e JUNQUEIRA, L.M.M.S. Tcnicas Bsicas de Citologia e Histologia. So
Paulo, Ed. Santos, 1983.
MANARA, N.T.F. Roteiro de aulas prticas de citologia vegetal. Santa Maria, Faculdade de
Agronomia-UFSM, (mimeografado-sem data).
MELLO, M.L.S. e VIDAL, B.C.; Prticas de Biologia Celular. So Paulo, Edgar Blcher, 1980.
POLIZELI, M.L.T.M., Manual Prtico de Biologia Celular. Ribeiro Preto, Holos editora, 1999.
QUESADO, H.L.C. e colaboradores. Biologia: Prticas. Fortaleza, Edies UFC, 1996.
SLATER, J. Experiments in molecular biology. Clifton, N.J., The Humana Press, 1986.
VALLE, F.C., Prticas de citologia e gentica. Rio de Janeiro, MEDSI, 2001.
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