Validacao Protocolos Analises Quimicas 2010

CONSELHO REGIONAL DE
QUMICA - IV REGIO (SP)
Validao e protocolos
em anlises qumicas
Ministrante: Leonardo Csar Amstalden
Laboratrio T&Analtica - Campinas/SP
Contatos: leonardo@teanalitica.com.br
Apoio
Ribeiro Preto, 22 de maio de 2010

Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato
PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
Minicursos CRQ-IV - 2010

Validao e Protocolos em Anlises Qumicas
VALIDAO
E PROTOCOLOS EM
ANLISES QUMICAS
Leonardo Csar Amstalden

Gerente da Qualidade - Laboratrio T&E Analtica Campinas SP
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Mtodos Qumicos: So procedimentos empregados para IDENTIFICAR

(Anlise Qualitativa) e/ou QUANTIFICAR (Anlise Quantitativa) compostos
qumicos:
Anlise qualitativa
A anlise qualitativa empregada quando se pretende determinar ou
identificar as espcies ou elementos qumicos presentes numa amostra,
podendo ser eles atmicos ou moleculares.
Anlise quantitativa
A anlise quantitativa empregada para se determinar a quantidade de
uma espcie ou elemento qumico numa amostra. Sendo utilizada para a
determinao de concentraes, volumes ou massa exata da substncia,
atravs de tcnicas de: gravimetria, volumetria, instrumentais, entre outras
expressa por resultados numricos dos componentes da amostra.

Mtodos Instrumentais em qumica analtica foram desenvolvidos a partir

do incio do sculo XX, baseados em propriedades como condutividade
eltrica, emisso ou absoro de luz dos analitos presentes em um
composto.
Tcnicas de separao, determinao e quantificao das espcies
qumicas passaram a ser conhecidas como MTODOS DE ANLISE
INSTRUMENTAL e foram favorecidas pelos dispositivos tecnolgicos
eletrnicos e capacidade de processamento dos computadores.
A maioria dos equipamentos analticos modernos possuem ou esto
conectados a um ou mais dispositivos eletrnicos sofisticados capazes de
detectar e registrar dados relativos aos analitos

Um mtodo quantitativo baseado na resposta do sistema de

deteco do instrumento ao sinal gerado pela espcie qumica de
interesse presente na amostra em estudo, comparado com aquele
gerado por um produto que tem esta mesma espcie qumica de
interesse presente em uma concentrao conhecida de declarada
(Padro Analtico).
A resposta geralmente um sinal eletrnico que gera um pico de
intensidade, cuja rea calculada atravs de um software de
aquisio de dados do instrumento, fornecendo um valor
numrico aos sinais que representam a espcie.
Assim so quantificados os sinais gerados pelas tcnicas de
HPLC, CFG, AA, ICPlasma, dentre outras.

At as dcadas de 80 e 90, um laboratrio desenvolvia um
mtodo analtico baseando-se principalmente na resposta
linear do detector a diferentes concentraes do analito em
uma faixa de interesse. Se fosse razovel, o mtodo era
aceito sem maiores questionamentos, muitas vezes
descrito apenas como uma receita de bolo. Porm algumas
questes comearam a ser levantadas, em especial duas:
Como asseguro que o resultado obtido verdadeiro?
Se outro laboratrio for utilizar meu mtodo, ser que
conseguir reproduzir os resultados que obtive?
Para responder essas questes preciso VALIDAR meu
mtodo

Definio: Validar um mtodo testar o seu desempenho, de acordo com

critrios estabelecidos, tendo como objetivo confirmar se ele apropriado para o
uso pretendido.
O laboratrio deve validar:
Mtodos no normalizados
Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio
Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram criados
Ampliaes ou modificaes em mtodos normalizados

Deve haver um procedimento que descreva o

processo de validao e cada estudo deve ser
planejado atravs de um Plano ou Protocolo de
estudo.
O laboratrio deve utilizar equipamentos
adequados e calibrados ou qualificados, quando
aplicvel.
O responsvel pelo estudo deve ser
competente na rea, sendo capaz de tomar
decises apropriadas durante a realizao do
estudo.

Documentos de referncia:
INMETRO DOQ-CGCRE-008 R03 - Orientao Sobre Validao de
Mtodos Analticos, fev/2010
ANVISA: RE 899 de 29 de maio de 2003 - GUIA PARA VALIDAO

DE MTODOS ANALTICOS E BIOANALTICOS

Como validar?
Os parmetros de validao devem estar claramente
declarados no procedimento documentado e incluir, quando
aplicvel:
Seletividade/Especificidade
Linearidade
Faixa de trabalho e Faixa linear
Limite de deteco
Limite de quantificao
Tendncia/recuperao
Preciso (repetitividade, preciso intermediria e
reprodutibilidade)
Robustez

ELEMENTOS DE UM ESTUDO DE VALIDAO
X
PRECISO
Limites
REP
REPR
PADRES
INTERLABO
Estabilidade
X
Linearidade e
faixa linear
Recuperao
Robustez
EXATIDO
Seletividade/Especificidade

Figura 1 Parmetros de validao conforme o tipo de ensaio

(1) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no ser

necessria a determinao dos limites de deteco e de
quantificao, como por exemplo: determinao de sacarose em
balas e determinao do teor de gordura em carnes, por exemplo,
componentes maiores com concentrao entre 1 a 100%.
(2) So considerados como de menor teor, concentraes entre 0,01 e

1% e como traos, os elementos em concentrao abaixo de
0,01%

SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da
medio. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito
tambm pode depender da concentrao.
Assim, verifica-se se o mtodo seletivo ou especfico para o analito de interesse, ou
seja, se a resposta do instrumento ao se aplicar o mtodo no sofre interferncia de
outros componentes da matriz.
Como avaliar a seletividade?
1) Analisar um branco de reagentes, analisar o padro, analisar a amostra com e sem o
analito de interesse (placebo). Caso o placebo no seja disponvel fazer acrscimo
controlado de padro sobre a amostra.
2) Avaliar a amostra na presena de interferentes, ou seja, introduzir elementos que
provoquem stress

Avaliao de Seletividade

Agente
Condies
Luz
Ex: Exposio da embalagem primria a Luz Fluorescente comum

e Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga por um perodo
de tempo definido
Temperatura
Ex: 60oC
definido
Umidade
30oC / 75% UR na embalagem primria por um perodo de tempo

definido
Agente Alcalino
Adio soluo alcalina NaOH 0,1M

definido
Agente cido
Adio soluo cida HCl 0,1M por um perodo de tempo definido
Agente Oxidante
Adio de soluo de H2O2 5% v/v por um perodo de

tempo definido.
na embalagem primria por um perodo de tempo
por um perodo de tempo

SELETIVIDADE
Um mtodo seletivo quando existe probabilidade acima 80% de ser a espcie
pesquisada
ESPECIFICIDADE
Um mtodo especfico quanto ele consegue definir uma funo qumica especfica ou
ainda uma nica espcie distinta em um nico sinal.
Um mtodo especfico quando h uma boa (>95%) probabilidade de ser a espcie
pesquisada

SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE
1- Teor de LCOOIS = Seletivo
2- Teor de BUTEN-2-OL-2 = Especfico

Teor de LCOOIS
= Seletivo
3- Teor de Trans- BUTEN-2-OL-2

Teor de
BUTEN-2-OL-2
Teor de LCOOIS
= Especfico
= Seletivo
= Seletivo

INTERFERNCIA
INTEGRAO
NORMAL
pico confirmado
INTEGRAO:
CALDAS
possvel pico
start do pico
1e 2a derivada
Linha de Base
1e 2a derivada
possvel
pico
pico confirmado

Fator de Assimetria
As = b1 /
b2
b1 b2
O fator de assimetria, T tailing factor, uma

medida de simetria de pico, sendo que valores de
T=1,0 referem-se a picos perfeitamente simtricos.
O valor de T pode variar aleatoriamente
dependendo da assimetria do pico. Com valores de
T < 1,0 observa-se que o pico apresenta uma
assimetria frontal, e com valores de T > 1,0 uma
assimetria distal. A variao da assimetria influi no
reconhecimento instrumental do inicio e final do
sinal cromatogrfico (derivada 1 e derivada 2),
responsvel pela variabilidade da rea integrada.

INTERFERNCIAS
Branco
Adio de padro
R=0
h total coeluio.
R = 1,0
representa 94% da resoluo

em linha de base.
R = 1,5
representa 99,8% da
resoluo em linha de base.

INTEGRAO DE REA
BB
Begins or
ends on
Baseline
Mesmo na integrao BB que fornece maior

preciso haver variabilidade em funo da
definio de primeira e segunda derivada
VB
BP
PB
P = Baseline Penetration
BV
V= Valley

LINEARIDADE - CURVAS
CURVA PADRO: sucesso crescente ou decrescente de pontos obtidos da relao entre a
concentrao da espcie padro pela sua intensidade de sinal proveniente do sistema de
deteco
CURVA DE CALIBRAO: utilizada com a finalidade de se obter o ajuste. Neste caso o

padro definido pelo fabricante ou instituies que zelem pela qualidade.
Na realidade o que se busca a RESPOSTA do sistema de deteco do sistema

grandeza introduzida do analito.
CURVA DE RESPOSTA: utilizada com a finalidade de se obter comparao analtica para a

quantificao. Busca linearidade dinmica. Aplica-se na curva de resposta a relao
sinal/concentrao a fim de verificar a linearidade (relao direta ou regresso linear)

LINEARIDADE
y
CURVA DE RESPOSTA
y=ax + b
x
Coeficiente Angular : expressa a inclinao da curva aos eixos
Coeficiente Linear: expressa a interseco da curva aos eixos
Coeficiente de Correlao: expressa a relao de x a y

LINEARIDADE
sinal
Variabilidade dos FR = Fator de Linearidade
2
Fator de Resposta (FR) = relao
sinal / concentrao
Fator de Linearidade a 2% , pode-se

considerar a relao como sendo linear.
1
Fator de Linearidade > que 2% , neste caso
deve-se utilizar da regresso linear
concentrao
Coeficiente de Correlao (r): Pode-se estabelecer o nvel da relao entre duas variveis atravs do
coeficiente de correlao o qual denotamos por r, que varia de -1 a 1.
Coeficiente de Determinao (r2): Obtido elevando-se r ao quadrado e varia de 0 a 1.
Assim se uma relao possui coeficiente de correlao 0,80 ento (0,80)2 = 0,64 que multiplicado por
100% = (64%) indica que a variao dos ys so explicadas em 64% pela relao com x.
Se r = 0,40 r2 = 0,16 ou 16%, ou seja, a variao dos ys explicada em 16% pela variao de x.
Quanto mais prximo de 1 for o valor de r2, melhor ser a reta descrita pela regresso linear dos pontos.
Normalmente procuram-se obter retas com r 0,99

LINEARIDADE
A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixa
dinmica linear. necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de
concentrao do analito coincide com a faixa dinmica linear e assegurar
que nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na resposta.
A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta
medida e a concentrao do analito. A linearidade obtida por
padronizao interna ou externa e formulada como expresso matemtica
usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na
amostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis :
y = ax+b
sendo:
y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);
x = concentrao;
a = inclinao da curva analtica = sensibilidade;
b = interseo com o eixo y, quando x = 0.

O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentrao
resultam em maior variao na resposta, ou seja, maior inclinao (a).
Em geral, sero necessrios vrios nveis de concentrao, no mnimo
cinco, para construir a curva analtica. O nmero de replicatas em cada
nvel de concentrao deve ser o mais prximo possvel daquele
empregado na rotina do laboratrio.
A verificao da ausncia de valores discrepantes pode ser feita pelo teste
de Grubbs (ISO 5725-3,1994 e ISO 5725-2, 1994) ou de resduo Jacknife
(SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) e a homocedasticidade, isto ,
homogeneidade da varincia dos resduos pelo teste de Cochran
(ISO 5725-3:1994) ou teste de Levene (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) ou o
teste de Brown-Forsythe (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005).
Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo aps
qualquer transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descrita
por uma funo que modela a concentrao do analito na amostra.

CURVA DE RESPOSTA - PREPARO
1- Por diluio da soluo -me
- definir a concentrao estimada ou esperada.
- preparar a soluo-me com o dobro da concentrao estimada ou esperada.
- por diluio obter os pontos de acordo com a tabela que se segue:
ponto ( eixo x )
concentrao
5
soluo me
4
80% da soluo me
3
50% da soluo me
2
30% da soluo me
1
10% da soluo me
2- Por preparao de cada ponto
Cada ponto da curva preparado individualmente. Neste caso evita-se o erro de obteno
da soluo-me. Os valores podem ter como base a tabela acima.

AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTA

A - BRANCO
Sempre que possvel a amostra ou o branco desta amostra deve ser a base para os valores de uma
curva, tanto para a adio como para a diluio. Obtido os pontos da curva de resposta,
podem-se definir regras de qualidade para a curva.
B - A CURVA
1) A curva deve ter no mnimo 5 pontos, incluindo o menor valor (menor valor mensurvel
ou o menor valor de interesse para a quantificao) e o maior valor.
2) Podem-se excluir pontos da curva, mas deve-se manter 5 pontos. O menor e o maior
devem permanecer.
3) Deve-se evitar excluir dois pontos seqenciais.
Nota: nesta situao para se ter 5 pontos, deve-se elaborar a curva com no mnimo 6
pontos, supondo-se a possibilidade de rejeitar um deles.

AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTA

C) EXCLUSO DE PONTOS
Um ponto da curva pode ser excludo dependendo do estudo e caso seja previsto em protocolo (lembrando que o ponto
excludo pode ser o valor mais prximo do valor verdadeiro). Um dos motivos da excluso ou no excluso do ponto a sua
influncia sobre a concentrao a ser analisada. Algumas instituies definem valores numricos para a excluso, por exemplo:
Variaes acima de 15% entre o valor da concentrao obtida para a concentrao de preparao (conc.=massa/volume do
balo volumtrico) seria um motivo de excluso. Exemplo:
Pto.
Conc.Terica
(mg/L)
Conc.Real
(mg/L)
Replicata 1
(mg/L)
Variao R1
(%)
Replicata 2
(mg/L)
Variao R2
(%)
0,50
0,52
0,75
144,2
0,44
84,6
1,00
0,98
1,02
104,1
0,97
98,9
1,50
1,53
1,48
96,7
1,55
101,3
2,00
2,10
2,30
109,5
1,77
84,2
2,50
2,45
2,38
97,1
2,65
108,1
3,00
3,20
2,70
84,3
3,05
95,3
3,50
3,60
3,50
97,2
3,68
102,2
Concentrao Terica: a ideal planejada

Concentrao Real: a obtida pela relao massa pesada do padro/volume do balo volumtrico
Variao: medida da relao entre o valor da replicata/concentrao real

TESTE DE GRUBBS
Rejeita valores em relao estimativa do desvio-padro. Este teste observa
valores dispersos anmalos maiores ou menores que aparecem no grupo de
medidas.
Para aplicao do teste de Grubbs, utiliza-se a amplitude em relao mdia:
1. Colocar os valores obtidos em ordem crescente
2. Determinar a mdia aritmtica
3. Determinar a amplitude do maior (maior valor - mdia)
4. Testar o maior valor do conjunto segundo a equao:
( xmaior x )
s
S = desvio padro

5. Testar o menor valor do conjunto segundo a equao:
( x xmenor )
s
6. Comparar os valores de G com os valores crticos a 95% de confiana

Nmero de resultados (n)
G (95%)
1,155
1,481
1,715
1,887
2,020
2,126
2,215
10
2,290

7. Se Gcalculado>Gtabelado o maior valor rejeitado e, se Gcalculado<Gtabelado o

maior valor , por enquanto, aprovado.
8. Se o maior valor for rejeitado, determinar a nova amplitude e testar o
menor valor da srie. Se o maior valor no for rejeitado testar o menor
valor da srie.
9. Repetir o processo at que o maior e o menor valores sejam aceitos
http://www.graphpad.com/quickcalcs/GrubbsHowTo.cfm

A(crescente)
B(crescente)
7,08
7,07
Med:7,13
8,16
7,89
Med:8,18
7,19
7,08
S=0,05
8,08
8,01
S=0,306
7,12
7,09
8,29
8,03
7,09
7,11
9,00
8,08
7,16
7,12
8,03
8,10
7,14
7,14
8,01
8,13
7,07
7,14
8,13
8,13
7,14
7,16
7,89
8,16
7,23
7,19
8,13
8,29
7,11
7,23
8,10
9,00

Produto A
Analisando o maior:
G=(7,23-7,13)/(0,05)=0,1/0,05=2,0 Gtabelado 95=2,290
Maior aprovado
Analisando o menor:
G=(7,13-7,07)/(0,05)=0,06/0,05=1,2 Gtabelado 95=2,290
Maior aprovado
Exerccio: Fazer o mesmo para o produto B

Faixa de Trabalho e Faixa Linear
Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do
analito ou valores da propriedade no qual o mtodo pode ser aplicado.
Todo experimento de determinao da faixa de trabalho iniciado pela

escolha de uma faixa preliminar. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de
aplicao para a qual o ensaio vai ser usado e a concentrao mais
esperada da amostra deve, sempre que possvel, se situar no centro da
faixa de trabalho.
No limite inferior da faixa de concentrao, o fator limitante o valor do limite

de quantificao. No limite superior, os fatores limitantes dependem do
sistema de resposta do equipamento de medio.

Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear e
dentro desta, a resposta do sinal ter uma relao linear com o analito ou
valor da propriedade. A extenso dessa faixa pode ser estabelecida
durante a avaliao da faixa de trabalho.
rea
Concentrao


Como definir a faixa de trabalho?
Depende dos objetivos do mtodo.
Normalmente o mtodo indica o valor alvo de concentrao a ser
determinada. Este valor determinado como 100% (meio da curva) e
trabalha-se com as solues mais concentradas e diludas para obter os
outros pontos.
Faixas comuns:
90% a 110%
80% a 120%
50% a 150%

Nmero de
Replicatas
Matriz
Objetivos e Procedimentos
Etapa 1: 7
Branco (gua reagente) com concentraes

variadas do analito ou;
Placebo da amostra com concentraes variadas
do analito;
Preparar diferentes concentraes de modo
independente e no a partir de uma soluo me.
Objetivo: Identificar a faixa linear aproximada

e os limites superior e inferior da faixa de
trabalho.
Graficar colocando no eixo X as concentraes e
no eixo y as respostas;
Ir para a etapa 2
Etapa 2: 7
Materiais de referncia de diferentes

concentraes na faixa linear ou;
Placebo da amostra com concentraes variadas
do analito na faixa linear
Objetivo: Determinar a faixa de trabalho e

confirmar a linearidade;
Graficar colocando no eixo X as concentraes e
no eixo y as respostas;
Verificar visualmente a existncia de pontos
dispersos que possam interferir na regresso;
Calcular o coeficiente de regresso linear;
Calcular e construir o grfico dos valores de
resduos. A distribuio aleatria em torno da
linha reta confirma a linearidade;
Ir para a etapa 3
Etapa 3: 7
Placebo da amostra com concentraes variada

do analito, prximas ao LD
Objetivo: Determinar o LQ (limite de

quantificao), que efetivamente forma o
limite mais baixo da faixa de trabalho
Expressar o LQ como a concentrao mais baixa
do analito que pode ser determinada com um
nvel aceitvel de incerteza.

DETECTABILIDADE
A DETECTABILIDADE normalmente confundida em anlise instrumental com a SENSIBILIDADE
DETECTABILIDADE
1- o quanto o sistema de deteco do sistema analtico consegue enxergar
2- a quantidade mnima da espcie qumica em massa que o sistema analtico consegue mensurar
3-Um equipamento possui alta detectabilidade, quando consegue enxergar uma quantidade
mnima da funo ou espcie em questo.
A detectabilidade de um equipamento que mede:

A__________________________________________B
0,1 g
possui menor detectabilidade que
0,01g

DETECTABILIDADE
Exemplo de Detectabilidades de Instrumentos
(considerao geral, pois depende da molcula e do meio)
CFG/FID
CFG/ECD
GC/MS/SIM
LC/MSMS
ICP
HPLC
=
0,5 mg/litro
=
0,1 g/litro
=
5 g/litro
0,1 ng/mL
=
1 g/litro
=
0,1 mg/litro
Exemplos:
1- Qual a detectabilidade do tolueno quando h deteco na anlise de 0,2 microlitros de uma
soluo aquosa a 0,5 mg/kg.
0,5mg/kg=0,5mg/litro=0,5g/mL=0,5ng/L. Como a detectabilidade foi para 0,2 L
0,5 ng 1L
x 0,2L
x = 0,1 ng de detectabilidade
2 - Se 0,5 L de amostra introduzida num GC/MS/SIM a massa detectada de 2,5 picogramas (pg)
Se o split for 1:50 a massa ser 0,05 pg = 50 fentogramas

Limite de Deteco (LD)
Quando so realizadas medidas em amostras com baixos nveis do analito
ou de uma propriedade, como por exemplo, anlise de traos, importante
saber qual o menor valor de concentrao do analito ou da propriedade que
pode ser detectado pelo mtodo.
O limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em funo

do tipo da amostra. fundamental assegurar-se de que todas as etapas de
processamento do mtodo analtico sejam includas na determinao desse
limite de deteco.
Para a validao de um mtodo analtico, normalmente suficiente fornecer
uma indicao do nvel em que a deteco do analito pode ser distinguida
do sinal do branco/rudo.

Determinao de Limite de Deteco (LD)
Existem diversas formas de se calcular o limite de deteco. Abaixo so apresentadas algumas
destas metodologias.
Matriz
Clculos
Observaes
Branco da amostra
LD = X + t (n1) .s
sendo:
X = mdia dos valores dos brancos da amostra;
t a distribuio de Student, dependente do
tamanho da amostra e do grau de confiana e,
s = desvio-padro amostral dos
brancos da amostra.
A mdia e o desvio-padro amostral

dos brancos da amostra so
dependentes da Matriz. Vlido
somente quando os valores dos
brancos apresentarem um desvio
padro amostral diferente de zero.
Branco da amostra com a

menor concentrao
aceitvel de analito
LD = 0 + t (n1) .s
sendo:
t = distribuio de Student, dependente do
tamanho da amostra e do grau de confiana e,
s = desvio-padro amostral dos brancos da
amostra, com adio.
A menor concentrao aceitvel

aquela tida como a concentrao
mais baixa para a qual um grau
aceitvel de incerteza pode ser
alcanado.
Branco da amostra e
Branco da amostra com
diferentes concentraes de
analito
LD = 3 x relao sinal/rudo
calculado
como
sendo
correspondente concentrao que
produziria um valor do sinal medido
3 vezes maior do que o nvel de
rudo mdio medido com a soluo
do branco.

LD PARA A RE 899 - ANVISA
No caso de mtodos instrumentais (HPLC, CG, absoro atmica), a estimativa do
limite de deteco pode ser feita com base na relao de 3 vezes o rudo da linha de
base. Pode ser determinado pela equao,
em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3

curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas ao
suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a partir da
curva de calibrao proveniente da anlise de um nmero apropriado de amostras do
branco; IC a inclinao da curva de calibrao.

fundamental que avaliaes independentes sejam realizadas em
amostras com concentrao igual ao limite de deteco determinado.
O nmero de replicatas muito elevado pode superestimar o limite de

deteco, por isto, este nmero (n) deve expressar a rotina do laboratrio.
recomendado um mnimo de 7 replicatas para a determinao do LD.
Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 = 6 graus de

liberdade de uma matriz de branco da amostra com adio da menor
concentrao aceitvel do analito. Para esses graus de liberdade, o valor de
t unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143 vezes o
desvio padro amostral.

DISTRIBUIO t DE STUDENT
Valores de t
Nveis de confiana
Graus de
Liberdade (n-1)
75%
80%
85%
90%
95%
97.5%
99%
99.5%
99.75%
99.9%
99.95%
1.000
1.376
1.963
3.078
6.314
12.71
31.82
63.66
127.3
318.3
636.6
0.816
1.061
1.386
1.886
2.920
4.303
6.965
9.925
14.09
22.33
31.60
0.765
0.978
1.250
1.638
2.353
3.182
4.541
5.841
7.453
10.21
12.92
0.741
0.941
1.190
1.533
2.132
2.776
3.747
4.604
5.598
7.173
8.610
0.727
0.920
1.156
1.476
2.015
2.571
3.365
4.032
4.773
5.893
6.869
0.718
0.906
1.134
1.440
1.943
2.447
3.143
3.707
4.317
5.208
5.959
0.711
0.896
1.119
1.415
1.895
2.365
2.998
3.499
4.029
4.785
5.408
0.706
0.889
1.108
1.397
1.860
2.306
2.896
3.355
3.833
4.501
5.041
0.703
0.883
1.100
1.383
1.833
2.262
2.821
3.250
3.690
4.297
4.781
10
0.700
0.879
1.093
1.372
1.812
2.228
2.764
3.169
3.581
4.144
4.587

Limite de Quantificao
Algumas vezes tambm denominado Limite de Determinao. Na prtica,
corresponde normalmente ao padro de calibrao de menor concentrao
(excluindo o branco). Este limite, aps ter sido determinado, deve ser testado
com amostras independentes, para averiguar se a tendncia e a preciso
conseguidas so satisfatrias.
Matriz
Determinao
Branco da amostra
LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10s
onde:
X = mdia dos valores dos brancos
s = desvio-padro amostral dos brancos
Branco com adio de

concentraes variadas do analito,
prximas ao LD
- Medir, uma vez cada replicata independente, a cada nvel de

concentrao.
- Calcular o desvio-padro amostral s do valor do analito, para
cada concentrao.
- Fazer o grfico concentrao versus s, e atribuir um valor para
o LQ, por inspeo.

LQ PARA A RE 899 - ANVISA
O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de solues
contendo concentraes decrescentes do frmaco at o menor nvel
determinvel com preciso e exatido aceitveis. Pode ser expresso pela
equao:
DPa x10
LQ
IC
em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3
curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas
ao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a
partir da curva de calibrao proveniente da anlise de um apropriado nmero
de amostras do branco; IC a inclinao da curva de calibrao.

O mtodo analtico deve ser especificado e o LQ para

cada analito deve ser expresso nas unidades
apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo
analtico. A matriz da amostra usada para determinar o
LQ deve ser identificada.
Para a anlise em nvel de traos, recomendado adotar
o LQ como a concentrao mais baixa da curva analtica.

Tendncia/Recuperao
Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendncia de um
mtodo so, entre outros:
uso de materiais de referncia certificados (MRC);
participao em comparaes interlaboratoriais;
realizao de ensaios de recuperao.
A tendncia, quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implica
numa combinao de componentes de erros aleatrios e sistemticos.
A determinao da tendncia com relao aos valores de referncia
apropriados importante no estabelecimento da rastreabilidade aos padres
reconhecidos.
A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica, definida como:
valor obtido
x100%
valor esperado
A exatido pode ser avaliada numericamente atravs da recuperao.

RECUPERAO
A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras

fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras
podem ser fortificadas com o analito em pelo menos trs diferentes
concentraes: baixa, mdia e alta, da faixa de uso do mtodo.
A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est

necessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presena de
analitos adicionados em uma forma mais facilmente detectvel pode
ocasionar avaliaes excessivamente otimistas da recuperao.

A recuperao calculada segundo:
C C2
x 100%
Recuperao (%) 1
C3
Sendo:
C1 = concentrao do analito na amostra fortificada,
C2 = concentrao do analito na amostra no fortificada,
C3 = concentrao do analito adicionada amostra fortificada.
Exemplo: Sobre uma amostra de bolacha adicionou-se 1000 UI de palmitato de retinol.

Aps 5 anlises (extrao e quantificao) por HPLC encontrou-se a mdia de 800 UI.
Qual foi a % de Recuperao?
Recuperao =( 800/1000 ) x 100% = 80%
Pode-se utilizar:
1- Outra substncia para monitorar a extrao
2- Utilizar a tcnica de Padro Interno (relao de sinais) para minimizar o erro entre
analistas ou variaes na injeo.

RECUPERAO
1- Monitor de extrao
Neste caso instroduz-se uma substncia externa, com nica finalidade de acompanhar a extrao
Monitor
mesma
quantidade
Sinal
analito
1000
5000
Sinal
500
Sinal
5000
5000
2- Padro Interno ( relao de sinais)

1 mg do
Padro interno
Sinal
5 mg do
ativo
500
2000
Rel= 2000/500= 4 = 5 mg do ativo
1 mg do
Padro
interno
Sinal
Ativo
extrado
500
1000
Rel= 1000/500=2= 2,5 mg do ativo
5000

PRECISO
PRECISO : a proximidade da concordncia (grau de

espalhamento) entre uma srie de medidas obtidas de
mltiplas amostragens de uma mesma amostra homognea
dentro de condies determinadas.
Qual a finalidade da Preciso?: garantir que as medidas no

foram realizadas ao acaso, que ela possa ser repetida e
reproduzida.

PRECISO
A Preciso sempre ter distores de medida, pois envolver sempre uma
variedade de fatores para gerar erros:
- corrente eltrica
- formao de base do analista na forma de operao e interpretao
- reagentes de lotes ou fabricantes diferentes
- estado emocional do analista
- iluminao do ambiente de trabalho
- variabilidade intrnseca do equipamento ( estabilidade ou tempo de estabilizao)
- necessidade analtica para obter a destreza do primeiro resultado
- diluies, derivaes, alquotas, temperatura ambiente e de armazenamento
- transportes envolvidos at a realizao da amostra
- limpeza do material analtico e de coleta
- contaminaes alfa ( no reconhecidas pelo uso constante )
- outras

Preciso
Normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as
trs formas mais comuns de express-la so: por meio da repetitividade,
preciso intermediria e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressas
pelo desvio padro e coeficiente de variao.
O coeficiente de variao (CV, usualmente expresso em %), tambm
conhecido como desvio padro relativo (DPR), calculado da seguinte
forma:
CV (%) DRP
DP
x100
Cmdia
Sendo:
DP = desvio-padro;
Cmdia = concentrao mdia determinada

Repetitividade
As condies de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando:
Mesmo procedimento de medio;
Mesmo observador;
Mesmo instrumento usado sob mesmas condies;
Mesmo local, e
Repeties no menor espao de tempo possvel.
A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da

caracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meio
da anlise de padres, material de referncia ou adio do analito a branco
da amostra, em vrias concentraes na faixa de trabalho.

Preciso intermediria
A preciso intermediria, de acordo com a ISO 5725-3, refere-se preciso
avaliada sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando
o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio, mas definindo exatamente quais
as condies a variar (uma ou mais), tais como:
Diferentes analistas;
Diferentes equipamentos;
Diferentes tempos.
Esta medida de preciso representa a variabilidade dos resultados em um
laboratrio.
Na maioria dos casos, o valor de preciso intermediria funo do nvel de
concentrao do ensaio e o seu clculo efetuado, preferencialmente, a partir
dos resultados obtidos, aps eliminao dos resultados discrepantes. A
visualizao grfica dos valores tambm pode ser til para identific-los.

Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da preciso

intermediria, existem vrios mtodos para determinao e controle desse
parmetro, tais como:
Por meio de grfico de controle do desvio padro, que poder ser aplicados
para replicatas de amostras e para padres estveis ao longo do tempo;
Por meio de expresses matemticas que apresentem resultados numricos e
critrios de aceitao definidos.
Um mtodo simplificado para estimar a preciso intermediria baseia-se na

execuo de n medies (n 15), em condies pr-definidas, sobre:
uma mesma amostra;
amostras supostamente idnticas;
padres

A estimativa da preciso intermediria Si ( ), neste caso, dada por:
Si( j ,k )
1 n
. ( yk y ) 2
n 1 k 1
em que Si (j,k) o desvio padro de preciso intermediria relativo a

esse grupo, onde os smbolos relativos s condies intermedirias de
preciso podem aparecer entre parntesis (Ex: Si (T.O) significa tempo e
operadores diferentes).
Sendo:
n = n de ensaios efetuados por amostra ou padro;
yk = cada resultado obtido;
y = representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido.

EXATIDO
Na prtica, a Exatido tem por finalidade, garantir que o valor medido, esteja prximo
do valor declarado.
Na amostragem garantir que todo o ativo foi quantificado na extenso desejada.
EXATIDO :
referncia.
qualidade que exprime compatibilidade de valor aceito com valor de
Espalhamento
Valor Distante
Valor Mdio
Valor nominal
ACURCIA : o grau de proximidade de um determinado valor ao valor real ou

conhecido nominal em condies determinadas. Pode ser medido em relao ao
maior desvio.

EXATIDO
Garantir a Exatido envolve situaes, hoje dispendiosas em tempo de resposta e ou

custo financeiro, como:
- PADRES ANALTICOS DE REFERNCIA CONFIVEIS
- ENSAIOS INTERLABORATORIAIS DA METODOLOGIA
- COMPARAES EM ENSAIOS DE PROFICINCIA
- RECONHECIMENTO POR ORGOS CONSIDERADOS COMO
GUARDIES DA CONFIABILIDADE

Robustez
A robustez de um mtodo analtico a medida de sua capacidade em resistir
a pequenas e deliberadas variaes dos parmetros analticos. Indica sua
confiana durante o uso normal.
Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliao
da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do mtodo variaes nas
condies analticas, estas devero ser controladas e precaues devem
ser includas no procedimento.

Testes de Robustez de Acordo com a RE899 - ANVISA

Preparo das Amostras
Estabilidade das solues analticas

Tempo de extrao
Espectrofotometria
Variao do pH da soluo
Temperatura
Diferentes fabricantes de solventes
Cromatografia Lquida
Variao do pH da fase mvel

Variao na composio da fase mvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Fluxo da fase mvel
Cromatografia Gasosa
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Temperatura
Velocidade do gs de arraste

Definidos os Parmetros de Validao necessrio planejar o estudo de
Validao de Metodologia Analtica.
Um estudo dividido em 3 etapas:
1. Plano ou Protocolo de Estudo
2. Etapa Experimental
3. Relatrio Final
O contedo de um plano de estudo e relatrio final depende da finalidade ao
qual o estudo se destina.
Ex: Se for parte integrante de um estudo maior com finalidade de registro de
um produto agro ao IBAMA, deve obedecer a norma BPL (Boas Prticas de
Laboratrio). No Brasil regida pela NIT DICLA 035 do INMETRO.
Se for parte de um estudo de Equivalncia Farmacutica para registro de um
frmaco junto ANVISA, deve obedecer s normas e resolues dessa
agncia.

PLANO OU PROTOCOLO DE ESTUDO
Todo estudo deve ser planejado antes de seu incio e esse
planejamento deve ser descrito em POP (Procedimento Operacional
Padro), contendo todos os itens necessrios para a conduo da
etapa experimental, orientando os analistas, e tambm para atender os
requerimentos dos organismos de avaliao dos registros.
O plano de estudo deve ser aprovado atravs de assinatura datada do
Diretor de Estudo e verificado quanto conformidade com as BPLs pelo
pessoal da Garantia da Qualidade
a) Emendas ao plano de estudo devem ser justificadas e aprovadas por
assinatura datada do Diretor de Estudo e mantida junto com o plano de
estudo.
b) Desvios ao plano de estudo devem ser descritos, explicados, dada
cincia e datados prontamente pelo Diretor de Estudo e mantido com os
dados brutos do estudo.

Contedo do Plano de Estudo
O plano de estudo deve conter, mas no estar limitado, s seguintes
informaes:
1. Identificao do Estudo, da Substncia Teste e da Substncia de
Referncia
a) Ttulo descritivo;
b) Declarao da natureza e do propsito do estudo;
c) Identificao da substnciateste por cdigo ou nome (IUPAC, nmero
do CAS, etc.);
d) Substncia de referncia a ser utilizada.

2 - Informaes referentes ao Patrocinador e Unidade Operacional

a) Nome e endereo do patrocinador;
b) Nome e endereo da(s) instalao(es) de teste(s) e unidade(s)
teste(s)envolvida(s);
c) Nome e endereo do Diretor de Estudo;
3. Datas
a) A data de aprovao do plano de estudo por assinatura do
Diretor de Estudo. A data de aprovao do plano de estudo por
assinatura da gerncia da instalao de teste e do patrocinador, se
requerido pelo rgo regulador ou fiscalizador no pas onde o
estudo est sendo conduzido.
b) As datas propostas para incio e trmino do experimento.

4. Mtodo
Referncia ao mtodo na qual a vidao de baseia, se aplicvel.
5. Outros aspectos (onde aplicveis)
Informaes detalhadas do desenho experimental, incluindo uma
descrio da cronologia do estudo, todos os mtodos, materiais e
condies, tipo e freqncia de anlises, medidas, observaes e
exames a serem realizados e mtodos estatsticos a serem utilizados
(sehouver).
6. Registros
Uma lista dos registros a serem arquivados, incluindo os dados brutos
originais.

ANEXO 1 MODELO DE PLANO DE ESTUDO

ANEXO 2 MODELO DE RELATRIO FINAL

PADRES
1- PADRO DE ESPCIE MAJORITRIA
2- PADRO POR HISTRICO
3- PADRO RASTREVEL (CERTIFICADO OU REFERENCIADO)
VALIDADE DO PADRO
PADRO PRIMRIO
PADRO SECUNDRIO
Alguns fornecedores indicam a validade.

Em alguns casos necessrio consultar.
Obtidos a partir do melhor lote de fabricao.

Comercializados por empresas respeitadas ou
referenciadas. Rastreabilidade das anlises e
produtos de origem.
Obtidos a partir do padro primrio

RASTREABILIDADE
a capacidade de reconstruir um estudo a qualquer tempo, a
partir dos registros analticos (dados brutos, clculos), dos
certificados de calibrao / qualificao dos instrumentos
utilizados, dos registros de utilizao dos equipamentos, dos
registros de treinamento do pessoal envolvido, plano de estudo,
relatrio final, desvios, emendas, anlise crtica, e demais
documentos que compe o trabalho.

ARREDONDAMENTOS E ALGARISMOS
SIGNIFICATIVOS
Arredondamentos manuais
Pode haver diferenas
Uso de planilhas eletrnicas
Ex: Arredondar para 2 casas decimais:

12,238
12,233
12,235
Minicursos CRQ-IV 2010 Validao e protocolos em anlises qumicas
Exemplo de plano de estudo de validao de metodologia analtica por HPLC/UV

em formulado farmacutico na forma de p estril injetvel pela tcnica de hplc/uv
para o ativo dacarbazina
ESTUDO / ATIVO
Dacarbazina
PATROCINADOR
xxxxxxxxxxxxxxxxx
RESPONSVEL
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
ENDEREO
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
CDIGO DO ESTUDO
xxxx-R00
REALIZAO
(UNIDADE OPERACIONAL)
Analtica Comrcio e Anlises Qumicas Ltda
ENDEREO
Rua Jos da Silva, 12 Pinheiros So

Paulo/SP CEP 05409-011
INCIO DO ESTUDO
23/ 04/ 2010
DATAS PREVISTAS
INCIO DOS ENSAIOS
TRMINO DOS ENSAIOS
TRMINO DO ESTUDO
23/ 04/ 2010

24/ 04/ 2010
26/ 04/ 2010
DIRETOR DE ESTUDO
xxxxxxxxxxxxx
ENDEREO

ANALISTA PRINCIPAL
xxxxxxxxxxx
GERENTE DA UNIDADE
DA GARANTIA DA QUALIDADE
xxxxxxxxxxxx
Apoio Caixa Econmica Federal
1-Objetivo:
Validao de metodologia analtica para a determinao de teor de

Dacarbazina, pela tcnica de Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (HPLC) com deteco no ultravioleta (UV) em formulado
farmacutico.
2-Princpio do Mtodo:
A amostra diluda e o ativo quantificado por HPLC em modo

fase reversa e deteco na regio espectral do ultravioleta (UV).
3-Identidade Qumica:
Dacarbazina
Frmula molecular: C6H10N6O
Peso molecular: 182,18 g/mol
4-Materiais:
Balana analtica
Pipetador automtico 1,0 mL e 5,0 mL
Cmara de Luz
Cmara de Fluxo Laminar
Estufa
pHmetro
Banho ultra-snico
Membrana de 0,45 micras
Cromatgrafo Lquido
Bales volumtricos 10 mL
5-Reagentes:
Acetonitrila
Fosfato de Potssio Monobsico
cido Fosfrico
6-Solues Preparadas: Hidrxido de Sdio

cido Clordrico
Tampo Fosfato de Potssio Monobsico
Perxido de Hidrognio
7-Padro de Referncia:
Padro
Fabricante
Dacarbazine
USP
Cdigo
T&E
G-3878
Pureza
Lote
100 %
Validade
(ms/ano)
Corrente na
abertura
8- Amostra
Amostra
Fabricante
Lote
Dacarbazina 200 mg
P Estril Injetvel
xxxx
xxxxx
Fabricao
Validade
(ms/ano)
(ms/ano)
10/2009
10/2011
Receber, identificar e armazenar as substncias de acordo com os procedimentos TE TC AM

001, TE TC AM 002 e TE TC AM 003.
Manusear as substncias com segurana. Em caso de dvida consultar a ficha de MSDS.
Solicitar, ao patrocinador, caso esteja indisponvel. Manter o frasco sempre bem fechado.
9-Condies Analticas:
Coluna:
CLV 09 Luna C-18 (2) 100A (250 X 4,6 mm) 5 m
Fase Mvel:
A Tampo pH 3,0 60 %
B Acetonitrila grau HPLC 40 %
Diluente:
Tampo - Fase Mvel - A
Vazo:
1,0 mL/min.
Volume de injeo: 10 L
Deteco:
Ultravioleta a 323 nm
Temperatura:
30 C
Tempo de Reteno Aproximadamente 2,6 minutos

Tempo de corrida
10 minutos
Observao
Durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz.
10-Experimental:
10.1 Preparo da soluo estoque
a)
b)
c)
Pesar aproximadamente 20 mg de padro de ativo em um balo de 50 mL;

Adicionar ao balo volumtrico cerca de 20 mL do Diluente deixando em banho
ultra-snico por dez minutos;
Completar o volume com o diluente e homogeneizar.
10.2 Preparo das solues de trabalho

Aliquotar as solues de trabalho em balo volumtrico de 10 mL para os pontos
correspondentes da curva conforme tabela 01:
Tabela 01: Preparo das solues de trabalho
Padro
Alquota (mL)
Volume Final (mL)
Concentrao (mg/mL)
50 %
0,50
10
0,02
75 %
0,75
10
0,03
100 %
1,00
10
0,04
125 %
1,25
10
0,05
150 %
1,50
10
0,06
10.3 Obteno da Curva de Resposta

a) Filtrar e injetar as solues de trabalho em HPLC nas condies analticas descritas;
b) Plotar a curva de resposta com a concentrao (mg/mL) versus rea do sinal analtico;
c) Trabalhar com coeficiente de correlao (r) no inferior a 0,99.
10.4 Preparo da Soluo Amostra

a) Realizar o peso mdio da amostra;
b) Pesar aproximadamente 0,24 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL;
c) Adicionar cerca de 10 mL de diluente. Deixar em banho ultra-snico por dez minutos,
completar o volume com Diluente e homogeneizar;
d) Aliquotar desta soluo 0,5 mL e transferir para um balo volumtrico de 50 mL;
e) Completar o volume com diluente, homogeneizar, filtrar e injetar.
10.5 Clculos
10.5.1 Clculo da concentrao do ativo sobre soluo amostra (mg/mL)
A concentrao do ativo sobre a soluo amostra foi calculada utilizando-se a equao da reta,
obtida pela injeo de cinco padres (tabela 1), de acordo com a seguinte equao:
Conc. Ativo
rea b
a
Onde:
Conc. Ativo = concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL);
rea = rea correspondente ao ativo no cromatograma;
b = coeficiente linear da curva de calibrao;
a = coeficiente angular da curva de calibrao
10.5.2 Clculo da concentrao final sobre a amostra (mg/Frasco)

A concentrao final do ativo sobre a amostra foi calculada utilizando a equao:
Conc . Amostra
Conc . Ativo dil PM

Massa
Onde:
Conc. Amostra = concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco);
Conc. Ativo = concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL);
dil = Diluio da amostra (mL)
PM = peso mdio da amostra (g)
Massa = massa amostra pesada (g)
Frasco = Frasco Ampola
10.5.3 Clculo da porcentagem de teor

A porcentagem de teor do ativo foi calculada utilizando-a equao:
Teor (%)
Conc . Amostra 100

Espec
Onde:
Espec = especificao declarada de ativo na amostra (P estril injetvel - mg/Frasco)
Teor (%) = % de ativo
11-Validao:
Os conceitos de validao aqui aplicados expressam os seguintes valores:
11.1
11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
Especificidade/ Seletividade
Linearidade
Preciso
11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida)
11.3.2 Intermediria (inter-corrida)
Recuperao
Intervalo
Robustez
11.1 Especificidade/Seletividade
A especificidade ser realizada atravs da anlise do padro 100 % de cada ativo, da fase mvel,
do diluente, da amostra e pela recuperao do ativo em soluo composta de padro e amostra
na proporo de 1:1. Esta soluo composta ser preparada adicionando-se soluo padro do
ponto equivalente ao de 100% da curva da linearidade sobre soluo amostra. As amostras sero
submetidas s condies de estresse para avaliao da especificidade / seletividade e sero
apresentados os resultados em forma de tabelas, como o exemplo abaixo:
Tabela - Condies Estresse

Agente
Condies
Hidrlise
alcalina
Adio de 0,1 mL de sol. de NaOH 0,1 M/mL de soluo de amostra na

concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas
Hidrlise cida
Oxidante
Luz
Temperatura
Adio de 0,1 mL de soluo de HCl 0,1 M/mL de soluo de amostra de

Adio de 0,1 mL de soluo H2O2 0,75 % (v/v)/mL de soluo de amostra
de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas
Exposio da embalagem primria Luz Fluorescente comum/24 horas e
Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga-20W/24 horas
(simultaneamente)
Exposio da embalagem primria 60 C/24 horas (estufa comum)
A Especificidade/Seletividade ser adequada se no apresentar interferncias detectveis de

outros compostos no tempo mdio de eluio do ativo nas amostras para o branco, placebo e
aps a aplicao dos agentes de estresse.
11.2 Linearidade
Determinar a linearidade em duplicata pelo coeficiente de correlao linear, entre as reas do
ativo nos padres e as concentraes correspondentes do composto na curva de resposta.
O critrio de aceitao a ser considerado r 0,99.
As faixas de linearidade a serem ensaiadas esto descritas no item 10.
Utilizar a equao da reta do primeiro dia para o clculo da especificidade / seletividade, da
preciso (repetibilidade) e da exatido.
Para os clculos da preciso intermediria, robustez e teor, utilizar a equao da reta obtida por
um segundo analista, em uma segunda ocasio.
11.3 Preciso
Avaliar a preciso atravs do coeficiente de variao, determinando a proximidade dos
resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla (determinao de teor
em seis preparaes de amostras, na concentrao 100 %), em duas ocasies.

Obteno dos resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentao. Este analista prepara e ensaia seis solues de amostras na concentrao de 100
% da curva de calibrao e calcular o CV com os seis resultados obtidos. A preciso ser
considerada adequada para repetibilidade (intra-corrida) da amostra se apresentar coeficiente de
variao inferior a 5,0 % segundo RE 899/03 [2].
11.3.2 Intermediria (inter-corridas)
Concordncia entre os resultados obtidos com analistas diferentes para doze determinaes a
100 %, em duas diferentes ocasies. Um segundo analista prepara e ensaia mais seis solues de
amostras na concentrao de 100 % da curva de calibrao no dia seguinte. Os clculos para
obteno do CV (%) so realizados com os resultados dos doze ensaios combinados A preciso
Intermediria (inter-corrida) da amostra ser considerada adequada se apresentar coeficiente de

variao inferior a 5,0 % segundo RE 899/03 [2].
11.4 Recuperao
Para avaliao deste parmetro, determinar os valores das recuperaes, verificados a partir de
nove determinaes contemplando o intervalo linear do mtodo analtico, ou seja, trs
concentraes: baixa (ponto inferior da curva), mdia (100 %) e alta (ponto superior da curva).
Preparar solues em triplicata, a partir de soluo estoque da substncia referncia nas
concentraes 50, 100 e 150 % sobre a soluo amostra nas mesmas concentraes
respectivamente na proporo de 1:1. Para o clculo utilizar a seguinte equao:
RECUPERA O
ConcentraoObtida
100
ConcentraoTerica
A recuperao ser considerada adequada se apresentar valores entre 90 e 110 %.

11.5 Intervalo
O intervalo ser definido pela faixa de linearidade determinada pelo mtodo e
confirmado pela preciso e exatido. Caso os parmetros estejam aceitveis, reportar a faixa de
linearidade como o intervalo estabelecido.
11.6 Robustez
Realizar alteraes em dois parmetros aplicveis ao mtodo.
Nota: Os resultados de robustez no so avaliados como critrios para estabelecimento da validade
de um mtodo analtico. Eles so apenas uma indicao de que o mtodo susceptvel ou no s
modificaes introduzidas. Para este estudo os parmetros a serem alterados sero o fluxo da fase
mvel de 1,0 mL/min. para 0,8 mL/min. e a temperatura, de 30C para 32C e para que o mtodo
seja robusto os resultados de recuperao devero estar dentro da faixa estabelecida para a exatido
do mtodo.
12-Arquivamento:
Folha de registro de amostras e anlises a efetuar;
Cpia do oramento aprovado;
Documentao de informaes do patrocinador;
Dados brutos, inclusive cromatogramas e os registros necessrios para que se componha a
rastreabilidade do estudo;
Plano de estudo;
Cpia do relatrio de estudo;
Outros documentos que o D.E. julgar necessrios
13-Substituies:
Nome
Cargo / Funo
Substituto
Analista de Laboratrio
Farmacutica Responsvel
Gerente da Qualidade
14-Etapas Crticas:
1) Preparo dos padres e amostras;
2) Injees dos padres e amostras.
Nota:
necessrio que seja monitorada a temperatura do laboratrio de 25C 5C pela equipe
responsvel e durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz, pois estas
observaes se tratam de etapas crticas no estudo.
15 - Referncias Bibliogrficas:
[1] - Leite, Flvio; Validao em Anlise Qumica Editora tomo 4a edio.
[2] - Resoluo RE 899, de 29 de maio de 2003, ANVISA.
[3] - Merck Index - 13th Ed., 2001.
16 Assinaturas
_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXX
Diretora de Estudo
CRF/SP XXXXXXX
_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXX
Analista Principal
CRQ/SP XXXXXXX
_________________________
___/___/___
XXXXXXXXXXXX
CREA/SP XXXXXXX
Exemplo de relatrio final de validao de metodologia analtica por HPLC/UV em

formulado farmacutico na forma de p estril injetvel pela tcnica de hplc/uv para o ativo
dacarbazina
ESTUDO / ATIVO
Dacarbazina
PATROCINADOR
xxxxxxxxxxxxxxxxx
RESPONSVEL
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
ENDEREO
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
CDIGO DO ESTUDO
xxxx-R00
REALIZAO
(UNIDADE OPERACIONAL)
Analtica Comrcio e Anlises Qumicas Ltda
ENDEREO

INCIO DO ESTUDO
23/ 04/ 2010
DATAS PREVISTAS
INCIO DOS ENSAIOS
TRMINO DOS ENSAIOS
TRMINO DO ESTUDO
23/ 04/ 2010

27/ 04/ 2010
28/ 04/ 2010
DIRETOR DE ESTUDO
xxxxxxxxxxxxx
ENDEREO

ANALISTA PRINCIPAL
xxxxxxxxxxx
GERENTE DA UNIDADE
DA GARANTIA DA QUALIDADE
xxxxxxxxxxxx
1-Objetivo:
Validao de metodologia analtica para a determinao de teor de

Dacarbazina, pela tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
(HPLC) com deteco no ultravioleta (UV) no formulado farmacutico
Dacarzin 200 mg P Estril Injetvel.
2-Princpio do Mtodo:
A amostra diluda e o ativo quantificado por HPLC em modo fase reversa

e deteco na regio espectral do ultravioleta (UV).
3-Identidade Qumica:
Dacarbazina
Frmula Molecular: C6H10N6O
Peso Molecular: 182,18 g/mol
4-Materiais:
Calibrao
Validade
(ms/ano)
(ms/ano)
BA-14
11/2009
11/2010
Transferpette
PP-VAL-01
06/2009
06/2010
Pipetador automtico
Transferpette
PP-VAL-02
08/2009
08/2010
Cmara de Luz
T&E Analtica
CDG-01
03/2010
03/2011
Cmera de Fluxo Laminar
Grupo Veco
FXL 04
10/2009
04/2010
pHmetro
Digmed
PH 04
07/2009
07/2010
Estufa
Faber-Primar
ES-8
04/2009
04/2010
Banho ultra-snico
Sonitech
US-04
N/A
N/A
Membrana de 0,45 micras
Millipore
N/A
N/A
N/A
Cromatgrafo Lquido
Shimadzu
HPLC-23
05/2009
05/2010
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
F1604
F1619
E7520
F7021
F7008
E7658
F9240
E7608
F1568
G7982
E7440
E7520
E7457
E0004
E0030
F0645
F0705
08/12/09
07/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
17/07/09
22/05/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
08/12/10
07/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
17/07/10
22/05/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
Material
Fabricante
TAG
Balana analtica
Shimadzu
Pipetador automtico
Bales volumtricos
de 10 mL
Bales volumtricos
de 25 mL
Bales volumtricos
de 50 mL
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Masterlabor
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
L. M.
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Laborglas
Hexis Cientifica
Hexis Cientfica
F7094
F7195
1567
L2524
E6399
G4446
D5548
D8332
F7216
F0705
F7216
F7248
5269
F7125
F7137
F7094
F7108
F7248
F7195
F7171
H1268
H0399
H0426
H0376
H0329
H0364
H0535
H0412
H0398
H0410
H0442
H1268
F5664
H 1460
H 1667
H 8093
F5605
H1147
H1241
H1351
H1266
H1401
H1280
H1383
62470
62478
N/A = No se aplica
5-Reagentes:
14/12/09
14/12/09
11/12/09
14/12/09
08/12/09
05/11/09
07/12/09
04/09/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
14/12/09
19/05/09
28/04/09
28/04/09
28/04/09
28/04/09
19/05/09
28/04/09
19/05/09
28/04/09
28/04/09
21/05/09
14/07/09
08/03/10
08/03/10
08/03/10
14/07/09
19/01/10
22/07/09
21/08/09
21/08/09
21/08/09
21/08/09
21/08/09
14/12/09
02/12/09
14/12/10
14/12/10
11/12/10
14/12/10
08/12/10
05/11/10
07/12/10
04/09/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
14/12/10
19/05/10
28/04/10
28/04/10
28/04/10
28/04/10
19/05/10
28/04/10
19/05/10
28/04/10
28/04/10
21/05/10
14/07/10
08/03/11
08/03/11
08/03/11
14/07/10
19/01/11
22/07/10
21/08/10
21/08/10
21/08/10
21/08/10
21/08/10
14/12/10
02/12/10
Reagente
Fabricante
Cdigo
Validade
Lote
T&E
(ms/ano)
Acetonitrila
Tedia
L 103
911288R
11/2014
Fosfato de Potssio Monob.
Ecibra
L 72
18112
07/2012
cido Fosfrico
Ecibra
L 54
18042
05/2012
Data de
Preparo
Validade
(ms/ano)
Preparado
por
6-Solues Preparadas:
Cdigo
Soluo
T&E
(ms/ano)
Hidrxido de Sdio 0,1 M
EQ -1745
12/2009
08/2010
Patrcia
cido Clordrico 0,1 M
PE-2766
11/2009
05/2010
Priscila
Tampo Fosf. Pot. Monob. 6,25 mM
V-596
04/2010
05/2010
Vanessa
Perxido de Hidrognio 0,75 %
V-566
02/2010
08/2010
Vanessa
7-Padro de referncia:
Padro
Fabricante
Dacarbazine
USP
Cdigo
T&E
G-3878
Pureza
Lote
100 %
Validade
(ms/ano)
Corrente na abertura
8-Identificao da Amostra:
Amostra
Dacarbazina 200 mg
P Estril Injetvel
Fabricante
Lote
xxxx
xxxxx
Fabricao
Validade
(ms/ano)
(ms/ano)
10/2009
10/2011
9-Condies Analticas Cromatografia Lquida:

Coluna:
CLV 09 Luna C-18 (2) 100A (250 X 4,6 mm) 5 m
Fase Mvel:
A Tampo pH 3,0 60 %
B Acetonitrila grau HPLC 40 %
Diluente:
Tampo - Fase Mvel - A
Vazo:
1,0 mL/min.
Volume de injeo:
10 L
Deteco:
Ultravioleta a 323 nm
Temperatura:
30 C
Tempo de Reteno
Aproximadamente 2,6 minutos
Tempo de corrida
10 minutos
Observao
Durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz.
10-Procedimentos:
10.1 Preparo da soluo estoque
a)
b)
c)
Pesar aproximadamente 20 mg de padro de ativo em um balo de 50 mL;

Adicionar ao balo volumtrico cerca de 20 mL do Diluente deixando em banho ultra-snico por
dez minutos;
Completar o volume com o diluente e homogeneizar.
10.2 Preparo das solues de trabalho

Aliquotar as solues de trabalho em balo volumtrico de 10 mL para os pontos correspondentes da curva.
Tabela 01: Preparo das solues de trabalho
Padro
Alquota (mL)
Volume Final (mL)
Concentrao (mg/mL)
50 %
0,50
10
0,02
75 %
0,75
10
0,03
100 %
1,00
10
0,04
125 %
1,25
10
0,05
150 %
1,50
10
0,06
10.3 Obteno da Curva de Resposta

a) Filtrar e injetar as solues de trabalho em HPLC nas condies analticas descritas;
b) Plotar a curva de resposta com a concentrao (mg/mL) versus rea do sinal analtico;
c) Trabalhar com coeficiente de correlao (r) no inferior a 0,99.
10.4 Preparo da Soluo Amostra
a) Realizar o peso mdio da amostra;
b) Pesar aproximadamente 0,24 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL;
c) Adicionar cerca de 10 mL de diluente. Deixar em banho ultra-snico por dez minutos, completar o
volume com Diluente e homogeneizar;
d) Aliquotar desta soluo 0,5 mL e transferir para um balo volumtrico de 50 mL;
e) Completar o volume com diluente, homogeneizar, filtrar e injetar.
10.5 Clculos
10.5.1 Clculo da concentrao do ativo sobre soluo amostra (mg/mL)
A concentrao do ativo sobre a soluo amostra foi calculada utilizando-se a equao da reta, obtida pela
injeo de cinco padres (tabela 1), de acordo com a seguinte equao:
Conc. Ativo
Onde: Conc. Ativo
rea
b
a
rea b
a
= concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL);

= rea correspondente ao ativo no cromatograma;
= coeficiente linear da curva de calibrao;
= coeficiente angular da curva de calibrao
10.5.2 Clculo da concentrao final sobre a amostra (mg/Frasco)

A concentrao final do ativo sobre a amostra foi calculada utilizando a equao:
Conc . Amostra
Onde: Conc. Amostra
Conc. Ativo
dil
PM
Massa
Frasco
Conc . Ativo dil PM

Massa
= concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco);

= concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL);
= Diluio da amostra (mL)
= peso mdio da amostra (g)
= massa amostra pesada (g)
= Frasco Ampola
10.5.3 Clculo da porcentagem de teor

A porcentagem de teor do ativo foi calculada utilizando-a equao:
Teor (%)
Conc . Amostra 100

Espec
Onde:
Espec
= especificao declarada de ativo na amostra (P estril injetvel - mg/Frasco)
Teor (%)
= % de ativo
11-Validao:
Os conceitos de validao aqui aplicados expressam os seguintes valores:
11.1
11.2
11.3
Especificidade/ Seletividade
Linearidade
Preciso
11.3.2 Intermediria (inter-corrida)

Recuperao
Intervalo
Robustez
11.4
11.5
11.6
11.1 Especificidade/Seletividade
A especificidade foi verificada atravs da anlise do padro 100% do ativo, da fase mvel, diluente, amostra
e pela recuperao do ativo em soluo composta de padro e amostra. Esta soluo composta foi preparada
na proporo de 1:1, adicionando-se soluo padro do ponto equivalente ao de 100% da curva da
linearidade sobre soluo amostra. Tal adio resultou em um valor mdio de recuperao de 98,3%. Os
cromatogramas obtidos pelas injees da fase mvel e diluente no mostraram sinais analticos no tempo de
reteno referente ao pico do ativo. A amostra foi submetida as condies de estresse para avaliao da
especificidade / seletividade e os resultados so apresentados na Tabela 02.
Tabela 02: Resultados obtidos para os ensaios de estresse
Diferena de
quantificao
(%)
Agente
Condies
Hidrlise
alcalina
Adio de 0,1 mL de sol. de NaOH 0,1 M/mL de soluo de amostra na

Adio de 0,1 mL de soluo de HCl 0,1 M/mL de soluo de amostra
de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas
Adio de 0,1 mL de soluo H2O2 0,75 % (v/v)/mL de soluo de
amostra de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24
horas
Exposio da embalagem primria Luz Fluorescente comum/24 horas
e Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga-20W/24 horas
simultaneamente.
Hidrlise cida
Oxidante
Luz
Temperatura
Exposio da embalagem primria 60 C/24 horas (estufa comum)
-0,6
-1,1
-1,1
-7,5
-10,1
A partir dos resultados para o ativo, conclui-se pela ausncia de interferncias detectveis de outros
compostos no tempo mdio de eluio dos ativos aps a aplicao dos agentes de estresse.
O que mais se pode concluir?
11.2 Linearidade
A linearidade foi determinada em duplicata pelo coeficiente de correlao linear, entre as reas do ativo nos
padres e as concentraes correspondentes do composto na curva de resposta, mostrados na Tabela 03 e na
Figura 01. Para a elaborao da curva conjugada foram utilizadas as reas individuais de injees em
duplicata. O critrio de aceitao considerado foi r 0,99, segundo RE 899/03 [2].
Tabela 03: Resultados obtidos para linearidade 1 Analista
Padro
Conc. (mg/mL)
50 %
0,02
75 %
0,03
100 %
0,04
125 %
0,05
rea
1283116
1287473
1897316
1897412
2496944
2495128
3080158
3076033
Coeficiente de correlao (r)
3628063
3628915
0, 9998
Equao da Reta
y = 58090301,98x + 130207,60
150 %
0,06
Figura 01: Grfico da curva da Linearidade

Linearidade 1 dia
y = 58090301,98x + 130207,60
rea
4000000
2000000
0
0,015
0,025
0,035
0,045
0,055
Concentrao
O coeficiente de correlao obtido foi considerado adequado por apresentar R> 0,99.
A equao da reta apresentada na Tabela 03 foi utilizada para o clculo da especificidade / seletividade, da
preciso (repetibilidade) e da exatido. Para os clculos da preciso intermediria, estabilidade e estresse
utilizaram-se a equao da reta obtida por um segundo analista, em uma segunda ocasio:
Equao da reta obtida na segunda ocasio: y = 57832881,19x + 119107,0
Coeficiente de correlao obtido na segunda ocasio: (r) = 0, 9999
Concluso?
11.3 Preciso
A preciso foi avaliada atravs do coeficiente de variao, determinando-se a proximidade dos resultados
obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla (determinao de teor em seis preparaes de
amostras, na concentrao 100 %), em duas ocasies.
11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida) - Obteno dos resultados dentro de um curto perodo de tempo com o
mesmo analista e mesma instrumentao.
Tabela 04: Resultados obtidos para repetibilidade - 1 Analista
Replicata
rea
1
2
3
4
5
6
2545998
2550004
2546411
2542426
2545806
2539551
Concentrao
(mg/Frasco)
190,89
200,88
200,75
201,21
201,55
200,21
Concluso?
% Teor
CV (%)
95,4
100,4
100,4
100,6
100,8
100,1
2,1
11.3.2 Intermediria (inter-corridas) - Concordncia entre os resultados obtidos com analistas diferentes para
doze determinaes a 100 %, em duas diferentes ocasies.
Tabela 05: Resultados obtidos para preciso intermediria
Replicata
1aAnalista
2 Analista
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
rea
Concentrao
(mg/Frasco)
% Teor
CV (%)
2545998
2550004
2546411
2542426
2545806
2539551
2570259
2574695
2572018
2562369
2569479
2564940
190,89
200,88
200,75
201,21
201,55
200,21
203,82
204,85
205,04
204,89
206,07
206,19
95,4
100,4
100,4
100,6
100,8
100,1
101,9
102,4
102,5
102,4
103,0
103,1
2,1
Concluso?
11.4 Recuperao
Para avaliao deste parmetro, foram determinados os valores das recuperaes, verificados a partir de
nove determinaes contemplando o intervalo linear do mtodo analtico, ou seja, trs concentraes: baixa
(50 %), mdia (100 %) e alta (150 %). As recuperaes foram preparadas a partir de soluo estoque da
substncia referncia nas concentraes 50, 100 e 150 % sobre a soluo amostra. Para o clculo foi
utilizada a seguinte equao:
RECUPERA O
ConcentraoObtida
100
ConcentraoTerica
Tabela 06: Resultados obtidos para exatido

Nvel de
Concentrao
Concentrao
Terica
(mg/mL)
Baixa
0,02
Mdia
0,04
Alta
0,06
rea
Concentrao
Obtida
(mg/mL)
Recuperao
(%)
1268002
1269094
1273525
2521473
2523750
2520053
3670360
3667522
3672960
0,02
0,02
0,02
0,04
0,04
0,04
0,06
0,06
0,06
97,0
97,1
97,4
101,9
102,0
101,8
100,6
100,5
100,6
Concluso?
Mdia das
Recuperaes
(%)
97,2
101,9
100,6
11.5 Intervalo
O intervalo foi estabelecido atravs da faixa de linearidade determinada pelo mtodo e confirmada pela
preciso e recuperao, sendo de 0,02 a 0,06 mg/mL.
11.6 Robustez
Para verificao da robustez, foram realizadas modificaes no fluxo da fase mvel de 1,0 mL/min. para 0,8
mL/min. e na temperatura, de 30C para 32C, com avaliao dos resultados obtidos para a amostra e padro
nas concentraes de 100 %. Os resultados obtidos so apresentados na Tabela 07:
Tabela 07: Resultados obtidos para robustez
Alteraes
Amostra
Fluxo 0,8
mL/min.
Temperatura
32 C
1
2
1
2
Concentrao
Terica
(mg/Frasco)
reas
Concentrao Obtida
(mg/Frasco)
Recuperao
(%)
203,82
3152871
3201222
2556107
2559015
191,48
194,42
193,07
193,29
93,9
95,4
94,7
94,8
Aps a verificao das modificaes realizadas no mtodo analtico, Diminuindo o fluxo da fase mvel de
1,0 mL/min para 0,8 mL/min. e na temperatura, de 30C para 32C.
Concluso?
12-Sumrio dos parmetros de aceitao

Parmetros
Critrios de Aceitao
Resultados para o Analito
Especificidade
Ausncia de interferncias
detectveis no tempo de reteno
para o analito na anlise
cromatogrfica
Ausncia de interferncias
detectveis no tempo de reteno
para o analito na anlise
cromatogrfica
Linearidade
r 0,99
Preciso
r = 0,9998 (1dia)
r = 0,9999 (2dia)
CV < 5,0 %
CV = 2,1 %
Preciso Intermediria
CV < 5,0 %
CV = 2,1 %
Recuperao
Recuperao
90 % a 110 %
Baixa: 97,2 %
Mdia: 101,9 %
Alta: 100,6 %
(Repetibilidade da amostra)
13-Consideraes gerais:
Consideram-se os seguintes fatores para validao total ou parcial:

a) Fatores que levam revalidao total:
Uso desta condio analtica para outro analito ou outro frmaco de mesmas caractersticas com
formulao indisponvel ou no conhecida.
Uso desta condio analtica para analisar um novo analito introduzido na formulao.
b) Fatores que levam revalidao parcial:
Alteraes no sistema analtico
14-Concluso:
Com os valores para os parmetros de validao determinados, a metodologia analtica est validada para a
anlise de teor de Dacarbazina na amostra de Dacarbazin 200 mg P Estril Injetvel, no intervalo de
0,02 a 0,06 mg/mL para Dacarbazina.
15 - Referncias Bibliogrficas:
[1] - Leite, Flvio; Validao em Anlise Qumica Editora tomo 4a edio.
[2] - Resoluo RE 899, de 29 de maio de 2003, ANVISA.
[3] - Merck Index - 13th Ed., 2001.
16 - Assinaturas:
_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXXXX
Diretora de Estudo
CRF/SP XXXXXXXXX
_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXXXXXXX
Analista Principal
CRQ/SP XXXXXXXXXX
_________________________ ___/___/___
XXXXXXXXXXXXXXXXX
CREA/SP XXXXXXXXXXXXXXX

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