cumprimento das Boas Prticas de Fabricao por parte das indstrias

farmacuticas.

1.1 Ensaio de Esterilidade Metodologias Utilizadas

H duas possibilidades de inoculao da amostra aos meios de cultura

que pode ser adotada; a inoculao direta e a inoculao indireta (BOWMAN, 1969;
FARMACOPIA

BRASILEIRA,

1988;

AKERS,

1994;

EUROPEAN

PHAEMACOPOEIA, 2002; THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2005). Sendo

a inoculao indireta tambm chamada de filtrao por membrana e o mtodo de
escolha quando a natureza do produto permitir (THE UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2005).

O mtodo empregando a Inoculao Direta utilizado desde a

oficializao do ensaio de esterilidade, em 1932 pela British Pharmacopeia 32
(HOLDOWSKY, 1957; VAN DOORNE et al., 1988). O procedimento original baseiase na transferncia direta, de quantidade preestabelecida do produto ao meio de
cultura estril e a incubao na temperatura apropriada, por no menos que 7 dias,
perodo que foi elevado para 14 dias na USP 24 (2000).

Como o produto transferido diretamente aos meios de cultura, devese ter cuidado com aqueles que apresentam em sua composio agentes
conservantes, pois podem provocar resultados falso-negativos, impedindo o
crescimento de microrganismos contaminantes, quando presentes. Assim, conforme
a natureza do produto, exige-se a inativao dos agentes conservantes atravs da
diluio prvia do produto ou pela adio de agentes inativadores (BUGNO, 2001).

Este mtodo parece simples na teoria, mas na prtica, detm um grau

de dificuldade por exigir do tcnico, destreza e concentrao para manter a
assepsia, onde a necessidade de repeties na abertura dos frascos, amostragem,
transferncia e mistura pode causar fadiga com subsequente deteriorao na
tcnica e na concentrao e, com isso aumentar a ocorrncia de contaminao
acidental do ensaio de esterilidade (AKERS, 1994).

O volume amostrado deve ser o suficiente para representar o volume

total e o volume dos meios devem ser suficiente para promover o crescimento do(s)
microrganismo(s) e devem ser respeitadas as quantidades estabelecidas no quadro
2.

A mais importante evoluo no ensaio de esterilidade foi a introduo

do mtodo de Inoculao Indireta tambm chamado de Filtrao por Membrana, por
Holdowisky em 1957 (HOLDOWSKY, 1957), na British pharmacopoeia em 1963 e
oficializado pela Food and Drugs Administration (FDA) em 1964 e na USP 18 em
1970 (BOWMAN, 1969; VAN DOORNE et al., 1988), tendo sido aplicado inicialmente
para substncias antibiticas (PICKET & LITSKI, 1981).

Baseia-se na passagem de uma amostra lquida atravs de um filtro

de membrana estril, que seccionado e transferido assepticamente para os meios
de cultura apropriados. Neste mtodo o produto no entra em contato com o meio
de cultura (BUGNO, 2001).

A membrana filtrante de ster de celulose a mais comumente usada

(PICKET & LITSKI, 1981), ou de materiais sintticos, com borda hidrofbica, que
resista, por exemplo, antineoplsicos extremamente agressivos, com porosidade
nominal mxima de 0,45 0,02 m, 47 mm de dimetro e permitir um fluxo de 55 a
75 mL de gua por cm2 por minuto, presso de 70 cmHg. O material da
membrana deve ser escolhido com base no produto a ser testado, apresentando
baixa afinidade pelos agentes antimicrobianos eventualmente presentes (PINTO et
al., 2003).

Os sistemas filtrantes devem permitir a manipulao assptica da

membrana, e so em geral compostos de materiais que permitam a sua
esterilizao por autoclavao. O filtro de membrana colocado sobre um sistema
filtrante, sendo montado e acoplado em uma bomba de vcuo. Aps a filtrao do
produto a membrana lavada, empregando-se para isto a passagem de volumes
adequados de soluo de lavagem com a finalidade de retirar resduos do produto
que eventualmente permaneam sobre a membrana. O tipo de soluo de lavagem
mais utilizado a gua peptonada a 0,1%, podendo ou no conter inativadores

especficos. A membrana ento seccionada e transferida para os meios de cultura

apropriados (SEYFARTH, 1983; AKERS, 1994).

A metodologia indireta ou filtrao por membrana oferece pelo menos 5

vantagens sobre o uso da metodologia direta (SEYFARTH, 1983; AKERS, 1994):

1- Maior sensibilidade;
2- Eliminao do agente antimicrobiano pela filtrao anterior transferncia
da membrana para os meios;
3- Todo o contedo da amostra pode ser testado, aumentando assim a
possibilidade de deteco de microrganismos contaminantes;
4- Concentrao de um nvel baixo de microrganismos contaminantes na
membrana, filtrando volumes maiores do produto;
5- Microrganismos presentes em produtos oleosos podem ser separados do
produto durante a filtrao e cultivados em meios aquosos apropriados.

Em contra partida, apresenta 2 desvantagens quando comparado

metodologia direta (AKERS, 1994):

1- Maior probabilidade de contaminao acidental durante o procedimento de

anlise por necessitar de uma maior habilidade do operador, um
monitoramento ambiental melhor em virtude da exposio da unidade de
filtrao, remoo da membrana, para proceder ao corte e em seguida a
transferncia para os meios de cultura. (Sistemas fechados como Steritest,
elimina esta desvantagem).
2- No possvel discriminar a extenso da contaminao entre as unidades,
se presente, porque todo o contedo dos frascos concentrado em uma
nica membrana.

Outra evoluo importante no ensaio de esterilidade foi a introduo do

Sistema Steritest que consiste de uma bomba peristltica e unidades filtrantes presterilizadas e contempla o ensaio de esterilidade completo, incluindo a
amostragem, filtrao, adio de meios de cultura e incubao (BUGNO, 2001).

Neste sistema, no ocorre a exposio da amostra, da membrana, do

lquido de lavagem e dos meios de cultura, no ambiente onde realizado o ensaio,
diminuindo assim o risco de contaminao acidental e conseqentemente a
ocorrncia de resultados falso-positivos (PICKET & LITSKI, 1981).

Por ser um ensaio destrutivo, no pode ser aplicado a todo o lote. A

falta de certeza absoluta quanto ao estado de esterilidade de todas as unidades
pertencentes ao lote uma limitao estatstica do ensaio, razo pela qual o critrio
de amostragem extremamente importante (AKERS, 1994), pois apenas uma
poro de todo o lote submetida ao ensaio de esterilidade (Quadros 2, 3 e 4) e, o
resultado obtido s deve ser extrapolado para as unidades no testadas a partir do
momento que se tenha autoclaves qualificadas e com o processo de esterilizao
validado.

1.2 Amostragem

A probabilidade de rejeio de um lote baseada no ensaio de

esterilidade depende do nvel de contaminao e do nmero de unidades testadas,
quanto maior for o nmero de unidades testadas e maior o volume de cada unidade,
maior ser a probabilidade em detectar microrganismos contaminantes, caso
presentes (BOWMAN, 1969; BROWN & GILBERT, 1977; BUGNO, 2001).

A relao entre o nvel de contaminao e a probabilidade de rejeio

do lote dada pela frmula (BROWN & GILBERT, 1977; VAN DOORNE et al.,
1988):
P = [1 (1 x)N]

Onde, P = probabilidade de rejeio do lote

x = nvel de contaminao do lote
N = nmero de unidades analisadas

A figura 1, mostra a probabilidade de aceitao de um lote, de acordo

com o nvel de contaminao e o nmero de unidades submetidas ao ensaio de
esterilidade.

10

FIGURA 1: PROBABILIDADE DE ACEITAO DE UM LOTE, DE ACORDO COM

O NVEL DE CONTAMINAO E O NMERO DE UNIDADES SUBMETIDAS AO
ENSAIO DE ESTERILIDADE

A probabilidade de aceitao de um lote contendo 1% de unidades

contaminadas no ensaio de esterilidade, executado sobre 20 unidades, de 82%, ao
passo que quando executado sobre 250 unidades, deste mesmo lote, a
probabilidade de aceitao passa a ser de 10%. Para no se ter o risco de aceitar
este mesmo lote 600 unidades deveriam testadas, tornando o ensaio invivel na
prtica. Verifica-se assim, que o aumento do nmero de unidades submetidas ao
ensaio de esterilidade diminui a probabilidade de aceitao de lotes contendo baixo
nvel de contaminao (SEYFARTH, 1983).

Segundo a USP 28 (2005), a amostragem que deve ser submetida ao

ensaio de esterilidade, est relacionada com o tamanho do lote (Quadro 3) e a
quantidade mnima a ser testada de acordo com a quantidade do produto em cada
frasco (Quadros 2 e 4).

11

QUADRO 2: QUANTIDADE DE AMOSTRA A SEREM TESTADAS DE ACORDO

COM O VOLUME DO FRASCO E A ALQUOTA A SER TRANSFERIDA DE
ACORDO COM O MTODO EMPREGADO

Volume de cada
frasco (mL)
< 10
10 50
51 100
51 100, para
administrao
intravenosa
101 500
> 500
Antibiticos (liquido)

Alquota a ser
transferida de cada
unidade
1mL, ou todo o contedo
se < 1mL
5mL
10mL

Volume de Meio de Cultura (mL)

Mtodo Direto Mtodo Indireto
15

100

40
80

100
100
100

do contedo

200

do contedo
500mL
1mL

No se aplica
No se aplica
No se aplica

100
100
100

QUADRO 3: NMERO MNIMO DE UNIDADES A SEREM TESTADOS EM

RELAO AO TAMANHO DO LOTE

Nmero de Unidades no Lote

Preparaes Parenterais
No mais que 100 unidades
101 500 unidades
> 500 unidades
Parenterais de grande volume
Antibiticos slidos
Embalagens < 5g
Embalagens > ou = 5g
Preparaes oftlmicas e outras preparaes
no injetveis
No mais que 200 unidades
Maior que 200 unidades
Se o produto apresentado na forma de dose
nica, aplicar o plano apresentado para
preparaes parenterais.

Nmero de Unidades que Devem Ser

Testadas para cada Meio.
10% ou 4 unidades, o quanto for maior.
10 unidades.
2% ou 20 unidades, o que for menor.
2% ou 10 unidades, o que for menor.
20 unidades
6 unidades

5% ou 2 unidades, o que for maior

10 unidades

12

QUADRO 4: QUANTIDADE DE UNIDADES PARA PRODUTOS SLIDOS

Volume de Meio de Cultura

(mL)
Mtodo Direto
Mtodo
Indireto

Contedo do Frasco (g)

Quantidade
mnima retirada de
cada frasco

< 50mg
51 200mg
200 300mg
300 600mg
> 600mg
Antibiticos slidos
Para injeo (<5g)
Para injeo, pharmacy bulk
packages (> 5g)

todo o contedo
Metade do contedo
100mg
200mg
200mg

200
200
200
200
200

100
100
100
100
100

150mg
500mg

200
200

100
100

1.3 Meios de Cultura

Aps vrias tentativas de obteno das condies ideais para

promover o crescimento dos microrganismos contaminantes desde a oficializao do
ensaio, atualmente diversas farmacopias preconizam a utilizao de, pelos menos,
dois meios de cultura; o meio fluido de tioglicolato e o caldo de casena soja
10,12,25,26,30,31,32

O meio fluido de tioglicolato foi introduzido em 1945, na USP XIII17,

recomendado por promover condies de anaerobiose e aerobiose em um mesmo
cultivo, apresentando em sua composio uma pequena quantidade de gar
bacteriolgico para dificultar a penetrao do oxignio e a rezarzurina como
indicador de oxi-reduo, que forma um anel de colorao prpura quando em
contato com oxignio. Alm de neutralizar a ao bacteriosttica de conservantes
base de mercrio 10,31.

O caldo de casena-soja foi introduzido em 1970, na USP XVIII

17,18

em

substituio ao caldo Sabouraud por permitir o crescimento de bactrias, fungos e

leveduras apesar do valor de pH 7,3 0,2.

Os meios de cultura destinados ao ensaio de esterilidade devem

passar por um rgido controle de qualidade, com o objetivo de garantir a utilizao de
meios estreis e capazes de promover o crescimento de microrganismos
contaminantes, quando presentes.

13

A esterilidade garantida retirando uma poro do lote dos meios de

cultura, submetidos ao mesmo ciclo de esterilizao, de forma aleatria, e incubando
nas temperaturas especficas do ensaio de esterilidade por um perodo de 14 dias 26.
Nenhum crescimento microbiano deve ser observado, eliminando a ocorrncia de
resultados falso-positivos.

Para verificar a capacidade de promoo de crescimento microbiano,

as farmacopias recomendam a inoculao, nos meios de cultura, de uma
suspenso com contagem inferior a 100 UFC (Quadro 5) sendo que aps o perodo
de incubao (por no mais que 3 dias no caso de bactrias e no mais que 5 dias
no caso de fungos), devem apresentar crescimento do microrganismo especfico
12,17,25,32,33

QUADRO 5: MICRORGANISMOS INDICADOS PARA O ENSAIO DE PROMOO

DE CRESCIMENTO E PARA A VALIDAO DO ENSAIO DE ESTERILIDADE.
___________________________________________________________________
Meios de cultura
Microrganismos
Temperatura
___________________________________________________________________
Fluido de Tioglicolato
Clostridium sporogenes
32,5 2,5C
(ATCC 11437;INCQS 0060)
Kocuria rhizophila
32,5 2,5C
(ATCC 9341;INCQS 0010)
Bacillus subtitlis
32,5 2,5C
(ATCC 6633;INCQS 00001)
Caldo Casena - soja
Bacillus subtitlis
22,5 2,5C
(ATCC 6633;INCQS 00001)
Candida albicans
22,5 2,5C
(ATCC 10231;INCQS 40006)
Aspergillus niger
22,5 2,5C
(ATCC 16404;INCQS 40036)
___________________________________________________________________

1.4 Condies para Incubao

No decorrer da evoluo do ensaio de esterilidade, foram adotados

vrios perodos de tempo de incubao. Considerando que os microrganismos,
quando presentes em um produto, encontram-se em um ambiente inspito e muitas
vezes sob a forma esporulada, estes necessitam de um tempo para se adaptarem e
se multiplicarem a nveis detectveis. A maioria das farmacopias recomendava um
perodo de incubao conforme o mtodo empregado. Entretanto, desde a
14

publicao da USP XXIV15 , passou a adotar o perodo de 14 dias independente do

mtodo utilizado, permitindo o desenvolvimento de microrganismo de crescimento
lento 17,25,26.
Durante o perodo de incubao, preciso ter condies timas em
termos de nutrientes, pH, presso osmtica alm do tempo e da temperatura tima
para permitir o crescimento microbiano. Desta forma, adotam-se as seguintes
condies de incubao:

Para a deteco de bactrias, o meio fluido de tioglicolato incubado a

temperatura de 32,5 2,5C;

Para a deteco de fungos, o caldo casena soja incubado a temperatura

de 22,5 2,5C.

1.5 Validao do Ensaio de Esterilidade

Deve ser executada quando o produto for novo, quando houver alguma
mudana nas condies do ensaio e na avaliao da eficcia de um agente
inativador. Consiste na avaliao da existncia de atividade antimicrobiana por parte
do produto, eliminando a possibilidade de ter resultado falso-negativo.

Como

controle

negativo,

todos

os

materiais

envolvidos

no

procedimento do ensaio de esterilidade como: meios de cultura, solues-diluente,

seringa, agulha e etc, devem ser submetidos ao ensaio de esterilidade para evitar a
ocorrncia de resultados falso-positivos.

A validao inicia-se com a preparao de suspenses bacterianas e

fngicas dos microrganismos listados no Quadro 5, na concentrao de at 100
UFC/mL. Estas sero inoculadas aos meios de cultura, que serviro de controles
positivos e tambm aos meios de cultura com o produto, onde ser avaliada a
presena de atividade antimicrobiana assim como a eficincia do agente inativador
12,25,26,32

15

1.6 Condies para a realizao do Ensaio de Esterilidade

O ensaio de esterilidade deve ser executado sob condies asspticas,

ou seja, em ambiente que no oferea risco de contaminao acidental, seja por
fontes externas ou pelos operadores, por exemplo, em fluxo Grau A em rea Grau B
12

. Desta forma sugerida a utilizao da tecnologia de sala limpa.

Esta tecnologia tem como definio uma sala na qual o suprimento e a

distribuio do ar, filtragem, materiais de construo e procedimentos de operao
visam controlar as concentraes de partculas em suspenso, atendendo aos nveis
apropriados de limpeza, conforme definidos pelo usurio e de acordo com a ISO
Standard 14644-1 Classification of Air Cleanlines 34.

O sistema de ar condicionado deve ser exclusivo e projetado de forma

que todo o ar insuflado passe por filtros HEPA (Alta Eficincia de Filtrao), cuja
eficincia varia de 99,97% para partculas de 0,5 m a 99,9999% para partculas de
0,12 m, tenha sua integridade testada quanto a vazamento e saturao. Alm da
concentrao de partculas, outros parmetros so tambm controlados, como por
exemplo, a umidade e a temperatura que so mantidas a 50 10% e 22 2C.

Deve passar por um processo de balanceamento para que seja

mantido um diferencial positivo de presso adequado (normalmente em torno de 1,2
milmetros de coluna dgua (mmCa)) entre a sala mais crtica, onde so realizados
os ensaios de esterilidade e a sala de apoio, como, por exemplo, a de troca de
vestimenta.

A rea deve ser projetada para facilitar a limpeza e evitar depsito de

partculas contaminantes, como arredondamento dos cantos, tubulaes embutidas,
visores e luminrias faceando a parede.

O revestimento das paredes, piso e teto devem ser resistentes, no

porosos e nem gerador de partculas, impermeveis, resistentes corroso e aos
agentes de limpeza e desinfeco. No devem apresentar reentrncias nem
salincias. Geralmente utilizada tinta epxi ou poliuretano, ao inoxidvel, alumnio
anodizado, alm de laminado melannico.
16

A principal fonte de contaminao em uma rea limpa so as pessoas,

pelo processo de escamao da pele, respirao, roupas e pelos movimentos
efetuados em seu interior, razo pela qual o treinamento prvio para a qualificao e
conscientizao do pessoal de fundamental importncia.

Para eliminar o risco de contaminao pessoal imprescindvel o uso

de vestimenta esterilizada, composta por macaco, gorro e botas que devem ser
confeccionadas em tecido especial que permita a esterilizao, no emita partcula,
oferea segurana, conforto e praticidade ao operador, permitindo movimentos livres
e luvas estreis livres de p.

Deve ser estabelecido um programa de limpeza, com a utilizao de

desinfetantes eficientes a fim de reduzir a concentrao de partculas totais, como
tambm um programa de monitoramento ambiental para verificar o nmero de
partculas viveis, em toda a rea e o tipo de microrganismos presentes.

Este monitoramento ambiental pode ser feito por dois mtodos, o

passivo (placas de sedimentao), que no deve ser usado como avaliao
quantitativa dos nveis de partculas viveis em ambientes controlados e o mtodo
ativo, considerado como mtodo de referncia para o monitoramento microbiolgico
quantitativo do ar atravs do uso de amostradores de ar 35.

A coleta das partculas viveis, pelo mtodo ativo, consiste na

impactao direta do ar amostrado sobre a superfcie do meio de cultura e os
resultados so expressos em UFC e podem ser correlacionados com o volume de ar
amostrado.

Com o objetivo de eliminar a probabilidade de ocorrer contaminaes

provenientes de qualquer origem, desde os anos 80, tem sido amplamente usada a
tecnologia do Sistema de Isolador pelas indstrias farmacuticas na rea de
produo, enchimento assptico e principalmente para a realizao do ensaio de
esterilidade 15.

O Sistema de Isolador pode ser definido como um mini ambiente

controlado, hermeticamente fechado, dotado de tecnologias eficientes e seguras que
17

protegem os componentes dos processos biofarmacuticos (produto, operador e

ambiente)36. Possui fluxo de ar de cima para baixo, com filtros HEPA em posies
adequadas proporcionando um ambiente Grau A, estril, cuja manipulao por luvas
e roupas especiais (meio escafandro), substituindo com grandes vantagens a sala
limpa.
O processo de esterilizao do sistema isolador baseia-se no
fechamento de todas as entradas e sadas de ar e a unidade ento operada com a
ventilao em circuito fechado. O primeiro passo a secagem deste ar em
circulao, mediante um processo de adsoro, at a umidade relativa chegar
abaixo de 30%. Ento, vapores do agente qumico so misturados ao ar em
recirculao, devendo a concentrao do agente esterilizante ser sempre mantida
abaixo da saturao, para evitar a condensao nas superfcies internas do isolador.
So utilizados como agentes qumicos esterilizantes o cido peractico ou perxido
de hidrognio.

Depois de um perodo pr-determinado, na validao do processo de

esterilizao, inicia-se um ciclo de purgao. Uma vez diminuda a concentrao do
agente qumico esterilizante, o sistema de circulao do ar volta a funcionar
normalmente.

Todo o material necessrio para proceder ao ensaio de esterilidade,

inclusive as amostras, tem sua superfcie descontaminada em uma unidade de
transferncia. Terminada a descontaminao, so transferidos para a unidade de
trabalho atravs de um sistema de dupla porta, podendo ser submetidas ao ensaio
de esterilidade.

Uma vantagem frente utilizao da rea limpa por no precisar ter

rea classificada, regime de fluxo de ar com a utilizao de filtros HEPA, diferencial
de presso, controle de temperatura, umidade, o uso de vestimenta e da
necessidade de antecmara.

Trata-se de uma tendncia mundial quando utilizado para a execuo

do ensaio de esterilidade, pois possui como principal vantagem a eliminao da
principal fonte de contaminao que o fator humano evitando a ocorrncia de
resultados falso-positivos36.
18

O ambiente estril garantido a partir da qualificao do equipamento

e da validao do processo de esterilizao. Desta forma, garante-se que qualquer
evidncia de crescimento microbiano em um ensaio de esterilidade seja proveniente
do produto, eliminando a ocorrncia de retestes.

1.7 Interpretao dos Resultados

Desde a sua origem, a interpretao do ensaio de esterilidade baseiase na evidncia macroscpica de crescimento microbiano, promovendo uma turbidez
no meio de cultura, durante o perodo de incubao 9,12,25,26,32

A evidncia de crescimento microbiano pode se dar pela formao de

aglomerados das colnias, pela formao de pelculas na superfcie dos meios de
cultura, pela presena de sedimentos depositados, pela turvao dos meios de
cultura ou pela presena de fibras soltas ou enoveladas como algodo caracterizando as hifas dos fungos filamentosos. importante que qualquer
alterao observada no meio de cultura a partir do primeiro dia de incubao, deva
ser levada em considerao, esgotando assim todas as possibilidades no
procedimento de identificao de microrganismos identificados at, pelo menos, o
nvel de gnero e, preferencialmente, at nvel de espcie4.

Segundo a USP XXVIII

26

, se aps o tempo de incubao nenhum

crescimento microbiano for observado, a amostra considerada satisfatria. Se for

observado crescimento microbiano, a amostra considerada insatisfatria, ao
menos que seja constatada alguma irregularidade quanto aos procedimentos
executados durante o ensaio, ento, se o ensaio considerado invlido, repetido
com o mesmo nmero de unidades testadas no ensaio original. Se no for
observada evidncia de crescimento microbiano, neste novo ensaio, a amostra
considerada satisfatria quanto ao ensaio de esterilidade, mas, se for encontrado
crescimento microbiano, o produto considerado insatisfatrio para o ensaio de
esterilidade.

O ensaio de esterilidade pode ser considerado invlido somente

quando ocorrer um dos casos relatados abaixo 16,26.

19

Monitoramento ambiental no estiver de acordo com os limites estabelecidos;

Ocorrer falhas durante o procedimento de anlise;

Observar crescimento microbiano no controle negativo;

- Aps a determinao da identidade do microrganismo isolado no ensaio, o

crescimento desta(s) espcie(s) for atribudo inequivocadamente a alguma falha
relacionada ao material e/ou a tcnica usada durante o procedimento do ensaio de
esterilidade.
A Farmacopia Brasileira25 permite a execuo do ensaio em at trs
etapas. Se, ao final do perodo de incubao no houver evidncia de crescimento
microbiano, a amostra considerada satisfatria. Havendo crescimento microbiano,
o produto considerado imprprio, a menos que se possa demonstrar o contrrio
por reteste, ou por meios que comprovem no ter a contaminao causa relacionada
com a amostra (ex.: contaminao ambiente, contaminao de controle negativo).

O reteste deve ser feito de maneira idntica ao teste inicial. Se no

aparecer evidncia de crescimento microbiano, a amostra satisfatria para o
ensaio de esterilidade. Se houver crescimento no primeiro reteste, isolar e
caracterizar o(s) contaminante(s) do primeiro reteste e comparar com o(s)
contaminantes do ensaio de esterilidade original. Se o contaminante for o mesmo
nos dois ensaios, a amostra considerada insatisfatria no ensaio de esterilidade.
Se os dois contaminantes forem diferentes, deve ser realizado um segundo reteste.

O segundo resteste deve ser feito utilizando o dobro de unidades da

amostra utilizadas no ensaio inicial. Os volumes de cada unidade devem ser os
mesmos indicados para o ensaio inicial. Se no houver evidncia de crescimento, a
amostra satisfatria para o ensaio de esterilidade. Se houver crescimento de
qualquer microrganismo, a amostra considerada insatisfatria.

1.8 Importncia da Identificao dos Microrganismos

importante a identificao no somente do gnero, mas tambm, da

espcie do(s) microrganismo(s) isolado(s), seja do ensaio de esterilidade como do
monitoramento ambiental.

20

A identificao dos microrganismos provenientes do monitoramento

ambiental permite: conhecer a flora do ambiente, avaliar a eficcia do procedimento
de limpeza e desinfeco (mtodos e agentes), avaliar os procedimentos asspticos
realizados pelos tcnicos, dando suporte no direcionamento dos treinamentos com o
pessoal, principalmente, quando o nvel de alerta excedido.

O nvel de alerta no monitoramento microbiolgico ambiental aquele

que indica um aumento da carga microbiana, fora das condies normais que, uma
vez excedido, no implica, necessariamente, numa ao corretiva definitiva, mas
merece uma investigao e tomada de ao para no interferir na qualidade da
resposta do ensaio analtico.

Quanto identificao dos microrganismos provenientes do ensaio

de suma importncia porque a partir da espcie isolada que se invalida ou no o
ensaio, comparando com a(s) espcie(s) encontrada(s) no monitoramento ambiental,
como tambm, a reprovao do produto baseada na coincidncia de espcies
isoladas no caso da realizao de dois ensaios como no ensaio que chega a realizar
o 2 reteste, que para a VISA verifique a possibili dade de estabelecimento de nexo
causal em amostras de denncia, ou ainda a origem da contaminao no processo
produtivo.

21