Artigo Original Vitri-Inga: Um Novo Protocolo De Vitrificagao Vitri-Inga: A New V Fernanda Carolina Fachini* Carlos Gilberto Almodin MD.Ph.D.*.° Vania Cibele Minguetti-Cémara M.Sc.* Antonio Fernandes Moron MD.Ph.D.° Raul Nakano® Litsuko Shimabukuru* Afiliacado dos autores: *Materbaby - Reproduc&o Humana e Genética, Maringa, Parana. ® Departamento de Obstetricia, Universidade Federal de Séo Paulo - UNIFESP, Sao Paulo. © Ferticlin - Sao Paulo, Sao Paulo. Local do Trabalho: Fertilclin e Materbaby - Reproducg3o Humana e Genética Trabalho apresentado de forma oral no XII Congresso Brasileiro de Reprodugo Assistida~ Congresso Regional da Rede Latino Americana de Reproducéo Assistida. RESUMO Objetivo: Propor @ avaliacdo de um novo método de vitrificagdo através das taxas de sobrevida, fertilizacdo € gravidez apés vitrificacdio-aquecimento de odcitos, Material e métodos: Das 54 pacientes Incluidas neste estudo, 258 odcitos foram vitrificados-aquecides pelo método de vitrificago Vitri- Ingé. No protocolo de vitri- ficacdo foram utilizadas duas solugdes de vitrificagao em concentracdes diferentes ¢ no protocolo de aqueci- mento foram utilizadas trés solugdes. Trés horas apés 0 aquecimento, foi realizado a injecdo intra-citoplasmatica de espermatozdides (ICSI). Apés 72 horas a qualidade embriondria foi avaliada, € os embrides selecionados foram transferidos, Resultados: Apés aquecimento, 215 odcitos sobrevive- ram (83,3%). © ICSI foi realizado em 214 destes o6ci- tos. Apés 72 horas, 0 nlimero de embrides clivados foi de 164 (76,6%), sendo que 99 embrides eram graus I € II (63,5%). A taxa de gravidez on-going foi de 24,5% , resultando em 13 pacientes grévidas. Conclusées: 0 método de vitrificacéo proposto e estu- dado parece ser uma boa opcao devido as altas taxas de sobrevida e fertilizagio apés ICSI. Além disso, este méto- do & uma alternativa eficiente, répida e econémica. Key words: oécitos, vitrificacdo, sobrevida. ABSTRACT Objective: The objective of this study was to propose the assessment of a new vitrification protocol through survival, fertilization and pregnancy rates after vitrifica~ tion / thawing of oocytes. Recebido em 04/11/2008, ‘Aceito em 23/12/1008 Material and methods: Among 54 patients included in this study, 258 oocytes were vitrified, using vitri-Inga protocol. The vitrification protocol was performed using two different vitrification solution concentrations and the thawing protocol was performed in three steps. Three hours after thawing the oocytes was submitted to ICSI and 72 hours later the embryos was transferred Results: After thawing, 215 oocytes (83.3%) survived. ICSI was performed in 214 oocytes. After 72 hours, we have 164 (76.6%) embryos, 99 (63.5%) were top embryos. The pregnancy rate was 24.5%, resulting in 13, patients pregnant. Conclusion: The vitrification protocol used same to be a good option due to the high survival and fertilization rates after ICSI. Despite that, this protocol is an efficient alternative, fast and economical. Key words: oocytes, vitrification, survival. INTRODUCAO Com 0 surgimento da Reprodugdo Assistida em 1979, nasceu também a necessidade de criopreservar game- tas e embrides. A criopreservacéo de espermatozdides teve sucesso rapidamente, devido ao pequeno tamanho da célula, entretanto, 0 mesmo néio ocorreu com oéci- tos e embrides. Na década de 80, haviam pesquisadores desenvolvendo metodologias de criopreservaco com a utilizagdo de substancias crioprotetoras. O uso de tais substncias permitiu que protocolos de congelamento lento fossem utilizados com sucesso na time década em embrides humanos e tém sido utllizados até agora. Porém, 0 mesmo protocolo néo tem trazido resultados Copyright - Tacos os direitos reservados a SBRA - Sociedade Brasileira de Reprodugéo Assistdapositivos quando aplicado aos odcitos. Alguns autores comesaram a analisar os danos causa~ dos nos odcitos por este pracesso. Chen e colaboradores (2003) relataram que as diferencas entre os embrides e oscitos estavam na permeabilidade da membrana plas- matica, na presenca de granulos corticais e no fuso na metéfase II nos odcitos. Ruffing e colaboradores (1993) relataram que 0 baixo coeficiente de permeabilidade da membrana plasmética dificulta a entrada das subst&ncias crioprotetoras a0 mesmo tempo em que altas taxes de lipideos intra-citoplasméticos incrementam os cristais de gelo tornando os oécites mais sensiveis ao congela~ mento que os embrides. Apés a fecundacdo 0 aumento do calcio livre no citoplasma aumenta a permeabilida- de da membrana plasmatica melhorando 0 transite do crloprotetor e diminuindo a formacao de cristais de gelo nos embrides (Gook et al., 1993; Fabri et al., 2000). Na metéfase IT 0s fusos esto em forma de barril, e 0s micro- tébulos de dimeros de tubulina alfa e beta sao facilmente afetados pelos cristais de gelo diminuindo sensivelmente a viabilidade dos odcites (Zhou et al. (2002). Alguns pesqui- sadores preconizaram a criopreservacdo dos oécitos com vesicula germinal acreditando que os resultados fossern melhores, porém foram similares (Agca & Peter, 1997). No final da década de 90 varios autores concordaram que as necessidades dos adcitos se resumiam em um proto- colo que fosse com grande velocidade de resfriamento e aquecimento em reduzido tempo de exposicao e pequeno volume de crioprotetor. (Bos-Mikich et a/., 1995; Fuku & Downey, 1995; Saha et al., 1994; Vajta ef al, 1996). A partir do modelo desenvolvido por Vatja com open pulled straw (OPS) relatando sucesso com embrides bovinos no processo de vitrificagio, varios pesquisado- res desenvolveram novos métodos que tem sido aplicado com sucesso (Vajta et a/., 1998). © proceso de vitrifi- cage que compreende a exposicio em altas taxas de concentragdes de crioprotetores por muito pouco tempo tem sido relatado com sucesso por varios autores tanto em animais como em humanos (Fuku et ai., 1995; Vaita & Nagy, 2006). A partir destas pesquisas desenvolvemos um meétodo pratico de baixo custo e com altas taxas de recuperago de oécitos e embriges. MATERIAIS E METODOS Este estudo envolveu pacientes com idade entre 23 a 45 ‘anos, que se submeteram ao tratamento pela fertliza- «80 in-vitro, e tiveram mais que seis oécitos apés puncéo folicular. A inclusdo das pacientes no estudo ocorreu apés avaliagao propedéutica de rotina € com consentimento informado prévio. {As pacientes foram submetidas & hiperestimulacgo ovaria- 1a pelo protocolo longo. Na fase litea média foi iniciado 0 uso de acetato de leuprolide (Lupron Abbott ~ Brasil) com aplicagdes subcuténeas de 0.15 ml. No segundo dia da menstruagio foi reduzida a dose de acetato de leuprolide para 0.05 mi/de iniciado estimulo com FSH recombinan- te (Gonal ~ Serono ~ Brasil). O crescimento folicular fol monitorado somente por ultra-som endovaginal. Gona~ dotrofina coriénica humana (HCG 10.000 1U, Choriomom = Meisler - Brasil) foi aéministrada quando 3 folfculos Vitri-ingé: Um Novo Protocolo De Vitrificaco - Fachini F.C, et al com 20 mm de diémetro eram observados. ‘A pungabo folicular foi realizada 36 horas apés a adminis tracdo do HCG usando ultra-som transvaginal. Depois da ‘captaco 05 odcites foram cultivados em meio GV (Inga med, Maringé-Brasil) suplementado com 10% de soro sintético substitute (SSS; Irvine Scientific, Santa Ana- CA-USA) em 5% de CO2 € 37°C. Uma a duas horas apés ‘a puncéo folicular, 08 oécitos foram colocados em hialu ronidase (Irvine Scientific, Santa Ana-California) para retirada das células do cumullus. Seis oécites maturos (metéfase I1) eram separados para a fertilizagio in-vitro ou ICSI € 0 restante dos oécitos era vitrificado. Foram vitrificados somente oécitos em metsfase IL Duas horas apés a coleta era avaliada a maturidade oocitéria € comegava-se 0 procedimento de vitrificacéo. Inicialmente os oocitos eram transferidos para a solugéo de equilibrio VI-1 (Ingémed, Maringé-Brasil) que contém 7,5% de etilenoglicol e 7,5% de dimetilsulf6xido. Os oéci- tos eram equilibrados nessa solucdo por 5-15 minutos. ‘Ap6s este tempo, cada oécito era colocado em trés gotas de 20u1 de solugéo de vitrificacgo permanecendo por 15 segundos em cada gota. 0 tempo que 0 oécito permane- cia na solucdo VII até a imersio da haste no nitrogénio no excedia 60 segundos. A soluco de vitrificagdo VI-2 (Ingémed, Maringé-Brasil) era constituida de 15% de etilenoglicol € 15% de dimetilsulféxido e sacarose 0,5M. 0s ofcitos foram entao colocados na haste de vitrificagao Vitri-inga (Ingamed, MaringS-Brasil), aparato que consis te em uma haste de polipropileno com uma extremida- de muito fina (0.7 mm de espessura) conectada a outra extremidade mais grossa (Figura 1). Os oécitos foram depositados na haste, com 0 minimo volume de solugio de vitrificagio, e entéo imediatamente imersos em nitro- génio liquide. Quando uma quantidade maior que 1 pil de soluco era depositada com os odcitos sobre a haste, 0 ‘excesso de liquide era aspirado. Para estocager segura a haste foi coberta com um prote- tor pléstico. Os protetores plésticos eram primelramente resfriados no equipamento Vitri-Eouip (Ingémed, Maringd~ Brasil). Posteriormente eram colocados verticalmente ness mesmo equipamento, totalmente mergulhados no nitrogé- nio liquido para receber as hastes contendo os oécitos. Para 0 aquecimento dos adcitos, imediatamente apés a retirada do tubo pléstico protetor da haste Vitri-Ingé, a parte mais fina desta era totalmente imersa na solugio de aquecimento contendo sacarose 1M (DV-I, Ingdmed, Maringé-Brasil) @ 37°C por 1 minuto, Os oécitos coleta- dos foram transferidos para solucdo diluente de sacero- se 0,5M (DV-II, Ingémed, Maringé-Brasil) por 3 minutos & temperatura ambiente, e entdo lavados em solucéo tampao (DV-III, Ingémed, Maringé-Brasil) por 2 vezes, 5 minutos cada, ‘Ap6s 0 aquecimento dos odcitos, a avallacdo da sobrevi- da foi realizada através do critério morfolégico. A sobre- vida dos oécitos foi definida pela re-expansdo do mesmo, tendo mantido membrana celular intacta, ooplasma normal e zona peliicida, bem como 0 espaco perivitelinico de tamanho normal. Nos odcitos que sobreviveram, 3 horas apés o aqueci- mento era realizada 0 ICSI. A fertilizacdo foi avaliada JBRA - Jornal Brasileiro de Reproducdo Assistida | V. 12 | n04 | Outubro-Novembro-Dezembro / 2008[Actigo Original aproximadamente 17-19 hores apés ICSI, e os pré- embrides mantidos em meio de cultura GV ( ingémed, Maringé-Brasil) suplementado com 10% de SSS, sob mistura gasosa (5% de CO,, 5% de 0, e 90% de N,). 0 desenvolvimento embriondrio foi avaliado no dia 3, quan- do a transferéncia foi realizada quiada pelo ultra-som. A gravidez fol observada pela presenca de gestacio vidvel e batimento cardiaco presentes apés a 13° semane pés- tranferéncia. RESULTADOS No presente estudo, 54 pacientes tiveram odcitos vitrif= cados, excedentes do ciclo de fertilizacdo in-vitro, ao qual foram submetidas. Todas as pacientes tiveram transfe~ réncia de embrides no ciclo de fertilizacéo in-vitro com oécitos frescos, mas no engravidaram. Os oécitos exce- dentes vitrificados somaram um total de 258 oécitos que posteriormente foram aquecidos para nova tentativa de fertlizagao in-vitro e transferéncia embrionéria: Dos oécitos aquecidos, 215 sobreviveram (83%) destes 214 foram submetides ao ICSI. Um oécito néo teve quali- dade suficiente para ser injetado. Dos oécitos injetados, 164 fertilizaram (76,6%) e desenvolveram embrides. Destes, 99 eram graus I e II (63,5%) segundo a classi- ficagdo da Rede Latino Americana de Reproducio Assis tida. Treze pacientes tornaram-se grévidas apés a trans- feréncia embrionaria (24,5%) e ndo houve nenhum caso de aborto (tabela 1) Tabela I. Resultados apés vitrificagdo e aquecimento de écitos em metéfase I Taxa (%) Ciclos 54 dade (média * OP) 37,447,3 écitos vitrificados 258 Oécitos desvitrifcedos 258 100 Oécitos sobreviveram 21s 83 ‘No sobreviveram 43 18,8 Oécitos ICSI aie 80,5 Oécitos fertlizados 184 76,6 No fertlizados 50 271 Embrides graus 1 € 11 99 63,5 Gestagio on-going 13 24,5 DISCUSSAO Pesquisas com vitrificacéo de embrides e principalmente: odcitos animais tém levado a formulacao de novas idéias € 2 resultados bastante promissores em relacdo a taxas de gravidez. Muitos problemas biolégicos e principalmen- te técnicos quanto vitrificacao tém sido eliminados € estdo sendo resolvidos. Os protocolos de vitrificagdo sao potencialmente nocives devido & elevada concentracao de crioprotetores. Melhorias nos protocolos de vitrifica- cdo tém introduzido misturas de dois ou mais crioproteto- res tentando diminuir os efeitos toxicos, além de reduzir 0 tempo e temperatura de expasicao a esses crioprotetores. Grafico I. Avaliacéo dos resultados da técnica de vitrficagao ] | | | | | taxa de embrides rau tel taxa de sobrevida taxa de fertiizagao Tem sido sugerido que a sobrevida de odcitos vitrifica- dos ndo depende somente da concentragio dos criopro- tetores em soluco, mas também da velocidade na qual eles s8o criopreservados e aquecidos. Este cuidado tem como objetivo evitar a formacdo de cristais de gelo. Para aumentar a velocidade do resfriamento tem-se tentado diminuir 0 volume de soluc&o de congelamento a qual 08 oécitos ou embrides seriam vitrificados utilizando-se Vérios tipos de aparatos. © ponto principal na obtenco de bons resultados com a vitrificacéo é 0 aparato usado, que forneca a possibilidade de vitrificar 0 embrido em um volume de liquide muito pequeno e permita que 0 procedimento seja realizado com bastante rapidez. As primeiras tentativas de vitri- ficagdo utilizando palhetas de 0,25 ml, as mesmas utili- zadas em congelamento lento de embries, no obtive- ram sucesso. A primeira gravidez obtida por Kuleshova et al. (1999) pela vitrificago utilizou uma palheta plastica puxada até ficar bem fina (OPS), técnica utilizada ante- riormente por Vajta et al. (1898) em embrides bovinos. ‘Atualmente, os principios do OPS so usados em muitas versdes, super-finos OPS (Isachenko et af., 2000), micro- pipetas de vidro (Kong et a/., 2000), pipetas de denudacao flexivels (Liebermann et al., 2002), micropipetas plasticas de diémetro fino (Cremades et al., 2004, Hredzak et al., 2005). As versées mais recentes do OPS no conseguem reproduzir bons resultados devido a dificuldade de mani pulacao deste principalmente durante 0 aquecimento. Os primeiros aparatos utilizados com sucesso na vitri- ficacdo foram sistemas fechados a exemplo do que era feito no congelamento lento, sem contato direto com 0 liquido nitrogénic, Uma abordagem mais recente quanto a0 uso de volume minimo € 0 “cryotop’, onde se utiliza uma pequena haste de prolipropileno composta de um filme fino soldado a um cabo pldstico com capa protetora (Kuwayama and Kato, 2000; Kuwayama et a/., 2005 a; b). Neste método os odcitos devem ser mantidos sobre o filme, a solucao excedente deve ser removida por aspiragio, e a amos- tra imersa diretamente no nitrogénio liquide. 0 méto- do é facil de ser realizado € as taxas de sobrevida so maiores que aquelas encontradas com OFS. Kuwayama et al. (2005) relataram 41 % de gravidez, 12 pacientes grdvidas apés a transferéncia de 29 embrides originedos JBRA - Jornal Brasileiro de Repraducio Assistida | V. 12 | n°4 | Outubro-Novembro-Dezembro / 2008de oécitos vitrficados-aquecidos, com taxas de sobrevida em torno de 90%. Os resultados parecem demonstrar que a técnica é mais eficiente que outros métodos apre- sentados até o momento. A utilizago do Cryotop levanta 0 problema quanto & possivel contaminacdo com o liquido nitrogénio, que provavelmente 0 mais forte argumento quanto ao seu Uso especialmente em humanos. 0 risco de 0 nitrogé- nio transmitir doencas existe, entretanto, ndo hé casos documentados de transmisséo de doencas relacionada a transferéncia de embriées (frescos ou congelados). Os poucos casos publicados aconteceram com amostras de sangue congeladas, que tem volumes 103 a 104 vezes maiores que amostras congeladas para embriologia. Para rminimizar 0 risco de contaminacéo tem-se utilizado nitro~ génio "virgem” nos procedimentos de vitrficacao, entre- tanto, uma outra op¢io, na tentativa eliminar o risco de transmissdo de doengas seria 0 uso de nitrogénio filtrado com filtro de 0,22 um Acreditando que a técnica com 0 “Cryotop” leve a metho- res resultados, mas com dificuldade da obtencdo de aparatos comercials desse tipo, foi criado 0 Vitri-Ingd, © qual foi utilizado nos procedimentos de vitrificagso relatados nesse estudo. Na realidade este aparato util- za um pouco do principio de uma outra abordagem, *o Cryoleop’, que consiste em uma pequena alca de nylon preso a um suporte e equipado com um protetor. 0 filme de solugo que se forma em torno do orifcio da alga é forte o suficiente para manter 0 odcito ou embrigo e com esse volume minimo de solucdo as taxes de resfriamento podem ser extremante maiores (Isachenko et al., 2003). No Vitri-Ingé hd um pequeno orificio onde o oécito ou embrigo fica suspenso com um volume muito pequeno de liquido. O aparato usado é importante principalmente durante 0 aquecimento. © método de vitriticacéo proposto e estudado parece ser uma boa opsao devido as altas taxas de sobrevida e ferti- lizagéo apés ICSI (Gréfico 1). Os resultados obtidos neste estudo demonstram o potencial da vitrficagdo no sucesso da criopreservagio de odcitos. © sucesso dessa técnica além de resolver os problemas legais e éticos associados as técnicas de congelamento de embrides, oferece uma oportunidade pare estender a capacidade reprodutiva Correspondéncia: Carlos Gilberto Aimodin ‘Av. XV de Novembro, 1232 - Maringa - PR CEP: 87.013-230 Fone: (44) 3224-3992 Fax: 55 (44) 225-1162 E-mail: almodin@materbaby.com.br Referéncias Bibliograficas ‘Agca Y, Llu 3, Peter AT. Cryoprotectant and water permeability fof immature and in vitro matured bovine oocytes. 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