Vitrificação

Vitrificação ee Reprodução
Reprodução
Assistida: uma
Assistida: uma revolução
revolução ??

Carlos Gilberto Almodin

Congelamento
Histórico

• Sobrevida embriões camundongo -

Whittinghan 1972
• Congelamento embrião humano - lento
Trouson & Mohr 1983 embriões 4/8 cels
Congelamento lento – embriões humanos
Histórico

Estágio de Sobrevida/ Gravidez clínica/ Implantação/

transferência descongelamento transferência (%) no. transferidos
(%) (%)
Embriões pró- 1101/1441 (76,4) 99/235 (42,1) 170/997 (17,10)
núcleo

Embriões divididos 1646/2093 (78,6) 153 /409 (37,4) 231/1516 (15,2)

Blastocistos 196/254 (77,2) 52/81 (64,2) 67/174 (38,5)

Resultados de 1995 – 2002 Veeck LL RBMOnLine 6:367-74

Criopreservação de oócitos
Histórico- Importância

• Casos de comprometimento da reserva ovariana –

tratamento para doenças malignas, falha ovariana
prematura
• Problemas éticos relacionados à criopreservação de
embriões em FIV-ET
• Síndrome de hiperestimulação ovariana
• Banco de oócitos - doação
• Aumento no sucesso dos resultados de FIV-ET – nova
tentativa
Criopreservação
Criopreservação de
de oócitos:
oócitos:
Histórico
Histórico -- Dificuldades
Dificuldades

Oócitos
• Características membrana plasmática
• Presença de grânulos corticais
• Fusos na metáfase II
Chen et al.,2003
Vitrificação
Vitrificação
Histórico
Histórico -- Dificuldades
Dificuldades

Criopreservação de Oócitos
• Baixo coeficiente de permeabilidade
• Alta concentração de lipídeos cristais gelo
• Alta sensibilidade ao congelamento
Parks & Ruffing, 1992
Vitrificação
Vitrificação
Histórico
Histórico -- Dificuldades
Dificuldades

Oócitos - Embriões
• Menor superfície/volume dificulta desidratação
Fabbri et al.,2000

• Fecundação - Ca livre citoplasma - Permeável

Gook et al., 1993

• Melhor transito crioprotetor e água

• Diminuição da formação cristais de gelo
Gook et al., 1993
Vitrificação
Vitrificação
Histórico
Histórico -- Dificuldades
Dificuldades

Oócitos – Metáfase II
• Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e beta
Zhou et al., 2002

• Cromossomos aos pares em forma de barril

Maro et al., 1986

• Crioprotetor – alteração dos fusos - viabilidade

Chen et al., 2000

• Vesicula germinal – menor condutividade hídrica

Agca et al., 1997
Vitrificação
Histórico - Necessidade

Criopreservação de oócitos

• Grande velocidade de resfriamento e reaquecimento

• Reduzido tempo de exposição

• Pequeno volume de crioprotetor

Vitrificação
Sucesso

• Capacidade de permeação CP
• Concentração dos CPs
• Tempo de exposição aos CPs
• Volume da solução
• Impede formação cristais de gelo
• Não provoca lesão osmótica ou toxica

Rall & Fahy, 1985

Vitrificação - Definição

“Vitrificação é a solidificação de uma solução em baixa

temperatura sem a formação de cristais de gelo”
Vatja G, 2000
Vitrificação
Definição – Como ocorre

O fenômeno é obtido com o aumento

extremo da viscosidade, associando grande
velocidade de resfriamento e o uso de soluções
crioprotetoras que impeçam a formação de
cristais de gelo.
 Congelamento Vitrificação
Lento
Cristais de gelo ++++ / ++ -
Resfriamento ++++ -/+
Toxicidade ++ ++++
Efeitos osmóticos ++ ++++
Problemas Mecânicos +++ +

Equipamento ++++ - / ++
Habilidade ++ ++
Velocidade ++ ++++

Contaminação + + / ++++
Avanço da criopreservação
nos últimos 30 anos

Potencial

lento vit
Décadas

`70 ‘80 ‘90 ‘00

Porque algumas pessoas
preferem congelamento lento
1. Educação conservadora
2. Congelamento lento leva a bons resultados
com criopreservação de embriões
3. Congelamento lento traz resultados
satisfatórios na criopreservação de oócitos
3. Vitrificação não tem uma única técnica
padronizada
4. Empresas não estão interessadas
Vitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápido

•Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)

• Procedimentos simples e eficientes
• Alta (CPAs) permeação celular
• - Solidificação sem formação de gelo
• Sólido contém distribuição iônica normal de estado líquido
• - viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”
• Nenhum equipamento $ especial é requerido
• Todo o custo é baixo
 •Vitrificaçaõ: Embriões Humanos
Autor Ano CPAs/ equipamento Estágio Resultados
Mukaida et al. 1998 EG, ficoll, D2-3 (4-8 c) Nascimento 1
sacarose/straw
Lane et al. 1999 EG, DMSO, ficoll, D6 spares Sobrevida pós
sacarose/cryolop descongel.

Choi et al. 2000 EG, sacarose/ EM grid D5-6 Nascimento 7

Yokota et al. 2000 EG, DMSO/straw D5 Gravidez

Yokota et al. 2001 EG, DMSO/straw D5 Nascimento
Mukaida et al 2001 EG, ficoll, sacarose/ D5 Nascimento
cryoloop

El-Danasouri et al. 2001 EG, sacarose/OPS D3 (6-8 c) Nascimento

Selman et al. 2002 EG, sacarose/OPS D1 zigoto Gravidez

Liebermann et al. 2002 EG, sacarose/ flexipet D1 zigoto Dev. Blast.

Vanderzwalmen et al. 2002 EG, ficoll, D 4-5, w/artificial Gravidez
sacarose/straw redução da
blastocele
 Vitrificação: Oócitos Humanos
Autor Ano CPAs/ Estágio Resultados
instrumento
Pensis et al. 1989 DMSO, PROH, MII Sobrevida pós-
sacarose/straw descongelamento
Hunter et al. 1995 DMSO, PROH, MII Fert., desenvolvimento
EG/straw
Hong et al. 1999 EG, sacarose/ EM GV/MII Sobrevida, formação de
grid blastocisto
Kuleshova et al. 1999 EG, sacarose / MII Nascimento (1)
OPS
Chung et al. 2000 EG, sacarose/ grid GV/ MI Blast., cromossomos normais
Yoon et al 2000 EG, sacarose/ EM MII Nascimento (3)
grid
Wu et al. 2001 EG, sacarose/ EM GV Gravidez bioquímica
grid
Chen et al. 2001 EG, sacarose/ MII Sobrevida, fertilização,
straw clivagem
Yoon et al. 2002 EG, sacarose/ EM MII Sobrevida, fertilização,
grid clivagem, PR (21%) IR
(6,4%), nascimento 7
Esforços para melhorar a
vitrificação

• 1985 -1997 decréscimo da toxicidade de

crioprotetores
• 1996 – aumento das taxas de
congelamento e resfriamento
• 1999 – busca de equipamentos
apropriados
 Vitrificação
Vitrificação
Sucesso
Sucesso

O aumento da velocidade de resfriamento reduziu os

danos produzidos pelas gotas lipídicas intracelulares,
principalmente as contidas nas membranas e no
citoesqueleto, por atravessar mais rapidamente as faixas
críticas (+15°C a –5°C) de temperatura

Dobrinski, 1996;Martino, 1996b; Isachenko, 1998; Zeron, 1999

 Métodos de vitrificação

•Desidratação em 2 passos antes da vitrificação

• Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.
• Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 seg.
• Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:
Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop (mínimo
volume no congelamento), Cryotip (straw puxado e fechado), Vitri-
Ingá
• Mergulhados diretamente no nitrogênio líquido
• Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com decréscimo da
concentração de sacarose.
•Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)
•Solução de diluição (0,5 M de sacarose)
•Solução de lavagem (não sacarose)
 Vitrificação
Vitrificação
vitrificação está baseada no contato direto da solução
crioprotetora com o nitrogênio
nitrogênio líquido

•A taxa de resfriamento calculada:

14.000 a 24.000°C/minuto - Martino, 1996b; Arav, 1997

20.000°C/minuto por Vajta et al., 1997 (OPS), Mezzalira et al.,

1999 (vidro), Lane et al., 1999 (cryoloop), Matsumoto et al.,
2001(nylon mesh)
 Velocidade de resfriamento

20000

Taxa de

resfriamento
°C/min
2000

Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Vitri-ingá

Método de Volume de Taxa de Taxa de
vitrificação solução (ul) congelamento aquecimento
(C/min) (C/min)
Straw 25.0 4460 1300
OPS 1.5 16340 13900
Cryotop/ <0.1 22800 42100
Vitri-ingá

Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005

Desenvolvimento de oócitos
bovinos depois da vitrificação

Método No. de oócitos No (%) com No (%) Desenvolvimento

Morfologia clivados a blastocisto
normal
Straw 152 144 (94.7) 60 (39.5) 8 (5.3)
OPS 149 143 (96.0) 71 (47.7) 11 (7.4)
Cryotop 153 148 (96.7) 91 (59.5) 35 (22.9)
Controle fresco 152 - 118 (77.6) 68 (44.7)

Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005

Vitri-ingá 100 86 (86.0) 32 (37,0)

JBRA 12:20-3,2008
 Gestação 2009

Procedimento Gravidez Gravidez Gravidez Aborto

total clínica química
Descongelamento 50,0% 50,0% 0,0% 0,0%
de embriões
Descongelamento 39,3% 10,7% 10,7% 17,9%
de oócitos
FIV 56,6% 45,3% 3,8% 7,5%
ICSI 56,3% 40,6% 9,4% 6,3%
ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%
 Gestação 2009 < 35 anos

Procedimento Gravidez Gravidez Gravidez Aborto

total clínica química
Descongelamento 75,0% 75,0% 0,0% 0,0%
de embriões
Descongelamento 35,3% 11,8% 0,0% 23,5%
de oócitos
FIV 56,2% 53,1% 0,0% 3,1%
ICSI 59,1% 50,0% 9,1% 0,0%
ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%
 Gestação 2010

Procedimento Gravidez Gravidez Gravidez Aborto

total clínica química
Descongelamento 20,0% 20,0% 0,0% 0,0%
de embriões
Descongelamento 58,4% 41,7% 16,7% 0,0%
de oócitos
FIV 55,6% 55,6% 0,0% 0,0%
ICSI 42,9% 33,3% 4,8% 4,8%
ICSI + PESA 28,6% 28,6% 0,0% 0,0%
 Gestação 2010 < 35 anos

Procedimento Gravidez Gravidez Gravidez Aborto

total clínica química
Descongelamento 25,0% 25,0% 0,0% 0,0%
de embriões
Descongelamento 60,0% 40,0% 20,0% 0,0%
de oócitos
FIV 50,0% 50,0% 0,0% 0,0%
ICSI 40,0% 30,0% 0,0% 10,0%
ICSI + PESA 40,0% 40,0% 0,0% 0,0%
 Preparo endometrial
• Embrião
Ciclo espontaneo + sup.Lutea. Prg+Est+Bus

• Oocitos
Neovlar 15 ou mais dias
Lupron 0.15 ml nos 5 ultimos dias do neovlar
Estrofen 2 mg/3d + 4 mg/3d + 6mg/d
Prl 100 mg + Bus no 4° d / Est 6 mg (Endométrio > 7 mm / A)
Aquecimento dia seguinte
Transferencia dia 3 pós aquecimento/ICSI
LANÇAMENTO
Vitrificação e Reprodução
Assistida: uma revolução ?

Sem duvida
OBRIGADO