Veterinria e Zootecnia 108

ISSN 0102-5716 ISSN Eletrnico 2178-3764

SISTEMTICA DE VIGILNCIA PARA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO

MUNICPIO DE BOTUCATU-SP.
Carla Janeiro Coiro1
Mariana Vincenzi2
Ana Paula Lopes Corra3
Felipe de Freitas Guimares3
Helio Langoni2
RESUMO
A leishmaniose visceral canina (LVC) considerada uma endemia de controle prioritrio no
mundo. No Brasil, sua ocorrncia vem aumentando devido principalmente, s alteraes na
estrutura agrria nas ltimas dcadas, como a migrao populacional para os centros urbanos
associada a mudanas ambientais. O municpio de Botucatu situa-se na rota de expanso da
doena em territrio paulista. O presente estudo teve como objetivo desenvolver aes de
vigilncia para a LVC no municpio de Botucatu a partir do diagnstico sorolgico, utilizando a
Reao de Imunofluorescncia Indireta (RIFI) e imunoensaio enzimtico (ELISA), em animais
atendidos no Ambulatrio de Dermatologia da Clnica de Pequenos Animais do Hospital
Veterinrio da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia de Botucatu, UNESP, Campus de
Botucatu. No total, foram examinadas 516 amostras de soro canino com dermatopatias, todas
com suspeita clnica de LVC, entretanto, nenhuma destas apresentou positividade.
Palavras-chave: leishmaniose visceral canina, RIFI, ELISA, sade pblica
SISTEMATIC MONITORING FOR CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS IN THE
CITY OF BOTUCATU/SP.
ABSTRACT
Canine visceral leishmaniasis (CVL) is considered an endemia of priority control worldwide. In
Brazil the incidence of the disease is increasing and expanding quickly due mainly changes in
agrarian structure in recent decades, the great population migration to urban centers and also due
to environmental changes. Botucatu city lies on the route of spread of the disease in Sao Paulo
State. The present study aimed to develop surveillance action for CVL using the indirect
Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) and Enzyme Linked immunosorbent Assay
(ELISA) in animals attended at the Dermatology Ambulatory of Small Animals at the Hospital
of the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science of Botucatu. Were examined 516
canine serum samples from animals with dermatopathies suspected of CVL, however,no sample
was positive.
Keywords: canine visceral leishmaniasis, IFAT, ELISA, public health

1
2
3

Departamento de Doenas Tropicais e Diagnstico por Imagem. Correspondncia. Faculdade de Medicina

UNESP/Botucatu
Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia - UNESP/Botucatu
Doutorando do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia UNESP/Botucatu

Coiro CJ. et al. Sistemtica de vigilncia para leishmaniose visceral canina no municpio de Botucatu-SP. Vet.
e Zootec. 2014 mar.; 21(1): 108-116.

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ISSN 0102-5716 ISSN Eletrnico 2178-3764

EL SEGUIMIENTO SISTEMTICO DE LA LEISHMANIASIS VISCERAL CANINA

EN BOTUCATU/SP.
RESUMEN
Leishmaniasis visceral canina (LVC) es considerada una prioridad en el control de
enfermedades endmicas en todo el mundo. En Brasil, su incidencia est aumentando debido
principalmente a los cambios en la estructura agraria en las ltimas dcadas, como la
migracin de la poblacin hacia los centros urbanos, y los cambios ambientales. Botucatu se
encuentra en la ruta de propagacin de la enfermedad en el territorio estatal. Este estudio tuvo
como objetivo desarrollar actividades de vigilancia de la leishmaniasis visceral canina en
Botucatu mediante ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y imunoensaio enzimtico
(ELISA) en animales de consulta en el Ambulatorio de Dermatologa de la Clnica de
Pequeos Animales del Hospital Veterinrio de la Facultad de Medicina y Zootecnia de
Botucatu, UNESP. Se examinaron 516 muestras de suero canino con enfermedades de piel,
animales con sospecha clnica de LVC, sin embargo, ninguna de las muestras fue positiva.
Palabras clave: leishmaniasis visceral canina, IFI, ELISA, la salud pblica
INTRODUO
A leishmaniose visceral canina (LVC) uma doena infecciosa de origem parasitria,
causada pelo protozorio do gnero Leishmania, transmitida pelo mosquito flebotomneo da
espcie Lutzomyia longipalpis. Tratava-se de doena de carter rural e periurbano, mas
atualmente se encontra urbanizada, presente em grandes centros urbanos. Essa mudana
perceptvel principalmente em reas de periferia devido ao alto adensamento populacional
humano e canino nesses locais (1).
A leishmaniose considerada uma das seis endemias parasitrias no mundo,
encontrando-se distribuda em quatro continentes, entre eles, Amrica Latina, frica, sia e
Europa. Com relao aos casos humanos, 90% ocorrem, principalmente, em Bangladesh,
Brasil, ndia e Sudo (2). Nas Amricas so registrados casos autctones na Argentina,
Bolvia, Colmbia, El Salvador, Guatemala, Honduras, Mxico, Paraguai, Venezuela e Brasil,
correspondendo a 90% dos casos que ocorrem no continente americano (3).
A sua importncia em sade pblica se deve ao aumento do nmero de casos e
gravidade da doena. No Brasil j foi registrada em 20 estados, com aproximadamente 1.600
municpios apresentando transmisso autctone (4), e os estudos de casos humanos e caninos
mostram a urbanizao da forma visceral da doena em grandes centros brasileiros (5). Entre
os anos de 1984 a 2002, foram notificados ao Ministrio da Sade 48.455 casos da doena
humana, sendo que os estados da Bahia, Cear, Maranho e Piau contriburam com 66% das
notificaes (6).
No Estado de So Paulo, a LVC foi diagnosticada em 1998 na cidade de Araatuba
(regio nordeste do estado de So Paulo) no servio de Patologia do Hospital Veterinrio da
Unesp (7). Neste mesmo ano, foram tambm detectados ces infectados no Municpio de
Araatuba (8). At 2006, em 68 municpios das regies administrativas de Araatuba, Bauru,
Marlia, Presidente Prudente e So Joo da Boa Vista encontrou-se o vetor Lutzomyia
longipalpis, e em 45 deles constatou-se a transmisso da enfermidade em ces, e em 34 foram
detectados tambm casos humanos (9). A alta densidade da populao canina um fator de
risco para a ocorrncia da leishmaniose visceral no homem (10).
A reduo dos investimentos em sade e educao, a descontinuidade das aes de
controle, adaptao do vetor aos ambientes modificados pelo homem alm do pouco
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conhecimento sobre as variantes genticas, hbitos alimentares e reprodutivos, os fatores

imunossupressores, como a infeco pelo HIV e dificuldade de seu controle em grandes
aglomerados urbanos, com problemas de desnutrio, condies precrias de moradia e
saneamento bsico so fatores que contribuem para a sua ocorrncia (11).
A LVC apresenta trs ciclos epidemiolgicos: silvestre, domstico e peridomstico. No
domstico ou peridomstico, os ambientes envolvidos so o rural, periurbano e/ou urbano. A
Leishmania circula entre candeos e gambs, que apesar de terem origem silvestre, esto
adaptados ao ambiente rural e urbano (sinantrpicos). O vetor se mantm e consegue
reproduzir no entorno domiciliar, transmitindo a enfermidade para o humanos e ces,
mantendo a infeco (12).
Os sinais clnicos nos ces so semelhantes aos de humanos como febre e
hepatoesplenomegalia. Apresentam ainda leses de pele como eczema no focinho e orelhas,
onicogrifose e linfoadenopatia. Nos casos caninos mais avanados, alm das alteraes de
pele ocorrem tambm uvete anterior, blefarite, celulite orbital, opacidade de crnea,
ceratoconjuntivite seca ou no, conjuntivite, edema das patas e paresia dos membros
posteriores, inanio, caquexia e morte. Entretanto, as alteraes cutneas so as
manifestaes mais comumente observadas na LVC (13). Em alguns animais, a doena pode
permanecer latente, com raros casos de cura espontnea, ou ocorrer evoluo aguda e grave,
com morte em poucas semanas (4).
Na espcie canina, pode haver remisso dos sintomas por longos perodos, com
posterior reaparecimento. Mais de 30% dos hospedeiros so assintomticos, contribuindo para
a manuteno da doena no ambiente (4). Os assintomticos so um grande problema na
sade pblica, pois podem no ser detectados para efetivao das medidas de controle.
O diagnstico laboratorial da infeco canina baseia-se no exame parasitolgico direto,
na reao de imunofluorescncia indireta (RIFI) e no imunoensaio enzimtico (ELISA) e nesta
espcie devem ser realizados inquritos sorolgicos amostrais a fim de se verificar a
prevalncia da doena em locais silenciosos ou com focos da doena, e censitrios, para reas
com transmisso, como atividade de vigilncia, uma vez que animais positivos devem ser
eutanasiados, como uma das medidas para o controle da enfermidade (9).
A RIFI preconizada pelo Ministrio da Sade para avaliao da soroprevalncia,
juntamente com o ELISA. Resultados falso-negativos podem ocorrer no perodo de incubao
da doena ou em fase inicial de soroconverso (14).
Em Itaipu-RJ, foi encontrada uma prevalncia de 11,94% (37/310) para LVC, pela
RIFI, em animais sem sinais clnicos da enfermidade (15). A soroprevalncia canina no
perodo de 1994 a 1998, em Belo Horizonte - MG foi de 3,6% (16). Esses resultados mostram
a importncia dos inquritos soroepidemiolgicos para se avaliar o grau de risco da
enfermidade no municpio, e para a populao.
Inqurito sorolgico e outras atividades de vigilncia estabelecidas pela Equipe de
Vigilncia em Sade Ambiental do Municpio de Botucatu, e pelo Hospital Veterinrio da
FMVZ, com encaminhamento de amostras de soro de ces com dermatopatias para
diagnstico diferencial com pesquisa de anticorpos anti-Leishmania spp., pela RIFI, no
revelou positividade, indicando que provavelmente no h autoctonia da LVC no municpio
(1), mas apenas a ocorrncia de casos importados ou alctones, de outras regies (17).
O controle da leishmaniose visceral recomendado pela Organizao Mundial de Sade
(OMS) desde a dcada de 70 baseado em trs pontos: diagnstico precoce e tratamento dos
casos humanos, eliminao dos ces reservatrios e controle do vetor com aplicao de
inseticidas (18). Ao longo dos anos, a aplicao, muitas vezes, parcial destas aes no
proporcionou a reduo da incidncia da LVC (4). O controle do reservatrio canino tem sido
o tema mais estudado e controverso quanto sua contribuio na reduo da incidncia da LV
humana e canina (19).
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A proximidade de Botucatu com regies endmicas para LVC como Bauru, Marlia,
Araatuba e Tup, associadas s condies climticas e fisiogrficas propicia a manuteno
da doena. A falta de controle quanto ao trnsito de ces de outras localidades, representam
fatores que contribuem para o risco de introduo e disseminao desta zoonose. O controle
da LVC deve ser feito de maneira estratgica, identificando-se reas de risco e, para isso,
alternativas como o inqurito sorolgico canino, baseado em critrios epidemiolgicos, so
indicados para o seu combate e vigilncia (20). A partir da anlise epidemiolgica realizada
no municpio e estado, os profissionais de sade podero identificar e classificar as diferentes
reas e adotar as recomendaes propostas para a vigilncia, monitoramento e controle da
leishmaniose visceral (4).
Os objetivos do presente estudo foram estabelecer aes de vigilncia para LVC em
Botucatu/SP capazes de monitorar a ocorrncia de casos e possibilitar a determinao de sua
distribuio espacial e temporal, alm de obter informaes para auxiliar na elaborao de um
programa de sade animal e sade pblica no Municpio de Botucatu.
MATERIAL E MTODOS
Foram utilizadas amostras de soro de ces suspeitos de LVC no municpio de Botucatu,
provenientes de animais atendidos no Ambulatrio de Dermatologia do Hospital Veterinrio
da FMVZ UNESP, campus de Botucatu/SP, durante o perodo, de Julho de 2008 a Julho de
2009. Estes animais deveriam atender como definio de caso:
Suspeito I: Animal residente em Botucatu que apresentasse pelo menos trs dos
seguintes sintomas: linfadenomegalia, perda de peso, queda de plo, formao de
crostas, reas descamadas ou onicogrifose.
Suspeito II: Animal que apresentasse sorologia positiva pela RIFI e ELISA;
Confirmado: Animal suspeito II com diagnstico parasitolgico positivo, de aspirado
de linfonodo.
Quanto populao canina estudada, 284 (55,03%) e 232 (44,97%) eram machos e
fmeas, respectivamente. Quanto a procedncia 463 (89,72%) nasceram em Botucatu e 14
(26,41%) eram procedentes de So Paulo, 13 (24,52%) de Pardinho, 9 (16,98%) de So
Manuel, 6 (11,32%) de Bauru e 11 (20,75%) sem informao. Quanto a distribuio dos
animais quanto ao local de permanncia no domicilio, 70 (13,56%) no canil, 203 (39,34%) no
domiclio e 243 (47,0%) no peridomiclio.
1- Reao de Imunofluorescncia Indireta
A pesquisa de anticorpos anti Leishmania spp., foi realizada pela RIFI, segundo
Camargo (21). Utilizou-se como antgeno a forma promastigota de L. major, mantida no
Servio de Diagnstico de Zoonoses da FMVZ, em meio LIT (Liver Infusion Tryptose).
2- Ensaio Imunoenzimtico (ELISA)
O teste de ELISA foi realizado utilizando como antgeno Leishmania major, cultivada
em 40 mL de meio LIT, durante sete dias em garrafa de ROUX de um litro, mantida a 25oC na
posio horizontal. O contedo da garrafa foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos em tubo
falcon. O sobrenadante foi desprezado e em sequncia adicionado 10 mL de PBS
homogeneizando e centrifugando-se como anteriormente, repetindo-se essa operao por mais
duas vezes. A seguir, o sedimento foi homogeneizado em 10 mL de PBS estril e congelado a
20oC por 24 horas. As formas promastigotas suspensas foram mantidas a -80oC, at o momento
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da sonicao. Esta foi realizada em ciclo de 50%, a 4oC por 30 segundos por seis vezes,
analisando-se ao microscpio para observar se as formas promastigotas foram quebradas em
pequenos fragmentos. O material obtido foi imediatamente centrifugado a 5000 rpm por 15
minutos sob refrigerao a 40C , e o sobrenadante resultante foi usado como antgeno, no qual foi
adicionado PMSF (Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride) 250 mM, que um inibidor de protease
para a conservao das protenas. O antgeno foi testado com amostras de soro de ces
sabidamente positivos e negativos, para testar sua viabilidade.
Para a sensibilizao das placas de ELISA, de poliestireno, de fundo chato, foram
usados trs microgramas de antgeno por poo totalizando 300 microgramas por placa. As
mesmas foram mantidas em cmara mida sob refrigerao, de um dia para o outro e
posteriormente lavadas quatro vezes com soluo de lavagem. Aps secagem, foram
incubadas com 150 L de PBSC (tampo bloqueio) por uma hora em estufa a 370C. Desprezouse o tampo e a placa foi lavada quatro vezes com soluo de lavagem e seca. Os soros testes
foram diludos em soluo PBSCT a 1:40 (195 L de PBSCT e 5 L de soro). Para a diluio
1:80, foram acrescentados 50 l de PBSCT e 50 L da diluio de 1:40. Da mesma maneira,
foram diludos dois controles positivos e quatro negativos, e dois testemunhos com 100 L de
PBSCT. Aps as diluies, a placa permaneceu na estufa 370C por 30 minutos. Depois foi lavada
quatro vezes com soluo de lavagem para retirada do excesso de soro e secadas. O conjugado
imunoenzimtico usado foi uma antiimunoglobulina de co, frao IgG, marcada com
peroxidase (Sigma-Company USA), previamente titulado. Aps o preenchimento de cada poo
com 100 L da soluo de PBSCT e conjugado, a placa foi incubada por 30 minutos a 37 oC e
em seguida lavadas com soluo de lavagem por quatro vezes. Em seguida foram adicionados
100L de substrato (5mg de O-fenilenodiamino- OPD+ 4L de gua oxigenada a 30% + 10
mL de tampo citrato-fosfato) por orifcio, e a placa mantida no escuro temperatura ambiente
por 10 minutos. A seguir adicionou-se 30 l/orifcio de cido sulfrico (H2SO4) 4N para
interromper a reao. A leitura foi realizada em leitor de ELISA a 492nm. Os resultados foram
expressos em valores de densidade ptica (DO).
O ponto de corte foi calculado de acordo com a frmula: CO= mdia CN X 2 X1,2, onde
CO=Cut-Off; mdia CN = mdia da densidade ptica dos orifcios do controle negativo; 2 =
fator de correo; 1,2 = nmero multiplicado ao valor do cut-off para embutir a zona cinza no
ponto de corte.
RESULTADOS E DISCUSSO
Todas as amostras foram negativas para a pesquisa de anticorpos anti-Leishmania spp., em
ambos os testes (RIFI e ELISA), apesar das alteraes clnicas, de acordo com a tabela 1,
devido a outras enfermidades ou dermatopatias, na medida em que tratavam-se de animais
atendidos no Ambulatrio de Dermatologia do HV.
Os resultados do inqurito sorolgico sugerem que o municpio de Botucatu continua
indene para LVC, o que j foi demonstrado em pesquisa prvia (1). Apesar dos animais
apresentarem alteraes sugestivas de LVC nenhum foi positivo nos testes utilizados, que so
recomendados oficialmente. Enfatiza-se que casos importados de LVC j foram
diagnosticados no Hospital Veterinrio da FMVZ- Botucatu (4), justificando-se a importncia
das aes de vigilncia epidemiolgica e sanitrias referentes a esta enfermidade no
municpio.
Os resultados deste estudo possibilitam tambm sugerir que at o momento do presente
estudo o vetor, Lutzomyia longipalpis, no se encontra no municpio. Especula-se que
condies climticas, altitude ou outros fatores ambientais sejam desfavorveis para a sua
manuteno, ao se considerar a proximidade de Botucatu com municpios endmicos e
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epidmicos, e o diagnstico de casos importados em ces que residiam em Botucatu h algum

tempo (4).
No h nenhuma forma de controle quanto ao trnsito de ces possivelmente infectados
entre reas endmicas e no endmicas. A proximidade entre cidades indenes e regies onde a
doena ocorre associada s condies climticas e fisiogrficas propcias manuteno da
enfermidade, e a falta de controle quanto ao trnsito de ces provenientes de outras
localidades, contribui para o risco de introduo e difuso da LVC (22), destacando-se a
importncia de um sistema de vigilncia para a deteco precoce, no caso de sua introduo
no municpio.
A movimentao de ces de um municpio para outro um fator de risco importante na
epidemiologia da LVC. No presente estudo, 53 (10,27%) dos animais eram procedentes de
outros municpios e seis (11,32%) deles procediam de Bauru, onde a enfermidade ocorre de
forma epidmica (9).
Na tabela 1 pode-se observar que muitos animais apresentavam vrios sinais clnicos
que so clssicos na LVC como: onicogrifose, emagrecimento, queda de plos,
hepatoesplenomegalia, entre outros, porm no so especficos podendo ser comuns a outras
enfermidades. A realizao de inquritos sorolgicos caninos (amostrais ou censitrios), alm
de sua funo de controle do reservatrio canino em reas extensas, tem papel fundamental na
deteco de focos silenciosos da doena e na delimitao de regies ou setores de maior
prevalncia, onde a execuo das medidas de controle necessria (23).
Tabela 1. Alteraes encontradas nos animais examinados na clnica de pequenos animais do
Hospital Veterinrio da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia de Botucatu.
Sinais Clnicos
Queda de pelos
Emagrecimento
reas de descamao
Crostas na pele
lceras/ferimentos crnicos na pele
Linfadenomegalia
Onicogrifose
Hepatoesplenomegalia

N
428
423
421
326
299
192
99
89

%
82,94
81,97
81,58
63,17
57,94
37,20
19,18
17,24

Resultados mais prticos quanto ao controle da LVC devero ser obtidos com o
aprimoramento do conhecimento epidemiolgico das caractersticas locais da enfermidade,
especialmente quanto ao papel dos ces, humanos e animais silvestres, como reservatrios,
para a continuidade do ciclo de transmisso da L. chagasi em reas onde as medidas de
controle preconizadas so corretamente executadas (23).
A relevncia dos inquritos soroepidemiolgicos pode ser confirmada, pela anlise da
soroprevalncia da LVC em ces domiciliados na zona urbana de Cuiab com a prevalncia
estimada em quatro bairros estudados de 3,4%. Os autores concluram que os principais fatores de risco
identificados na ocorrncia da infeco canina na cidade de Cuiab, foram localizao dos
ces no peridomiclio, bem como a proximidade das residncias com matas, evidenciando
mudanas na ocorrncia da doena no ambiente urbano (24).
Alm da importncia dos inquritos soroepidemiolgicos so essenciais as atividades de
educao em sade, transmitindo para a populao informaes sobre a doena no co e em
humanos, envolvendo amplamente a comunidade, utilizando-se veculos de comunicao
disponveis, bem como a realizao de palestras em escolas, e entidades de classe enfocando
principalmente os aspectos epidemiolgicos e de controle (1). relevante ainda a utilizao
de coleiras repelentes em ces, principalmente nas situaes com grande disperso dos
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flebotomneos transmissores, sendo importantes ainda os inquritos entomolgicos na

pesquisa de espcies de flebotomneos presentes no municpio.
CONCLUSO
Conclui-se que as aes de vigilncia a partir de inquritos soro epidemiolgicos so
importantes para o conhecimento da situao epidemiolgica da LVC nos municpios e que
apesar do resultado negativo no universo amostral pesquisado, estas aes devem ser
permanentes, pois a Rodovia Marechal Rondon, considerada rota de disperso da LVC no
Estado de So Paulo, contorna grande parte do municpio de Botucatu. Alm disso, a partir
destas aes se torna possvel monitorar a aparecimento de casos de maneira rpida e
eficiente, obtendo desta forma informaes para a elaborao de um programa de sade
animal e sade pblica no Municpio de Botucatu.
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Recebido em: 10/11/2012
Aceito em: 20/03/2013

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