Apostila Mauren

UFT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
PROCEDIMENTOS EM TÉCNICAS
LABORATORIAIS VEGETAIS
Gurupi/2010
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PRECAUÇÕES......................................................................5
PREPARO DE SOLUÇÕES ................................................................7
FÓRMULAS E PROBLEMAS MAIS COMUNS ...............................................................................7

MOLARIDADE (M – G/L)............................................................................................................7
PERCENTUAL (% - G/ML) ..........................................................................................................7
OUTRAS RELAÇÕES ...................................................................................................................7
DILUIÇÕES DE SOLUÇÕES ..........................................................................................................8
SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL.............................9
ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N ................................................................................................9

ÁGUA DEPC 0,1%...............................................................................................................10
ÁGUA LIVRE DE RNASE ..................................................................................................10
CLORETO DE LÍTIO (LICL) 5M......................................................................................10
EDTA 0,5M PH 8.0...............................................................................................................10
EDTA 500 MM; PH 8.0 ........................................................................................................10
FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO (25:24:1)........................................11
GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO) ..............................................11
HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N ......................................................................11
NACL 5M -DEPC .................................................................................................................11
NACL 5M .............................................................................................................................12
RNASE A 10MG/ML............................................................................................................12
SDS 20% ...............................................................................................................................12
TAMPÕES ............................................................................................................................13
TRIS HCL LIVRE DE RNASE....................................................................................................13
TRIS HCL 1M .........................................................................................................................13
SOLUÇÃO T AMPÃO (WASH BUFFER)........................................................................................13
TAE 50X ................................................................................................................................14
TBE 10X ................................................................................................................................14
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TE PH 8.0 ...............................................................................................................................14
TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 1M ............................................................................................14
STE ........................................................................................................................................15
TAMPÃO DE AMOSTRA PARA ELETROFORESE ..........................................................................15
TAMPÃO FOSFATO SALINA- PBS 10X......................................................................................16
FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS ...........................16
MACERAÇÃO ....................................................................................................................16
CENTRIFUGAÇÃO.............................................................................................................16
TIPOS DE CENTRÍFUGAS ...........................................................................................................17
VELOCIDADES DE SEPARAÇÃO DE COMPONENTES ....................................................................18
CENTRIFUGAÇÃO X SOLVENTES ..............................................................................................19
ESPECTROFOTOMETRIA................................................................................................19
ELETROFORESE................................................................................................................21
ELETROFORESE EM GEL ..........................................................................................................22
Gel de Agarose........................................................................................................................23
Gel de Poliacrilamida ..............................................................................................................24
DNA ......................................................................................................................................25
SENTIDO 5’- 3’ .......................................................................................................................28
PROTEÍNAS ........................................................................................................................29
RNA.......................................................................................................................................30
ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.............................................34
NUCLEASES E RIBONUCLEAES.....................................................................................34
NUCLEASES ........................................................................................................................35
Enzimas de restrição tipo II ....................................................................................................36
.......................................................................................................................36
Nuclease Bal 31 ......................................................................................................................36
Nuclease S1 ............................................................................................................................36
Desoxirribonuclease I (DNAse I) .............................................................................................37
Nuclease Microcócica .............................................................................................................37
Exonuclease III .......................................................................................................................38
RIBONUCLEASES ..............................................................................................................38
Ribonuclease A (RNAse A) .....................................................................................................38
Ribonuclease H (RNAse H).....................................................................................................38
Ribonuclease T1......................................................................................................................39
DNA POLIMERASES ..........................................................................................................39
DNA Polimerases DNA – Dependentes...................................................................................39
DNA Polimerase I ..................................................................................................................40
Fragmento Klenow ..................................................................................................................41
T4 DNA Polimerase................................................................................................................42
T7 DNA Polimerase................................................................................................................42
Taq DNA Polimerase ..............................................................................................................42
DNA POLIMERASES RNA – DEPENDENTES .............................................................................43
AMV Transcriptase Reversa ..................................................................................................43
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DNA Polimerase - Independente de Molde ...............................................................................44

RNA POLIMERASES .........................................................................................................44
RNA Polimerases DNA – Dependentes....................................................................................45
RNA Polimerases DNA – Independentes..................................................................................45
Polinucleotídeo Fosforilase ......................................................................................................46
LIGASES .............................................................................................................................46
T4 DNA Ligase.......................................................................................................................46
T4 RNA Ligase.......................................................................................................................47
FOSFATASES E QUINASES ..............................................................................................47
Fosfatases ...............................................................................................................................47
Quinases ................................................................................................................................48
SOLUÇÃO TAMPÃO ..........................................................................................................48
TAMPÃO DE CORRIDA.....................................................................................................49
TAE (TRIS-ACETATO-EDTA) ..........................................................................................49
CTAB 2% .............................................................................................................................49
NACL 5M...............................................................................................................................50
EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0 .........................50
CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL) ........................................50
INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA...................................................................................51
Β -MERCAPTOETANOL 0,2%..................................................................................................51
PVP (POLIVINILPIRROLIDONA) ...................................................................................51
BROMETO DE ETÍDEO.....................................................................................................51
BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO) ............................................................................51
DPEC.....................................................................................................................................52
TRIS- HCL; PH 7,4 ...............................................................................................................52
PROTEÍNA K.......................................................................................................................52
ETANOL OU ISOPROPANOL ...........................................................................................52
ACETATO DE SÓDIO (SAIS) ............................................................................................52
TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS ......................................................53
INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS.....................................................53

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB .........................53
EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO DE DOYLE E DOYLE ................56
MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS ...................59
ESTIMATIVA DE CONCENTRAÇÃO DE DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO ..........................................62
QUANTIFICAÇÃO DE DNA (E RNA) ATRAVÉS DE ESPECTROFOTOMETRIA................................62
ESPECTROFOTOMETRIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE DNA .........................................................63
...........................................................................................................................66
ISOLAMENTO DE DNA PELO MÉTODO TRIZOL ......................................67
QUANTIFICAÇÃO E EXPECTATIVA DE RENDIMENTO DE DNA...................................................69
REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DE ENDONUCLEASE ...........................................................................69
Guia de Solução de Problemas.................................................................................................70
VISUALIZAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO .................................72
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GEL DE ELETROFORESE...........................................................................................................72
....................................................................................................................................74
MULTIPLICAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO.................................75
PRINCÍPIOS DO MÉTODO REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ....................................75
VARIAÇÃO DO PCR ................................................................................................................77
EXTRAÇÃO DE RNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB ...............................78
ISOLAMENTO DE RNA PELO MÉTODO TRIZOL ....................................80
ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS USANDO O MÉTODO TRIZOL ......................88
GEL PARA ELETROFORESE DE PROTEÍNAS .......................................91
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ...............................................91
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS PARA PROTEÍNAS ................................92
MÉTODO COLORIMÉTRICO BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO DE
PROTEÍNA ..........................................................................................................................93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95
PRECAUÇÕES
As precauções a serem seguidas objetivam tanto a biossegurança quanto a eficiência dos

métodos utilizados.
• Sempre usar luvas para manipulação de reagentes.
• Durante extrações de RNA as luvas devem ser trocadas se houver contato com
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superfícies ou material não tratado com DEPC.
• A vidraria deve ser aquecida a 180ºC por no mínimo 8 horas, ou 2 horas a 210ºC.
• Pode-se tratar vidraria e material de plástico com DEPC 0,1%, lavando com água
previamente tratada com DEPC e esterilizando-os em autoclave por 20 min a
121ºC.
• O DEPC é altamente tóxico devendo ser manipulado em capela de exaustão com

luvas, jaleco e óculos de proteção.
• Folhas coletadas para análises devem ser rapidamente congeladas a fim de inibir
ação de RNAses endógenas.
• Fenol, clorofórmio, formaldeído e β-mercaptoetanol são tóxicos e devem ser
manipulados em capela de exaustão com EPIs.
• O brometo de etídeo é mutagênico e moderadamente tóxico. Usar luvas e tomar

cuidado ao retirá-las ou quando for enxaguar as mãos com luvas as luvas ainda
(nunca com os dedos para cima).
• A pipetagem deve ser feita com exatidão, tomando o cuidado com excessos do
lado de fora da ponteira.
• As ponteiras devem ser autoclavadas antes do uso.
• O pó do SDS é irritante. Recomenda-se o uso de máscara.
• O tampão CTAB não dissolve antes de o pH atingir o nível ótimo pedido na

técnica.
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• A solução-tampão do meio para eletroforese de proteínas deve ser

meticulosamente testada quanto ao pH, pois as proteínas são substâncias
anfóteras, isto é, variam a sua carga, positiva ou negativa, em função do pH.
Com um pH alterado a eletroforese pode revelar resultados falsos.
• A luz UV é mutagênica. Usar óculos de proteção e luvas.
• Qualquer substância ou solução deve ser acondicionada com identificação

necessária (nome do composto, pH, molaridade), data e validade.
PREPARO DE SOLUÇÕES
Fórmulas e problemas mais comuns
Molaridade (M – g/L)
Molaridade é a concentração de uma SOLUÇÃO em molar.
1 molar = 1 mol de soluto em 1L de solução final.
1 mol de soluto = soma de todas massas moleculares que compõem o soluto.
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Ex. 1 mol de NaCl = 58,5g (Na = 23g e Cl = 35,5g)

NaCl 1M = 58,5G DE NAcL em 1L de água
58,5g/mol = 58,5MM
MM = massa molar
OBS. 1M de NaCl é muito concentrado, quase saturado, mas a concentração depende da
massa molecular dos compostos da solução.
Percentual (% - g/mL)
Pode ser expresso em m/v (massa/volume), v/v (volume/volume), m/m (massa/massa).

Ex. NaCl 2% = 2g de NaCl em 100mL de solução final.
Para solutos líquidos: ex. Glicerol 10% = 10 mL de glicerol em 100 mL de solução final
( 10 mL de glicerol + 90 mL de água)
Outras Relações
mg/mL,µg/mL
Ex. qualquer solução de 100mL em concentração 10 mg/mL =
1g de soluto em 100 mL de solução final =
1000mg/100mL = 10mg/1mL
0,001g = 1 mg
100g = 0,1 Kg
ppm (partes por milhão)
Usado para soluções muito diluídas:

massa de soluto (mg) = 1 = 10 ppm
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massa de solução (Kg) 0,1
d = massa do soluto (g)

volume da solução (L)
c = massa do soluto (g)

volume da solução (L)
Diluições de Soluções
Para se obter diluições de soluções tem que acrescentar solvente.

Para calcular a relação entre as quantidades de soluto e solvente após a diluição:
Antes da Diluição
Massa de soluto (g) x volume de solução (L)

Volume de solução (L)
Após a Diluição
Massa de soluto (g) x volume de solução (L)

Volume de solução (L)
Ou:
C (g/L)1 x V (L)1 = C (g/L)2 x V (L)2 e

M (mol/L)1 x V (L)1 = M (mol/L)2 x V (L)2
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Exemplo:
Obter álcool etílico 70% a partir de álcool etílico 95%:
Álcool 70% = 700 mL de álcool + 300 mL de água
Para 1L:
315,78 mL de álcool 95% + 684,22 mL de água = 1 L de álcool 30%
95% x V1 = 30% x 1 L
V1 = 0,31578 L = 315,78 mL
1 L – 315,78 mL = 684,22 mL
SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL
ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N
Água destilada 400 mL em béquer

HCL 37% 104,2 mL
Completar o volume até 500 mL com água destilada em proveta
ÁGUA DEPC 0,1%
DEPC 0,5 mL
Água destilada autoclavada por 2 horas 500 mL
Água destilada autoclavada por 2 horas = U.P.A
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ÁGUA LIVRE DE RNASE
Água UPA 500 mL

DEPC 0,5 mL
Reagir por 1 hora
Autoclavar por 30 minutos
CLORETO DE LÍTIO (LICL) 5M
Cloreto de Lítio 2,12 g

Água destilada 10 mL
EDTA 0,5M PH 8.0
EDTA 18,612 g
Água DEPC 70 mL
Ajustar o pH para 8.0 com NaOH
Completar o volume para 100mL com água DEPEC.
EDTA 500 MM; PH 8.0
Na2EDTA.2H2O 186,1 g
Agitar com agitador magnético
Ajustar pH para 8.0 com NaOH, aprox. 20g em pastilhas
Completar o volume para 1L após atingir o pH 8.0.
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FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO (25:24:1)
Clorofórmio 480 mL
Álcool isoamílico 20 mL
Fenol equilibrado 500 mL
GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO)
Agarose 2g
TAE ou TBE 1X 200 mL
Fundir em microondas. Deixar esfriar até 70ºC aprox.
Adicionar brometo de etídio 1% 1 µL
Misturar suavemente.
HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N
NaOH 400 g
Água destilada 1L
NACL 5M -DEPC
NaCl 146 g
Água DEPC q.s.p. 500 mL
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NACL 5M
NaCl 292,2 g
Água destilada q.s.p. 1 L
Esterilizar em autoclave
RNASE A 10MG/ML
RNAse pancreática (RNAse A) 100 mg

Acetato de sódio 10mM; pH 5.2
Ferver por 15 min.Esfriar.
Ajustar pH com 0,1 volume de Tris-HCL 1M; pH 7.4
Dividir em 1 mL
Armazenar a -20ºC.
SDS 20%
SDS 200 g
Banho-maria a 50ºC, no mínimo.
Água destilada q.s.p. 1 L
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TAMPÕES
Tris HCl Livre de RNAse

Estoque
Tris HCl 1,5 M ; pH 8,0 18,1 g
Água DEPC 0,1% 70 mL
Ajustar o pH para 8.0 com HCl
Completar o volume para 100 mL com água DEPC autoclavada após adição de DEPC
0,1% reagindo por 1hora (val: 3 meses 4ºC)
Tris HCl 1M
Tris base 121,1 g

Água destilada (sem DEPC) 800mL
Ajustar o pH desejado com HCl concentrado nas quantidades:
Para pH 7.5 – 70 mL; para pH 7.6 – 60 mL; para pH 8.0 – 42 mL
Obs: 60,55g de tris- 400 mL de água dest.
30,25g de tris – 200 mL de água dest.
Solução Tampão (Wash Buffer)
Tris HCl 1,5M 3,33 mL

EDTA 0,5M 1 mL
NaCl 2M 200 mL
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BSA 0,25g
Completar o volume com água UPA com DEPC (re-autoclavar a água UPA após
adicionar DEPC 0,1% reagindo por 1 hora) até 500mL
TAE 50X
Tris base 242g

Ácido acético glacial 57,1 mL
EDTA 0,5 M; pH 8.0 100 mL
Água destilada q.s.p. 1000 mL
Ajustar o pH da solução de EDTA com NaOH.
Concentração de uso 1X. Estocar à temperatura ambiente.
TBE 10X
Tris base 108 g

Ácido bórico 55 g
EDTA 500 mM; pH 8.0 40 mL
Água destilada q.s.p. 1L
TE pH 8.0
Tris HCl 1M; pH 8.0 1 mL

EDTA 500 mM; pH 8.0 200 µL
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Tampão Fosfato de Sódio 1M
NaH2PO4.H2O 1M 13,8g + água destilada q.s.p. 100 mL

Na2HPO4 1M 14,2g + água destilada q.s.p. 100 mL
Diluir nas seguintes proporções de acordo com o pH desejado:
NaH2PO4.H2 Na2HPO4 pH
53,7 mL 46,3 mL 6.8
42,3 mL 57,7 mL 7.0
22,6 mL 77,4 mL 7.4
15,5 mL 84,5 mL 7.6
10,4 mL 89,6 mL 7.8
STE
NaCl 5M 2 mL
Tris-HCl 1M 1 mL
EDTA 500mM; pH 8.0 200 µL
Tampão de Amostra para Eletroforese
Ficoll tipo 400 ou Glicerol 3g

EDTA 500 mM; pH 8.0 20 µL
Azul de bromofenol 25 mg
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Xilene Cianol FF 25 mg
*Usar água DPEC 0,1% para géis de RNA
Tampão Fosfato Salina- PBS 10X
Na2HPO4 14,4 g
KH2PO4 2,4 g
NaCl 80 g
KCl 2g
Água destilada q.s.p. 1L
Ajustar o pH para 7.4. Esterilizar em autoclave
FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS
MACERAÇÃO
Em cadinhos com nitrogênio líquido: as paredes celulares devem ser rompidas com o
objetivo de liberar os constituintes celulares.
CENTRIFUGAÇÃO
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Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas. A desproteinização é

obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio, pois esses solventes
orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são separadas após centrifugação,
permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo os ácidos nucléicos e
a fase orgânica (inferior).
A centrifugação depende do raio do rotor em cm, do ângulo fixo (tubo inclinado) ou
ângulo variável ou swingout (tubo pêndulo). A força centrífuga relativa (RCF) ou xg
significa quantas vezes uma amostra é acelerada em relação à gravidade na superfície da
Terra (9,8 N/s2 ou 1xg).
A centrifugação é baseada no fato de um movimento circular a uma dada velocidade
angular, resultar uma força(F) que atua sobre a amostra. F é diretamente proporcional ao
raio ® do rotor (em cm) e ao quadrado da velocidade angular (w) em radianos:
F= ω2r ou RCF= ω2r ou w= π (rpm)
980 30
Daí RCF= 1,119.10-5 rpm2r
Como r é diretamente proporcional à RCF, quando o raio aumenta, o RCF aumenta.

No RPM a RFC varia de acordo com o raio que pode variar de acordo com o rotor
usado. Por isso usa-se mais o xg do que o RPM.
No caso de rotores de ângulo fixo, a distância do raio do centro do rotor ao topo ou ao
fundo do tubo com a amostra é distinta. A RCF, então, é maior no fundo do tubo.
No caso de rotores de ângulos pendulares, há um único RCF.
Tipos de centrífugas
Microcentrífugas
0,5 a 1,5 mL de capacidade e até 14000 rpm em segundos.
Centrífugas de média velocidade
São geralmente preparativas. Apresenta vários volumes, aceleração máxima até 20000
rpm e vários tipos de rotores. Pode ser feita a separação de bactérias ou outras células
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do meio de cultura até o fracionamento celular.

Ultracentrífugas
A primeira foi da marca Svedberg e hoje existem as que atingem 60000xg. Podem ser
preparativas para separação de moléculas e/ou partículas ou técnicas analítica para medir
as propriedades físicas de macromoléculas.
Apresenta o rotor em câmara blindada, sistema de alto vácuo para eliminar o atrito com
o ar e o superaquecimento. Possui sistema de refrigeração. Os rotores são em liga de
titânio e o disco na parte inferior do rotor possui uma superfície clara e outra escura para
a leitura óptica por fotocélula que capta o sinal quando o rotor gira e pode desligar a
centrífuga caso haja desbalanceamento dos tubos ou caso a velocidade máxima seja
alterada.
A unidade S de peso para compostos microssomais foi devido à marca Svedberg que
proporcionou tal medida.
É tecnicamente chamado de coeficiente de sedimentação (s): velocidade por unidade de
força. S de uma partícula é a sua velocidade de sedimentação por unidade de campo de
força F.
As unidades Svedberg (S) são expressas em 10-13segundos porque grande parte das
moléculas biológicas sedimenta a velocidades iguais ou superiores a essa.
Ex: albumina sérica: coeficiente de sedimente de 4,5S
Vírus da poliomielite: 150S
Mitocôndria: 15000- 65000S
Ribossomos: 80S
DNA de bacteriófago: T5 50S
tRNA de E. coli: 15 S
tRNA de levedura: 4S
Velocidades de separação de componentes
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Tecido homogeneizado e filtrado

A 2000 xg/10min: fração nuclear
O sobrenadante fica com a fração pós nuclear
Fração pós nuclear a 15000 xg/10min: fração mitocondrial
O sobrenadante fica com a fração pós mitocondrial
Fração pós mitocondrial a 100000xg/60min: fração microssomal
O sobrenadante fica com a fração pós microssomal
Fração pós microssomal a 300000xg/120min: polirribossomos e subunidade de
ribossomos.
O sobrenadante fica com o citossol.
Centrifugação X Solventes
Na centrifugação diferencial usa-se meio aquoso de densidade baixa que separa o solúvel
no sobrenadante.
Na ultra-centrifugação pode ser usado gradiente de densidade para ultra centrifugação
zonal e ultra centrifugação em gradiente de equilíbrio de densidade (isopínica).
Na ultra-centrifugação zonal usa-se um gradiente leve (como a sacarose) preparado com
uma concentração compatível com a do material a ser separado (entre 15% e 50%)
A densidade máxima do meio deve ser inferior á menos densidade das macro-moléculas
de interesse.
Ocorre uma migração das partículas em função de sua massa molecular. A taxa de
migração é fortemente definida pelo coeficiente de sedimentação (s). Ao fim do
procedimento há zonas ou faixas de material separado ao longo do gradiente.
Na ultra-centrifugação zonal uma centrifugação por longo período de tempo pode levar
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à sedimentação não diferenciada.

Na ultra-centrifugação isopínica as espécies analisadas movem-se em um gradiente até
encontrarem um ponto em que sua densidade é equivalente à do meio, sem que se
desloque, pois ela flutua num colchão formado pelo gradiente. Diz-se então que a
partícula/molécula atingiu sua densidade de flutuação (densidade boiante). Mesmo em
uma centrifugação prolongada não há sedimentação por que a concentração do gradiente
é superior à maior densidade das partículas mais pesadas. Por isso para o solvente é
utilizado sal alta massa molecular, como o cloreto de césio. Para separação de moléculas
como ácidos nucléicos (DNA e diferentes espécies de RNA), ribossomos e lisossomos.
ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetro é o aparelho utilizado para quantificação do comprimento de luz
absorvido ou refletido por uma substância.
A cor é a luz resultante de vários comprimentos de onda que foram refletidos, assim,
uma substância que tem a cor vermelha sendo refletida, é por que absorveu a cor azul.
No espectrofotômetro há um prisma que decompõe a luz em vários comprimentos de
onda. Uma fenda deixa passar apenas o comprimento de onde que se quer analisar.
Através dessa fenda a luz atinge a substância colocada dentro de uma cubeta de vidro ou
quartzo. A luz que é refletida do outro lado da cubeta é medida por sua intensidade.
Toda substância tem um padrão de absorção de energia característico. Cada substância
tem um espectro de absorção específico e um comprimento de onda específico com o
qual ocorre um máximo de absorção de luz.
Com esses dados um pesquisador pode saber, por exemplo, se uma amostra de DNA
está ou não contaminada com proteínas, e vice-versa.
Alguns dados relevantes são apresentados a seguir:
dsDNA - 1,0 A260 = 50µg/mL = 0,15 mM/ número de pares de bases
ssDNA – 1,0 A260 = 33µg/mL = 0,10 mM/ número de pares de bases
ssRNA - 1,0 A260 = 40µg/mL = 0,11 mM/ número de pares de bases
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Por exemplo: um fragmento de DNA com 100pb com leitura de A260 = 1,0 – 0,15
mM/100 = 0,0015 = 1,5 nM
1µg de um fragmento de DNA com 1000pb = 1,52 pmol = 9,1 x 1011 moléculas
1µg do plasmídeo pUC19 (2686pb) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 moléculas
1µg do plasmídeo pBR 322(4361pb) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 moléculas
1µg de DNA do bacteriófago M13mp19 (fita dupla com 7249pb na forma) = 0,21 pmol
= 1,3 x 1011 moléculas
1µg de DNA do bacteriófago λ(48502pb) = 0,03 pmol = 1,8 x 1011 moléculas
1 pmol de um fragmento de DNA com 1000pb = 0,66 µg
1 pmol de plasmídeo pUC19 (2686pb) = 1,77 µg
1 pmol do plasmídeo pBR322(4361pb)= 2,88 µg
1pmol de DNA do bacteriófago M13mp19(fita dupla com 7249pb) = 4,78 µg
1pmol de DNA do bacteriófago λ(48502pb) = 32,01
1 Kbp de dNA pode codificar 333 aminoácidos = uma proteína de 37000 Da

10000 Da de proteína = 270 pb
50000 Da de proteína = 1350 pb
ELETROFORESE
A eletroforese é usada para separar partículas moleculares pequenas e visualizá-las com

coloração posterior.
O princípio da eletroforese consiste na separação das partículas por carga elétrica,
através de corrente elétrica imposta em superfície aquosa salina (o sal permite o
transporte de carga elétrica) que está em contato com um meio onde estão depositadas
as partículas. As mais leves chegam ao pólo com carga contrária à sua primeiro que as
partículas com cargas mais pesadas. Lembrando que DNA e RNA possuem carga
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negativa e, portanto, migram para o lado positivo, sempre.

Essas partículas podem ser de DNA, RNA ou proteínas que já foram clivadas em várias
partes. O meio ao qual serão depositadas deve ser sólido ou semi-sólido e não pode
interferir na estrutura da partícula e deve permitir o “deslizamento” para o pólo com
carga contrária à sua. Esse meio pode ser um papel de filtro, sílica em gel, membrana de
acetato de celulose, gel de agarose, gel de amido ou gel de poliacrilamida.
A solução salina também não pode interferir na composição das partículas, por isso é
usada solução-tampão como meio de transporte de elétrons.
Para a visualização das estruturas separadas é necessário recorrer a posterior coloração
do meio, que pode ser revelado a olho nu ou por fluorescência com ajuda de luz
ultravioleta ou quimiluminescência. Dá-se o nome de “banda” às estruturas já separadas.
A direção do pulso elétrico pode ser em sentido único (negativo para positivo) ou em
orientação ortogonal, onde o sentido é alterado para zigue-zague para o caso de
separação de partículas muito grandes. Essa técnica é chamada de eletroforese em gel de
campo pulsado, pois o pulso elétrico é interrompido para mudança de sentido.
Para o sucesso da técnica em sentido único, que é o mais comum, há dois fatores
prioritários a serem seguidos: a voltagem, corrente e potência devem ser constantes, e a
temperatura sob a qual se realiza a eletroforese deve ser monitorada, principalmente no
caso de separação de moléculas de proteínas.
Eletroforese em Gel
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No caso dos meios em gel, as partículas se movimentam dentro dele. Antes da semi-
solidificação é preciso colocar um pente no lugar onde serão depositadas as partículas a
serem separadas, pois no lugar dos dentes do pente formam poços para o depósito das
partículas.
A eletroforese em gel pode ser feita em posição vertical ou horizontal, com um tipo de
gel ou com dois tipos de gel.
O gel é preparado como a gelatina comum, a partir da agarose ou amido ou
poliacrilamida que semi-solidificam em temperaturas mais baixas que 50ºC.
A estrutura do gel depende da sua composição e cada estrutura apresenta uma
porosidade por onde vão transitar as partículas. Alguns géis apresentam uma malha mais
estreita que outros. O que determina que as estruturas de cargas mais leves e pesadas
sejam mais bem separadas. Partículas mais pesadas indicam que os seus tamanhos são
maiores que as partículas de cargas mais leves.
Para ter um parâmetro são usados marcadores moleculares com pesos conhecidos que
migram ao lado das partículas analisadas. Eles devem ter a mesma natureza das
partículas.
O processo de eletroforese pode ser contínuo ou descontínuo. Na composição do gel é
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utilizada uma solução tampão que pode ser a mesma que cobrirá o gel para fazer a
condução elétrica (sistema contínuo) ou pode ser diferente (sistema descontínuo).
No sistema descontínuo há dois tipos de géis: o gel concentrador e o gel separador, que
é usado na técnica para separação de proteínas (gel de poliacrilamida).
A malha do gel de agarose é mais larga que a malha do gel de poliacrilamida, assim, o gel
de agarose permite a passagem, por exemplo, de DNAs com dezenas e até mesmo
centenas de quilobases, mas não diferem no peso de pares de bases específicos. Já o gel
de poliacrilamida pode separar um único par de bases, mas apenas em moléculas com
tamanhos de até algumas centenas de pares de bases. Por isso são usadas as enzimas de
restrição anteriormente à técnica de separação em eletroforese, pois quebram as
partículas em pedaços conhecidos.
Gel de Agarose
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) linear extraído de algas marinhas

que dissolve em água fervente e gelifica quando resfria, formando redes minúsculas.
O diâmetro dos poros da matriz formada é diretamente proporcional à concentração do
polímero utilizado.
Poder de resolução do gel de agarose
Intervalo de tamanho de moléculas de DNA separadas em géis contendo diferentes concentrações de
agarose*
Concentração de agarose no gel (% Faixa de tamanho de DNA dupla fita e
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0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
*Adaptado de Sambrook e Russel, 2001.
Para a visualização do DNA a técnica pode ser acrescentada de brometo de etídeo que é
um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência violeta
quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução de velocidade de
migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.
A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear
(III). A forma I migra mais rápido que a forma III em géis comuns. A forma II é a mais
lenta de todas.
Gel de Poliacrilamida
Usado para técnica de separação de proteínas.

Pode ser usado o SDS (dodecil sulfato de sódio) na composição do gel.
A proteína deve ser previamente desnaturada por aquecimento na presença de
β-mercaptoetanol para romperem as pontes de dissulfeto e os polipeptídeos adquirirem a
carga negativa do SDS.
A migração do complexo SDS-proteína não depende da conformação protéica, mas do
seu tamanho. Na saturação, cerca de 1,4g de SDS é ligado por rama de proteína, o que
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corresponde a uma molécula d SDS para cada dois resíduos de aminoácidos.

O sistema SDS-Page é formado por dois géis diferentes: o gel concentrador e o gel
separador.
O gel concentrador é formado por uma malha de grande porosidade (gel de
poliacrilamida 5%). Tem função de compactar a amostra em um pequeno volume,
depositando-a sobre a superfície - limite do gel separador como uma banda estreita.
O gel separador tem uma malha mais estreita (poliacrilamida a 8-20%) que tem a função
de separar os complexos SDS-proteína em função de suas massas moleculares.
O que permite que a amostra seja compactada para a faixa estreita entre os dois géis é a
diferença de pH entre a constituição do gel e o tampão de corrida utilizado.
O tamanho dos poros diminui com o aumento da relação molar bisacrilamida/acrilamida.
Faixa efetiva de separação de proteínas no sistema SDS-PAGE
Concentração do Gel de Poliacrilamida* Faixa Linear de Separação de Proteínas
15 12-43
10 16-68
7,5 36-94
5,0 57-212
* A relação molar acrilamida/bisacrilamida é de 29;1.adaptado de sambrook&Russel,2001.
Para visualização das bandas de proteínas mergulha-se o gel, após a migração, em

corante comassie-blue ou sais de prata.
DNA
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Em uma amostra normal de DNA espera-se encontrar: Quantidade de (T +C) é sempre

igual à de (A+G).
A quantidade de T é sempre igual à de A e C é sempre igual à de G, mas (A+T) não
precisa ser igual à de G+C).
Essa proporção varia em indivíduos de espécies diferentes, mas é a mesma em tecidos
diferentes do mesmo organismo.
G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA com muito G-C é mais
estável que DNA com muito A-T.
Há um padrão na configuração do DNA:
Adenina e Guanina são moléculas maiores ligadas ao açúcar. Timina e Citosina são
moléculas menores ligadas ao açúcar.
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Cada molécula de açúcar liga-se a um fosfato que se liga a outra molécula de açúcar.
O tamanho da ligação entre açúcar –fosfato – açúcar é de 3.4 A.
O tamanho da ligação entre aprox. 10 grupos de ligações de pares de bases é de 34 A.
Isso muda para aprox. 11 pares de bases em alta concentração de sal ou desidratando o
DNA. “In vivo “ou “in vitro” essa situação pode ocorrer se houver formação de
heterodúplices como DNA-RNAc ou dúplices RNA-RNA.
O giro da fita é pela direita, mas certas seqüências giram para esquerda (zDNA- DNA
zigue-zague).
Segmentos específicos no DNA podem sofrer mudanças de sentido.
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Uma mesma molécula de DNA pode se apresentar sob três formas ou topoisômeros
distintos.
A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear
(III).
Uma bactéria como a E.coli contém aproximadamente 4 milhões de pares de bases em
seu genoma. O genoma humano é composto por aproximadamente 3 bilhões de pares de
bases. A salamandra africana contém cerca de 50 bilhões de pares de bases e o lírio tem
cerca de 250 bilhões de pares de bases.
Em procariotos a maior parte do DNA parece ser codificante, já em eucariotos grande
parte são seqüências repetidas ao longo de todo o genoma (DNA - não codificante).
Sentido 5’- 3’
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O fósforo diéster liga o carbono 5’ ao carbono 3’ do outro açúcar na fita. Quem se liga à
T, G, A ou C é o açúcar, sempre pelo carbono 1’.
A ligação do fósforo diéster e o açúcar se dá no sentido 5’-3’, o que faz com que a
torção da fita fique para a direita.
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PROTEÍNAS
As proteínas são sintetizadas a partir do código genético.
“In vivo”, a ação da síntese de proteínas ocorre nos ribossomos. A primeira etapa para
síntese de proteínas é retransmitir a informação do DNA para os ribossomos. Para isso,
as enzimas celulares sintetizam uma cópia funcional de um gene para levar seu código
genético até os ribossomos. Essa cópia funcional é chamada RNA mensageiro, que é
uma molécula muito parecida com o DNA.
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Em uma segunda etapa os códons do RNAm é associado aos aminoácidos corretos pelo
RNT transportador.
Na terceira etapa, os aminoácidos são ligados para formar uma cadeia protéica. O
ribossomo que é formado de proteínas e RNA executa essa função.
Quando a cadeia protéica termina um sinal de terminação é adicionado à cadeia fazendo
com que o ribossomo não tenha mais como ligar aminoácidos e libere a cadeia formada.
Existem 20 aminoácidos que se combinam para formar milhares de proteínas.
Uma proteína de tamanho médio requer cerca de 1200 bases de seqüências codificante.
Além da combinação entre aminoácidos, as proteínas podem se enovelar tendo uma
característica tridimensional, expondo ligações onde se encaixarão aos receptores com
estrutura química compatível.
RNA
O RNA é formado por nucleotídeos compostos por açúcar, fosfatos e uma das quatro
diferentes bases orgânicas.
O RNA difere química e estruturalmente do DNA.

Diferença química: no lugar do açúcar desoxirribose, o RNA contém ribose e no lugar da
Timina, o RNA contém Uracila.
Diferença estrutural: apesar das bases do RNA também poderem formar pares
complementares, o RNA geralmente é formado por apenas uma única fita de esqueleto
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açúcar-fosfato e bases. Embora seja capaz de parear com fitas simples não forma dupla
hélice.
Síntese do RNAm
Assemelha-se à replicação do DNA.
A dupla hélice de DNA é desenrolada e as bases são expostas. Nucleotídeos que estão
no meio separados se pareiam com os nucleotídeos complementares da fita. A Uracila se
pareia com a Adenina. Ligações fosfodiésteres são formadas entre os nucleotídeos e o
RNAm recém sintetizado possui uma seqüência de bases que é exatamente completar à
fita molde de DNA.
O processo de usar uma fita molde de DNA para criar uma molécula de RNAm
complementar é chamado de transcrição.
Os RNA transportadores e ribossomais não são traduzidos em proteínas.
Diferenças entre transcrição e replicação
Na replicação do DNA ambas as fitas são usadas como molde para geração de duas
novas fitas para duas novas hélices.
Na transcrição, apenas uma fita simples de RNA é produzida e a nova molécula de
RNAm é liberada do molde conforme é sintetizada e a dupla hélice de DNA volta a
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enrolar-se à medida que “solta” a fita de RNAm sintetizada.
Essa síntese só é possível através das RNA polimerase.

Ação da RNA polimerase
A hélice do DNA contém milhões de pares de bases. A RNA polimerase reconhece o
início e o término dos pares de bases que são os constituintes de um gene, e a partir daí
liga os códons complementares e para de ligá-los quando há uma sequencia no DNA que
indica o término do gene.
Essa sequencia de pares de bases no DNA que indica o começo de genes é chamada de
promotor e a que indica o término de genes é o terminador.
RNAt
O ribossomo reconhece o RNAm e o prende na posição adequada para que seus códons
sejam “lidos” corretamente. A tarefa é traduzir o código que o RNAm trás do DNA em
aminoácidos e estes serão agrupados e determinarão a proteína formada.
No RNAt há um anticódon que é o complementar do RNAm que só se liga a uma
sequencia específica de três bases. Na outra extremidade do RNAt está um aminoácido
que é ligado a esse RNAt através de uma enzima, a aminoacil sintetase. Assim o
aminoácido correto correspondente ao códon do RNAm é trazido ao ribossomo e pode
ser ligado à cadeia de aminoácidos em uma sequencia específica que determinará a
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proteína. Esse processo é a tradução.
Tradução em bactérias
No RNAm há sinais, seqüências específicas de bases que têm complemento no
ribossomo de bactérias que fica a 8 e 13 nucleotídeos antes do códon de iniciação
(geralmente esse códon de iniciação em bactérias é o AUG). Essas seqüências são
formadas por 5’GAGG-3’ ou 5’-AGGA-3’. No RNAm também há uma sequencia de
terminação. Não existe um RNAt que se pareie com uma sequencia de terminação. Uma
proteína é a responsável pela terminação da tradução.
Como os sinais de começo e término de uma proteína estão no RNAm, estão também no
DNA. Por isso é importante saber reconhecer os sinais de comando das bactérias que são
os vetores de estudo em Biotecnologia.
ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Enzimas purificadas a partir dos organismos nos quais foram inicialmente identificadas.
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A nomenclatura é feita pelas iniciais desse organismo, incluindo a sua linhagem, e por
algarismos romanos que indicam a ordem em que foi encontrada a cepa. Exemplo: EcoR
I, primeira enzima isolada de Escherichia coli, cepa R.
Para evitar a desnaturação das enzimas numa reação, a concentração de proteína nunca
deve ser inferior a 0,1 mg/mL. A fração V da albumina bovina (BSA) é uma fonte de
proteína neutra para estabilizar a enzima.
Geralmente são classificadas de acordo com os tipos de reações que elas catalisam.
As mais utilizadas são: Nucleases e Ribonucleases, DNA polimerases, RNA
polimerases, Ligases, Fosfatases e quinases.
NUCLEASES E RIBONUCLEAES
Nucleases são responsáveis pela quebra enzimática da ligação fosfodiéster do DNA e às
vezes do RNA também e as ribonucleases são responsáveis pela quebra enzimática da
ligação fosfodiéster do RNA.
As nucleases têm atividade exonucleásicas ou endonucleásica, as ribonucleases têm
atividade endorribonucleásica.
Além de reconhecer diferentes sítios-alvo, as diferentes endonucleases também clivam

em diferentes posições dentro desses sítios. Assim, são produzidas moléculas com
extremidades cegas ou com extremidades 5’ ou 3’coesivas.
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EcoRI cliva as duas fitas do seu sítio de reconhecimento, originando extremidades 5’

coesivas. Essas são chamadas de extremidades coesivas uma vez que aderem
rapidamente a outras moléculas clivadas com a mesma fita, que apresentam extremidades
de fita simples complementares, unindo-se por pareamento de bases.
NUCLEASES
Dentre outras, estão incluídas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição.
Reconhecem pequenas regiões de 4 a 8 pb específicas do DNA, chamadas de sítio de
restrição, e clivam estas regiões em ambas as fitas de DNA.
Levam o termo “restrição” porque algumas enzimas específicas clivam o DNA exógeno
que o bacteriófago implanta na célula bacteriana. Para que essa enzima não clive o
próprio DNA, existem enzimas modificadoras que metilam o DNA endógeno,
modificando o sítio de restrição, impedindo ligação de enzimas clivadoras.
Há enzimas de restrição que clivam o mesmo sítio no DNA, mas que foram isoladas de
microrganismos diferentes, estas são chamadas de isosquizômeros.
As endonucleases de restrição I e III clivam o DNA fora do sítio de especificidade,
enquanto as do tipo II clivam dentro do próprio sítio.
Enzimas de restrição tipo II
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Nuclease Bal 31, Nuclease S1, Desoxirribonuclease I (DNAse I), Nuclease Microcócica,
Exonuclease III.
As enzimas de restrição tipo II têm um padrão de clivagem previsível se for conhecida a
seqüência de DNA analisada. Funcionam reconhecendo uma seqüência palindrômica, isto
é, que possui um duplo eixo rotacional, tendo a mesma seqüência quando lida no sentido
5’- 3’ em ambas as fitas. Por exemplo: 5’- GAATTCC-3’, que é o sítio de restrição da
EcoR I.
Atua melhor em fita dupla de DNA do que em fita simples.
São aplicadas em digestão total ou parcial de DNA para serem clonadas ou em análise de
restrição.
Nuclease Bal 31
São exonucleases 3’- 5’ que remove progressivamente nucleotídeos da extremidade 3’-

OH de DNA fita simples ou DNA fita dupla, mas têm alta especificidade para DNA fita
simples.
São aplicadas na deleção controlada a partir das extremidades de DNA fita dupla e
geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento.
Nuclease S1
São endonucleases de fita simples que atuam melhor em DNA de fita simples do que em
RNA de fita simples.
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São aplicadas para análise de híbridos de DNA-RNA para identificação de íntrons, ma

identificação da seqüência terminal dos transcritos (S1 Nuclease Mapping) e na remoção
de bases salientes para produção de bases abruptas (a diferença está na forma como as
extremidades foram clivadas).
A ação dessa nuclease é interrompida com a adição de EDTA.
Desoxirribonuclease I (DNAse I)
São endonucleases que degradam DNA fita simples ou dupla.

São aplicadas para cortar moléculas de DNA antes de fazer marcação isotópica;
identificam regiões do DNA onde se ligam proteínas; removem DNA em preparações de
RNA; removem moldes de DNA após transcrição in vitro; detecta regiões
transcricionalmente ativas na cromatina.
Nuclease Microcócica
Têm atividade nucleásica não específica sobre DNA e RNA fita simples ou dupla.
São aplicadas para remoção de ácidos nucléicos de extratos celulares e para estudos em
cromatina.
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Exonuclease III
São específicas para DNA fita dupla com terminal 3’-OH, atuando como exonuclease 3’-
5’; removem grupos fosfatos da região 3’ terminal de DNA fita simples e DNA fita dupla
através da ação da parte 3’ fosfatase que apresenta e funciona como endonuclease
atuando assim especificamente para RNA e híbridos DNA-RNA.
São aplicadas como End-labelling de DNA fita dupla que têm extremidades abruptas;
geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento; fazem deleção controlada
de seqüências a partir de extremidades de DNA fita simples ( em conjunto com uma
endonuclease específica para fita simples, como a Nuclease S1) e em técnicas de
mutagênese.
RIBONUCLEASES
Ribonuclease A (RNAse A), Ribonuclease H (RNAse H), Ribonuclease T1.
São usadas para eliminar RNA, ou quando se mapeia, quantifica ou sequencia um RNA.
Para o sequenciamento de RNA é preciso usar uma combinação de RNAses que clivam
em seqüências específicas, como as RNAses T1, U2 e CL3.
Ribonuclease A (RNAse A)
São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres na posição 3’ de uma

pirimidina.
São aplicadas na remoção de preparações de DNA.
Antes de usar essa enzima pela primeira vez, deve-se ferver a solução a 100ºC por
quinze minutos a fim de inativar eventuais contaminações com DNAse.
Ribonuclease H (RNAse H)
São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres de RNA em híbridos DNA-

RNA.
Atenção: estas não degradam RNA fita simples, RNA fita dupla, DNA fita simples nem
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DNA fita dupla.

São aplicadas para eliminar de fita de RNAm após a síntese da primeira fita do DNAc (é
a fita de DNA sintetizada a partir de um molde de RNA – DNA complementar), para
facilitar a síntese da segunda fita de DNAc.
Ribonuclease T1
São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres de RNA após um resíduo G.

São usadas para sequenciamento de RNA, mapeamento e quantificação de moléculas de
RNA por proteção pela nuclease em conjunto com a RNAse A e quantificação de
transcritos feitos por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA sem G.
Dependendo da concentração de NaCl ela atua diferente. Em concentrações de NaCl
entre 0 e 100mM, a ribonuclease T1 cliva RNA de fita dupla, fita simples e a fita de
RNA em heteroduplexes DNA:RNA.
Na concentração de NaCl 0,3M ou acima, atua somente sobre RNA fita simples.
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DNA POLIMERASES
Fazem a duplicação e reparo do DNA nas células vivas.

São agrupadas em três grupos de acordo com o molde (template) que utilizam:
DNA polimerase DNA – dependentes;
DNA polimerases RNA – dependentes;
DNA polimerases independentes de molde.
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DNA Polimerases DNA – Dependentes

DNA polimerases I, fragmentos Klenow, T4 DNA polimerase, T7 DNA polimerase, Taq
DNA polimerase.
Adicionam desoxirribonucleotídeos (dNTP) a uma extremidade 3’-OH de um fragmento
de DNA (ou RNA) que esteja pareado com uma molécula complementar de DNA que
serve como molde. A direção de síntese é sempre no sentido 5’- 3’, a partir da
extremidade 3’-OH do DNA iniciador (primer).
Os fragmentos Klenow
Algumas DNA polimerases tiram nucleotídeos da extremidade 5’ (exonuclease) ou
3’(exonuclease também). Quando ela corta a partir da extremidade 5’, pode ser
aproveitada junto com a DNAse I que corta o DNA de fita dupla para marcar a molécula
pela técnica de nick translation.
Quando a atividade de retirar nucleotídeos a partir da extremidade 5’ é indesejada, trata-
se a DNA polimerase I com uma protease que elimina a porção N- terminal da molécula
que tem atividade de retirada de nucleotídeos.
Por engenharia genética é possível obter o gene de DNA polimerase I truncada
(quebrada) na porção N-terminal. Quando o gene é transcrito, resulta uma polimerase
sem a porção N-terminal que recebe o nome de fragmento grande da DNA polimerase de
E. coli (por ser obtido através deste vetor) ou fragmento Klenow.
Quando a polimerase não se dissocia do DNA molde e adiciona nucleotídeos
continuamente a partir de um primer, diz-se que esse processo é a processividade da
polimerase. A maioria das polimerases tem baixa processividade, sendo uma das
exceções a T7 DNA polimerase que é usada para incorporar milhares de nucleotídeos em
reações de sequenciamento de DNA.
DNA Polimerase I
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Geralmente age adicionando açúcar à ponta 3’ de uma cadeia de nucleotídeos. Tendo

formas de trifosfato de desoxirribonucleotídeos como substrato e energia. A energia para
a ligação vem da própria quebra da ligação do trifosfato, sobrando bifosfato e sendo
adicionado um fosfato.
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase), para isso, requer molde de DNA fita
simples iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’(ação exonucleásica), degradando DNA
fita dupla ou híbridos DNA-RNA a partir da extremidade 5’-PO4, liberando nucleotídeos
5’ fosfatos ou pequenos oligonucleotídeos de até 10 nucleotídeos de tamanho.
Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica) degradando a fita
simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH, o que remove os pareamentos
errados de bases.
É aplicada na marcação de DNA por nick translation e na síntese da segunda fita de
cDNA (em combinação com a RNAse H).
“In vivo” a reação para replicação do DNA pela polimerase I é muito lenta( aprox. 20
nucleotídeos/ seg.) e muito abundante( aprox. 400 moléculas/ célula) e a polimerase I se
dissocia do DNA após a incorporação de 20 a 50 nucleotídeos. Por isso os
pesquisadores desconfiaram que a polimerase I não poderia ser a única responsável pela
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maioria das sínteses de DNA.

Foi descoberto mais tarde que a polimerase III catalisa a síntese de DNA na forquilha da
replicação.
Fragmento Klenow
Age no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples, iniciador
de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH livre
Pode agir retirando nucleotídeos (ação exonucleásica) no sentido 3’-5’, degradando o
DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.
É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente; na
marcação de DNA por random priming; no sequenciamento de DNA pelo método de
terminação de cadeia; na síntese de segunda fita de cDNA; na mutação sítio-dirigida, n
síntese da segunda fita e na produção de sondas de DNA fita simples por primer
extension.
T4 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples e
iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica), degradando
ativamente o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.
Não age retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’.
É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente; na
marcação de DNA fita dupla pela técnica de replacement synthesis; na geração de
subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento e em gap-filling na manutenção
sítio-dirigida.
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T7 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples
iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’(ação exonucleásica) degradando o
DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.
Não retira nucleotídeos no sentido 5’-3’.
É aplicado no sequenciamento de DNA pelo método da terminação em cadeia e na
síntese da segunda fita de DNA.
Esta enzima substitui a Polimerase Klenow quando se deseja mais rapidez e afinidade
pelo molde de DNA.
Há um aversão dessa enzima (Sequenase) que não possui a capacidade de retirada de
nucleotídeos da extremidade 3’-5’, sendo ideal pra o sequenciamento de DNA, pois é
altamente processiva.
Taq DNA Polimerase
Foi isolada de bactéria termófilas.

Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo um molde de DNA fita simples
iniciador de DNA ou RNA cm extremidade 3’-OH.
Pode agir retirando nucleotídeos na extremidade 3’-5’(ação exonucleásica) degradando
DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 5’-PO4.
È aplicado em PCR; sequenciamento da DNA a altas temperaturas e em DNA
footprinting.
Existem outras polimerases termoestáveis no mercado: Bst Polimerase, rTth Polimerase,
Vente Polimerase, Pirostase, Hot Tub.
DNA Polimerases RNA – Dependentes

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AMV Transcriptase reversa

Duplicam genomas baseados em RNA, como o dos retrovírus. Essas enzimas são
empregadas por esses organismos para sintetizar uma cópia de DNA a partir de seus
genomas de RNA. Esta é a chamada transcrição reversa, as enzimas que as promovem
são as Transcriptases Reversas.
Essas enzimas são multifuncionais, mas é mais empregada na síntese de DNA a partir de
um molde de RNAm, tendo como iniciador um oligo (dT).
A fita de DNA que é sintetizada a partir do RNA é chamada cDNA (DNA
complementar).
Também podem polimerizar uma molécula de DNA a partir de um molde de DNA.
AMV Transcriptase Reversa
Age como DNA polimerase 5’-3’requerendo molde de RNA fita simples ou fita dupla e
um iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Não possui atividade exonucleásica.
Pode agir no sentido 5’-3’ e 3’-5’ como exorribonuclease degradando especificamente o
componente de RNA dos híbridos DNA-RNA. Essa atividade é denominada “atividade
tipo RNAse H”
É aplicada para síntese da primeira fita de cDNA; no sequenciamento de DNA pelo
método da terminação de cadeia (sobretudo em moldes ricos em G e C), pois não possui
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atividade exonucleásica 3’-5’; identificação de estruturas secundárias do RNA e

marcação da extremidade 3’ do DNA.
DNA Polimerase - Independente de Molde
Terminal Transferase
Enzima isolada de timo de novilho que catalisa a incorporação de dNTP
(ribonucleotídeo) a uma extremidade 3’-OH de DNA sem necessidade de molde. Essa
capacidade foi utilizada para tornar compatíveis as extremidades de insertos e vetores de
clonagem através da construção de extremidades homopoliméricas complementares.
Terminal Deoxinucleotidil Transferase (Terminal Transferase)

Adiciona dNTP(ribonucleotídeo) à extremidade 3’-OH de DNA fita simples ou DNA
fita dupla, mas a reação ocorre com mais eficiência em fita simples. Para aumentar a
eficiência em fita dupla tem que adicionar Co++.
È aplicada na adição de cauda homopolimérica e na marcação de extremidade 3’-OH
como 3’- dNTP(ribonucleotídeo), 3’NTP ou ddNTP marcados radioativamente.
RNA POLIMERASES
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São as principais enzimas responsáveis pela transcrição do DNA em RNA. Catalisam a

adição de ribonucleotídeos a uma extremidade 3’-OH sem a necessidade de um iniciador
anelado.
As RNA polimerases são divididas em três classes: DNA - dependentes; DNA –
independentes e RNA – dependentes RNA – dependentes(Replicases).
Responsáveis pela duplicação de certos genomas virais de RNA.
DNA– dependentes
Podem ter origem bacteriana ou viral.
Bacteriana:
RNA polimerase DNA - dependentes
RNA polimerase de E. coli responsável pelo reconhecimento das regiões -10 e -35 do
promotor bacteriano. Têm baixa processividade “in vitro”, portanto são preferíveis as
RNA polimerases dos vírus SP6, T7 e T3.
RNA polimerases DNA – independentes
Poli (A) polimerase isolada de E. coli que não requer molde de DNA e que adiciona
resíduos de AMP a uma extremidade 3’-OH de RNA a partir de ATP.
Polinucleotídeo fosforilase foi a enzima chave para a síntese das moléculas de RNA que
permitiu a elucidação do código genético. Age como a Poli (A) polimerase, mas a partir
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de precursores de NDP.
RNA Polimerases DNA – Dependentes

RNA polimerase de E. coli
Transcreve a partir de promotores que possuem a seqüência consenso de promotores de
E. coli.
É aplicada em transcrição in vitro e na síntese de RNA marcado radiotivamente.
RNA polimerase de fagos (SP6, T3 e T7)

Têm transcrição altamente específica a partir de promotores dos fagos SP6, T3, T7.
É aplicada em produção de RNA anti-sense; na síntese de RNA marcado
radioativamente; na síntese de RNAm para tradução in vitro e no sequenciamento de
RNA.
RNA Polimerases DNA – Independentes

Poli (A) polimerase
Adicionam cauda poli (A) à extremidade 3’-OH de RNA fita simples.
É aplicada na marcação radioativa de RNA e na adição de cauda poli (A) para servir de
molde para oligo (dT) durante síntese de cDNA.
Polinucleotídeo Fosforilase
Adiciona ribonucleotídeo a uma extremidade 3’-OH de um RNA aceptor.
É aplicada na síntese artificial de moléculas de RNA.
LIGASES
As ligases catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos justapostos 3’-
OH e 5’-PO4.
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A reação ocorre entre moléculas de DNA fita dupla com extremidades abruptas ou
coesivas.
Podem ser de origem bacteriana ou viral.
A DNA ligase de E. coli de origem bacteriana usa como fonte de energia o NADH.
A T4 DNA ligase de origem viral usa como fonte de energia o ATP, por isso são
preferenciais em clonagens moleculares para ligar extremidades abruptas.
A RNA ligase une moléculas de RNA ou DNA fita simples na presença de ATP.
Há evidências de que a T4 RNA ligase estimula a atividade da T4 DNA ligase na ligação
de extremidades abruptas.
T4 DNA Ligase
Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades adjacentes 3’-OH e 5’-
PO4 intramolecularmente em regiões de corte (nicks) ou entre extremidades coesivas ou
abruptas.
È aplicada entre moléculas de DNA para clonagem de fragmentos.
T4 RNA Ligase
Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades 3’-OH e 5’-PO4 de DNA
fita simples e RNA fita simples.
È aplicada na união de moléculas de DNA fita simples ou RNA fita simples; no aumento
de eficiência da T4 DNA ligase em ligações de extremidades abruptas e na marcação da
extremidade 3’-OH de RNA.
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FOSFATASES E QUINASES
Fosfatases são empregadas para desfosforilar extremidades 5’-PO4 de vetores de
clonagem para evitar o religamento dos mesmos após a adição da DNA ligase na
presença de insertos, assim aumenta o número de clones transformantes contendo
insertos clonados no vetor.
Podem agir em associação com as Quinases, pois a Polinucleotídeo Quinase transfere um
grupo fosfato terminal do ATP (y fosfato) à extremidade 5’-OH das extremidades
defosforiladas. Esse grupo terminal pode ser marcado radiotivamente.
As quinases também podem trocar o grupo 5’-PO4 do DNA para o ADP, mas essa
reação é menos eficiente que a atividade de transferência do grupo fosfato do ATP ao
5’-OH.
Fosfatases
Fosfatase alcalina bacteriana (Bacterial Alkaline Phosphatase – BAP);

Fosfatase alcalina de intestino de novilho (Calf Intestinal Phosphatase – CIP);
Fosfatase alcalina de camarão (Shrimp Alkaline Phosphatase – SAP).
Removem grupos fosfato de extremidade 5’de rNA fita simples, DNA fita simples, RNA
fita dupla, DNA fita dupla, dNTP e NTP
São aplicadas em defosforilação de DNA fita dupla para evitar autoligação de vetores de
clonagem; na defosforilação de DNA e RNA para posterior marcação da extremidade 5’
com Polinucleotídeo Quinase e como componente de conjugado de anticorpo para
imunodecção.
Quinases
T4 Polinucleotídeo Quinase
5’quinase: transfere y- fosfato de ATP para uma extremidade 5’-OH de DNA fita
simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla.
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3’fosfatase: remove grupos fosfato da extremidade 3’ de DNA fita simples, DNA fita
dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla.
São usadas na marcação de extremidade 5’ de DNA ou RNA para sequenciamento de
DNA pela técnica de Maxam-Gilbert; no sequenciamento de RNA e na remoção de 3’-
PO4.
Cuidados quanto ao uso de enzimas de restrição:

• Contaminantes (polifenóis, polissacarídeos etc.) interferem na atividade das
enzimas, reduzindo a eficiência. A contaminação por polissacarídeos consiste na
principal contaminação afetando a pureza do DNA extraído de plantas. Esses
carboidratos podem inibir a atividade de várias enzimas usadas em manipulações
biológicas de DNA, tais como ligases, polimerases, e enzimas de restrição.
A contaminação por fenóis, e a conseqüente oxidação do DNA, pode ser evitada
agregando PVP, β-mercaptoetanol ao tampão de extração. Em casos extremos, o
composto dietilditiocarbamato (0,1 M) pode ser adicionado.
SOLUÇÃO TAMPÃO
Soluções capazes de manter o pH constante mesmo que pequena quantidade de ácido ou
base seja a ela adicionada.
Para a escolha do tampão:
a) escolher um sistema ác/bas conjugado com pKa (da base ou do ácido ) mais próximo
possível do pH desejado.
pKa: ponto de inflexão da curva de neutralização de um grupamento ácido ou básico.
A capacidade tamponante será maior em um pH próximo ao pKa, pois nessa faixa é mais
fácil absorver radicais OH- e H+ gerados nessa solução.
b) permitir o preparo de solução tampão de menor concentração depende da capacidade
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tamponante do par ácido /base.

c) não alterar outras variáveis como a força iônica.
Deve-se evitar a ação de DNAses (nucleases), que podem degradar o DNA. Por esse
motivo os tampões de extração de DNA possuem pH por volta de 8,0 (enquanto o pH
ótimo para ação de DNAses endógenas fica por volta de 7,0) :
TAMPÃO DE CORRIDA
A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam na migração e na
qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa força iônica, a migração é muito
lenta, e em extrema força iônica provoca uma alta condutividade elétrica, que gera calor
e pode levar à desnaturação das partículas analisadas.
Os tampões mais utilizados são: TAE e TBE
TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)
Tem baixo custo, mas capacidade tamponante menor que o TBE.
Não deve ser utilizado em corridas longas nem em altas voltagens. Caso seja necessário
seu uso nesses casos, deve-se trocar o tampão no meio da corrida.
O TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA apresenta-se sob
a forma linear ou supernoveladas.
CTAB 2%
• As membranas celulares devem ser rompidas para liberação do DNA: detergente

catiônico CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide - Brometo de
etiltrimetilamônio).
• Os ácidos nucléicos devem ser separados de polissacarídeos, porque inibem a
ação de enzimas de restrição e torna a amostra de DNA excessivamente viscosa,
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interferindo na migração do DNA em corridas eletroforéticas. Polissacarídeos e

ácidos nucléicos possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente.
• Os ácidos nucléicos são poliânions solúveis em água. Os sais de sódio e potássio
de ácidos nucléicos são insolúveis na maioria dos solventes orgânicos, incluindo
numa mistura de etanol e água, mas eles não são desnaturados por solventes
orgânicos. O detergente catiônico CTAB solubiliza membranas celulares, e
dependendo da concentração de NaCl no tampão, CTAB forma um complexo
com o DNA, e é utilizado para precipitar DNA seletivamente.
NaCl 5M
• Precipitação do DNA
• Neutralizante
EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0

• Também para evitar ação de DNAses.
Este agente quelante imobiliza cations de Mg, que são cofatores para várias
endonucleases.
CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL)

• Os ácidos nucléicos devem ser separados das proteínas. Desnaturam as proteínas
tornando-as insolúveis à fase aquosa.
• A utilização de solução fenol/clorofórmio seguida de clorofórmio /álcool
isoamílico é usada para remover qualquer traço de fenol remanescente. Nesse
processo as proteínas desnaturadas ficam na interface das fases fenólica e aquosa.
INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA
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• Hidrólise do RNA
β-Mercaptoetanol 0,2%
• Antioxidante: O DNA deve ser protegido da ação de compostos fenólicos, como
peroxidades e polifenoloxidades que oxidam o DNA (a contaminação por
compostos fenólicos pode ser evidenciada pela coloração do DNA marrom).
Ação: quebra parte do dissulfeto para a molécula ficar linear, eliminando a
contaminação por fenóis.
PVP (POLIVINILPIRROLIDONA)
• Também antioxidante, evita a oxidação de polifenóis, eliminando a contaminação
por fenóis.
BROMETO DE ETÍDEO
• É um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência
violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução de
velocidade de migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.
BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)

• Também antioxidante, evita a oxidação de polifenóis.
• Proteína neutra que estabiliza enzimas de restrição.
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DPEC
• Inibidor de RNA. Para extração de RNA, é comum tratar as soluções com dietil
pirocarbonato (DEPC) de forma a desnaturar RNAses. Entretanto, em certos
casos e situações, apenas a esterilização em autoclave já é suficiente para inativar
ribonucleases. Não é necessário tratar o tampão de extração. Todos os tubos de
centrífugas, cadinhos, almofariz, pipetas (plásticas ou de vidro) devem ser
autoclavadas e secadas antes do uso, ou tratados com DEPC.
• Não misturar DEPC e TRIS. Caso o protocolo necessite de TRIS livre de
RNAse, usar água livre de RNAse.
TRIS- HCl; pH 7,4

• Solução neutralizante.
PROTEÍNA K
• Alguns protocolos incorporam proteases (proteinase K) para facilitar a separação
do DNA das proteínas da cromatina.
ETANOL OU ISOPROPANOL
• Recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol ou
isopropanol).
ACETATO DE SÓDIO (SAIS)

• Eliminação do RNA por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por
solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (Ex.
7,5 M de Acetato de Sódio), DNA e os RNA pequenos (principalmente tRNA)
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permanecem em solução, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.
TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS
INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS
Tampão USO:
7,0 ml tampão fosfato monobásico
12,0 ml tampão fosfato dibásico
181 ml água destilada
Por último: 12 g bissulfito
Macerar alíquota de aprox.20g de folha positiva para vírus em 20 ml de tampão uso.

Usar Carburundum 400 mesh para esfoliar a folha de mudas novas em estágio de até 3
folhas (folhas cotiledonares expandidas) e esfregar o macerado nas folhas.
Transplantar as mudas após 3 dias de inoculação.
EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB
Tampão CTAB para extração de DNA vegetal de folhas cotiledonares expandidas
Estoque Concentração Final Volume Final 15 mL

CTAB 5% 2% 6 mL
NaCl 5M 1,4 M 4,2 mL
EDTA 0,5 M 20 mM 0,6 mL
Tris-HCl (pH8)1,0M 100 mM 1,5 mL
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PVP* sólido 2% 0,3 g

β-Mercaptoetanol** 0,2% 30 µL
H2O completar o volume para 15 mL
• PVP - polivinilpirrolidona; **Colocar imediatamente antes do uso e sob capela.
PROCEDIMENTO:
• Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal.
• Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido
a 65ºC.
• Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente.
A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o DNA.
• Adicionar 1 volume de clorofórmio( álcool isoamílico) ou trisol e agitar o tubo
manualmente ou com agitador por 10 min.
• Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm)
• Transferir o sobrenadante para outro tubo.
• Repetir a extração com clorofórmio ou trisol e agitar o tubo manualmente ou
com agitador por 10 min
• Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm)
Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA.
• Opcionalmente, adicionar RNAse a uma concentração final de 100mg/ml e
incubar a 37ºC por 30 min.
• Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto
gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo.
• Se o complexo DNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar esse
DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o DNA não aparecer ou
ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o
sobrenadante.
Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de DNA
e polissacarídeos.
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• Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado

se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para “grudar” o
precipitado no fundo do tubo.
• Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar.
O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que
pode dificultar a ressuspensão do DNA.
• Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4ºC por uma hora ou
mais.
• Para uma purificação posterior, seguir para a etapa de acetato de amônio ou fazer
purificação por gradiente de CsCl.
Maceração 15 ml de tampão CTAB + um volume de
Clorofórmio
Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com clorofórmio
Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com clorofórmio:

Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes e RNAse:
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Misturar por inversão de tubo suavemente:
Filamento de DNA lavar precipitado de DNA com etanol 70%
Inverter tubo para secar
Dissolver o precipitado em 200 a 500 µL de TE
Sem RNAse, nem desproteinização, os compostos celulares apresentam-se assim, após

centrifugação:
1ºProteína, 2°DNA, 3ºRΝΑ:
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EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO DE DOYLE E

DOYLE
O DNA de plantas será extraído de acordo com protocolo modificado de Doyle e Doyle
(l990). Esse método foi adaptado de um método proposto por Saghai-Maroof et al.
(1984). Ler considerações em Ferreira e Grattapaglia (1995) (pg 121 a 139).
1. Coletar as amostras de folhas jovens e saudáveis das plantas, evitando áreas atacadas
por pragas e doenças. De modo geral devem-se lavar as folhas em água corrente,
usando, sempre que necessária água sanitária e/ou sabão. Enxaguar, e em seguida rinsar
em água destilada, e secar com papel toalha. Esse material pode ser congelado,
liofilizado, seco em estufa a aproximadamente 4oC, ou usado diretamente.
2. Utilizar cerca de 150 mg de lâminas de folha frescas ou 50 mg de folhas liofilizadas ou
secas. As amostras serão trituradas em almofariz na presença de nitrogênio líquido.
Uma possibilidade é utilizar discos foliares cortados com a tampa dos microtubos
Eppendorf de 1,5 ml. O material pode ser triturado em cadinho e transferido para o
tubo, ou diretamente no tubo usando um micro-pistilo.
3. O material será transferido para um tubo de centrífuga, e 650 µ1 do tampão de
extração será adicionado:
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10 ml
2% CTAB 0,2 g do produto
1.4 M NaCl 2,8 ml do estoque 5 M NaCl
100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 1 ml estoque 1 M Tris Cl pH 8,0
20 mM EDTA, pH 8,0 400 µl do estoque 0,5 M EDTA, pH 8,0
1% polivinilpirrolidona MW10,000 0,1 g do produto
4. Adicionar a uma alíquota do tampão a ser usado, pouco antes do uso:

0,2 % β-mercaptoethanol
50 µg ml-l de proteinase K
5. Misturar os tubos em vórtex, e colocá-los em banho-maria a 55oC por 60 minutos.

6. Adicionar 650 µl de clorofórmio: álcool isoamil (24:1) e misturar até formar uma
emulsão.
7. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm.
8. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para não
pipetar a interfase. Caso o volume da fase superior não for superior à fase
intermediária com fragmentos de tecido, adicionar mais tampão e misturar
vigorosamente e re-centrifugue.
9. Adicionar 200 µl.tubo-1 do tampão de extração sem proteinase K e β-mercaptoetanol,
e adicionar 650 µl de clorofórmio: álcool isoamil (24:1), misturando até formar uma
emulsão.
10. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm.
11. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para não
pipetar a interfase.
12. Repetir esses três passos anteriores mais uma vez.
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13. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, e adicionar um
volume igual de isopropanol.
14. Centrifugar o DNA por 5 minutos a 12000 rpm.
15. Lavar o pellet com 1 ml de Etanol 70% para remover sais por duas vezes, e secar ao
ar ou sob vácuo num dessecador.
16. Ressuspender o DNA em 20 µl de tampão TE contendo ribonuclease [RNAse]
(10µg.ml-l). A RNAse deve ser fervida dependendo da origem comercial. Várias
preparações são contaminadas por DNAses, que são inativadas pela fervura,
enquanto que as RNAses não são (demonstrando a resistência dessas enzimas). Em
geral prepara-se estoque dissolvendo 100 mg de RNAse em 10 mM de Tris-HCl (pH
7,5) e 15 mM NaCl; aquecer em água fervente por 15 minutos e resfriar lentamente a
temperatura ambiente. Fazer alíquotas de 1 ml e armazenar a –20oC.
MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS
Preparação de DNA de células eucarióticas (Sambrook&Russel, 2001).

Método adequado para Southern Blot e para construção de banco genômico por obter
um DNA genômico de alta qualidade de elevada massa molecular.
Soluções e material
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TBS
• Tris-HCl 20mM; pH7.4
• NaCl 150mM
Proteinase K
Tampão de extração
• Tris HCl 10 mM ; pH 8.0
• EDTA 0,1M
• SDS 0,5%
RNAse a 20 µg/mL
Dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mM; pH 4.8 e fervida em banho-maria por
vinte minutos para eliminar qualquer DNAse contaminante. Conservar em eppendorf de
1,5 mL a -20ºC.
Fenol equilibrado
• 1 volume de fenol
• 1 volume de Tris 1M
• B-Hidroxiquinolina 0,1% (p/v)
• B-Meracaptoetanol 0,2% (p/v)
• Solução equilibrada com Tris-HCl 100mM; pH8.0; EDTA 1mM; NaCl 200mM
Etanol absoluto
Etanol 70% (v/v)
TE
• Tris-HCl 10mM; pH8.0
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• EDTA 1mM; pH 8.0
Solução de ácido cítrico / glicose

• Ácido cítrico 0,48 g
• Citrato de sódio 1,32 g
• Glicose 1,47 g
• Água destilada q.s.p. 100 mL
Materiais: Incubadora com agitação, tubos de vidro e plástico, centrífuga, bastão de

vidro em forma de gancho.
Método
1. Usar 0,5 mL de TBS para raspar as células da placa de cultura

2. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga e colocar no gelo
3. Lavar a placa 1x com 1 mL de TBS e juntar a primeira suspensão (pode ser utilizado
0,5 g de tecido mole)
4. Centrifugar a 1500xg/10 min a 4ºC. Ressuspender as células em 5 a 10 volumes de
TBS gelado e repetir a centrifugação.
5. Transferir a solução para um enlermeyer (para uma suspensão de 1 mL de células,
usar frasco de 50 mL) e adicionar 10 mL de tampão de extração para cada 1 mL de
suspensão de células
6. Incubar a 37ºC por 1 hora
7. Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100 g/
mL.
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5 159
Notas para isolamento de DNA:
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* Expectativas de rendimento de DNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura celular

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* Razão A260/280 < 1.70

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20Ca
oin
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* Outras aplicações:
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Referências bibliográficas
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

PREPARO DE SOLUÇÕES ................................................................7

FÓRMULAS E PROBLEMAS MAIS COMUNS ...............................................................................7

SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL.............................9

ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N ................................................................................................9

FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS ...........................16

DNA Polimerase - Independente de Molde ...............................................................................44

TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS ......................................................53

INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS.....................................................53

As precauções a serem seguidas objetivam tanto a biossegurança quanto a eficiência dos

• Sempre usar luvas para manipulação de reagentes.

superfícies ou material não tratado com DEPC.

• O DEPC é altamente tóxico devendo ser manipulado em capela de exaustão com

• O brometo de etídeo é mutagênico e moderadamente tóxico. Usar luvas e tomar

• As ponteiras devem ser autoclavadas antes do uso.

• O pó do SDS é irritante. Recomenda-se o uso de máscara.

• O tampão CTAB não dissolve antes de o pH atingir o nível ótimo pedido na

• A solução-tampão do meio para eletroforese de proteínas deve ser

• A luz UV é mutagênica. Usar óculos de proteção e luvas.

• Qualquer substância ou solução deve ser acondicionada com identificação

Fórmulas e problemas mais comuns

Ex. 1 mol de NaCl = 58,5g (Na = 23g e Cl = 35,5g)

Pode ser expresso em m/v (massa/volume), v/v (volume/volume), m/m (massa/massa).

ppm (partes por milhão)

Usado para soluções muito diluídas:

massa de solução (Kg) 0,1

d = massa do soluto (g)

c = massa do soluto (g)

Para se obter diluições de soluções tem que acrescentar solvente.

Massa de soluto (g) x volume de solução (L)

Massa de soluto (g) x volume de solução (L)

C (g/L)1 x V (L)1 = C (g/L)2 x V (L)2 e

SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL

ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N

Água destilada 400 mL em béquer

ÁGUA DEPC 0,1%

ÁGUA LIVRE DE RNASE

Água UPA 500 mL

CLORETO DE LÍTIO (LICL) 5M

Cloreto de Lítio 2,12 g

EDTA 0,5M PH 8.0

EDTA 500 MM; PH 8.0

FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO (25:24:1)

GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO)

HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N

RNAse pancreática (RNAse A) 100 mg

Tris HCl Livre de RNAse

Tris base 121,1 g

Solução Tampão (Wash Buffer)

Tris HCl 1,5M 3,33 mL

Tris base 242g

Tris base 108 g

Tris HCl 1M; pH 8.0 1 mL

Tampão Fosfato de Sódio 1M

NaH2PO4.H2O 1M 13,8g + água destilada q.s.p. 100 mL

Diluir nas seguintes proporções de acordo com o pH desejado:

Tampão de Amostra para Eletroforese

Ficoll tipo 400 ou Glicerol 3g

Tampão Fosfato Salina- PBS 10X

FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS

Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas. A desproteinização é

Como r é diretamente proporcional à RCF, quando o raio aumenta, o RCF aumenta.