Proteínas

Predição de Estrutura Secundária

Marcilio Souto
DIMAp/UFRN

1
Somos seres protéicos
• A vida está intimamente ligada às proteínas
– Estas moléculas especiais realizam as mais
variadas funções no nosso organismo
• Transporte de nutrientes e metabólitos,
catálise de reações biológicas
– Apesar da complexidade de suas funções,
as proteínas são relativamente simples:
• Repetições de 20 unidades básicas, os
aminoácidos

2
Aminoácido
• Um aminoácido consiste em um caborno
“central” com uma ligação a grupo amino
(-NH2), outra a um grupo carboxila (-COOH), a
terceira a um átomo de hidrogênio e a quarta
a uma cadeia lateral
COOvariável
-

|
H3N+--C--H
|
R
3
Aminoácidos
• Single- & three-letter amino acid codes
– G Glycine Gly P Proline Pro
– A Alanine Ala V Valine Val
– L Leucine Leu I Isoleucine Ile
– M Methionine Met C Cysteine Cys
– F Phenylalanine Phe Y Tyrosine Tyr
– W Tryptophan Trp H Histidine His
– K Lysine Lys R Arginine Arg
– Q Glutamine Gln N Asparagine Asn
– E Glutamic Acid Glu D Aspartic Acid Asp
– S Serine Ser T Threonine Thr
• Additional codes
– B Asn/Asp Z Gln/Glu X Any amino acid
4
Definição
• As proteínas são macromoléculas complexas,
compostas de aminoácidos, e necessárias para
os processos químicos que ocorrem nos
organismos vivos
• São os constituintes básicos da vida: tanto que
seu nome deriva da palavra grega "proteios",
que significa "em primeiro lugar”
• Nos animais, as proteínas correspondem a
cerca de 80% do peso dos músculos
desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do
sangue seco. Mesmo nos vegetais as proteínas
estão presentes. 5
Importância
• A importância das proteínas, entretanto, está
relacionada com suas funções no organismo, e
não com sua quantidade
• Todas as enzimas conhecidas, por exemplo,
são proteínas
– Muitas vezes, as enzimas existem em porções muito
pequenas.
– Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as
reações metabólicas e capacitam aos organismos a
construção de outras moléculas - proteínas, ácidos
nucléicos, carboidratos e lipídios - que são
necessárias para a vida.
6
Polipeptídeos
• As proteínas também são chamadas de polipeptídeos,
porque os aminoácidos que as compõe são unidos por
ligações peptídicas
– Uma ligação peptídica é a união do grupo amino
(-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila
(-COOH) de outro aminoácido, através da formação
de uma amida

7
Estrutura da Proteínas
• Embora sejam quase inúmeras, todas as proteínas são
formadas exclusivamente por apenas 20 aminoácidos,
que se repetem numa seqüência característica para
cada proteína
– Esta seqüência, conhecida como estrutura primária,
é que, de fato, determina a forma e a função da
proteína.
– A estrutura primária é somente a sequência dos
amino ácidos, sem se preocupar com a orientação
espacial da molécula
– As interações intermoleculares entre os aminoácidos
das proteínas fazem com que a cadeia protéica
assuma uma estrutura secundária e uma estrutura
terciária.
8
Estrutura Secundária
• A estrutura secundária é uma função dos ângulos
formados pelas ligações peptídicas que ligam os
aminoácidos
– "The secondary structure of a segment of
polypeptide chain is the local spatial arrangement of
its main-chain atoms without regard to the
conformation of its side chains or to its relationship
with other segments".
– A conformação espacial é mantida graças as
interações intermoleculares (ligação hidrogênio)
entre os hidrogênios dos grupos amino e os átomos
de oxigênio dos outros amino ácidos.

9
Estrutura Secundária
• Em geral, estas ligações forçam a proteína a
assumir uma forma helicoidal, como uma
corda enrolada em torno de um tubo
imaginário.

– Esta forma, a mais comum, é chamado de alfa

hélice.
– Outras duas formas na estrutura secundária são as
beta-sheets e turns. Nas beta-sheets, um segmento
da cadeia interage com outro, paralelamente.

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α-Hélice
• É a forma mais comum de estrutura
secundária regular
• Caracteriza-se por uma hélice em
espiral formada por 3,6 resíduos de
aminoácidos por volta
• As cadeias laterais dos aminoácidos
se distribuem para fora da hélice
• A principal força de estabilização da a
- Hélice é a ponte de hidrogênio.

11
β-Folhas
• Envolve 2 ou mais segmentos
polipeptídicos da mesma molécula
ou de moléculas diferentes,
arranjados em paralelo ou no
sentido anti-paralelo
• Os segmentos em folha β da
proteína adquirem um aspecto de
uma folha de papel dobrada em
pregas.
• As pontes de hidrogênio mais uma
vez são a força de estabilização
principal desta estrutura

12
Estrutura Terciária
• A estrutura terciária relaciona-se com os
loopings e dobraduras da cadeia protéica
sobre ela mesma.
• É a conformação espacial da proteína, como
um todo, e não de determinados segmentos
particulares da cadeia protéica.
• A forma das proteínas está relacionada com
sua estrutura terciária.
• Existem, por exemplo, proteínas globulares
(que tem forma esférica).

13
 Estrutura Terciária
• O que determina a estrutura terciária são as
cadeias laterais dos aminoácidos
– Algumas cadeias são tão longas e hidrofóbicas que
perturbam a estrutura secundária helicoidal,
provocando a dobra ou looping da proteína.
• Muitas vezes, as partes hidrofóbicas da proteína
agrupam-se no interior da proteína dobrada
– Longe da água e dos íons do ambiente onde a proteína
se encontra, deixando as partes hidrofílicas expostas na
superfície da estrutura da proteína.
• Regiões como "sítio ativos", "sítios regulatórios"
e módulos são propriedades da estrutura
terciária 14
Estrutura Terciária

15
Estrutura Quaternária
• Existe, finalmente, a estrutura quaternária
– Ccertas proteínas, tal como a hemoglobina, são
compostas por mais de uma unidade polipeptídica
(cadeia protéica).
– A conformação espacial destas cadeias, juntas, é que
determina a estrutura quaternária. Esta estrutura é
mantida pelas mesmas forças que determinam as
estruturas secundárias e terciárias. A figura ao lado
mostra uma imumoglobulina que é, na verdade, um
tetrâmero, isto é, constituída por 4 cadeias protéicas
(polipeptídeos).

16
Estrutura Quaternária
• A figura ao lado mostra uma imumoglobulina que é, na
verdade, um tetrâmero, isto é, constituída por 4 cadeias
protéicas (polipeptídeos).

17
Proteínas Conjugadas
• As proteínas podem ser simples
– Constituidas somente por aminoácidos
• ou conjugadas
– Contêm grupos prostéticos, isto é, grupos não
aminoácidos, tais como carbohidratos, íons,
pigmentos, etc.
– A hemoglobina é um exemplo de proteína
conjugada: contém 4 grupos prostéticos, cada um
consistindo de um íon de ferro e a porfirina. São
justamente estes grupos que habilitam a
hemoglobina a carregar o oxigênio através da
corrente sanguínea. As liproproteínas, tal como LDL
e HDL, são também exemplos de proteínas
conjugadas - neste caso, com lipídeos. 18
Proteínas Conjugadas

19
Outras Classificações
• Uma outra forma de classificar as proteínas é baseado
na sua função.
• Sobre este prisma, elas podem ser divididas em dois
grupos:
– proteínas estruturais e proteínas biologicamente
ativas
– Algumas proteínas, entretanto, podem pertencer aos
dois grupos
– A maioria das proteínas estruturais são fibrosas -
compostas por cadeias alongadas. Dois bons
exemplos, nos animais, são o colágeno (ossos,
tendões, pele e ligamentos) e a queratina (unhas,
cabelos, penas e bicos).
20
Outras Classificações
• A grande maioria das proteínas biologicamente ativas
são globulares, e sua atividade funcional é intrínsica a
sua organização espacial
– Exemplos são as enzimas, hormônios protéicos (que
atuam como mensageiros químicos), proteínas de
transporte (como as lipo-proteínas, que podem
carregar o colesterol) e imunoglobulinas (ou
anticorpos), que protegem o corpo de
microorganimos invasores.
– Muitas proteínas biologicamente ativas ficam na
região da membrana celular, e atuam de diversas
maneiras

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Outras Classificações
• A figura ao lado mostra uma porina, uma proteína trans-
membrana, que atua como um canal iônico em bactérias.
Existe um "buraco" na estrutura protéica, de cerca de 11
angstrons de diâmetro, onde os íons passam, seletivamente

22
Enzimas
• As enzimas são uma classe muito importante de proteínas
biologicamente ativas.
• Elas são responsáveis pela catálise de diversas reações em
nosso organismo. Reações que, sem o auxílio das enzimas,
jamais aconteceriam ou, ainda, gerariam indesejados produtos
colaterais.
• Em uma proteína enzimática, existe um certo domínio
chamado de "sítio ativo", que liga-se ao substrato - a molécula
reagente - e diminui a energia do estado de transição que leva
ao produto desejado.
• A ligação entre o sítio ativo e o substrato é extremamente
específica:
– a molécula precisa ter certas características eletrônicas e
espaciais que permitam o seu "encaixe" com a proteína.
Por isso esta relação tem sido chamada de lock'n'key, ou
seja, chave-fechadura. 23
Enzimas: Sítio Ativo
• No exemplo da figura, uma determinada região da proteína
liga-se à um substrato, que se adapta ao sítio ativo da enzima
tal como uma chave faz a sua fechadura.

24
Enzimas: Inibidor

• A atividade de uma enzima pode ser bloqueada pela

ação de outra molécula, um inibidor.
• Quando um inibidor interage com uma determinada
região da enzima, chamado de sítio regulatório, provoca
uma alteração na sua conformação e uma desativação
do sítio catalítico.
• A atividade enzimática, portanto, pode ser controlada,
pelo organismo, através da liberação ou captação de
inibidores.

25
Enzimas: Inibidor

26
Caso tenham esquecido
• A sequência dos amino ácidos em todas as proteínas - fator
que é responsável por sua estrutura e função - é determinado
geneticamente a partir da sequência dos nucleotídeos no DNA
celular.
• Quando uma proteína em particular é necessária, o código do
DNA (gene) para esta proteína é transcrito em uma sequência
complementar de nucleotídeos ao longo de um segmento de
RNA - chamado de RNA mensageiro.
• Este segmento de RNA serve como uma forma para a síntese
da proteína subsequente: cada grupo de 3 nuclueotídeos
especifica um determinado aminoácido;
– estes aminoácidos são ligados na sequência codificada pelo RNA.
No final do processo, obtém-se a proteína completa, cuja
sequência de aminoácidos foi ditada pelo RNA mensageiro. Desta
maneira, o organismo é capaz de sintetizar as várias proteínas
com as funções mais diversas de que precisa.
27
Previsão de Estrutura de
Proteínas
• Experimental
– Cristalização
• Raios X
• Ressonância nuclear magnética
– Cerca de 10 a 12 mil estruturas em repositórios
públicos
– Processo caro e demorado
• Teórico
– Homologia
– Ab Inition
– Threading
– Aprendizado de Máquina

28
Modelagem por Homologia
• A ferramenta mais bem sucedida de predição de estruturas
tridimensionais de proteínas é a modelagem por homologia,
também conhecida como modelagem comparativa.
• Esta abordagem baseia-se em alguns padrões gerais que têm
sido observados, em nível molecular, no processo de evolução
biológica:
– homologia entre seqüências de aminoácidos implica em
semelhança estrutural e funcional;
– proteínas homólogas apresentam regiões internas
conservadas (principalmente constituídas de elementos de
estrutura secundária: hélices-a e fitas-b);
– as principais diferenças estruturais entre proteínas
homólogas ocorrem nas regiões externas, constituídas
principalmente por alças ("loops"), que ligam os elementos
de estruturas secundárias.
29
Modelagem por Homologia
• Outro fato importante é que as proteínas agrupam-se
em um número limitado de famílias tridimensionais.
Estima-se que existam cerca de 5.000 famílias
protéicas.

• Conseqüentemente, quando se conhece a estrutura de

pelo menos um representante de uma família, é
geralmente possível modelar, por homologia, os demais
membros da família.

30
Modelagem por Homologia
• A modelagem de uma proteína (proteína-problema) pelo
método da homologia baseia-se no conceito de
evolução molecular.
– Isto é, parte-se do princípio de que a semelhança entre as
estruturas primárias desta proteína e de proteínas
homólogas de estruturas tridimensionais conhecidas
(proteínas-molde) implica em similaridade estrutural entre
elas.
• Os métodos correntes de modelagem de proteínas por
homologia implicam basicamente em quatro passos
sucessivos:
– identificação e seleção de proteínas-molde;
– alinhamento das seqüências de resíduos;
– construção das coordenadas do modelo;
– validação. 31
Threading
• Esta técnica é baseada na comparação da proteína em
questão com modelos descritivos dos enovelamentos de
proteínas homólogas

• Nesses modelos são descritas:

– a distância entre os resíduos de aminoácidos

– a estrutura secundária de cada fragmento
– as características fisico-químicas de cada resíduo

32
Ab Initio
• Entretanto, um grande desejo dos que trabalham com
proteínas é o desenvolvimento de programas realmente
eficientes para a modelagem ab initio
– Um programa que seja capaz de predizer a estrutura
terciária de uma proteína, tendo como informação
apenas a seqüência dos resíduos de aminoácidos e
suas interações fisico-químicas, entre si e com o
meio.
– Programas assim existem hoje mas têm muito a
melhorar para que possamos confiar unicamente no
seu resultado.

33
Predição de Estrutura
• Decomposição em três problemas:
– Da Estrutura Primária para a
Estrutura Secundária e outras
Características Estruturais
– Da Estrutura Primária e
Características Estruturais para
Representações Topológicas
– De Representações Topológicas para
Coordenadas 3D.
34
Protein Structure Terms
Protein Folds: The core 3D structure of a domain is called a fold. There
are only a few thousand possible folds.
Motif: A short conserved region in a protein sequence. Motifs are
frequently highly conserved parts of domains.
Domain: An independently folded unit within a protein, often joined by a
flexible segment of the polypeptide chain.
Class:used to classify protein domains according to their secondary
structural content and organization
Core:portion of the folded protein molecule that compromises the
hydrophobic interior of the α helices and β sheets.
Profile:a scoring matrix that represents a multiple sequence alignment of a
protein family

35
Protein Structure Terminology
α helix – the most abundant type of secondary structure
in proteins. The helix has an average of 3.6 amino acids
per turn with a hydrogen bond formed about every fourth
residue. Average length is 10 amino acids
β sheet- formed by hydrogen bonds between an average
of 5-10 consecutive amino acids in one portion of the
chain with another 5-10 further down the chain. The
interacting regions may be adjacent, with a short loop in
between or far apart with other structures in between.

36
Alpha Helix

37
38
Beta Sheet

39
40
41
Secondary Structure and Folding
Classes
In the absence of “known” information about secondary
structure, there are methods available for predicting the ability of
a sequence to form α helices and β strands.
Methods rely on observations made from groups of proteins
whose three-dimensional structure has been experimentally
determined
Classification system based on the order of secondary structural
elements within a protein

42
Secondary Structure Prediction
• Predict the secondary structural conformation of each
residue of protein sequences in general - making use of
global rules applying across all sequence families (not
those within individual families).
• Prediction programs are trained on data sets of non-
homologous proteins of known structure (eg all sequence
identity < 25%)

43
Estruturas Secundárias
DSSP classes: 
• H = alpha helix
• E = sheet
• G = 3-10 helix
• S = kind of turn
• T = beta turn
• B = beta bridge
• I = pi-helix (very rare)
• C = the rest
CASP (harder) assignment: 
• α = H and G
• β = E and B
• γ = the rest
Alternative assignment: 
• α= H
• β= B
• γ = the rest

44
Algorithms:
• Nearest Neighbour - find the most similar sub-sequences
of known structure (eg Levin, Robson, Garnier, 1986)
• Statistical, such as pairwise frequencies of amino acids as
a function of separation and secondary structure (Garnier,
Osguthorpe, Robson, 1978)
• Neural Networks, (eg PHD - Rost and Sander, 1993)
• Hybrid methods, eg using statistics, physico-chemical
properties such as hydrophobic moments and others (eg
DSC, King and Sternberg, 1996)

45
 History:
• The first generation prediction methods following in the
60's and 70's all based on single amino acid propensities
• The second-generation methods dominating the scene until
the early 90's utilised propensities for segments of 3-51
adjacent residues
– It seemed that prediction accuracy stalled at levels
slightly above 60%
– The reason for this limit was the restriction to local
information
– Can we introduce some global information into local
stretches of residues
46
Traditional

47
48
Secondary structure prediction
profits from divergence
• Early on Dickerson [1976] realised that information
contained in multiple alignments can improve predictions
• However, the breakthrough of the third generation
methods to levels above 70% accuracy required a
combination of larger databases with more advanced
algorithms
• The major component of these new methods was the use of
evolutionary information. All naturally evolved proteins
with more than 35% pairwise identical residues over more
than 100 aligned residues have similar structures

49
New database searches extend
family divergence found
• The breakthrough to large-scale routine searches has been
achieved by the development of PSI-BLAST [Altschul, S.
et al. (1997)] and Hidden Markov models [Eddy, S. R.
(1998); Karplus, K., Barrett, C. & Hughey, R. (1998)]
• More data + refined search = better prediction
• Prediction accuracy peaks at 76% accuracy. The currently
best methods reach a level of 76% three-state per-residue
accuracy ( Table 1 ). This constitutes a sustained level
more than four percentage points above last century's best
method not using diverged profiles (PHD in Table 1 )

50
51
Method Q3 Description
PROF 77.2 divergent profile-based neural network prediction
trained and tested with PSI-BLAST
PSIPRED 76.6 divergent profile (PSI-Blast) based neural network
prediction

SSpro 76.3 profile-based advanced neural network prediction

method

JPred2 75.2 divergent profile (PSI-BLAST) based neural network

prediction

PHDpsi 75.1 divergent profile (PSI-BLAST) based neural network

prediction

PHD 71.9 simple profile-based neural network prediction

Cop 78 advanced neural network prediction method

SAM 76 neural network prediction, using Hidden Markov

HMMSTR 74 models as input
52
 Caution: over-optimism
• Seemingly improve accuracy by ignoring short segments.
There are many ways to publish higher levels of accuracy
• Comparing apples and oranges, or too few apples with one
another
– There is NO value in comparing methods evaluated on
different data sets
– For example, 16 new protein structures are clearly too
few! For that set, JPred2, PHD, PROF, PSIPRED, SAM-
T99sec and SSpro are indistinguishable
• Seemingly achieve 100% accuracy by using correlated sets
• EVA: automatic evaluation of automatic prediction servers
53
 Clever methods can be more
accurate 1/4
• SSpro: advanced recursive neural network system
– The only method published recently that appears to improve
prediction accuracy significantly not through more divergent profiles
but through the particular algorithm is SSpro [Baldi, P., Brunak, S.,
Frasconi, P., Soda, G. & Pollastri, G. (1999)]
– The system never learns that secondary structure correlates between
adjacent residues
– PHD addressed this problem by a second level structure-to-structure
network that was trained on the predicted secondary structure from
the first level sequence-to-structure network [Rost, B. & Sander, C.
(1993)]. PSIPRED and JPred2 as well.
– Pierre Baldi and colleagues deviated substantially from this concept.
Instead of using an additional network, they embedded the
correlation into one single recursive neural network
54
 Clever methods can be more
accurate 2/4
• HMMSTR: hidden Markov models for connecting library of
structure fragments
– Can we predict secondary structure for protein U by local sequence
similarity to segments of known structures {S} even when overall U
differs from any of the known structures {S}?
– Yes, as shown by many nearest-neighbour-based prediction methods,
the most successful of which seems to be NSSP [Salamov, A. A. &
Solovyev, V. V. (1997)]
– A conceptually quite different realisation of the same concept has
been implemented in HMMSTR by Chris Bystroff, David Baker and
colleagues (2000)

55
 Clever methods can be more
accurate 3/4
• HMMSTR: hidden Markov models for connecting library of
structure fragments
– Firstly, build a library of local stretches (3-19) of residues with 'basic
structural motifs' (I-sites)
– Secondly, assemble these local motifs through Hidden Markov
models introducing structural context on the level of super-
secondary structure
– Thus, the goal is to predict protein structure through identification of
'grammatical units of protein structure formation’
– Although HMMSTR intrinsically aims at predicting higher order
aspects of 3D structure, a side-result is the prediction of 1D
secondary structure

56
 Clever methods can be more
accurate 4/4
• Copenhagen: a Danish group developed a neural network-based method
that is most amazing in many respects Petersen, T. N. et al. (2000).
– The authors estimate the method to yield levels above 77% prediction
accuracy
– If true, this is the best current method
– Like PSIPRED, JPred2, and PROF, the method uses PSI-BLAST
profiles as input, and like most methods since PHD a two-level
approach addressing the problem of predicting short segments
– It replaces the standard 3 output units (for helix, strand, other), by 9
output units
– Also new is the particular way of weighting the average over different
networks by the overall reliability of the prediction for that network,
and the mere number of different networks considered (up to 800!)
57
Combining mediocre and good
methods is best
• Combination improves on non-systematic errors
– Systematic errors, e.g., through non-local effects
– White noise errors caused by, e.g., the succession of the examples
during training neural networks
– Theoretically, combining any number of methods improves
accuracy as long as the errors of the individual methods are
mutually independent and are not only systematic
• PHD - and more recently others [Chandonia, JPred2,
Copenhagen] - utilised this fact by combining different
neural networks.

58
 Discussion
• Methods improved significantly over last two years
– Growing databases and improved search techniques -
predominantly through the iterated PSI-BLAST tool - yielded a
substantial improvement in secondary structure prediction
accuracy over the last two years.
– State-of-the-art methods now reach sustained levels of 76%
prediction accuracy
• What is the limit of prediction accuracy?
– 88% is the limit, but shall we ever reach close to there?
– Larger databases may get us six percentage points higher, and it
may not. The answer remains nebulous

59
References
• B. Rost (2001) Protein secondary structure prediction continues to rise.
Journal of Structural Biology, 134, pp. 204-218 (Columbia University).
• Bystroff, C., Thorsson, V. & Baker, D. (2000). HMMSTR: a hidden Markov
model for local sequence-structure correlations in proteins. J. Mol. Biol., 301,
173-190 (University of Washington)
• Cuff, J. A., Clamp, M. E., Siddiqui, A. S., Finlay, M. & Barton, G. J. (1998).
JPred: a consensus secondary structure prediction server. Bioinformatics, 14,
892-893 (JPred – Oxford/Cambridge)
• Cuff, J. A. & Barton, G. J. (2000). Application of multiple sequence alignment
profiles to improve protein secondary structure prediction. Proteins, 40, 502-
511 (JPred2)
• Rost, B. (1996). PHD: predicting one-dimensional protein structure by profile
based neural networks. Meth. Enzymol., 266, 525-539. (PHD – Heidelberg –
Germany)

60
References
• Przybylski, D. & Rost, B. (2000). PSI-BLAST for structure prediction: plug-in
and win. Columbia University (PHDPsi)
• Rost WWW, B. (2000). Better secondary structure prediction through more
data. Columbia University, WWW document (
http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein) (PROF)
• Altschul, S., Madden, T., Shaffer, A., Zhang, J., Zhang, Z. et al. (1997).
Gapped Blast and PSI-Blast: a new generation of protein database search
programs. Nucl. Acids Res., 25, 3389-3402. (PSI-BLAST – USA)
• Jones, D. T. (1999). Protein secondary structure prediction based on position-
specific scoring matrices. J. Mol. Biol., 292, 195-202 (PSIPRED – Warwick)
• Karplus, K., Barrett, C. & Hughey, R. (1998). Hidden Markov models for
detecting remote protein homologies. Bioinformatics, 14, 846-856 (SAM-
T99Sec – University of California Sta. Cruz)

61
References
• Baldi, P., Brunak, S., Frasconi, P., Soda, G. & Pollastri, G. (1999). Exploiting
the past and the future in protein secondary structure prediction.
Bioinformatics, 15, 937-946. (Sspro – University of California at Irvine and
Italy)
• Petersen, T. N., Lundegaard, C., Nielsen, M., Bohr, H., Bohr, J. et al. (2000).
Prediction of protein secondary structure at 80% accuracy. Proteins, 41, 17-20
– Denamark, including Brunak)
• Salamov, A. A. & Solovyev, V. V. (1997). Protein secondary structure
prediction using local alignments. J. Mol. Biol., 268, 31-36 (nearest-neigbour
method)

62