MARLUS CHORILLI, ET AL.

Efeito de Emulso Contendo Extrato Seco de Guaran sobre os Vasos Sanguneos da Derme Papilar de Ratos
Emulsion Effect Containing Dry Extract of Guarana Over the Blood Vessels of the Papillary Dermis of Rats
RESUMO O extrato seco de guaran (ESG) rico em cafena, a qual vem sendo utilizada em formulaes tpicas destinadas preveno e tratamento da lipodistroa ginide. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos de emulso (E) contendo concentraes diferentes de ESG, acrescida, separadamente, de dois promotores qumicos de permeao cutnea cido olico (AO) ou miristato de isopropila (MI) sobre os vasos sanguneos da derme papilar de ratos. Foram utilizados dois grupos experimentais com cinco ratos machos Wistar cada, nos quais delimitaram-se quatro reas de tratamento de 1 cm2 no dorso, expostas s seguintes formulaes: no primeiro grupo experimental, E + ESG 20%, E + ESG 20% + AO 1%, E + ESG 20% + MI 1% e controle (C); j no segundo grupo, realizaram-se os tratamentos E + ESG 50%, E + ESG 50% + AO 1%, E + ESG 50% + MI 1% e C. Fragmentos dessas reas foram xados em soluo tamponada de formol 10% e processados para colorao com hematoxilina e eosina (HE). Os vasos sanguneos foram contados utilizando-se ocular reticulada. Os resultados mostraram aumento no nmero de vasos sanguneos na derme papilar apenas quando empregado E + ESG 50% (439,22%). Todavia, os promotores qumicos no alteraram o efeito do ESG 50% nos vasos sanguneos da derme (aumento do nmero de vasos de 500% com AO e, de 460%, com MI). Palavras-chave GUARAN PROMOTORES DE PERMEAO DERME PAPILAR VASOS SANGUNEOS. ABSTRACT The dry extract of guarana (DEG) is rich in caffeine. It has been used in topic formulations destined to the prevention and treatment of the gynoid lipodystrophy. The aim of this work was to study the effects of emulsion (E) with different concentrations of DEG, mixed with two distinct chemical promoters of cutaneous permeation oleic acid (OA) or isopropyl myristate (IM), over the blood vessels in papillary dermis of rats. T wo experimental groups with ve male Wistar rats were used. Four areas of 1 cm2 in the back were submitted to the following formulations: in the 1st experimental group E + DEG 20%, E + DEG 20% + OA 1%, E + DEG 20% + IM 1% and control (C); in the 2nd group the treatments were E + DEG 50%, E + DEG 50% + OA 1%, E + DEG 50% + IM 1% and C. Segments of these areas were xed in 10% buffered formaldehyde and processed for staining with Hematoxylin and Eosin (HE). The number of blood vessels was counted using a reticular eyepiece. The results showed that only emulsions with 50% of DEG increased the number of papillary
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MARLUS CHORILLI*
Departamento de Frmacos e Medicamentos Faculdade de Cincias Farmacuticas de Araraquara (Unesp/SP)

MARIA CRISTINA DE ALMEIDA PRADO RIBEIRO

Biloga graduada pela UNIMEP/SP

MARIA SLVIA MARIANI PIRES-DE-CAMPOS

Curso de Fisioterapia Faculdade de Cincias da Sade (UNIMEP/SP)

GISLAINE RICCI LEONARDI

Curso de Farmcia Faculdade de Cincias da Sade (UNIMEP/SP)

MARIA LUIZA OZORES POLACOW

Cursos de Farmcia e Fisioterapia Faculdade de Cincias da Sade (UNIMEP/SP) *Correspondncias: Rua Silva Jardim, 1.198, Bairro Alto, 13417-230, Piracicaba/SP chorilli@fcfar.unesp.br

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dermis blood vessels (439.22%). However, the chemical promoters did not alter the effect of 50% DEG in dermis blood vessels (increase of the number of vessels of 500% with AO and 460% with MI). Keywords GUARANA PERMEATION PROMOTERS PAPILLARY DERMIS BLOOD VESSELS.

INTRODUO
rias plantas vm ganhando aceitao por parte dos prossionais da rea cosmtica e dos consumidores. O uso de extratos vegetais em produtos cosmticos tem sido cada vez mais motivado pelos pesquisadores e formuladores da rea. Porm, preciso cautela e um estudo minucioso da eccia de cosmticos contendo extratos vegetais para a obteno de produtos de alta qualidade.8 H sculos, o extrato de guaran vem sendo utilizado, via oral, como estimulante do sistema nervoso central. Tal propriedade pode ser associada especialmente cafena, um dos princpios ativos mais abundantes nesse extrato.9 O extrato de guaran composto quimicamente por bases xantnicas (cafena, teolina e teobromina) e por saponinas e taninos em altas concentraes, sendo que os taninos apresentam ao antioxidante.9 Sabe-se que a cafena sinttica vem sendo empregada em formulaes tpicas para o tratamento e a preveno da lipodistroa ginide.1, 7 Assim, distribuidores do extrato de guaran tm sugerido o uso dele em formulaes tpicas para lipodistroa ginide. No entanto, a eccia do uso do extrato de guaran topicamente ainda no foi comprovada na literatura cientca. A lipodistroa ginide, conhecida popularmente como celulite, congura-se como uma alterao do relevo cutneo, que ocorre sobretudo em mulheres, nas regies da cintura plvica, membros inferiores e abdome. A alterao inicial que leva formao da celulite parece ser a deteriorao da substncia intersticial e rede capilar, levando a reteno excessiva de lquidos na derme e em tecidos subcutneos. Tais alteraes so determinadas pelo estrgeno.16 Estudos de Rosenbaum et al.15 apontam a anatomia topogrca do tecido adiposo, na qual distinguem-se duas camadas separadas por uma fscia supercial. A camada mais externa, que ca em contato com a derme, chama-se areolar e composta por adipcitos globulares e volumosos, em disposio vertical, com vasos sanguneos numerosos e delicados. J a camada mais profunda, denominada lamelar, apresenta clulas fusifor8

mes, menores e com disposio horizontal, onde os vasos so de maior calibre.15 Em mulheres, o limite derme-hipoderme irregular e os septos de tecido conjuntivo formam vigas verticais. Dessa forma, se houver hipertroa da hipoderme, ocorrer formao de herniaes para a derme reticular, resultando no aspecto casca de laranja na pele. Em homens, o limite derme-hipoderme liso, os septos so mais espessos e oblquos, e, quando ocorre hipertroa da hipoderme, esses septos, por serem oblquos, pressionam as clulas adiposas contra a musculatura subjacente em direo derme, sem formar, portanto, herniaes.15, 16 Qualquer substncia que atue sobre a substncia fundamental amorfa, sobre vasos ou sobre o tecido adiposo poder ser til no tratamento da lipodistroa ginide, j que a sua causa multifatorial.16 Mas, para atuar na derme e hipoderme, a substncia ativa precisa permear a pele e, por isso, promotores qumicos de permeao, muitas vezes, so adicionados nas formulaes.17 A presena dos promotores de permeao, atuando por mecanismos diversos, pode proporcionar variaes no uxo de uma substncia atravs da pele, mediante modicaes na estrutura das membranas celulares, alteraes dos coecientes de difuso e dos coecientes de partilha estrato crneo-veculo, inuenciando no contedo hdrico ou ainda por diminuio das tenses de interface.17 Tais promotores, todavia, devem apresentar-se incuos, farmacologicamente inativos, no interferindo nos princpios ativos nem modicando as caractersticas fsicas e sensoriais prprias de cada produto, devendo tambm apresentar efeito imediato e reversvel.17 Entre os promotores de permeao, tem-se o cido olico (AO) e o miristato de isopropila (MI). Por tcnicas calorimtricas, justica-se o emprego do AO pelo fato de ele uidicar os lipdeos do estrato crneo, permitindo a difuso mais rpida das substncias. O MI, ster de cido graxo, pode aumentar a solubilidade das substncias no veculo.17 Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos de emulso (E) contendo concentraes diferentes de extrato seco de guaran (ESG), acrescida, separadamente, de dois promotores qumiSADE REV., Piracicaba, 6(14): 07-12, 2004

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cos de permeao cutnea AO ou MI sobre os vasos sanguneos da derme papilar de ratos.

MATERIAL E MTODOS
Quanticao de cafena no ESG
A quanticao de cafena no ESG foi realizada segundo procedimento encontrado na Farmacopia dos Estados Unidos do Brasil, 2. ed.10 Pesou-se cerca de 5 g de ESG e transferiu-se para um funil de separao. Adicionaram-se 40 mL de clorofrmio, 5 mL de hidrxido de amnio 10% e agitou-se por cinco minutos. Deixouse em repouso por 15 minutos e ltrou-se o clorofrmio para um bquer atravs de algodo hidrlo. Repetiu-se a extrao com trs pores de 20 mL de clorofrmio. Em banho de areia, evaporaram-se os extratos clorofrmicos reunidos, at a secura. Juntaram-se ao resduo 15 mL de gua destilada, 0,5 mL de cido sulfrico 10% e ferveu-se por dois minutos. Os extratos foram resfriados e ltrados em papel de ltro para um funil de separao. Alcalinizou-se o ltrado com hidrxido de amnio 10% e extraiu-se a cafena com 20 mL, 25 mL e 30 mL de clorofrmio. Os extratos clorofrmicos foram recolhidos, ltrando-os atravs de algodo hidrlo para um bquer tarado. Evaporou-se o extrato clorofrmico em banho de areia, levando-o posteriormente a uma estufa a 90C por uma hora. Esfriou-se o extrato em dessecador e calculou-se a quantidade percentual de cafena extrada do ESG. O experimento foi realizado em triplicata.

trole; j no segundo grupo empregou-se numa das reas E + ESG 50%, em outra E + ESG 50% + AO 1% e numa terceira E + ESG 50% + MI 1%, servindo de controle a quarta rea. A quantidade de formulao aplicada nas reas de tratamento foi de 1 g por dia, com exceo do grupo-controle, que no recebeu formulao. Fragmentos dessas reas foram xados em soluo tamponada de formol 10% e processados rotineiramente em parana para colorao com hematoxilina e eosina (HE). De cada rea zeramse trs lminas com trs cortes no seriados de 6 m. Contaram-se os nmeros de vasos sanguneos em cinco reas de 250 m2 por corte, utilizando ocular reticular integradora milimetrada da Zeiss.5 Portanto, por animal, em cada tratamento, obteve-se uma rea total de 11.250 m2 (250 m2 x cinco reas x nove cortes). A anlise estatstica foi realizada por meio de teste no paramtrico de Kruskal-Wallis, seguido por teste de comparao mltipla de Dunn's.

RESULTADOS E DISCUSSO
Quanticao de cafena no ESG
Os resultados da quanticao de cafena no ESG encontram-se na tabela 1.
Tabela 1. Quanticao de cafena em 5g de ESG. AMOSTRA QUANTIDADE DE CAFENA % 1 0,503 10,06 2 0,49 9,8 3 0,501 10,02 Mdia 0,498 0,007 9,96 0,14

Anlise experimental
As emulses empregadas no experimento compuseram-se de base auto-emulsionante a frio (que contm uma associao balanceada de doadores de viscosidade, emulsionantes, steres fosfricos e emolientes) 5%, MI ou AO 1%, metil dibromoglutaronitrila e fenoxietanol 0,2%, glicerina 5%, gua destilada e ESG 20% ou 50%. Utilizaram-se dez ratos machos albinos, linhagem Wistar, divididos em dois grupos experimentais. Em todos os animais, foram delimitadas quatro reas de 1 cm2 no dorso, expostas diariamente, por um perodo de 15 dias, s seguintes formulaes: o primeiro grupo experimental recebeu E + ESG 20% numa das reas, E + ESG 20% + AO 1% numa segunda rea e E + ESG 20% + MI 1% numa terceira, reservando-se a quarta para o conEstudos anteriores comprovaram que 5% de cafena em formulaes dermocosmticas provocaram diminuio signicativa do nmero de adipcitos, levando ainda lise dessas clulas.3 Alm disso, tal concentrao de cafena est presente em vrias formulaes lipolticas presentes no mercado. Dessa forma, pretendia-se incorporar nas formulaes uma quantidade de extrato de guaran em que se tivesse 5% de cafena. Para tanto, realizou-se a quanticao de cafena no ESG (tab. 1). Observou-se a presena de cerca de 10% de cafena em 5 g de extrato. Esse resultado est de acordo ao preconizado na literatura.10 Assim, para se ter 5% de cafena na formulao, 50% de extrato precisariam ser incorporados a ela. Para outro grupo, incorporaram-se 20% de extrato nas for9

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mulaes (2% de cafena), com o propsito de saber se a ao seria dose-dependente.

Anlises morfomtricas e histolgicas

A tabela 2 apresenta os resultados das contagens do nmero de vasos sanguneos nos tratamentos realizados. Observa-se que rea controle no apresentou diferena estatisticamente signicativa em relao rea tratada com E + ESG 20%, independentemente da presena ou no dos promotores qumicos de absoro. Isso nos leva a acreditar que tal concentrao de extrato pode ser insuciente para ocasionar algum benefcio na pele acometida pela celulite. Por outro lado, quando a base cosmtica foi acrescida de 50% de ESG, obteve-se um aumento de 439,22% na vascularizao da derme. Todavia, a presena dos promotores qumicos no alterou estatisticamente o efeito do ESG 50% nos vasos sanguneos da derme (aumento do nmero de vasos de 500% com AO e 460% com MI). Esses promotores foram utilizados em concentraes geralmente comuns nas formulaes. Ainda assim, elas provavelmente no se revelaram sucientes para promover alguma alterao no efeito do ESG 50%. Alberti et al.2 vericaram o efeito promotor do MI numa concentrao de 50% na formulao. J Touitou et al.18 observaram o efeito promotor do AO numa concentrao de 10%. Os efeitos das formulaes nos vasos sanguneos da derme podem ser melhor visualizados na gura 1, em que se percebe maior nmero de vasos sanguneos nas reas onde aplicou-se ESG 50% (1e, 1f e 1g) quando comparado com o controle (1a). Nas reas que receberam ESG 20%, entretanto, no se vericou alteraes estatisticamente signicativas no nmero de vasos sanguneos (1b, 1c e 1d) em relao ao controle (1a).
Tabela 2. Contagem do nmero de vasos sanguneos da regio papilar da derme analisados numa rea de 11.250 m2. TRATAMENTOS MDIA ERRO-PADRO
MDIO

Controle 9,00 0,89 E + ESG 20% 17,40 2,75 E + ESG 20% + AO 1% 18,53 3,73 E + ESG 20% + MI 1% 16,60 3,24 E + ESG 50% 39,53* 1,64 E + ESG 50% + AO 1% 45,13* 3,76 E + ESG 50% + MI 1% 41,40* 1,06 * p < 0,05 quando comparado com o controle. Os valores esto representados como mdia erro-padro mdio (n = 5).
10

O objetivo principal do trabalho era vericar a eccia das formulaes na hipoderme do rato, mas ela revelou-se bastante reduzida e irregular. Em estudo anterior, observou-se que o suno tem se mostrado um bom modelo experimental para o estudo de formulaes destinadas a preveno e tratamento da celulite.3, 14 Contudo, os resultados obtidos sugerem que 50% do extrato na base cosmtica, independentemente do promotor qumico utilizado, podem ocasionar efeitos interessantes na pele, uma vez que o aumento da vascularizao essencial ao fornecimento suciente de oxignio e nutrientes para a pele, mantendo a homeostase e a nutrio tecidual normal.6 Tal efeito deve ser buscado por um produto cosmtico, visto que, aprimorando a nutrio cutnea, seu aspecto conseqentemente tambm ir melhorar. Essas alteraes na derme apontam possivelmente um quadro de angiognese, que pode ser denida como um complexo processo biolgico caracterizado pelo desenvolvimento de novos vasos sanguneos. Tal processo envolve mltiplos passos, entre eles, induo da hiper-permeabilidade microvascular, levando ao extravasamento de protenas plasmticas, como brinognio e protrombina, degradao enzimtica da membrana basal vascular e matriz intersticial, migrao e proliferao de clulas endoteliais mediante a liberao do fator de crescimento vascular endotelial (FCVE) e, nalmente, formao de vasos sanguneos maduros.6 Segundo Espnola et al.,9 taninos e saponinas esto presentes em altas concentraes no extrato de guaran. Os taninos constituem um grupo de bioavonides polifenlicos ativos, sintetizados por muitas plantas, facilitando a cicatrizao de feridas.11 Khanna et al.12 notaram que o tratamento tpico com extrato de semente de uva com suas altas concentraes de taninos, que possuem notvel ao antioxidante aumentou a liberao do FCVE. O aumento da liberao de FCVE, por sua vez, leva maior permeabilidade vascular, promovendo angiognese. Para Detmar,6 durante a angiognese, a expresso do FCVE induzida em queratincitos da epiderme por vrios estmulos, transformando fator de crescimento tumoral alfa (TNF-) e hipxia, o que aumenta a vascularizao da derme, como vericado neste trabalho (g. 1 e tab. 2).
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Figura 1. Controle (1a); E + ESG 20% (1b); E + ESG 20% + AO 1% (1c); E + ESG 20% + MI 1% (1d); E + ESG 50% (1e); E + ESG 50% + AO 1% (1f); E + ESG 50% + MI 1% (1g). Observar nos tratamentos com E + ESG 50%, acrescido tanto de AO 1% quanto de MI 1%, a presena de vasos sanguneos na derme seta (HE, 10x).

1a

1b

1c

1d

1e

1f

1g
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Morisaki et al.13 tambm perceberam que as saponinas, presentes no ESG, estimulam a angiognese in vivo. Em relao ao excessivo sangramento observado no momento da retirada dos fragmentos de pele, ele pode ser explicado pelo fato de o extrato de guaran diminuir a agregao plaquetria e a formao de tromboxanas plaquetrias, aumentando a quantidade de sangue.4 Este estudo preliminar, por sua vez, nos conduzir, certamente, a outras pesquisas. Em estudos futuros, pretende-se, por exemplo, avaliar a eccia da base acrescida de 50% de extrato no tecido adiposo de sunos. Por outro lado, pode-se vericar que 50% de ESG aumentaram a microcirculao cutnea, o que pode ser interessante a outras categorias de cosmticos, como os que

possuem atividade antienvelhecimento da pele, j que permitem melhora na nutrio cutnea.

CONCLUSES
Diante das condies experimentais, pode-se concluir que: o rato no se mostrou um modelo experimental para estudo de hipoderme; ESG 20% no provocou alteraes signicativas na derme papilar de ratos, independentemente do promotor qumico utilizado; j ESG 50% causou aumento do nmero de vasos sanguneos na derme, sendo que os promotores qumicos de absoro no potencializaram o efeito do extrato.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Accrsio W. Celulite x Cafena. Revista de Cosmiatria & Esttica 1999; 7(4): 25-6. 2. Alberti I, Kalia YN, Naik A, Bonny JD, Guy RH. Effect of Ethanol and Isopropyl Myristate on the Availability of Topical Terbinane in Human Stratum Corneum, in Vivo. International Journal of Pharmaceutics 2001; 219:11-9. 3. Chorilli M, Polacow MLO, Pires-de-Campos MSM, Leonardi GR, Granzotto TM. Estudo da Permeao Cutnea da Cafena com o Uso do UltraSom: teste in vivo e avaliao histolgica. Anais do XXXIV Congresso Brasileiro de Farmacologia e Teraputica Experimental; 2002 Out 28-31; guas de Lindia, Brasil. guas de Lindia: SBFTE; 2002. 239. 4. Bydlowski SP Damico EA, Chamone DA. An Aqueous Extract of Guarana (Paullinia cupana) Decreases Platelet Thromboxane Synthesis. Braz J , Med Biol Res 1991; 24(4):421-4. 5. De Lacerda, CAM. Manual de Quanticao Morfolgica: morfometria, alometria, estereologia. 2. ed. Rio de Janeiro: CEBIO; 1994. p.8-9. 6. Detmar M. The Role of VEGF and Thrombospondins in Skin Angiogenesis. Journal of Dermatological Science 2000; 24:S78-S84. 7. Di Salvo RM. Controlando o Surgimento da Celulite. Cosm Toil 1996; 8(4):56-62. 8. Dweck AC. Formulating with Natural Ingredients. Cosm Toil 2001; 116(5):57-60. 9. Espinola EB, Dias RF, Mattei R, Carlini EA. Pharmacological Activity of Guarana (Paullinia cupana Mart.) in Laboratory Animals. Journal of Ethnopharmacology 1997; 35:223-9. 10. Farmacopia dos Estados Unidos do Brasil. 2. ed. 1959. p.512-3. 11. Hupkens P Boxma H, Dokter J. Tannic Acid as a Topical Agent in Burns: historical considerations and implications for new developments. Burns , 1995; 21:57-61. 12. Khanna S, Venojarvi M, Roy S, Sharma N, Trikha P Bagchi D, et al. Dermal Wound Healing Properties of Redox-Active Grape Seed Proanthocyani, dins. Free Radical Biology & Medicine 2002; 33(8):1.089-96. 13. Morisaki N, Watanabe S, Tezuka M, Zenibayashi M, Shiina RL, Koyama N, et al. Mechanism of Angiogenic Effects of Saponin from Ginseng Radix Rubra in Human Umbilical vein Endothelial Cells. Br J Pharmacol 1995; 115(7):1.188-93. 14. Polacow MLO, Pires-de-Campos MSM, Leonardi GR, Carvalho LS, Fiori Jnior JF. Avaliao Histolgica da Pele de Sunos Submetida ao Tratamento Tpico com Tiratricol e Ultra-Som. Anais do XV Congresso Brasileiro de Cosmetologia; 2001 Jul 24-26; So Paulo, Brasil. So Paulo: ABC; 2001. p.499-505. 15. Rosenbaum M, Prieto V, Hellmer J, Boschmann M, Krueger J, Leibel R, et al. An Exploratory Investigation of the Morphology and Biochemistry of Cellulite. Plastic and Reconstructive Surgery 1998; 101(7):1.934-9. 16. Rossi AB, Vergnanini AL. Cellulite: a review. J Eur Acad Dermatol Venereol 2000; 14(4):251-62. 17. Santos D, Bahia, MFG. Promotores de Absoro e Penetrao. Cosm Toil 1995; 7(5):42-51. 18. Touitou E, Godin B, Karl Y, Bujanover S, Becker Y. Oleic Acid, a Skin Penetration Enhancer, Affects Langerhans Cells and Corneocytes. Journal of Controlled Release 2002; 80:1-7. Submetido: 15/jan./2004 Aprovado: 17/set./2004
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