Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para clulas, tecidos e rgos vegetais - Produo de mudas em larga escala
Introduo
Joo Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia

A micropropagao uma forma vegetativa de propagao de diferentes espcies de plantas por meio da tcnica denominada cultura de tecidos. Essa tcnica requer laboratrios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imerso temporria, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material desinfestado j em condies de laboratrio em ambiente estril, e introduzido em frascos igualmente estreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contm, todos os nutrientes necessrios ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, alm de substncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material so mantidos em salas

de crescimento, sob condies de temperatura, luminosidade e fotoperodo adequados. Milhes de plantas so produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagao. Entretanto, esse mtodo de multiplicao altamente demandante de mo-de-obra e s em condies especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagao frente a outras formas de propagao baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagao baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com nmero reduzido de plntulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulao das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mo-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imerso temporria ou permanente de clulas, gemas, embries ou qualquer tipo de propgulo que possa ser utilizado na micropropagao. Os biorreatores utilizam meio de cultura lquido, permitem a renovao do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parmetros essenciais ao crescimento do propgulo, tais como pH, oxignio dissolvido, temperatura, concentrao de ons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, h muitas dcadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactrias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de clulas vegetais isoladas, de forma mui-

36

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 24- janeiro/fevereiro 2002

mais comum a injeo de um fluxo de ar a uma determinada presso, combinada com o movimento de uma hlice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita, 1994). O ar que entra no sistema esterilizado ao ser forado a passar atravs de uma membrana com poros de 0,22 a 0,44 micras de dimetro. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros, embora volumes menores como 250 e 500 ml, ou maiores, 20 ou at mesmo 300 litros j tenham sido utilizados. Entretanto, a maioria dos frascos utilizados est na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita, 1994). Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrio Vrios tipos de biorreatores tm sido desenvolvidos e utilizados ou tm potencial de uso em cultivo de gemas, embries e plantas. Esses biorreatores so classificados pelo tipo de agitao e construo do frasco (Takayama & Akita, 1994). Biorreatores tipo aerador agitador (aeration agitation bioreactor) Esse tipo de biorreator o mais parecido com os fermentadores convencionais. A agitao basicamente feita por meio de hlices conectadas a um eixo giratrio. basicamente utilizado para clulas e embries somticos (Kessel & Carr ,1972; Preil et al., 1988). A grande desvantagem desse modelo de biorreator que, para haver uma boa homogeneizao do meio, necessrio que a hlice gire em velocidades suficientemente elevadas, o que, regra geral, causa dano mecnico acentuado ao material em cultivo, principalmente em hastes e gemas. Biorreator tipo tambor rotatrio (roller drum bioreactor) Nesse tipo de biorreator, o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos, que servem no apenas de apoio, mas que tambm so responsveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatrio. Nesse tipo de biorreator, o dano mecnico mnimo e adequado ao
37

Figura 2. Sistema de biorreator, modelo compacto de 4 pares de frascos, utilizando bomba compressora de ar
to parecida com o que era feito com os fungos e bactrias. Inicialmente, os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificao para o cultivo de clulas vegetais. Para isso, pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovao do ar e nas formas de agitao das clulas. Biorreatores para cultivo de clulas vegetais foram bastante estudados, principalmente na dcada de 80, e uma srie de modelos especficos para plantas foram desenvolvidos. Recentemente, os biorreatores comearam a ser utilizados para cultivo de clulas, tecidos, gemas e plntulas, tendo como objetivo final a produo de mudas em larga escala. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagao vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagao de begnia. Nesse caso, os autores utilizaram segmentos nodais de plntulas estabelecidas in vitro, seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. Procedimentos similares foram adaptados para uma srie de outras espcies vegetais (Noriega & Sndahl, 1993; Akita & Takayama, 1994). Os biorreatores so aplicados igualmente produo de embries somticos (Tautorus et al., 1992; Denchev et al., 1992 e sementes sintticas (Attree et al., 1994; Onishi et al., 1994). Essa metodologia exige completo domnio sobre o processo de induo e seleo de calos embriognicos, bem como da diferenciao e encapslulamento dos embries somticos, alm da germinao das sementes sintticas. Constituio bsica dos biorreatores A constituio dos biorreatores usados para cultura de embrio, gemas e hastes caulinares para fins de micropropagao fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos, bactrias e clulas vegetais (Takayama & Akita, 1994). Basicamente, os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo, motor eltrico conectado a um eixo que se estende at o interior do frasco, bomba compressora de ar, sensores de temperatura, pH e oxignio (Takayama & Akita, 1994). O frasco de cultura desenhado de tal forma a permitir uma tima aerao do meio de cultura, bem como uma homogeneizao satisfatria com um mnimo de dano mecnico do material em cultivo. Os frascos podem ser feitos de vidro, ao inoxidvel, policarbonato, polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 C durante 15 a 30 minutos. Freqentemente, o frasco de cultivo apresenta um envoltrio metlico em forma de jaqueta, por onde circula gua com temperatura pre-determinada, para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita, 1994). A homogeneizao do meio de cultura e a aerao do material em cultivo so feitos de diversas formas, sendo a

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 24- janeiro/fevereiro 2002

biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de clulas, tecidos e rgos porque no h dano mecnico nem agitao via borbulhamento. O inconveniente desse modelo a no renovao do ar interno do frasco de cultivo, o que pode ser contornado com a incluso de um sistema de aerao via injeo de ar estril. Biorretor de aerao por membrana porosa ao oxignio (oxygen permeable membrane aerator bioreactor) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contm uma canalizao fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxignio, que pode ser de teflon, silicone, policarbonato ou polipropileno, atravs do qual o oxignio passa para o meio de cultura. Esse modelo de biorreator no apresenta problemas relacionados com o dano mecnico, uma vez que no h nenhum tipo de agitao, entretanto, a homogeneizao do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al, 1994). Biorreator do tipo sobre-aerao (overlay aeration bioreactor) Nesse modelo, a aerao feita por sopramento do ar estril sobre o meio de cultura. Eventualmente, esse tipo de aerao pode ser combinado com agitao suave do meio (Ishibashi et al., 1987). Esse modelo apresenta deficincia na aerao, o que pode comprometer o crescimento, sobretudo, de clulas e tecidos. Biorreator de imerso temporria Em todos os modelos descritos anteriormente, com exceo daquele que utiliza um sistema de pulverizao do meio, o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Essa imerso contnua causa problemas de hiperhidratao dos tecidos, rgos e plntulas. Dependendo da espcie e do tipo de meio utilizado, a hiperhidratao dos tecidos pode causar distrbios fisiolgicos srios, que iro afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Visando a eliminar ou a minimizar

Figura 3. Detalhe dos frascos do biorreator, com clulas embriognicas de caf em cultivo
cultivo de embries e plantas. Entretanto, o nvel de oxigenao s adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al., 1983). Biorreator tipo filtro rotatrio (spin filter biorreactor) Biorreator de filtro rotatrio apresenta um filtro conectado a um eixo central, por onde o meio de cultura descarregado (Styer, 1985). Esse elemento responsvel igualmente pela homogeneizao, bem como pela aerao do material em cultivo. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagao via embriognese somtica (Wheat et al., 1986). Biorreator tipo borbulhamento (air driven bioreactor) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituio muito simples. A homogeneizao do meio, bem como a aerao so feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. Pode ser de dois tipos: aerao simples ou coluna de bolha. Biorreator de aerao simples e coluna de bolha (bubble column bioreactor) A relao altura/dimetro de 1 a 2 define o biorreator de aerao simples e se a relao 3 ou acima, o biorreator do tipo coluna de bolha. Esses modelos
38

de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares, bulbos, cormos e tubrculos (Takayama & Misawa, 1981; Takayama et al, 1991). Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagaco, por Takayama & Misawa (1981). Biorreator do tipo levantamento de ar (air lift bioreactor) O meio de cultura nesse tipo de biorreator movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. Esse modelo apresenta bons resultados, uma vez que h uma boa aerao e homogeneizao do meio de cultura e pouco dano mecnico ao material em cultivo (Park et al, 1989). A nica diferena desse biorreator para o modelo anterior que o borbulhamento de ar feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. Biorreator do tipo fase gasosa (gaseous phase bioreactor) Esse modelo equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo posicionado. O meio de cultura, pulverizado sobre o material em cultivo , em seguida, drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama, 1984). Esse tipo de

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 24- janeiro/fevereiro 2002

Figura 4. Hastes de abacaxi, em cultivo, em biorreator de imerso temporria, em meio de multiplicao

esse problema, foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imerso temporria (Alvard et al., 1993). Nesse tipo de biorreator, o meio de cultura permanece em contato com o explante por um perodo predeterminado. Em seguida, o meio drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) constitudo de um frasco de dois compartimentos, um superior e um inferior, conectados entre si por um tubo. O meio de cultura colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado, no superior. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeo de ar no compartimento inferior. Quando todo o meio passa para o compartimento superior, ocorre borbulhamento e aerao do meio em contato com o material em cultivo. O ar expelido atravs de um orifcio na tampa do compartimento superior. Aps um perodo preestabelecido, a presso do ar no compartimento inferior aliviada, o que, por gravidade, faz com que o meio retorne ao compartimento inferior, permanecendo a at que o ciclo recomece. O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) foi modificado no que se refere construo, mas mantendo as mesmas caractersticas de funcionamento, dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA (Teisson et al., 1995). O sistema RITA vem sendo utilizado para uma srie de espcies vegetais, com diferentes tipos de explantes, apresentando resultados muito bons (Alvard et al., 1993; Teisson et al., 1995; Etienne et al., 1997; Cabasson et al., 1997; Etienne et al., 1999). Na realidade, o princpio da imerso temporria para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). Segundo Harris & Mason (1983), Steward et al. (1952) demonstraram que razes de cenoura imersos em meio lquido no apresentavam crescimento satisfatrio e concluram que o motivo se Figura 5. Mudas alongadas de abacaxi, aps a tratava de deficincia de multiplicao e alongamento em biorreator de oxigenao do meio de imerso temporria, prontas para serem cultura. Visando a contoraclimatadas

nar esse problema, delinearam e construram um equipamento que foi denominado auxophyton, o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda, de tal forma que, em determinado momento, os segmentos de raiz eram expostos ao ar e, no momento seguinte, submersos no meio lquido, conseguindo, com isso, um aumento da matria fresca de 38,1 mg em meio gelificado para 98,6 mg em meio lquido, no auxophyton. Posteriormente, um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983), para cultivo de explantes de uva em meio lquido em frascos tipo Erlenmeyer, apresentava o mesmo princpio relatado por Steward et al. (1952). Nesse equipamento, o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posio a intervalos predeterminados, de tal forma que, em certa posio, o explante se encontrava submerso e, em outra posio, no submerso. O estoque inicial de explantes era obtido atravs do cultivo, por 28 dias, em meio gelificado com agar. Aps 90 dias de cultivo no meio de imerso temporria, a produo de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo perodo em meio com agar. Em 1985, Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imerso temporria, que consistia de uma grande cmara de cultura, a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatrio, esse mtodo de cultivo por imerso temporria mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imerso temporria na propagao de Pinus. Nesse sistema, o meio nutritivo lquido era colocado sobre o meio slido sobre o qual estavam os explantes. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. Aps esse perodo, o meio era retirado atravs de uma bomba de vcuo. Esse procedimento era repetido a cada semana. Pouco tempo depois, Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automtico de cultivo sob imerso temporria, no qual plntulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado, com adio e remoo automtica e peridica do meio lquido. Simonton et al. (1991) desenvolve39

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 24- janeiro/fevereiro 2002

c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes nmeros de frascos de cultivo, o que determinado pela extenso das tubulaes, bem como pela potncia do compressor ou da fonte de ar comprimido; d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz, fotoperodo e temperatura; e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imerso temporria ou contnua. f) no regime de imerso contnua, o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contnuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporrio, cujo perodo pode ser definido pelo temporizador. Para isso, so necessrios pequenos ajustes no equipamento;

Figura 6. Plantas aclimatadas de abacaxi, multiplicadas em biorreator de imerso temporria

ram um equipamento automtico de micropropagao, no qual o meio lquido era injetado sobre as plntulas em cultivo, de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposio do explante ao meio de cultura, alguns problemas foram identificados, como o uso de um frasco relativamente grande, de difcil manuseio, alm de alguns problemas de contaminao especialmente do tipo bacteriana. Uma modificao mais recente do modelo de biorreator de imerso temporria foi feito por Lorenzo et al. (1998) para micropropagao de gemas de cana-de-acar e Escalona et al. (1999) para gemas de abacaxi. Esse sistema utiliza dois frascos, sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. O meio de cultura transferido de um frasco para o outro por meio de um vcuo de 250 mm de Hg. Entretanto, no foram apresentados detalhes adicionais da construo e funcionamento desse tipo de biorreator. Os modelos de biorreatores de imerso contnua encontrados na literatura cientfica, em termos gerais, so equipamentos: a) complexos, do ponto de vista de montagem e funcionamento; b) destinam-se apenas ao cultivo sob condies de imerso contnua, no permitindo versatilidade no seu uso, por
40

ex., transformao de um modelo de imerso contnua para imerso temporria e vice-versa; c) de difcil manipulao durante as fases de esterilizao, carga, descarga e troca do meio de cultura. Por sua vez, os modelos de imerso temporria so mais simples na sua concepo, montagem e funcionamento. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI, para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al., (1993) e Lorenzo et al. (1998), que permite uma grande versatilidade de uso. O equipamento apresenta as seguintes caractersticas no encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos, os quais podem variar em tamanho, formato, constituio, tipo de tampa, transparncia, etc.; b) a montagem simples e os componentes (vlvulas solenides, temporizadores, fonte de ar comprimido, filtros de ar, fluxmetro, conexes metlicas, mangueiras de silicone, etc.) podem ser de fcil aquisio ou feitura;

g) o equipamento permite fazer, ainda, uso de uma fonte de ar artificial com dosagens especficas de oxignio, nitrognio e gs carbnico; h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de clulas e embries, quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. Nos primeiros ensaios, o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberizao e hastes de abacaxi visando multibrotao e ao alongamento das mudas, sob regime de imerso temporria. Em ambos os casos, os resultados preliminares foram excelentes. No momento, esto em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi, em experimentos de multiplicao para fins de comparao com o cultivo em meio lquido estacionrio e em meio gelificado. Esto igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de clulas embriognicas de caf. Por ser um equipamento recmdesenvolvido, vrias modificaes esto sendo introduzidas no sistema, como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminao com vistas a ajust-lo para cultivo de explantes especficos, como clulas e gemas, alm de propiciar uma

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 24- janeiro/fevereiro 2002

melhora no funcionamento, bem como no uso e economia da fonte luminosa. Alguns exemplos de uso podem ser enumerados para esse sistema de cultivo em meio lquido, de forma semi-automtica: cultivo de clulas embriognicas e no embriognicas, embries somticos de diferentes espcies, gemas axilares e apicais para fins de multibrotao, microestacas de vrias espcies para fins de crescimento e multiplicao das hastes caulinares, cultivo de raiz para experimentos diversos, incluindo a produo de metablitos secundrios, alm de outras aplicaes, como a germinao de embrio zigtico in vitro, em alta quantidade e em condies totalmente asspticas. Referncia Bibliogrfica Akita, M & Takayama, S. Stimulation of potato (Solanum tuberosum L. ) tuberization by semicontinous liquid medium surface level control. Plant Cell Rep. 13:184187, 1994; Alvard, D.; Cote, F. & Teisson, C. Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 32:55-60, 1993; Aitken-Chistie, J. & Davies, H. Development of a semiautomated micropropagation system. Acta Horticult. 230:81-87, 1988; Atken-Chistie, J. & Jones, C. Towards automation: radiata pine shoot hedges in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 8:185-196, 1987; Attree, S.M.; Pomeroy, M.K. & Fowke, L.C. Production of vigorous, desiccation tolerant white spruce (Picea glauca (Moench.) Voss.) synthetic seeds in a bioreactor. Plant Cell Rep. 13:601-606, 1994; Cabasson, C.; Alvard, D.; Dambier, D.; Ollitrault, P. & Teisson, C. Improvement of Citrus somatic embryo development by temporary immersion. Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 50:33-37, 1997; Denchev, P.D.; Kuklin, A.I. & Scragg, A.H. Somatic embryo production in bioreactors. J. Biotechnol. 26:99-109, 1992; Escalona, M; Lorenzo,J.C; Gonzalez, B.; Daquinta, M.; Gonzalez, J.L.; Desjardins,Y.; Borroto, C.G. Pine-

apple (Ananas comosus L. Merr) micropropagation in temporary immersion systems. Plant Cell Rep. 18(9):.743-748, 1999; Etienne, H.; Lartaud, M; Michaux-Ferrierre, N. Carron, M.P. Berthouly, M. & Teisson, C. Improvement of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis (Mll. Arg.) using the temporary immersion technique. In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant 33:81-87, 1997; Etienne-Bary, D. Bertrand, B.; Vasquez, N. & Etienne, H. Direct sowing of Coffea arabica somatic embryos mass-produced in a bioreactor and regeneration of plants. Plant Cell Rep. 19:111-117, 1999; Harris, R.E. & Mason, E.B.B. Two machines for in vitro propagation of plants in liquid medium. Can. J. Plant Sci. 63:311-316, 1983; Ishibashi, T.; Odawara, U.; Fujiwara, K. & Ookuma, M. New oxygen supplying methods for animal cell reactors. Hitachi Hyouron 69:301305, 1987; Kessel, R.H.J. & Carr,A.H.. The effect of dissolved oxygen concentration on growth and differentiation of carrot (Daucus carota) tissue. J. Exp. Bot. 23:996-1007, 1972; Lorenzo, J.C.; Gonzalez, B.L.; Escalona, M.; Teisson, C. ; Espinosa, P. & Borroto, C. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system. Cell, Tissue and Org. Cult. 54:197-200, 1988; Luttman, R.; Florek, P. & Preil, W. Silicone-tubing aerated bioreactors for somatic embryo production. Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 39(2):157-170, 1994; Noriega, C. & Sndahl, M.R. Arabic coffee micropropagation through somatic embryogenesis via bioreactors. Biotechnologie ASIC, 15e Colloque, Montpellier. p.73-81 1993; Onishi, N.; Sakamoto, Y. & Hirosawa, T. Synthetic seeds as an application of mass production of somatic embryos. Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 39:137-145, 1994; Park, J.M. ; Hu, W-S. & Staba, E.J. Cultivation of Artemisia annua L. plantlets in a bioreactor containing a single carbon and a single nitrogen source. Biotechnol. and Bioeng. 34:1209-1213, 1989; Preil, W.; Florek, P.; Wix, U. & Beck, A.. Towards mass propagation by use

of bioreactors. Acta Hortic. 226:99100, 1988; Simonton, W.; Robacker, C. & Krueger, S. A programable micropropagation apparatus using cycled liquid medium. Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 27:211-218, 1991; Steward, F.C.; Caplin, S.M. & Millar, F.K. Investigations on growth and metabolism of plant cells. I. New techniques for the investigation of metabolism, nutrition and growth in undifferentiated cells. Ann. Bot. 16:5777, 1952; Styer, D.J. Bioreactor technology for plant propagation. In: Tissue Culture In Forestry and Agriculture. Henke, R.R. & Hughes, K.W. (Eds.). Plenum Press, New York, pp.117-130, 1985; Takayama, S. & Akita, M. The types of bioreactors used for shoots and embryos. Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 39:147-156, 1994; Takayama, S. & Misawa, M. Mass propagation of Begonia x hiemalis) plantlets by shake culture. Plant & Cell Physiol. 22(3):461-467, 1981; Takayama, S.; Swedlund, B. & Miwa, U. Automated propagation of microbulbs of lilies. In: Cell Cultures and Somatic Cell Genetics. Vasil, I.K., ed., Academic Press Inc. Vol. 8, p.111131, 1991; Tanaka, H.; Nishijima, F. Suwa, M. & Iwamoto, T. Rotating drum fermentor for plant cell suspension cultures. Biotechnol. Bioeng. 25:2359-2370, 1983; Tautorus, T.E.; Lulsdorf, M.M.; Kikcio & Dunstan, D.I. Bioreactor culture of Picea glauca-engelmannii (interior spruce) somatic embryos. Growth parameters. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38:46-51, 1992; Teisson, C.; Alvard, D.; Berthouly, M.; Cote, F.; Escalant, J.V. & Etienne, H. In vitro culture by temporary immersion: a new device. Plantations 2(5):32-33, 1995; Tisserat, B.; Vandercook, C.E. Development of an automated plant culture system. Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 5:107-117, 1985; Ushiyama, K. Large scale culture techniques of plant cells and the secondary metabolite production. Hakko. To Kogyo 46:7-11, 1984; Wheat, D.; Bondrik, R.P. & Nystrom, J. Spin filter bioreactor technology as applied to industrial plant propagation. HortSci. 21:819, 1986.
41

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 24- janeiro/fevereiro 2002