CONTAGEM DE Campylobacter spp.

SEGUNDO A ESPECIFICAO TCNICA ISO 10272 2(2006)

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OBJECTIVO Verificar a presena e contagem de Campylobacter spp., segundo a especificao Tcnica ISO 10272-2 (2006), em uma amostra de um prato do dia, frango grelhado com arroz de midos. A colheita da amostra foi efectuada em uma unidade de Restaurao, como parte de um procedimento de verificao da implementao de um plano HACCP, por forma a se poder verificar ou no a segurana dos produtos oferecidos ao consumidor final. A amostra foi recepcionada pelo Laboratrio em Avaliao de Contaminantes e Perigos Biolgicos do Instituto Superior de Cincias da Sade Egas Moniz, no dia 08 de Dezembro de 2010. INTRODUO Campylobacter spp. O termo Campylobacter foi proposto em 1963 por Sebald e Vron para designar as bactrias microaerfilas at ento includas no gnero Vibrio. Caractersticas gerais As bactrias do gnero Campylobacter so bastonetes Gram negativos e caracterizam-se por terem uma morfologia curva tpica, em forma de S, de vrgula ou em espiral. Por vezes, estes microrganismos podem ainda apresentar uma forma que se designa por asa de gaivota. Outras caractersticas frequentemente observadas so as longas formas espirais, que ocorrem quando duas clulas filhas permanecem juntas, aps a respectiva diviso. O gnero Campylobacter apresenta as seguintes dimenses: 2 a 0,5 m de largura e 0,5 a 8 m de comprimento. Estes microrganismos so mveis, devido presena de um nico flagelo polar em uma ou em ambas as extremidades, que pode medir at trs vezes o comprimento da clula, e que lhe confere o movimento caracterstico tipo saca-rolha ou vaivm. De referir

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que, esta caracterstica pode ser facilmente observvel ao microscpio de contraste de fase ou em campo escuro. O seu metabolismo respiratrio. As condies que permitem o seu crescimento e sobrevivncia so as seguintes: Temperatura A temperatura ptima situa-se entre os 37C e 42C, no crescendo em ambientes com temperaturas inferiores a 30C. pH O pH ptimo para o desenvolvimento do gnero Campylobacter situa-se entre 5,8 e 8,0, ficando inactivos a pH inferior a 4,9. Actividade da gua (aw) A atividade de gua (Aa) um parmetro muito importante para o desenvolvimento microbiano, a concentrao mnima necessria 0,97 e no podendo passar de 2,0% de NaCl. Relao com o oxignio Desenvolvem-se em microaerofilia, isto , crescem em concentraes reduzidas de oxignio e elevadas concentraes de dixido de carbono, embora existam espcies que se desenvolvem em anaerobiose. O seu crescimento estimulado pelo hidrognio, quer em microaerofilia, quer em anaerobiose. Radiao As bactrias so sensveis radiao gama (aproximadamente 2 KiloGrey). Principais fontes de contaminao Campylobacter spp. encontra-se distribudo na natureza, sendo o principal reservatrio o tracto gastrointestinal das aves, mamferos domsticos, nomeadamente bovinos, sunos, ovinos, candeos e felinos, bem como animais
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selvagens. A contaminao por este agente enteropatognico ocorre quer directamente atravs do contacto com animais portadores e respectivas carcaas, quer indirectamente pela ingesto de alimentos contaminados, tais como carne de aves, sunos e bovinos, leite no pasteurizado e gua. Alimentos mais frequentemente associados a intoxicaes por

Campylobacter spp. O Leite no pasteurizado ou contaminado ps pasteurizao, carnes de aves mal cozinhadas e gua inadequadamente tratada so as principais fontes de contaminao. O Campylobacter pode, tambm, estar presente nos midos das aves, especialmente fgado. O leite no pasteurizado contamina-se quando a vaca apresenta infeco por Campylobacter no bere ou quando o leite entra em contacto com fezes ou adubo orgnico no tratado. guas de superfcie contaminam-se com fezes de aves silvestres e gado. Os produtos base de carne de aves surgem como causa principal das campylobacterioses, nomeadamente atravs do consumo de carne mal cozida (essencialmente de aves) ou pela contaminao cruzada. Principais sintomas da intoxicao por Campylobacter ssp. A Campilobacteriose origina sintomas geralmente severos, tais como, diarreia aquosa com muco e sangue, dores abdominais agudas, podendo surgir febre e dores de cabea. A sintomatologia surge 2 a 6 dias aps a ingesto dos alimentos contaminados e subsistem por 7 dias, ocorrendo a excreo do microrganismo pelas fezes durante 2 a 3 semanas. Grupos de risco Preveno da contaminao Confirmao laboratorial Embora a pesquisa de Campylobacter raramente seja imposta pela regulamentao, a indstria agro-alimentar tem a responsabilidade de decidir e
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de pr em prtica as medidas necessrias para garantir a segurana dos alimentos. Assim, a EFSA (European Food Safety Authority) preconiza um plano de vigilncia destinado a reduzir o risco ligado ao Campylobacter atravs de uma nova norma NF EN ISO 10272-1 (Abril 2006) para pesquisa do Campylobacter spp. A identificao presuntiva de Campylobacter baseia-se na sua citomorfologia (colorao de Gram), na mobilidade caracterstica observvel em microscpio e na prova da oxidase. O controlo da campilobacteriose humanas depende da higiene, quer na manipulao dos alimentos, quer no contacto com animais.

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MEIOS DE CULTURA Para a cultura de microrganismos necessrio existirem meios de cultura apropriados que simulem ou at melhorem as condies naturais do ambiente em que se desenvolvem. Os meios de cultura so preparaes (slidas, lquidas ou semi-slidas) que contm todos os nutrientes utilizados para o crescimento de microrganismos em laboratrio. Os microrganismos tm necessidades nutricionais variveis de acordo com a espcie. Se as exigncias de determinado microrganismo so conhecidas possvel estabelecer um conjunto de condies (meio de cultura, valores de pH, oxignio, etc.) que favoream o seu crescimento e desencorajem o crescimento de outros, permitindo assim o seu isolamento. Gelose Campyfood ID Os meios selectivos so formulados para suprimir o crescimento de microrganismos que no interessam para o nosso objectivo, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar. A gelose Campyfood ID um meio selectivo, da bioMrieux, pronto a usar para uma deteco fcil do Campylobacter em produtos alimentares e amostras ambientais. A especificidade deste meio conseguida atravs da associao especfica de um indicador colorido e de antibiticos. As bactrias Campylobacter formam colnias vermelhas a laranja vermelha na gelose bege clara geralmente aps apenas 24 horas de incubao microaeroflica a 41,5C. Gelose Columbia um meio no selectivo (meio base) que com a adio de substncias especficas, sangue ou agentes selectivos, origina meios de cultura especiais para multiplicao, isolamento ou identificao de microrganismos. Colorao de Gram

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Foi descoberta pelo mdico Dinamarqus Christian Gram em 18831 e baseiase na diferena de composio qumica e espessura das paredes bacterianas que condiciona a permeabilidade ao lcool e acetona e, em consequncia, a dissoluo mais ou menos rpida de complexos corados formados no citoplasma. Esta colorao permite dividir as bactrias em dois grandes grupos: - as bactrias Gram (+); - as bactrias Gram (-). A tcnica de colorao de Gram consiste em expor as clulas bacterianas seguinte sequncia: Corante primrio: violeta de cristal: cora o citoplasma de prpura, independentemente do tipo de clula. Mordente: soluo de iodo (Lugol): aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula. Agente descolorante: lcool, acetona ou ambos: solvente lipdico. Contrastante: safranina ou fucsina bsica: cora o citoplasma de vermelho. As bactrias geralmente mordente, Gram+ apresentam e uma parede espessa, predominantemente homognea, por no estratificada constituda

peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolvel que se forma por aco do fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (prpura). As bactrias Gram - apresentam uma parede estratificada constituda por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contm peptidoglicano e que mais fina que a das Gram+. Deste modo, o precipitado insolvel, que se forma por aco do mordente, removido e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante, pelo que as clulas ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante. Teste da Oxidase

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O teste da oxidase consiste na pesquisa da enzima citocromo oxidase do tipo aa3 que cataliza o ltimo passo da cadeia respiratria (as bactrias aerbias estritas so oxidase positivas; as bactrias aerbias e anaerbias facultativas so oxidase negativas). O teste da oxidase realizado recorrendo ao composto tetrametil-pfenilenodiamina que na presena da citocromo oxidase oxidado pelo citocromo c a um composto de cor prpura designado por azul de Wurster.

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PROCEDIMENTO ANALTICO Enriquecimento: - Pesar 10 gr. de amostra, carne de frango, (num saco de homogeneizao estril); - Adicionar 90 ml de Triptona Sal (Preparao da Suspenso me); - Homogeneizar a amostra em homogeneizador peristltico (Stomacher); Isolamento: - Com a ajuda de uma pipeta, inocular 1ml da suspenso - me e adicionar ao meio Campyfood ID; - Com o auxlio de um espalhador (vareta em L), esterilizado, semear o incuo uniformemente, pela superfcie do meio; - Deixar secar as placas durante 15 minutos temperatura ambiente; - Incubar, colocando as placas em posio invertida, a 41,5C 1C durante 24 horas 2. Identificao/Confirmao: - Retirar as placas da estufa e proceder leitura e contagem das mesmas; - Aps contagem de colnias caractersticas de Campylobacter, abaixo das 150 por placa, realizar a confirmao das mesmas (confirmar 5 colnias isoladas/placa); - Com a ajuda de uma ansa proceder repicagem de duas colnia isoladas para 2 placas contendo um meio no selectivo (Gelose Columbia); - Inocular por estria, com ajuda da ansa, superfcie do meio; - Incubar uma em anaerobiose (41,5C) e uma em microaerofilia (25C) Efectuar o Teste de Colorao de Gram: 1) Preparao do esfregao: - Colocar uma gota de gua destilada no centro de uma lmina. - Colocar uma pequena poro suspenso me na lmina e homogeneizar;

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- Deixou-se secar ao ar, passando de seguida a lmina pela chama para fixar o material. 2) Colorao de Gram: - Cobrir o esfregao com o corante cristal violeta deixando-o actuar durante 1 minuto; - Escorrer o corante e lavar a lmina com gua corrente, deixando a gua correr suavemente sobre a lmina; - Inundar a lmina com Lugol deixando-o actuar durante 1 minuto; - Lavar novamente com gua, e sobre descorar com uma mistura de lcool e acetona (mas no tirando corante em excesso); - Lavar novamente com gua; - Cobrir a lmina com gua destilada e deitar algumas gotas de Fucsina na mesma, deixando actuar durante cerca de 30 segundos ; - Lavar novamente com gua; - Secar a lmina com papel de filtro; - Observar ao Microscpio ptico com a objectiva de imerso(100x).

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RESULTADOS Isolamento das colnias em meio Campyfood ID Colnias cor-de-rosa avermelhadas Confirmao das colnias em Gelose Columbia: Aerobiose (41,5C) No h crescimento Microaerofilia (25C) No h crescimento Teste de Colorao Gram: Colorao rosa Gram Contagens: Meio Campyfood ID 10-1 25

Meio de Cultura Diluies N. Colnias

Para contagem de colnias totais foram consideradas as placas das duas diluies sucessivas, efectuadas, para clculo do nmero N de ufc, com a ajuda da seguinte equao:

C N= Vd =

25 = 25 x 10 ufc / g

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INTERPRETAO DOS RESULTADOS A amostra analisada no se encontra abrangida no Regulamento (CE) pelo que tivemos de recorrer aos

1441/2007 de 5 de Dezembro de 2007

valores guia do Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge INSA, para apreciao de resultados analticos de modo a podermos quantificar o produto segundo os nveis de qualidade / segurana. Microorganismo Satisfatri Campylobacter spp. o Ausente em 25g Valores Guia No Aceitvel Inaceitvel Satisfatrio Presente em 25 g

A Contagem de campylobacter spp. foi de 25 x 10 ufc / g pelo que a nossa amostra se encontra inaceitvel.

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CONCLUSO A amostra apresenta-se inaceitvel, o controlo da contaminao passa pela preveno de possveis contaminaes cruzadas, os alimentos depois de cozinhados no devem entrar em contacto, nem com alimentos crs, nem com utenslios e superfcies onde estes foram preparados. Sabe-se que as carcaas de aves, bem como os seus midos e fgado tm grande incidncia de Campylobacter, resultante de contaminao cruzada durante o processamento. A preveno da Campilobacteriose passa ainda por evitar o consumo de carnes mal cozinhadas, sobretudo de aves, leite no pasteurizado e guas indevidamente tratadas.

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BIBLIOGRAFIA Manual de Apoio do Mdulo de laboratrio em Avaliao de Contaminantes e Perigos Biolgicos do NISQA Sebenta das aulas prticas da Disciplina de Microbiologia Geral do Instituto Superior de Sade Egas Moniz, CRl Orientaes para a Elaborao de um Manual de Boas Prticas em bacteriologia do Ministrio da Sade e do Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge, 2004 Microbiologia, Wanda Ferreira, Joo Sousa, Volume I, Lidel, 1998 edies tcnicas Microbiologia, Wanda Ferreira, Joo Sousa, Volume II, Lidel, 2000 edies tcnicas Regulamento (CE) 2073/2005 de 15 de Novembro relativo a critrios microbiolgicos aplicveis aos gneros alimentcios, Jornal Oficial da Unio europeia, L338/1, Comisso Europeia Bruxelas, 2005 Regulamento (CE) 1441/2007 de 5 de Dezembro de 2007 que altera o Regulamento (CE) n. 2073/2005 relativo a critrios microbiolgicos aplicveis aos gneros alimentcios, Jornal Oficial da unio europeia, L322/12, Comisso Europeia, Bruxelas Valores Guia para avaliao da qualidade microbiolgica de alimentos prontos a comer preparados em estabelecimentos de restaurao do Instituto Nacional de Sade Doutor Ricardo Jorge - INSA HOFFMANN, F. L. Higiene: Fatores limitantes proliferao de microrganismo de alimento. Revista Brasileira de Alimentos, So Paulo, v.9, n. 1, p. 23- 30, 2001.

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