Fundao Paulista de Tecnologia e Educao Laboratrio de Anlises Qumicas, Microbiolgicas e Controle Industrial

Ttulo: Data de emisso: Teste de esterilidade comercial para alimentos de maio/2007 baixa acidez pH4,6 rea emitente: Identificao: Departamento da Qualidade PA.LACI MB.012 Edio/Reviso: 01/04 Folha: 1 de 8

1. OBJETIVOS Estabelecer procedimento para a verificao da eficcia do processo de esterilizao aplicado a alimentos de baixa acidez, comercialmente estreis; 2. APLICAO Aplica-se a amostras de alimentos comercialmente estreis de baixa acidez (enlatados). 3. PRINCPIO 3.1. Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras nas temperaturas de 36 1C pelo perodo de 10 dias e a 55 1C pelo perodo de 5 a 7 dias, objetivando a deteco de crescimento bacteriano com formao de gs, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na verificao de possveis microfugas. 3.2. Semeadura e incubao Baseia-se na utilizao de meios lquidos no seletivos com capacidade de promover o crescimento de microrganismos por meio da incubao em aerobiose e anaerobiose, em temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesfilos e termfilos. 3.3. Provas complementares

3.3.1. Colorao pelo mtodo de Gram e de esporos Baseia-se na observao microscpica das caractersticas morfolgicas e tintoriais dos microrganismos presentes e de seus esporos. 3.3.2. Prova da Catalase Baseia-se na verificao da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima catalase, que decompe o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 3.3.3. Prova da termofilia estrita Baseia-se na verificao da germinao e crescimento dos esporos nas temperaturas de 36 1C e 55 1C para certificao da exigncia absoluta de elevada temperatura para seu desenvolvimento. A germinao dos esporos a 36 1C indica a capacidade mesoflica do microrganismo.

Elaborao Elisa Maria Fernandes maio/2007

Aprovao Maurcio Ferreira de Macedo maio/2007

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O crescimento a 36 1C e a 55 1C indica a capacidade termoflica facultativa do microrganismo. O crescimento somente a 55 1C indica a capacidade termoflica estrita do microrganismo. 4. MATERIAIS 4.1. Equipamentos, vidrarias e outros Equipamentos, vidraria e demais insumos laboratrios de microbiologia de alimentos; Equipamentos, vidraria e outros; Abridores metlicos estreis; Pinas estreis; bsicos obrigatrios em

4.2. Meios de cultura e reagentes Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi; Caldo glicose triptona; gar glicose triptona; gar nutriente; gar nutriente com sulfato de mangans; gar para esporulao; gar crebro-corao (ABHI); Corantes para a colorao de esporos; Corantes para a colorao de Gram; Perxido de hidrognio 3%; Vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida. 5. TCNICA 5.1. Pr-incubao Seguir os procedimentos para pr incubao no POP.LACI LAB.006, Procedimento para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos. Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a alterao, quando ocorrer.

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5.1.1 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao Ao final da pr-incubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da pr-incubao. Proceder conforme item 5.3 para a anlise destas amostras. 5.2. Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle laboratrio POP.LACI LAB.009. especficos estabelecidos pelo

5.3. Amostras tufadas As amostras que derem entrada no laboratrio com evidncias de tufamento e estiverem acompanhadas de ofcio com solicitao de anlise especial sero analisadas imediatamente, devendo ser preparadas conforme as instrues descritas abaixo: Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado oposto ao analista. Colocar um chumao de algodo embebido em soluo desinfetante, previamente aprovada pelos testes do laboratrio, no local onde ser iniciada a abertura da embalagem. Esse procedimento tem o objetivo de proteger o ambiente e o analista contra uma possvel contaminao proveniente do alimento em anlise pela expulso de gases e/ou lquidos presentes no recipiente no momento do rompimento da hermeticidade. Outros cuidados como o uso de luvas, mscara, toucas, etc. tambm devero ser adotados. Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio sob o chumao de algodo. Deixar em repouso sem retirar a proteo de algodo sobre o orifcio at que a presso interna do produto esteja equilibrada com a externa. Com outro abridor estril, abrir cuidadosamente a lata e transferir pores do contedo, tomadas do lado oposto ao local do orifcio inicialmente feito, para os meios de cultivo indicados. Aps a retirada das alquotas estabelecidas pela metodologia especfica, fechar cuidadosamente a lata e acondicion-la em saco plstico autoclavvel, fechando-o com fita adesiva. A amostra, assim embalada, dever ser imediatamente descartada conforme norma especfica do laboratrio.

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As amostras alteradas que chegarem desacompanhadas de ofcio com solicitao especfica no sero analisadas. Fazer constar no Certificado Oficial de Anlise a informao do motivo da no aceitao. No flambar os recipientes tufados. Os mesmos devero ser somente desinfetados com algodo embebido em soluo desinfetante. Manter registros das condies das amostras no momento da sua recepo no laboratrio. 5.4. Inoculao das amostras Utilizando a amostra incubada a 36 1C, retirar alquotas de cerca de 1 a 2 gramas ou mL e semear em quatro tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, e tambm em quatro tubos contendo caldo glicose triptona. Aps a inoculao das amostras, acrescentar, assepticamente, sobre o caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi uma camada de aproximadamente 2 cm de vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida, estril, previamente fundido. 5.5. Incubao Incubar dois tubos de cada meio nas temperaturas de 36 1C e 55 1C por 120 horas (5 dias). 5.6. Leitura e Interpretao Verificar, nos tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, a formao de gs, a turvao do meio e possvel alterao na aparncia da carne do meio, sinais indicativos de crescimento bacteriano. Os clostrdios sacarolticos produzem cido e gs com odor cido, sem a digesto da carne cozida mas com conseqente avermelhamento da mesma. Os clostrdios proteolticos degradam a protena em aminocidos, com a precipitao da tirosina na forma de cristais brancos, produzindo um odor ftido de compostos sulfurados com conseqente enegrecimento da carne cozida e turvao do caldo. Verificar, nos tubos com caldo glicose triptona, se ocorreu turvao e/ou formao de pelcula na superfcie do caldo, alteraes que indicam crescimento bacteriano. Considerar como negativo o teste para a esterilidade comercial quando no se observar nenhuma das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados. Dar seqncia ao teste quando forem observadas quaisquer das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados. 5.6.1. Confirmao de tubos com crescimento positivo ou suspeito

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Os tubos suspeitos de apresentarem crescimento devem ser repicados por estriamento em placas de ABHI, conforme segue: 5.6.1.1. Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 36 1C (aerbios mesfilos) Repicar concomitantemente para duas placas com ABHI. Incubar uma destas placas a 55 1C e a outra a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.6.1.2. Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 55 1C (aerbios termfilos) Repicar para uma placa com ABHI. Incubar a 55 1C por 24 a 48 horas. 5.6.1.3. Quando o tubo suspeito for o de caldo de carne cozida (ou de caldo Tarozzi), incubado a 36 1C (anaerbio mesfilo) ou a 55 1C (anaerbios termfilos), repicar para uma placa com ABHI. Incubar por 24 a 48 horas, na mesma temperatura de incubao usada para o tubo de origem (36 1C ou 55 1C), em anaerobiose. 5.6.2. Leitura Aps a incubao, verificar o crescimento de microrganismos nas placas. O no crescimento indicar resultado negativo para o teste de esterilidade comercial. Quando for verificado crescimento nas placas, repicar as culturas obtidas para tubos com gar estoque inclinado e incubar nas mesmas condies das placas de origem. Aps incubao, realizar os testes complementares a seguir: 5.7. Testes complementares

5.7.1. Colorao de Gram A partir das colnias que crescerem nas placas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues constantes do POP.LACI LAB.008, Procedimentos de colorao. Quando for verificada a presena de bastonetes Gram positivos nos tubos incubados em anaerobiose, a realizao da prova de catalase necessria para a diferenciao entre Bacillus sp (catalase positiva) e Clostridium sp (catalase negativa). Registrar no resultado final a morfologia dos cultivos celulares isolados observada.

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5.7.2. Prova da catalase Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur estril, transferir a cultura para uma lmina de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. No caso da presena de bastonetes Gram positivos, resultados de catalase negativos indicam a presena de Clostridium sp e resultados positivos indicam a presena de Bacillus sp. Quando for detectada a presena de Clostridium sp, guardar as culturas para testes complementares, caso sejam necessrios.

5.7.3. Prova da termofilia estrita Quando forem detectados bastonetes termfilos, realizar prova para confirmao de termofilia estrita do microrganismo isolado. A partir dos tubos com caldo glicose triptona positivos incubados a 55 1C, repicar maciamente para tubos contendo gar nutriente inclinado com sulfato de mangans (ou gar para esporulao). Incubar a 55 1C de 2 a 10 dias. A partir do segundo dia, verificar a presena de esporos por meio da aplicao da tcnica para colorao de esporos, conforme instrues constantes do POP.LACI LAB.008, Procedimentos de colorao. Quando forem detectadas culturas esporuladas, preparar suspenso de esporos, lavando o crescimento obtido no tubo com gar nutriente/sulfato de mangans com 1 mL de gua destilada ou deionizada estril. Inativar as formas vegetativas por meio da aplicao de um choque trmico a 80C por 15 minutos na suspenso preparada de 1 mL. Inocular 0,1 mL do lavado, aps o choque trmico, em dois tubos contendo caldo glicose triptona. Incubar um tubo a 36 1C e outro a 55 1C por 2 a 4 dias. Verificar o crescimento de microrganismos, evidenciado pela turvao do caldo. O crescimento bacteriano somente no tubo incubado a 55 1C determina a termofilia estrita do microrganismo isolado. O crescimento bacteriano nos dois tubos determina a termofilia facultativa do microrganismo isolado. Registrar no resultado final a caracterstica mesoflica ou termoflica do microrganismo isolado.

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5.7.4. Confirmao de microrganismos flat sour (opcional) A partir das culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de caldo glicose triptona incubados a 55 1C, repicar para a superfcie seca de 2 placas com gar glicose triptona. Incubar uma das placas a 36 1C por 72 horas e a outra a 55 1C por 48 horas em cmara mida. O crescimento de colnias amarelas, regulares, com dimetro de aproximadamente 2 a 3 mm, rodeadas de zona de clarificao tambm amarela, nas placas incubadas a 55 1C, com ncleo opaco e o no crescimento naquelas incubadas a 36 1C, confirmar a presena de Bacillus stearothermophilus (renomeado Geobacillus stearothermophilus), microrganismo responsvel pela deteriorao flat sour.

6. RESULTADOS 6.1. Pr-incubao Expressar, no campo referente a emisso do resultado para prova de princubao, nas temperaturas requeridas, o resultado como sem alterao quando no se observar qualquer alterao ou anormalidade no recipiente e nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra, e como alterado quando for observada qualquer alterao ou anormalidade no recipiente ou nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o tipo de alterao observado. 6.2. Pesquisa de aerbios e anaerbios termfilos e mesfilos Expressar, nos campos referentes a emisso dos resultados para as pesquisas de aerbio e anaerbio mesfilo e termfilo, o resultado como negativa, quando no for observado qualquer desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como positiva quando for observada a presena de microrganismos. Sempre que possvel, fazer constar do resultado final as observaes feitas ao microscpio. 7. REGISTRO REG.LACI LAB.021 Teste esterilidade comercial para alimentos de baixa acidez - pH4,6.

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REG.LACI LAB.022 CQA Teste de esterilidade comercial para alimentos de baixa acidez - pH4,6. 8. DOCUMENTO DE REFERNCIA MINISTRIO DA AGRICULTURA PECURIA E ABASTECIMENTO. Instruo Normativa n 62: Oficializa os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de Origem Animal e gua. Braslia, 2003.

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