Regulao da Atividade Gnica em Procariontes

INTRODUO
A informao gnica unidimensional transcrita em RNA e, posteriormente, traduzida em protena como informao tridimensional, que responsvel por todos os processos biolgicos essenciais ou auxiliares; O comportamento de um organismo depende da natureza, da amplitude e das condies ambientais nas quais seus genes so expressos: Genes que codificam protenas de (housekeeper) - expressos o tempo todo; manuteno

Genes cujos produtos so sintetizados apenas nos momentos e em quantidades exatas necessrias - genes regulados. A regulao gnica torna possvel a adaptao, a variao, a diferenciao e o desenvolvimento celular.

 Os sistemas regulatrios entre procariontes e eucariontes so diferentes, principalmente em razo das diferenas de estruturas e organizao gnica. Em procariontes (e provavelmente eucariontes unicelulares) os sistemas regulatrios so movidos para fornecer a mxima taxa de crescimento em um determinado ambiente, exceto quando tal crescimento for detrimental. Em eucariontes multicelulares, por outro lado, uma clula embrionria deve no apenas crescer e se multiplicar, mas tambm sofrer considervel mudana em morfologia e bioqumica (diferenciar-se) e ento manter-se inalterada neste estado.

Viso Geral da regulao da transcrio em procariontes e eucariontes.

Fundamentos da Regulao
Os mecanismos regulatrios mais bem compreendidos so os usados por bactrias e bacterifagos;
A expresso gnica pode ser regulada pelo controle tanto da sntese de RNA quanto da sntese de protena; Existem sinais regulatrios para determinar a quantidade mxima de cada protena que deve estar presente na clula (p.ex. 20 cpias de repressor lac e 100.000 cpias do fator de transcrio EF-Tu); Por isso, existem atividades reguladoras do tipo ligadesliga, permitindo a sntese quando o produto gnico necessrio e inibindo quando no ;

No estado desligado, um nvel basal de expresso gnica quase sempre mantido, apenas no estado de esporos a expresso da maioria dos genes bacterianos est totalmente desligada; Em eucariontes, entretanto, o desligamento total de um gene uma condio prevalente; A organizao gnica em perons, prevalente em procariontes, proporciona a regulao coordenada dos produtos de vrios genes que participam de uma via metablica; Nos eucariontes os mRNAs so, em geral, monocistrnicos e os genes so organizados separadamente e dispersos em cromossomos diferentes, requerendo regulao individualizada;

Regulao ao Nvel de Transcrio

Existem vrios mecanismos para regulao da transcrio, o tipo usado, em geral, depende se as enzimas reguladas agem em vias metablicas de degradao ou de sntese de compostos; Em um sistema degradativo de vrias etapas, a disponibilidade da molcula a ser degradada frequentemente determina a sntese ou no das enzimas de degradao;

Em contraste, em uma via biossinttica, o produto final , em geral, a molcula regulatria;

Geralmente, os dois padres de regulao se enquadram em duas categorias principais: regulao positiva ou regulao negativa.

Distino entre regulao negativa e regulao positiva

Regulao negativa
Nestes sistemas, uma protena especfica (protena repressora) inibe a transcrio de um gene (ou genes) quando presente na clula; A inibio do repressor pode ser direta e a presena de um indutor (molcula antagonista do repressor) necessria para que ocorra a transcrio; Em outros casos, a protena repressora pode depender de uma molcula sinal especfica, com a qual forma um complexo para ser ativa.

Modelo geral de regulao negativa por um repressor de ao direta (A) e do efeito de um indutor na remoo do stio operador (B).

Regulao Positiva
No sistema de regulao positiva uma protena, denominada de ativador, funciona para aumentar a taxa de transcrio de um peron;

Alguns ativadores para serem efetivos tambm dependem de associao com alguma molcula sinal.

Modelo geral de regulao positiva por um ativador de ao direta (A) e do efeito da molcula sinal ou efetora que induz o ativador a se ligar no stio operador (B).

OBSERVAES GERAIS IMPORTANTES DA REGULAO GNICA Os repressores e ativadores no so mutuamente excludentes em sua atuao e natureza: ambos podem estar presentes em um mesmo peron e uma mesma protena pode funcionar ora como repressora, ora como ativadora. Um sistema degradativo pode ser regulado positiva ou negativamente, enquanto uma via biossinttica regulada, geralmente, negativamente. Tanto em procariontes quanto em eucariontes a prpria atividade enzimtica pode ser regulada pelos produtos finais de uma sequncia de reaes (inibio feedback). Pequenas molculas que no os produtos da reao enzimtica tambm so utilizadas para ativar ou inibir uma enzima (molcula efetora alostrica).

O MODELO DO PERON lac EM E. coli

Em E. coli o metabolismo da lactose requer duas enzimas: uma permease para transportar a lactose para a clula e a galactosidase para quebrar a molcula de lactose; A permease e a -galactosidase so codficadas por duas sequncias adjacentes, Z e Y, respectivamente; Uma terceria sequncia contgua codifica uma enzima adicional, denominada transacetilase, no envolvida no metabolismo da lactose; Assim, as sequncias Z, Y, A so de genes estruturais, ou sejam, genes que codificam a estrutura de protenas (polipeptdeos); Todos os trs genes so transcritos em uma nica molcula de mRNA, portanto, a regulao da produo deste mRNA coordena a sntese de todas as trs enzimas.

O Modelo do Operon lac de E. coli

Experimentos que possibilitaram a compreenso da estrutura e funcionamento do operon lac

Utilizao de linhagens bacterianas diplides parciais produzidas por *plasmdeos F:
*Plasmdeo F molcula de DNA extracromossmico mas capaz de se integrar ao cromossomo bacteriano e de ser transferido entre clulas bacterianas (por meio da conjugao); A transferncia de uma cpia de um plasmdeo integrado pode levar junto alguns genes do cromossomo bacteriano, da bactria doadora para a bactria receptora; Desde que haja um conjunto completo de genes para metabolizar a lactose, seja no plasmdeo seja no cromossomo, estes diplides exibem um fentipo Lac+;

Por conveno, o gentipo do plasmdeo escrito esquerda da barra diagonal e o do cromossomo direita .

 Os diplides parciais Flac+/lac- ou Flac-/lac+ exibem fentipo Lac+; Nos diplides parciais Flac-/lac-, algumas clulas apresentaram fentipo Lac- enquanto outras foram Lac+; Todos os mutantes Lac- isolados caram em dois grupos: os que tinham mutao no gene lacZ e os que tinha mutao no gene lacY; Estes resultados evidenciaram que o sistema lac era constitudo por pelos menos dois genes estruturais (lacZ e lacY); Experimentos em que clulas foram colocadas em um meio com lactose marcada com 14C mostraram que nenhuma lactose entrava em uma clula lacY- mas entreva prontamente em uma clula lacZ-

 As dosagens enzimticas mostraram que a galactosidade est presente em clulas lacZ+, mas ausente em clulas lacZ-; O mapeamento mostrou que os genes lacZ, LacY e LacA so adjacentes;

A produo do mRNA do operon lac s realizada quando a lactose est presente no meio de cultivo como fonte nica fonte de carbono;
Concluso: o sistema indutvel, regulado ao nvel de transcrio e a lactose atua como um indutor;

 De fato, neste tipo de experimento no se utiliza lactose, mas um anlogo denominado de isopropiltiogalctosdeo (IPTG), este anlogo um indutor mas no um substrato para a galactosidase. Foram isolados mutantes em que o mRNA lac era produzido tanto na presena quanto na ausncia do indutor (mutaes constitutivas). Testes com diplides parciais portadores de duas mutaes constitutivas mostraram a existncia de duas classes: lacI+ e lacOc.

Expresso de lacZ
Gentipo
I+O+lacZ+ I-O+lacZ+ F I-O+lacZ+/I+O+lacZ+(ou -)

Indutor ausente (sem IPTG)

Indutor presente (com IPTG)

fentipo
Indutvel Constitutivo Indutvel

+
-

+
+

F I+O+lacZ+/I-O+lacZ+
I+OclacZ+ F I+OclacZ+/I+O+lacZF I+OclacZ-/I+O+lacZ+ F I+OclacZ-/I-O+lacZ+ F I+OclacZ+/I-O+lacZ-

+ + +

+
+ + + + +

Indutvel
Constitutivo Constitutivo Indutvel Indutvel Constitutivo

Concluses:
O produto do gene lacI deve ser uma entidade difundvel denominada, posteriormente, de protena repressora Lac; As mutaes Oc causam uma expresso constitutiva dos genes lac apenas quando a mutao e os genes esto na mesma molcula;

Apenas os genes cis adjacentes Oc so afetados por ele, por isso a mutao denominada de cis-dominante;
Logo, a regio O no codifica um produto difundvel, de fato ela uma regio no codificante envolvida na regulao e denominada de operador; A protena repressora do gene lacI se liga ao operador O+ e impede a transcrio dos genes estruturais lac.

 Outra classe de mutantes Lac- (denominada de P-) foi isolada e caracterizada como cis-dominante, em experimentos com diplides parciais. Estas mutaes foram mapeadas em uma regio adjacente ao operador e foi denominada de stio promotor.

Resumindo: o sistema de uso de lactose consiste de dois tipos de componentes: genes estruturais que codificam produtos necessrios para transportar e metabolizar lactose e elementos regulatrios (gene lacI, o operador (O) e promotor (P)). Juntos, os genes estruturais e os elementos regulatrios constituem o operon lac.
O operon lac exemplifica um tipo de regulao negativa, em que um indutor desativa o repressor pelo processo chamado de desrepresso.

peron lac bloqueado

peron Lac desbloqueado

Efeito da Glicose na expresso do peron lac

A -galactosidase forma glicose e galactose pela quebra da lactose. Por isso, se h glicose e lactose no meio de cultura, a atividade do peron lac no necessria.

O exame desta caracterstica indica que o operon lac est tambm sujeito regulao positiva:
A molcula AMP cclico (cAMP) tem sua concentrao intracelular relacionada concentrao de glicose. Assim, quando o nvel de glicose baixo na clula, a concentrao de cAMP alta e vice versa.

 O cAMP responsvel pela vinculao entre atividade do operon lac e concentrao intracelular de glicose; O cAMP se liga a outra protena, denominada de receptor de cAMP (CRP ou CAP), formando o complexo cAMP-CRP, que se liga no stio ativador, localizado na regio do promotor, para que ocorra a transcrio do operon lac; A ausncia de complexo cAMP-CRP faz com a RNA polimerase se ligue fracamente ao promotor lac, de modo que a transcrio raramente iniciada; Assim o complexo cAMP-CRP um regulador positivo, enquanto o produto do gene i (repressor) um regulador negativo do operon lac.

Controle positivo do operon Lac: Em baixas conc. de glicose formado o cAMP que forma um complexo com o CAP (ou CRP); O complexo se liga no stio promotor do operon

Controle negativo e positivo do peron Lac pelo repressor lac e pela protena ativadora do catabolismo (CAP ou CRP) : Grande quantidade de mRNA produzida apenas quando: A lactose est presente para inativar o repressor e, Os baixos nveis de glicose promovem a formao do complexo CAP-cAMP, que regula positivamente a transcrio.

peron da Galactose de E. coli

O peron gal tambm um sistema de induo com trs cstrons (galE, galT e galK), regulado por cAMP-CRP, um repressor e dois stios promotores, que so inversamente ativados pelo complexo cAMP-CRP; cAMP-CRP ativa a transcrio a partir do promotor P1, mas inibe a transcrio a partir do promotor P2; Foi demonstrado experimentalmente que a sntese de mRNA gal a partir dos dois promotores inversamente proporcional conc. de cAMP intracelular;

O produto do gene galR, o repressor do operon gal, se liga aos dois stios operadores e induz a formao de uma ala no DNA, envolvendo as regies promotoras, o que impede a ligao da RNA polimerase e o incio da transcrio.

peron da Arabinose
O peron ara, como os perons lac e gal, indutvel;
As enzimas ara so sintetizadas apenas quando as clulas so expostas arabinose, cuja transcrio regulada pela protena AraC; AraC atua diretamente como repressora na ausncia de arabinose, mas na sua presena forma o complexo arabinosearaC que ativa a transcrio a partir do promotor ara; Se o gene araC deletado, o operon ara nunca expresso, mesmo na presena de arabinose; Portanto AraC exemplifica o caso de uma protena reguladora que atua tanto como repressor quanto como indutor.

peron de Triptofano e a Atenuao

Em E. coli, a expresso das enzimas envolvidas na sntese de muitos aminocidos e vitaminas regulada pela interao entre o repressor e co-repressor; O co-repressor geralmente o prprio produto da via biossinttica; O peron trp, que controla a transcrio de cinco cstrons envolvidos na codificao das enzimas da biossntese do triptofano funciona assim; A protena reguladora do sistema de represso do peron trp codificada pelo gene trpR, localizado em outra regio do genoma bacteriano;

O peron trp contm 5 genes estruturais que codificam as enzimas envolvidas na biossntese do triptofano, (trpE, trpD, trpC, trpB, trpA). Os elementos reguladores (stio promotor, operador e sequncia atenuadora localizam-se montante do cistron trpE. O gene trpR localiza-se em outra regio do genoma.

Existem dois nveis de regulao:

a) Altos nveis de triptofano desligam o sistema ao nvel de co-repressor neste caso a transcrio nunca comea porque o promotor est bloqueado;
b) Se os nveis de triptofano no so suficientemente altos, a expresso submetida a um sistema de controle mais refinado, sensvel concentrao intracelular de triptofano: 1- trmino prematuro da transcrio antecedente ao primeiro gene estrutural; 2regulao da frequncia deste trmino concentrao intracelular de triptofano; pela

Regulao do peron trp por dois processos distintos: (1) Altos nveis de triptofono - bloqueio da transcrio pela ligao, no stio operador, do complexo co-repressor/repressor; (2) trmino prematuro da transcrio (mRNA atenuado) quando os nveis intracelulares de triptofano so intermedirios.

 O mRNA lder (L) contm 162 bases e vrias caractersticas singulares: 1) Um cdon AUG e um cdon finalizador UGA que definem a codificao do polipeptdeo lder de 14 aminocidos; 2) Dois cdon adjacentes, correspondentes 10 e 11 posies do peptdeo lder, especificam o aminocido triptofano; 3) Quatro segmentos do mRNA lder so capazes de fazer pareamento intrafilamentar por dois modos mutuamente exclusivos, formando hastes-alas 1-2 e 3-4 ou apenas a haste-ala 2-3; O mecanismo para efetuar o trmino prematuro da transcrio baseado no potencial do mRNA em formar as haste-alas alternativas 1-2 (protetora) e 3-4 ( atenuadora) ou 2-3 (preemptora);

 A orientao para trmino prematuro depende da formao ou no da estrutura atenuadora da haste-ala 3-4;

O trmino da transcrio no atenuador mediado pela traduo do peptdeo lider, que sensvel concentrao de tRNAtrp carregado;
Se o suprimento intracelular de triptofono for baixo, a quantidade de tRNAtrp ser insuficiente e a traduo ficar parada nos cdons de triptofano (posies 10 e 11); Dois pontos devem ser destacados: 1- todo pareamento de bases eliminado no segmento de mRNA que est em contato com o ribossomo; 2 se as hastes-alas 1-2 e 3-4 forem formadas simultaneamente, ento a haste 2-3 no poder estar presente;

Se a haste-ala 3-4 no for formada a transcrio segue adiante e uma molcula completa do mRNA do peron sintentizada.

Modelo do mecanismo de controle por atenuao do peron trp de E. coli

Reguladores Especficos versus Globais

Protenas reguladoras podem ser altamente especficas, como repressor Lac, ou podem ter um efeito mais global, como cAMP-CRP;

Outro exemplo de regulador geral a protena LexA, envolvida no controle da expresso de genes que codificam enzimas de reparo de danos induzidos por UV; Estes genes esto localizados em diferentes regies do genoma de E. coli e a protena LexA se liga aos operadores de todos eles; Um conjunto de genes ou perons cuja expresso seja regulada por um regulador global denominado de rgulon;

Auto-regulao
Genes cujas exigncias de seus produtos variem muito nas clulas, possuem mecanismo de auto-regulao, geralmente com o produto do gene funcionando diretamente como regulador positivo ou negativo, conforme o caso; A auto-regulao pode ocorrer tambm ao nvel de traduo como nos casos dos componentes proticos do ribossomos, que se ligam ao mRNA , bloqueado a ligao de ribossomos intactos e a sntese protica; Os genes que codificam as diversas protenas ribossmicas esto organizados em perons com at 11 cstrons; Em cada um destes perons encontra-se pelo menos um cstron cujo produto tem atividade de represso traducional;

 Como cada cstron possui seu prprio stio de ligao o ribossomo (RBS), seria esperado que apenas aquele onde houve ligao da protena tivesse sua traduo bloqueada;
No entanto, devido formao de estruturas secundrias no mRNA, a liberao dos diversos RBS depende da traduo dos cstrons antecedentes.

Genes Constitutivos
Genes constitutivos so expressos o tempo todo na clula, em taxas predeterminadas pela eficincia (fora) de seus promotores; Tais genes codificam protenas de manuteno da clula viva, p.ex. os genes que codificam enzimas do metabolismo da glicose, cujos nveis permanecem mais ou menos constantes na clula.

Controle da traduo do mRNA do peron S10, que codifica protenas ribossmicas. A protena L4, quando em excesso, liga-se em uma regio montante do cstron rpsJ e bloqueia a traduo da maioria dos genes, com exceo de rplP e rpmC.

Resumo dos mecanismos de controle transcricional da expresso gnica. A linha fina de mRNA, no controle positivo, indica transcrio em um nvel basal; O X abaixo do promotor (P) indica bloqueio da transcrio; Altos nveis de transcrio so indicados por vrias cpias de mRNA .

Controle Ps-transcricional
Em geral, as taxas de snteses de protenas de diferentes cstrons de um mesmo peron so desiguais; Estas diferenas, resultantes de regulao ps-transcricional, so obtidas de dois modos: 1) Controle traducional Determinado pela eficincia de ligao dos ribossomos sequncia crtica (Shine-Dalgarno) de cada cstron e tambm pela posio relativa dos cstrons; ex. operon lac 100 lacZ : 50 lacY : 20 lacA; A eficincia de ligao do ribossomo tambm modulada pela formao de estruturas secundrias no mRNA, ou pela complementao de bases do mRNA com outra molcula de RNA com atividade reguladora.

2) Estabilidade do mRNA Em bactrias esta estabilidade da ordem de alguns minutos, facilitando as mudanas no espectro de sntese de protenas. Outro aspecto importante modo como se d a degradao do mRNA. ex. o mRNA do operon lac degradado da extremidade 3 para 5, por isso, sempre h mais segmentos de lacZ que lacY e de lacY que lacA;

Resumindo: a expresso geral de um operon regulada pelo incio da transcrio de um mRNA e/ou pelo seu trmino prematuro, enquanto a concentrao relativa das protenas codificadas determinada tanto pela taxa de degradao do mRNA, quanto pela frequncia do incio da traduo de cada cstron.

Inibio Feedback e Controle Alostrico

Inibio feedback se refere paralisao reversvel e especfica da atividade cataltica de uma enzima, em uma via bioqumica pela ligao de um produto enzimtico posterior na mesma via; p.ex. Altas conc. de isoleucina inibem a atividade da primeira enzima da via metablica de sua biossntese a partir de treonina; A isoleucina liga-se, reversivelmente, a stio diferente de seu stio ativo e muda a estrutura da protena enzimtica; Protenas cuja forma ou conformao mudada pela ligao de uma pequena molcula (efetores alostricos) em um stio diferente de seu stio ativo so chamada de protenas alostricas.

Inibio feedback da via biossinttica da isoleucina

Alterao conformacional de uma protena enzimtica pela ligao de um efetor alostrico.

 Algumas vias biossintticas so ramicadas, sendo responsveis pela sntese de dois ou mais produtos a partir de um precursor comum;

Um caso bem estudado da sntese de lisina, metionina e treonina, tendo como precursor comum o aspartato (ver ilustrao seguinte)
A inibio feedback ocorre tanto em procariontes quanto em eucariontes, em modos muito variados; Todas as mudanas nas propriedades das proteinas regulatrias discutidas anteriomente so exemplos de mudanas de conformao alostricas pela ligao de pequenas molculas efetoras; A inibio ou ativao por mudanas alostricas proporcionam uma rpida resposta a mudanas no ambiente celular.