PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOQUMICA INSTITUTO DE QUMICA TECNOLOGIA ENZIMTICA APLICADA A FRMACOS

RELATRIO DE PRTICAS: PRODUO DE ASPARAGINASE POR EXPRESSO HETERLOGA DO GENE ASP3 DE Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris BIOCONVERSO MICROBIANA DO LIMONENO POR Yarrowia lipolytica.

Introduo
A L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase E.C.3.5.1.1), responde pela catlise hidroltica da L-asparagina em cido L-asprtico e amnia, como ilustrado pela figura a seguir:

Introduo
Leucemia Linfoblstica Aguda (LLA)

CLULAS NORMAIS VERSUS CLULAS TUMORAIS

L- Asparagina

Introduo
Uso da levedura de Pichia pastoris - Produo de protenas recombinantes

Promotores eficientes, fortemente regulados. Forte tendncia ao crescimento aerbico (Cregg et al., 2009). Atinge altas densidades celulares. Modificaes ps traducionais Organismo metilotrfico - GRAS ("Generally Recognized As Safe")
Expresso heterloga de lipase de Aspergillus tamarii (Yurimoto et al., 2009). Expresso de beta glucanases de Alicyclobacillus sp (Bai et al., 2010) em Pichia pastoris, dentre outras.

Objetivos

Produo recombinante de asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris (expresso heterloga).

Inculo Crescimento Total consumo da fonte de carbono (Glicerol) Induo com metanol

Pichia pastoris

Produo de asparaginaseII

Teste de atividade

MATERIAL E MTODOS
Quantificao da concentrao de Glicerol

MATERIAL E MTODOS
Quantificao da atividade da enzima asparaginase

Asparagina 0,1M Hidroxilamina 1M Suspenso de clulas Tampo Fosfato 20mM

Amostra (mL) 0,5 0,5 4,0 ---

Branco Amostra (mL) ----4,0 1,0

Branco Asparagina (mL) 0,5 0,5 --4,0

A seguir tem-se um esquema das reaes enzimticas que levam a asparagina at o complexo Fe hidroxamato, composto que absorve no comprimento de onda de 500nm:

RESULTADOS E DISCUSSO
Crescimento celular

Incubao (h) 0 19 24 48 72

Massa celular g (peso seco de clula)/L --0,37 0,59 2,25 3,23

Glicerol (g/L) 10,00 10,00 5,76 0.00

Tempo: 24 (h)

Tempo: 72 (h)

RESULTADOS E DISCUSSO
Induo da expresso da enzima recombinante

Dosagem da Atividade da Asparaginase Dosagem de Amostra Massa celular asparaginase Induo g (peso seco de (h) clula)/L t=0 t=30min t=0 t=4 t=24 3,23 3,31 3,39 0 0,131 0 0,438

Abs

0 0,307

RESULTADOS E DISCUSSO
Induo da expresso da enzima recombinante Uma unidade enzimtica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formao de 1mmol de produto por minuto sob condies especficas. sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado 500nm de 950. Absorvncia / Absortividade molar = M ou n moles/L 0,307/950 = 3,23 x 10-4 M ou 323 mol/L

RESULTADOS E DISCUSSO
Induo da expresso da enzima recombinante Para um volume de 5mL N moles = (323 mol/L X 5)/1000 = 1,615 mol ( em 30 minutos de reao) Considerando-se a reao enzimtica em velocidade inicial N moles/ min = 1,615/ 30 = 0,054 mol/min Em 4mL de suspenso celular 0,054 mol/min / volume de suspenso celular = 0,0135 mol/(min x mL) U/L 0,0135 mol/ min X mL X 1000 = 13,5 mol/ min X L = 13,46 U/L U/L X h 13,5 mol/ min X L X 60 = 807,5 mol /h X L = 807,5 U/ L X h Massa celular Massa celular = D.O (600nm) X fator (peso seco de clula) = 0,47 x 0,26 = 0,122g/L U/g de peso seco de clula (13,46 U/L )/ (0,122g/L)= 110,32U/g

RESULTADOS E DISCUSSO
Induo da expresso da enzima recombinante Depois de feitos os clculos e todas as dosagens, obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir:

Curva de Induo da Expresso da Asparaginase

Induo (h) pH meio Massa celular Asparaginase U/g (peso seco de clula)

g (peso seco de clula)/L 3,23

3,31 3,39

0
24 48

6,0
5,5 4,5

0
0 3,97

CONCLUSO
- A concentrao da biomassa da levedura P. pastoris encontrada foi de 3,23g(peso seco de clulas)/L , valor obtido aps o consumo total do glicerol em 72h. - A expresso da enzima foi detectada 48h aps a induo com metanol . - A produo da asparaginase por expresso heterloga do gene ASP3 foi de 110,32U/g (peso seco de clula).

BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K, Wlodawer A, Lubkowski J. (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase. Biochemistry. 40(19):565564

Bai Y, Wang J, Zhang Z, Shi P, Luo H, Huang H, Luo C, Yao B.(2010) Expression of an extremely acidic beta-1,4-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp. A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence. Microb Cell Fact. 14;9:33.
Bihong Shi, Liqing Zeng, Haolei Song, Qiaoqin Shi, and Songgang Wu. (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris. Int J Mol Sci. 2010 Jun 3;11(6):2373-82. Clavell LA, Gelber RD, Cohen HJ, Hitchcock-Bryan S, Cassady JR, Tarbell NJ, Blattner SR, Tantravahi R, Leavitt P, Sallan SE. (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 315(11):657-63. Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T. (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol. 463:169-89.

BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA, Sarhan M, Mansour J. (2004) Production, isolation, and purification of Lasparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation. J Biochem Mol Biol. 37(4):387-93. Ertel IJ, Nesbit ME, Hammond D, Weiner J, Sather H. (1979) Effective dose of Lasparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia: a report from Childrens Cancer Study Group. Cancer Res. 39(10):3893-6. Haskell CM, Canellos GP, Leventhal BG, Carbone PP, Block JB, Serpick AA, Selawry OS. (1969) L-asparaginase: therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease. N Engl J Med. 281(19):1028-34.

Jaffe N, Traggis D, Das L, Moloney WC, Hann HW, Kim BS, Nair R. (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in children.Cancer Res. ;31(7):942-9.
Kearney SL, Dahlberg SE, Levy DE, Voss SD, Sallan SE, Silverman LB. (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis. Pediatr Blood Cancer. 53(2):162-7.

BIBLIOGRAFIA
Kwon YM, Chung HS, Moon C, Yockman J, Park YJ, Gitlin SD, David AE, Yang VC. (2009) LAsparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). J Control Release.139(3):182-9. Epub . Losa Fras V, Martn-Sacristn Martn B, Daz Conejo R, Ramos Corral R, Velasco Arribas MR. (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone. An Pediatr (Barc). 72(1):85-7. Epub 2009 Oct 30. Tallal L, Tan C, Oettgen H, Wollner N, McCarthy M, Helson L, Burchenal J, Karnofsky D, Murphy ML. (1970) E. coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children. Cancer. 25(2):306-20. Yurimoto H. (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii. Biosci Biotechnol Biochem. 73(4):793-800.